JP6478695B2

JP6478695B2 - 被験物質の評価方法および低浸透圧刺激抑制剤

Info

Publication number: JP6478695B2
Application number: JP2015032310A
Authority: JP
Inventors: 郁尚藤田; 邦敏内田; 真琴富永
Original assignee: Mandom Corp; Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Current assignee: Mandom Corp; Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Priority date: 2015-02-20
Filing date: 2015-02-20
Publication date: 2019-03-06
Anticipated expiration: 2035-02-20
Also published as: JP2016152789A

Description

本発明は、被験物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧料などの外用剤の開発などに有用な被験物質の評価方法および低浸透圧刺激抑制剤に関する。

化粧料などの外用剤を使用する際に、当該外用剤が誤って眼、口などに混入した場合、不快な感覚刺激が引き起こされることがある。前記不快な感覚刺激は、細胞内液の浸透圧に比べて外用剤の浸透圧が低い場合、細胞外の水などの溶媒が細胞内へ移動して細胞が膨張することによって引き起こされると考えられている。

近年、使用者の安全意識の高まりに伴い、不快な感覚刺激を与えない外用剤が好まれる傾向にあることから、前記外用剤は、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧によって引き起こされる感覚刺激を与えないか、または当該感覚刺激が少ないことが望ましい。したがって、前記低浸透圧によって引き起こされる感覚刺激を抑制する低浸透圧刺激抑制作用を有する物質が求められている。

被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する場合、例えば、ヒトに眼、口などにおける感覚刺激を抑制するかどうかを評価させる方法などを行なうことが考えられる。しかし、前記方法は、ヒトに多大な負荷がかかり、しかも評価結果がヒトによって左右されることから、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することが困難であるという欠点を有する。

ところで、一過性受容体電位チャネルの１つであるＴＲＰＡ１は、パラベン類、アルカリ剤などによって活性化し、活性化されたＴＲＰＡ１を介して不快な刺激を引き起こすことが、本発明者らによって見出されている（例えば、特許文献１〜４参照）。

特開２００８−７９５２８号公報特開２００９−８２０５３号公報特開２００９−２２５７３３号公報特開２０１２−０６２３０４号公報

しかしながら、本発明者らは、現時点では、低浸透圧液によって生じる不快な感覚刺激とＴＲＰＡ１との関連性や、前記関連性を利用して、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することができる、被験物質の評価方法および低浸透圧液によって生じる不快な感覚刺激を効果的に抑制することができる低浸透圧刺激抑制剤を提供することを目的とする。

本発明は、
（１）被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価することを特徴とする被験物質の評価方法、
（２）前記低浸透圧液が、前記細胞内液の浸透圧よりも４０〜２００ｍＯｓｍ低い浸透圧を有する前記（１）に記載の方法、
（３）前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象が、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる前記ＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加である前記（１）または（２）に記載の方法、ならびに
（４）細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触によって引き起こされる感覚刺激を抑制するための低浸透圧刺激抑制剤であって、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の被験物質の評価方法により、低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価された物質としてカンファーまたはユーカリプトールを有効成分として含有することを特徴とする低浸透圧刺激抑制剤
に関する。

本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、低浸透圧液によって生じる不快な感覚刺激を効果的に抑制することができるという優れた効果を奏する。

試験例１において、細胞内液の浸透圧との差と細胞面積上昇率との関係を調べた結果を示すグラフである。試験例１において、細胞内液の浸透圧との差とＴＲＰＡ１活性化度との関係を調べた結果を示すグラフである。（Ａ）は試験例１において、低浸透圧液に接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液に接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度との関係を調べた結果を示すグラフ、（Ｂ）はＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度との関係を調べた結果を示すグラフである。実施例１において、各被験試料と抑制率との関係を調べた結果を示すグラフである。

１．被験物質の評価方法
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ（すなわち、低浸透圧液中で前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ）、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価することを特徴とする。

なお、本明細書において、「低浸透圧刺激抑制作用」とは、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされる感覚刺激を抑制する作用をいう。以下、「細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされる感覚刺激」を「低浸透圧刺激」ともいう。

本発明の被験物質の評価方法は、前記低浸透圧液と前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを、前記低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧が細胞内液の浸透圧よりも低くなるように調整して接触させ、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価するという操作が行なわれている点に１つの大きな特徴を有する。前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１が活性化されることおよび前記ＴＲＰＡ１発現細胞において、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象は、低浸透圧刺激と関連していることが本発明者らによって見出されている。したがって、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用は、前記低浸透圧液と前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときにＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象と関連している。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記操作が行なわれているので、被験者を用いなくてもよいことから、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価することができる。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する際に、前記ＴＲＰＡ１発現細胞を用い、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定しているので、同一条件下に同時に何回も並行して評価を行なうことができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、評価結果にバラつきが生じやすい被験者に評価させる方法と比べ、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく評価することができる。

前記被験物質としては、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒は、ＴＲＰＡ１発現細胞の生育、ＴＲＰＡ１の生理学的機能の発現に影響を与えない溶媒であるのが望ましい。被験物質を溶解させる溶媒としては、例えば、エタノール、生理的食塩水、水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

本明細書において、特に断りのない限り、浸透圧〔ｍＯｓｍ（イオン量換算）〕は、式（Ｉ）：

〔浸透圧（ｍＯｓｍ）〕
＝〔電解質イオン量〕＋〔浸透圧調整剤量〕（Ｉ）

（式中、「電解質イオン量」は浸透圧に影響を与える電解質を構成する電解質アニオンおよび電解質カチオンそれぞれのモル数の和、「浸透圧調整剤量」は浸透圧調整剤のモル数を示す）
に基づいて算出される。

前記電解質としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどのハロゲン化アルカリ金属、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどのハロゲン化アルカリ土類金属などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

前記浸透圧調整剤としては、例えば、マンニトール、グルコース、スクロースなどの糖などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

細胞内液の浸透圧（以下、「浸透圧Ａ」ともいう）と、低浸透圧液の浸透圧（以下、「浸透圧Ｂ」ともいう）との差（浸透圧Ａ−浸透圧Ｂ）は、低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象をより確実に発生させ、低浸透圧刺激抑制作用の評価を容易に、かつ的確に行なう観点から、好ましくは４０ｍＯｓｍ（９０８ｈＰａ）以上、より好ましくは８０ｍＯｓｍ（１８１６ｈＰａ）以上であり、ＴＲＰＡ１に依存しない細胞の応答を抑制する観点から、好ましくは２００ｍＯｓｍ（４５４０ｈＰａ）以下、より好ましくは１６０ｍＯｓｍ（３６３２ｈＰａ）以下である。前記浸透圧Ｂは、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧などによって異なるので、一概には決定することができないことから、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧などに応じて適宜設定することが好ましい。例えば、ヒトの細胞の細胞内液の浸透圧は、通常、２８０〜３２０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：６３５６〜７２６４ｈＰａ）、好ましくは３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）である。したがって、ＴＲＰＡ１発現細胞がヒトの細胞に由来する場合、前記低浸透圧液の浸透圧は、ＴＲＰＡ１に依存しない細胞の応答を抑制する観点から、好ましくは１００ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：２２７０ｈＰａ）以上、より好ましくは１４０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：３１７８ｈＰａ）以上であり、低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象をより確実に発生させ、低浸透圧刺激抑制作用の評価を容易に、かつ的確に行なう観点から、好ましくは２６０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５９０２ｈＰａ）以下、より好ましくは２４０ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５４４８ｈＰａ）以下である。

前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰチャネル）の１つであるＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、ＴＲＰＡ１アゴニストによる化学刺激、冷覚刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能；前記刺激による細胞における膜電位の調節能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ＴＲＰＡ１のアゴニストとしては、例えば、メントール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、アルカリ剤（例えば、アンモニア、モノエタノールアミン、水酸化カリウムなど）、アリルイソチオシアネート、メチルパラベン、アリシン、イシリン、過酸化水素、ブラジキニン、アクロレイン、香油成分（例えば、シトラール、オイゲノール、シンナムアルデヒドなど）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、内因性ＴＲＰＡ１を発現している内因性ＴＲＰＡ１発現細胞であってもよく、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている外因性ＴＲＰＡ１発現細胞であってもよい。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で的確に測定することができる観点から、外因性ＴＲＰＡ１発現細胞が好ましい。

前記内因性ＴＲＰＡ１発現細胞としては、例えば、感覚神経細胞、内耳細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記内因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、ヒトにおける被験物質の低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価する観点から、好ましくはヒト由来の細胞である。

前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、宿主細胞に導入された前記核酸が、染色体外要素として存在している細胞であってもよく、宿主細胞に導入された前記核酸が組み込みにより染色体に組み込まれている細胞であってもよい。

前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターなどにより宿主細胞を形質転換することにより得られる。

ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。ヒトにおける被験物質の低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価する観点から、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、好ましくはヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸である。ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。なお、ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づき作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づき設計され、合成された２種のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などにより得られる。

変異型核酸としては、例えば、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔｔｏｏｐｅｎｇａｐ１１、Ｃｏｓｔｔｏｅｘｔｅｎｄｇａｐ１、ｅｘｐｅｃｔｖａｌｕｅ１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ１１の条件（デフォルト値）下、評価対象の配列をアライメントして算出される配列相同性の値が、ＴＲＰＡ１が有する生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されない。

なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸によりコードされるポリペプチドの生理学的機能と同等またはそれ以上の生理学的機能を有するポリペプチドをコードする核酸を得る観点から、好ましくは配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸と、配列番号：１に対する配列相同性が少なくとも８０％である塩基配列からなる核酸とが特異的にハイブリダイゼーションする条件である。前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸とハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５重量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中、室温以上、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

組換えベクターは、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸を、慣用のベクターと連結させることにより得られる。前記ベクターは、調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。ベクターは、形質転換後の細胞のなかからの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞の選択が容易であることから、好ましくは選択マーカー遺伝子を有するベクターである。また、ベクターは、必要により、ＴＲＰＡ１を連結させるための部位の上流に、宿主細胞内でＴＲＰＡ１を発現させるに適した発現プロモーターを有していてもよい。ベクターとしては、例えば、大腸菌のプラスミドベクター、酵母のプラスミドベクターなどのプラスミドベクター；レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの宿主細胞のなかでは、ヒトにおける被験物質の低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価する観点から、好ましくは動物細胞である。前記動物細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などのヒト細胞；ＣＯＳ−７細胞などのサル細胞；ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などのマウス細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの動物細胞のなかでは、ヒトにおける被験物質の低浸透圧刺激抑制作用を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。

形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどにより行なうことができる。また、得られた細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞であることの確認は、例えば、細胞を、１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することにより行なうことができる。細胞が外因性ＴＲＰＡ１発現細胞である場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも大きくなる。

前記低浸透圧液は、例えば、精製水と電解質とイオン強度に関係しない浸透圧調整剤とを混合することなどによって得ることができる。

前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、被験物質の量は、被験物質の種類、ＴＲＰＡ１発現細胞の数などによって異なるので、一概には決定することができないことから、被験物質の種類、ＴＲＰＡ１発現細胞の数などに応じて適宜決定することが望ましい。

前記被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞との接触に際して、１ｃｍ^２あたりのＴＲＰＡ１発現細胞の数は、試験データの信頼性の観点から、好ましくは１×１０³細胞以上、より好ましくは１×１０^４細胞以上であり、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは１×１０⁵細胞以下、より好ましくは５×１０⁴細胞以下である。

前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象としては、例えば、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の増加などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象は、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加であることが好ましい。

前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象として、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加を用いる場合、前記低浸透圧刺激抑制作用は、例えば、被験物質の接触前後のＴＲＰＡ１発現細胞における前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウムイオン濃度の変化を調べることなどによって評価することができる。具体的には、前記低浸透圧刺激抑制作用は、
（Ａ１）前記低浸透圧液と被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記ＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度〔「カルシウムイオン濃度（Ａ）」という〕を測定するステップ、
（Ａ２）前記低浸透圧液とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記ＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度〔「カルシウムイオン濃度（Ｂ）」という〕を測定するステップ、および
（Ａ３）前記ステップ（Ａ１）で得られたカルシウムイオン濃度（Ａ）と前記ステップ（Ａ２）で得られたカルシウムイオン濃度（Ｂ）とを比較するステップ
を行なうことによって評価することができる。前記ステップ（Ａ３）において、カルシウムイオン濃度（Ｂ）と比べてカルシウムイオン濃度（Ａ）が減少している場合、当該被験物質は、低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。なお、かかる評価を行なう際には、前記低浸透圧刺激抑制作用の評価をより的確に行なう観点から、低浸透圧液に起因する感覚刺激を引き起こさない対照（陰性対照）とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させたときの前記ＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度をさらに用いてもよい。また、前記カルシウムイオン濃度（Ａ）とカルシウムイオン濃度（Ｂ）との間の差の絶対値が大きいほど、当該被験物質は、高い低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。

前記カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムイオンと特異的に結合するカルシウム指示薬をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、当該ＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオンに前記カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬を定量する方法などによって測定することができる。

前記カルシウム指示薬は、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬を簡便な操作で定量することができることから、カルシウムイオンとの結合前後の変化を光学的特性の変化などによって検出することができる試薬であることが好ましい。前記光学的特性の変化としては、例えば、蛍光強度の変化、吸光度の変化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものでない。前記カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記カルシウム指示薬のなかでは、測定が容易であり、かつＴＲＰＡ１発現細胞内に存在する夾雑物質の動態との区別化が容易である観点から、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬が好ましい。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、ＦＵＲＡ２、ＦＵＲＡ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記蛍光カルシウム指示薬は、１種類の励起波長を有していてもよく、２種類以上の励起波長を有していてもよい。前記カルシウム指示薬が前記蛍光カルシウム指示薬である場合、当該蛍光マグネシウム指示薬は、蛍光強度の測定が容易であり、しかも被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用の評価の精度をより高めることができることから、２種類の励起波長を有する蛍光マグネシウム指示薬が好ましい。

カルシウムイオン濃度の測定に際し、１種類の励起波長を有する蛍光マグネシウム指示薬を用いる場合、当該励起波長における蛍光強度に基づき、低浸透圧刺激抑制作用を評価することができる。また、カルシウムイオン濃度の測定に際し、２種類以上の励起波長を有する蛍光マグネシウム指示薬を用いる場合、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用の評価の精度をより高める観点から、当該２種類以上の励起波長から選ばれた２種類の励起波長（第１励起波長および第２励起波長）を選択し、第１励起波長および第２励起波長それぞれにおける蛍光強度から算出された蛍光強度比に基づき、低浸透圧刺激抑制作用を評価することができる。

カルシウムイオン濃度の測定に際し、例えば、２種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ２−ＡＭを用いる場合、第１励起波長における蛍光強度（以下、「第１蛍光強度」ともいう）として３４０ｎｍにおける蛍光強度および第２励起波長における蛍光強度（以下、「第２蛍光強度」ともいう）として３８０ｎｍにおける蛍光強度を用いることができる。この場合、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用は、例えば、式（ＩＩ）：

〔式中、「蛍光強度比Ａ」は式（ＩＩＩ）：

に基づいて算出された蛍光強度比、「蛍光強度比Ｂ」は式（ＩＶ）：

に基づいて算出された蛍光強度比、「蛍光強度比Ｃ」は式（Ｖ）：

に基づいて算出された蛍光強度比を示す。〕
に基づいて算出された抑制率などを用いて評価することができる。前記抑制率が５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上である場合、被験物質は、低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。また、前記抑制率が高いほど、前記被験物質は、高い低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。

前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象として、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされるＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の増加を用いる場合、前記低浸透圧刺激抑制作用は、例えば、
（Ｂ１）前記低浸透圧液と被験物質とＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記ＴＲＰＡ１発現細胞内における一定電位下での電流〔「電流（Ａ）」という〕を測定するステップ、
（Ｂ２）ＴＲＰＡ１発現細胞とＴＲＰＡ１アゴニストとを接触させ、前記ＴＲＰＡ１発現細胞内における前記（１）における電位と同じ電位下での電流〔「電流（Ｂ）」という〕を測定するステップ、および
（Ｂ３）前記ステップ（Ｂ１）で得られた電流（Ａ）と前記ステップ（Ｂ２）で得られた電流（Ｂ）とを比較するステップ
を行なうことによって評価することができる。前記ステップ（Ｂ３）において、電流（Ｂ）と比べて電流（Ａ）が小さい場合、当該被験物質は、前記低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。また、前記電流（Ａ）と電流（Ｂ）との間の差が大きいほど、当該被験物質は、高い低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価することができる。前記電流は、例えば、パッチクランプ法などによって測定することができる。

以上説明したように、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法は、眼、口などに誤って混入する可能性のある外用剤の開発などに用いられることが期待されるものである。

２．低浸透圧刺激抑制剤
本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされる感覚刺激を抑制するための低浸透圧刺激抑制剤であって、前記被験物質の評価方法により、低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価された物質（以下、「低浸透圧刺激抑制物質」ともいう）を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、前記低浸透圧刺激抑制物質を含有しているので、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧刺激を抑制することができる。

前記低浸透圧刺激抑制物質としては、例えば、ルテニウムレッド、カンファーおよびユーカリプトールなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

本発明の低浸透圧刺激抑制剤における前記低浸透圧刺激抑制物質の含有量は、低浸透圧刺激抑制物質の種類、低浸透圧刺激抑制剤の用途などによって異なるので、一概には決定することができないことから、低浸透圧刺激抑制物質の種類、低浸透圧刺激抑制剤の用途などに応じて適宜決定することが好ましい。

本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、本発明の目的が妨げられない範囲内で、例えば、水、ｐＨ調整剤、キレート化剤、安定化剤などの他の成分を含有していてもよい。なお、本発明の低浸透圧刺激抑制剤が前記成分を含有する場合、本発明の目的が妨げられない範囲で、本発明の低浸透圧刺激抑制剤中において、前記低浸透圧刺激抑制物質と前記成分とが複合体を形成していてもよい。

本発明の低浸透圧刺激抑制剤は、低浸透圧刺激抑制作用を有することから、眼、口などに誤って混入する可能性のある外用剤、低浸透圧を有する外用剤などに配合することができる。

本発明の低浸透圧刺激抑制剤を外用剤に配合する場合、外用剤の剤形は、外用剤の用途などに応じて適宜選択することができる。外用剤の剤形としては、例えば、ローション、クリーム、フォーム、乳液、ジェル、パック、粉剤、エアゾール剤、貼付剤などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記外用剤としては、例えば、ボディーローション、デオドラント化粧料（例えば、デオドラントローション、デオドラントジェル、デオドラントスプレー、デオドラントロールオン、デオドラントペーパーなど）、化粧水、乳液、スキンケアクリーム、トニック、スティック化粧料、リップ、皮膚脱色剤（ボディーブリーチング剤）、洗浄料（例えば、ボディーシャンプー、クレンジング剤、洗顔剤、固形石鹸など）、シート化粧料（例えば、拭き取り用シート、シートパック剤など）、貼付剤（例えば、パップ剤など）、髭剃り用化粧料（例えば、シェービングジェルなど）、洗髪用化粧料（例えば、シャンプー、リンスなど）、育毛剤、ヘアカラー、ヘアブリーチ、パーマ液、ヘアスタイリング剤（例えば、ヘアトニックなど）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

前記外用剤における前記低浸透圧刺激抑制剤の含有量は、前記低浸透圧刺激抑制物質の種類、外用剤の用途などによって異なることから、一概には決定することができないので、前記低浸透圧刺激抑制物質の種類、外用剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。

また、前記外用剤には、前記低浸透圧刺激抑制剤の他に、本発明の目的が妨げられない範囲で、例えば、高級アルコール、ロウ、炭化水素油、脂肪酸、油脂、エステル油、シリコーン油などの油剤；陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などの界面活性剤；多価アルコール、糖、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体などの保湿剤；増粘剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン、アミノ酸、防腐剤、水などの成分が配合されていてもよい。

以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、バスソリューションの浸透圧（イオン量換算）は、式（Ｉ）にしたがって算出された値である。

（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳＲｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）ＩＲｅｄｕｃｅｄ−ＳｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）〕２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。

また、５体積％二酸化炭素雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０^５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。

得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。

（製造例２）
塩化ナトリウム、マンニトール、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、グルコースおよび２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸緩衝液（以下、「ＨＥＰＥＳ緩衝液」ともいう）（ｐＨ７．４）を、下記組成：６０ｍＭ塩化ナトリウム、１６０ｍＭマンニトール、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液となるように混合し、細胞内液の浸透圧と同じ浸透圧を有するバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）〕を得た。

（製造例３）
製造例２において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を８０ｍＭに設定したことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が８０ｍＯｓｍ（１８１６ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：２３２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：５２６６ｈＰａ）〕を得た。

（製造例４）
製造例２において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を４０ｍＭに設定したことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が１２０ｍＯｓｍ（２７２４ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：１９２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：４３５８ｈＰａ）〕を得た。

（製造例５）
製造例２において、マンニトールの濃度を１６０ｍＭに設定する代わりに、マンニトールの濃度を０ｍＭに設定したことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、細胞内液の浸透圧との差が１６０ｍＯｓｍ（３６３２ｈＰａ）であるバスソリューション〔浸透圧（イオン量換算）：１５２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：３４５０ｈＰａ）〕を得た。

（試験例１）
（１）低浸透圧刺激と細胞面積上昇率との関係の評価
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞（５×１０^４細胞）を循環チャンバー〔ワーナーインストゥルメンツ製、商品名：ＲＣ−２６〕に入れた。その後、チャンバー中のＴＲＰＡ１発現細胞を、浸透圧（イオン量換算）：３１２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：７０８２ｈＰａ）を有する標準バスソリューション〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。洗浄後のＴＲＰＡ１発現細胞をデジタルカメラで撮影した。得られた画像と、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪ〔アメリカ国立衛生研究所のウェブページｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／にて提供〕とを用い、細胞内液と同じ浸透圧を有する浸透圧液を接触させたときの細胞の面積（以下、「細胞面積Ａ₀」ともいう）を求めた。

つぎに、洗浄後のＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、製造例２、製造例３、または製造例５で得られたバスソリューションを添加した。前記バスソリューションの添加後の細胞をデジタルカメラで撮影した。得られた画像と、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪとを用い、細胞内液よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液を接触させたときの細胞の面積（以下、「細胞面積Ａ₁」ともいう）を求めた。

つぎに、細胞面積Ａ₀および細胞面積Ａ₁を用い、式（ＶＩ）：
細胞面積上昇率
＝（細胞面積Ａ₁−細胞面積Ａ₀）／細胞面積Ａ₀ （ＶＩ）

に基づいて細胞面積上昇率を求めた。

試験例１において、細胞内液の浸透圧との差と細胞面積上昇率との関係を調べた結果を図１に示す。

図１に示された結果から、細胞内液の浸透圧との差が大きいほど、細胞面積上昇率が高いことがわかる。

（２）低浸透圧刺激とＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１活性化度との関係の評価
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を標準バスソリューション〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕にて洗浄した。つぎに、ＴＲＰＡ１発現細胞を製造例２、製造例３、製造例４または製造例５で得られたバスソリューションに曝露した。曝露後１分間経過後に、溶液Ｂ〔組成：１４０ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸および１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕を含む電極の先端を前記ＴＲＰＡ１発現細胞に接触させ、電流記録ソフトウェア〔モルキュラーデバイス社製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ１０〕と電流記録装置〔モルキュラーデバイス社製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ２００ＢＡｍｐｌｉｆｉｅｒ〕とを用い、電圧を６０ｍＶに固定したときの電流変化を測定した。

算出された開口確率（Ｐｏ）と、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の数とを用い、式（ＶＩＩ）：

ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）
＝ＴＲＰＡ１発現細胞におけるＴＲＰＡ１の数（Ｎ）×開口確率（Ｐｏ）
（ＶＩＩ）

にしたがって、ＴＲＰＡ１活性化度を求めた。

試験例１において、細胞内液の浸透圧との差とＴＲＰＡ１活性化度との関係を調べた結果を図２に示す。

図２に示された結果から、細胞内液の浸透圧との差が大きいほど、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）が大きいことがわかる。これらの結果から、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧により、ＴＲＰＡ１発現細胞のＴＲＰＡ１がより活性化されることがわかる。したがって、これらの結果から、ヒトにおいて、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によってＴＲＰＡ１の活性が増強されることにより、痛覚が引き起こされることが示唆される。また、これらの結果から、例えば、ヒトの眼に低浸透圧液が接触したときにヒトが知覚する眼刺激感は、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によってＴＲＰＡ１の活性が増強されることにより、引き起こされることが示唆される。

（３）細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１活性化度の変化との関係の評価
試験例１（１）において、製造例２、製造例３または製造例５で得られたバスソリューションを用いる代わりに、種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、細胞面積上昇率を求めた。また、試験例１（２）において、製造例２、製造例３、製造例４または製造例５で得られたバスソリューションを用いる代わりに、前記種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いたことを除き、試験例１（２）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）を求めた。つぎに、各バスソリューションを用いたときの細胞面積上昇率と、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）とを、ｘ軸が細胞面積上昇率であり、ｙ軸がＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）である２次元座標上にプロットした。

また、前記において、種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いる代わりに、１μＭＴＲＰＡ１アゴニスト（アリルイソチオシアネート）を含有し、かつ種々の浸透圧を有するバスソリューションを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、細胞面積上昇率およびＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）を求めた。つぎに、各バスソリューションを用いたときの細胞面積上昇率と、ＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）とを、ｘ軸が細胞面積上昇率であり、ｙ軸がＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）である２次元座標上にプロットした。

試験例１において、低浸透圧液に接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液に接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との関係を調べた結果を図３(Ａ)、ＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との関係を調べた結果を図３（Ｂ）に示す。図中、Ｒは相関係数を示す。

図３（Ａ）および（Ｂ）に示された結果から、低浸透圧液に接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液に接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間およびＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間の両方において、相関係数Ｒが０．５１であることがわかる。したがって、これらの結果から、低浸透圧液に接触させたときの細胞面積上昇率と低浸透圧液に接触させたときのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間には、ＴＲＰＡ１アゴニストの存在下での細胞面積上昇率とＴＲＰＡ１アゴニストの存在下でのＴＲＰＡ１活性化度（ＮＰｏ）との間の場合と同様に正の相関がみられることがわかる。これらの結果から、低浸透圧液による細胞の膨張と、細胞内カルシウム濃度の増加とが関連していることがわかる。したがって、これらの結果から、低浸透圧液によって細胞が膨張することにより、ＴＲＰＡ１の活性が増大することが示唆される。

（製造例６）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるルテニウムレッドをその濃度が１０μＭとなるように添加し、被験試料を得た。

（製造例７）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるカンファーをその濃度が５ｍＭとなるように添加し、被験試料を得た。

（製造例８）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるユーカリプトールをその濃度が５ｍＭとなるように添加し、被験試料を得た。

（製造例９）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１の活性との関連性がないグリセロールをその濃度が５ｍＭとなるように添加し、被験試料を得た。

（製造例１０）
製造例４で得られたバスソリューションに、被験物質として、ＴＲＰＡ１の活性との関連性がないマルチトールをその濃度が５ｍＭとなるように添加し、被験試料を得た。

（実施例１）
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。

得られたＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞を、標準バスソリューション〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。

つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ２−ＡＭ導入ＴＲＰＡ１発現細胞が入ったチャンバーに、製造例６、製造例７、製造例８、製造例９または製造例１０で得られた被験試料を添加した。なお、製造例６、製造例７、製造例８、製造例９または製造例１０で得られた被験試料とＴＲＰＡ１発現細胞とを含む混合物の浸透圧（イオン量換算）は１９２ｍＯｓｍ（２５℃での浸透圧：４３５８ｈＰａ）であった。

その後、チャンバーにおいて、励起波長３４０ｎｍにおけるＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度_{３４０ｎｍ}」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＴＲＰＭ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度_{３８０ｎｍ}」という）を測定した。つぎに、測定された蛍光強度_{３４０ｎｍ}および蛍光強度_{３８０ｎｍ}を用い、式（Ｖ）に基づいて蛍光強度比Ｃを求めた。また、前記において、前記被験試料の代わりに、低浸透圧液としての製造例４で得られたバスソリューションを用いたこと、および式（Ｖ）を用いる代わりに、式（ＩＩＩ）を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、蛍光強度比Ａを求めた。さらに、前記において、前記被験試料を用いる代わりに、対照としての標準バスソリューションを用いたこと、および式（Ｖ）を用いる代わりに、式（ＩＶ）を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、蛍光強度比Ｂを求めた。前記蛍光強度比Ａ〜Ｃを用い、式（ＩＩ）に基づいて、抑制率を求めた。

実施例１において、各被験試料と抑制率との関係を調べた結果を図４に示す。図中、レーン１は製造例６で得られた被験試料を用いたときの抑制率、レーン２は製造例７で得られた被験試料を用いたときの抑制率、レーン３は製造例８で得られた被験試料を用いたときの抑制率、レーン４は製造例９で得られた被験試料を用いたときの抑制率、レーン５は製造例１０で得られた被験試料を用いたときの抑制率を示す。

図４に示された結果から、ＴＲＰＡ１の活性を抑制するアンタゴニストであるルテニウムレッドを含有する被験試料（レーン１）、カンファーを含有する被験試料（レーン２）、ユーカリプトールを含有する被験試料（レーン３）を用いたときの抑制率は、３０％以上であることがわかる。これらの結果から、ルテニウムレッド、カンファーおよびユーカリプトールは、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされるＴＲＰＡ１を介する細胞内カルシウム濃度の増加を抑制することがわかる。したがって、ルテニウムレッド、カンファーおよびユーカリプトールは、低浸透圧刺激抑制作用を有することがわかる。

これに対し、ＴＲＰＡ１の活性とは関係がない物質であるグリセロールを含有する被験試料（レーン４）およびマルチトールを含有する被験試料（レーン５）を用いたときの抑制率は、１０％未満であることがわかる。これらの結果から、グリセロールおよびマルチトールは、細胞内液の浸透圧よりも低い低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる細胞内カルシウム濃度の増加を抑制しないことがわかる。したがって、グリセロールおよびマルチトールは、低浸透圧刺激抑制作用を有しないことがわかる。

したがって、以上の結果から、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と、被験物質と、ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、ＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する方法は、被験者を用いなくてもよいことから、評価結果にバラつきが生じやすい被験者に評価させる方法と比べ、被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を再現性よく的確に評価することができることがわかる。

また、前記において、低浸透圧刺激抑制作用を有すると判定された被験物質は、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液による刺激を抑制するので、細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液によって引き起こされる痛みを抑制する低浸透圧刺激抑制剤の有効成分として有用であることが示唆される。

Claims

被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価する被験物質の評価方法であって、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液と前記被験物質と前記ＴＲＰＡ１発現細胞とを接触させ、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が有する低浸透圧刺激抑制作用を評価することを特徴とする被験物質の評価方法。
前記低浸透圧液が、前記細胞内液の浸透圧よりも４０〜２００ｍＯｓｍ低い浸透圧を有する請求項１に記載の方法。
前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象が、前記低浸透圧液によってＴＲＰＡ１を介して引き起こされる前記ＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加である請求項１または２に記載の方法。
細胞内液の浸透圧よりも低い浸透圧を有する低浸透圧液とＴＲＰＡ１発現細胞との接触によって引き起こされる感覚刺激を抑制するための低浸透圧刺激抑制剤であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の被験物質の評価方法により、低浸透圧刺激抑制作用を有すると評価された物質としてカンファーまたはユーカリプトールを有効成分として含有することを特徴とする低浸透圧刺激抑制剤。