JP6061448B2

JP6061448B2 - 被験物質の評価方法

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Publication number: JP6061448B2
Application number: JP2011053275A
Authority: JP
Inventors: 郁尚藤田; 雅之高石
Original assignee: Mandom Corp
Current assignee: Mandom Corp
Priority date: 2011-03-10
Filing date: 2011-03-10
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2031-03-10
Also published as: JP2012187043A

Description

本発明は、被験物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、香料および／または香油を含有する外用剤の開発に有用な被験物質の評価方法に関する。

化粧料などの外用剤には、その原料のにおいをマスキングしたり、嗅覚を介して使用者に心地よい感覚を与えたりするために、香料や香油が配合されている。

しかしながら、使用者によっては、香料や香油が配合された外用剤が皮膚に接触したとき、不快な刺激を感じることがある。近年、使用者の安全意識の高まりから、不快な刺激を与えないか、または不快な刺激が少ない外用剤が好まれる傾向にある。

ところで、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）は、痛みを惹起する因子を受容する受容体として機能することが知られている。例えば、ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度の変化が、パラベン類やアルカリ剤が配合された皮膚外用剤を用いたときに引き起こされる不快な刺激と関連していることが、本発明者らによって見出されている。また、前記パラベン類やアルカリ剤による刺激と前記ＴＲＰＡ１を介した細胞内カルシウムイオン濃度との関連性を利用して、パラベン類やアルカリ剤による刺激を抑制する物質を評価することが提案されている（例えば、特許文献１および２参照）。

しかしながら、本発明者らは、現時点では、香料や香油が配合された外用剤が皮膚に接触したときに生じる不快な刺激とＴＲＰＡ１との関連性や、前記関連性を利用して、前記香料や香油による刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。

特開２００８−７９５２８号公報特開２００９−８２０５３号公報

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、香料および／または香油による刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価することができる被験物質の評価方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は、
（１）香料および／または香油と被験物質とをＴＲＰＡ１発現細胞に接触させ、前記香料および／または香油によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が香料および／または香油による刺激を抑制する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法、
（２）前記生理学的事象が、前記香料および／または香油の存在下における前記被験物質との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記（１）に記載の評価方法、
（３）前記香料が、カルボン、メントン、シトロネラール、シトラール、リナロール、テルピネオールおよびオイゲノールからなる群より選ばれた少なくとも１種である前記（１）または（２）に記載の評価方法、ならびに
（４）前記香油が、スペアミント油、タイム油、チョウジ油、ラベンダー油、セージ油およびローマカミツレ油からなる群より選ばれた少なくとも１種である前記（１）または（２）に記載の評価方法
に関する。

本発明の被験物質の評価方法は、香料および／または香油による刺激を抑制する物質を簡便な操作で評価することができるという優れた効果を奏する。

実施例１において、試料と抑制率との関係を調べた結果を示すグラフである。実施例２において、試料と抑制率との関係を調べた結果を示すグラフである。

本発明の被験物質の評価方法は、香料および／または香油と被験物質とをＴＲＰＡ１発現細胞に接触させ、前記香料および／または香油によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が香料および／または香油による刺激を抑制する物質であるかどうかを評価することを特徴とする。

本発明の被験物質の評価方法には、香料および／または香油によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定する点に１つの大きな特徴がある。本発明の被験物質の評価方法によれば、前記生理学的事象を測定するので、ヒト、実験動物などを用いる場合と比べて、簡便な操作で、被験物質が香料および／または香油による刺激を抑制する物質であるかどうかを評価することができる。さらに、前記生理学的事象は、同一条件下に同時に何回も並行して測定することができるので、本発明の被験物質の評価方法によれば、迅速かつ高い処理効率で多種類の被験物質を評価することができる。

前記香料としては、例えば、カルボン、メントン、シトロネラール、シトラール、リナロール、テルピネオール、オイゲノール、ゲラニルニトリル、レモニール、シス−３−ヘキセノール、マグノール、フルクトン、フルイテート、ポイレネート、ボルネオール、メチルサリチレート、アネトール、エストラゴール、サイモール、メチルオイゲノール、フェニルエチルアルコール、ゲラニオール、シトロネロール、ネロール、ベンジルアセテート、ベンジルプロピオネート、ヘディオン、ハイドロキシシトロネラール、リリアール、p-クレゾール、サンタロール、チンチロール、クマリン、ヘリオトロピン、バニリン、マルトール、インドール、スカトールなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記香料のなかでは、アロマテラピーなどに利用され、汎用性が高く、ヒトの皮膚に対する負荷が低いことから、カルボン、メントン、シトロネラール、シトラール、リナロール、テルピネオールおよびオイゲノールからなる群より選ばれた少なくとも１種が好ましい。

前記香油としては、例えば、スペアミント油、タイム油、チョウジ油、ラベンダー油、セージ油、ローマカミツレ油、イランイラン油、グレープフルーツ油、ジャスミン油、ジンジャー油、オレンジ油、バジル油、ヒノキ油、ベルガモット油、メリッサ油、ゆず油、ライム油、レモン油、ローズマリー油などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記香油のなかでは、アロマテラピーなどに利用され、汎用性が高く、ヒトの皮膚に対する負荷が低いことから、スペアミント油、タイム油、チョウジ油、ラベンダー油、セージ油およびローマカミツレ油からなる群より選ばれた少なくとも１種である。

前記被験物質としては、特に限定されないが、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物などが挙げられる。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒は、前記生理学的事象の測定に影響を与えない溶媒であることが好ましい。前記溶媒としては、例えば、生理的食塩水、水などが挙げられる。

前記ＴＲＰＡ１発現細胞は、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を発現する細胞である。前記ＴＲＰＡ１の生理学的機能としては、例えば、マスタード、シナモアルデヒド、アリルイソチオシアネート、カルバクロール、アリシンなどによる化学刺激、冷覚刺激（例えば、１７℃前後での刺激）、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられる。

前記ＴＲＰＡ１発現細胞としては、内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞などが挙げられる。前記内因性ＴＲＰＡ１を発現している野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経の細胞、内耳の細胞などが挙げられる。前記ＴＲＰＡ１発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＡ１発現細胞」ともいう）が好ましい。前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、染色体外要素として前記核酸が存在している細胞であってもよく、前記核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。

前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を保持する組換えベクターにより宿主細胞を形質転換することによって得られる。

前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＡ１をコードする核酸であってもよい。

前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ヒトに適用する被験物質を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＡ１の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１個または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。

ＴＲＰＡ１をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔｔｏｏｐｅｎｇａｐ１１、Ｃｏｓｔｔｏｅｘｔｅｎｄｇａｐ１、ｅｘｐｅｃｔｖａｌｕｅ１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ１１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、ＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられる。

なお、本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸と前記相補鎖核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。

前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。

前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。これらのなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＡ１の生理学的機能を十分に再現する観点から、動物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられる。ヒト細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。サル細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。前記宿主細胞のなかでは、取扱いが容易である観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＡ１の活性化を容易にかつ選択的に測定することができる観点から、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。

前記組換えベクターは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。前記ベクターは、その調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＡ１を効率よく発現させることができるベクターであればよい。前記ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択する観点から、選択マーカー遺伝子を有するベクターであることが好ましい。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、前記外因性ＴＲＰＡ１発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。

前記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールドスプリングハーバープレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などの記載に準じて行なうことができる。形質転換後の細胞からの外因性ＴＲＰＡ１発現細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどによって行なうことができる。

得られた細胞が、ＴＲＰＡ１を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１〜１０ｍＭパラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＡ１を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、パラオキシ安息香酸メチルエステルと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。

香料および／または香油および被験物質と、ＴＲＰＡ１発現細胞との接触は、例えば、各細胞の培養に適した培地中で、香料および／または香油および被験物質と、ＴＲＰＡ１発現細胞とをインキュベーションすることなどによって行なわれる。

前記培地としては、ＴＲＰＡ１発現細胞が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど〕を含む培地であればよい。前記培地は、一般に用いられる基本培地に前記成分を補って用いてもよく、市販されている培地をそのまま用いてもよい。基本培地としては、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などが挙げられる。かかる培地は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、用いられる細胞がＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、培地として、１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。

被験物質に接触させるＴＲＰＡ１発現細胞の量は、試験データの信頼性の観点から、被験物質１００μＬあたり、１×１０¹細胞以上が好ましく、１×１０²細胞以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０^２細胞以下が好ましく、２×１０^２細胞以下がより好ましい。

前記ＴＲＰＡ１発現細胞に接触させる香料および／または香油の量は、香料および／または香油の種類によって異なるため、一概に決定することができないことから、香料および／または香油の種類に応じて適宜設定することができる。

前記ＴＲＰＡ１発現細胞に接触させる被験物質の量は、被験物質の種類によって異なるため、一概に決定することができないことから、被験物質の種類に応じて適宜設定することができる。

なお、ＴＲＰＡ１発現細胞は、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持するために、必要に応じて、ＴＲＰＡ１発現細胞を、当該ＴＲＰＡ１発現細胞に適した条件下で、予めインキュベーションしておいてもよい。

前記インキュベーションは、用いられる細胞の種類に応じた方法によって行なうことができる。かかる方法としては、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などが挙げられる。また、インキュベーション温度、インキュベーション時間、二酸化炭素濃度などの条件は、用いられる細胞に応じて適宜設定される。例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞として、ＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞を用いる場合、かかる細胞は、前記生理学的事象を測定するのに適した状態に細胞を維持する観点から、通常、５体積％二酸化炭素を含む雰囲気中で、好ましくは３６〜３８℃、より好ましくは３６．５〜３７．５℃でインキュベーションすればよい。

前記生理学的事象としては、香料および／または香油の存在下における被験物質の接触前後の一定電位下での電流の変化、香料および／または香油の存在下における被験物質の接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化、これらの組み合わせなどが挙げられる。本発明においては、簡便な操作で、かつ高感度で測定することができる観点から、前記生理学的事象は、香料および／または香油の存在下における被験物質の接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化であることが好ましい。

前記一定の電位での電流の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。

細胞内カルシウムイオン濃度は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＡ１発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などを用いて算出することができる。この場合、香料および／または香油の存在下における被験物質との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、香料および／または香油と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度に対する香料および／または香油と被験物質と接触させたときの細胞内カルシウムイオン濃度の変化〔すなわち、香料および／または香油による細胞内カルシウムイオン濃度の増加に対する被験物質による抑制率〕を求めることによって調べることができる。

前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンと結合した当該蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ２、ＦＵＲＡ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられる。

なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。例えば、蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ２−ＡＭの励起波長は、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍである。この場合、前記抑制率は、式（Ｉ）：

〔式中、Δ蛍光強度比_Aは、式（ＩＩ）:

を示し、Δ蛍光強度比_Bは、式（ＩＩＩ）:

を示す〕
に基づいて求めることができる。なお、本明細書において、「蛍光強度_340nm」はＴＲＰＡ１発現細胞に導入され、かつ細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく励起波長３４０ｎｍにおける蛍光の強度を示し、「蛍光強度_380nm」はＴＲＰＡ１発現細胞に導入されたＦＵＲＡ２−ＡＭに基づく励起波長３８０ｎｍにおける蛍光の強度を示す。

以上説明したように、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記香料および／または香油によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象により、被験物質が香料および／または香油による刺激を抑制する物質であるかどうかを評価することができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法は、香料および／または香油を含有する外用剤の開発などに利用することができる。

つぎに、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。

（製造例１）
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）に示される塩基配列の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳＲｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μｌと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）ＩＲｅｄｕｃｅｄ−ＳｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。

また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０^５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。

得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。

（試験例１）
製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入細胞を得た。

得られたＦＵＲＡ２−ＡＭ導入細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ２−ＡＭ導入細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。

つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ２−ＡＭ導入細胞が入ったチャンバーに１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを入れ、ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入細胞と１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａとを混合した。

その後、チャンバーにおいて、蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmを測定した。

測定された蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmから、蛍光強度比_{メントール}を算出した。前記蛍光強度比_{メントール}は、式（ＩＶ）：

に基づいて算出した。

また、前記１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａの代わりに溶媒Ａを用いたことを除き、前記１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いた場合と同様にして蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmを測定した。

測定された蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmから、蛍光強度比_溶媒Ａを算出した。前記蛍光強度比_溶媒Ａは、式（Ｖ）：

に基づいて算出した。

その結果、蛍光強度比_{メントール}は、１．８０であった。また、蛍光強度比_溶媒Ａは、０．８７であった。これらの結果から、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いた場合、溶媒Ａを用いた場合と比べて、ＴＲＰＡ１発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度が増加していることがわかる。

ＴＲＰＡ１の活性化は、パラベン類やアルコールによる不快な刺激と関連していると考えられている。したがって、以上の結果から、ＴＲＰＡ１がメントールによっても活性化されるので、メントールにより皮膚に与えられる感覚のうちの不快な刺激は、ＴＲＰＡ１の活性化によって引き起こされていることが示唆される。

（試験例２）
試験例１において、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａの代わりに被験物質を含有する被験試料を用いたことを除き、試験例１と同様に操作を行ない、蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmを測定した。なお、被験物質として香料であるカルボン、メントン、シトロネラール、シトラール、リナロール、テルピネオールまたはオイゲノールを用いた。被験試料は、１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ、１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａまたは１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａである。

測定された蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmから、Δ蛍光強度比_aを算出した。前記Δ蛍光強度比_aは、式（ＶＩ）：

に基づいて算出した。なお、前記対照は、溶媒Ａである。

また、前記被験試料の代わりにＴＲＰＡ１のアゴニストを用いたことを除き、前記被験試料を用いた場合と同様にして蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmを測定した。なお、前記アゴニストとして１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いた。

測定された蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmから、Δ蛍光強度比_bを算出した。前記Δ蛍光強度比_bは、式（ＶＩＩ）：

に基づいて算出した。

算出されたΔ蛍光強度比_aとΔ蛍光強度比_bとから、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比_a／Δ蛍光強度比_bを算出した。

その結果、１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａ（試料番号１）、１ｍＭメントンを含有する溶媒Ａ（試料番号２）、１ｍＭシトロネラールを含有する溶媒Ａ（試料番号３）、１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａ（試料番号４）、１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａ（試料番号５）、１ｍＭテルピネオールを含有する溶媒Ａ（試料番号６）および１ｍＭオイゲノールを含有する溶媒Ａ（試料番号７）それぞれを用いた場合、Δ蛍光強度比_a／Δ蛍光強度比_b が０を超えていた。これらの結果から、カルボン、メントン、シトロネラール、シトラール、リナロール、テルピネオール、オイゲノールなどの香料は、メントールと同様に、ＴＲＰＡ１を活性化することがわかる。したがって、香料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、香油による刺激を抑制する物質を評価することができることが示唆される。

（試験例３）
試験例２において、被験物質として香油であるスペアミント油、タイム油、クローブ油、ラベンダー油、セージ油またはローマカミツレ油を用いたことを除き、試験例２と同様に操作を行ない、ＴＲＰＡ１発現細胞におけるΔ蛍光強度比_a／Δ蛍光強度比_bを算出した。なお、被験試料は、０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）、０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号２）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号３）、０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）、０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）または０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａ（試料番号６）である。

その結果、０．０１体積％スペアミント油を含有する溶媒Ａ（試料番号１）、０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａ（試料番号２）、０．０１体積％クローブ油を含有する溶媒Ａ（試料番号３）、０．０１体積％ラベンダー油を含有する溶媒Ａ（試料番号４）、０．０１体積％セージ油を含有する溶媒Ａ（試料番号５）および０．０１体積％ローマカミツレ油を含有する溶媒Ａ（試料番号６）それぞれを用いた場合、Δ蛍光強度比_a／Δ蛍光強度比_bが０を超えていた。これらの結果から、スペアミント油、タイム油、クローブ油、ラベンダー油、セージ油、ローマカミツレ油などの香油は、メントールと同様に、ＴＲＰＡ１を活性化することがわかる。したがって、香油によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、香油による刺激を抑制する物質を評価することができることが示唆される。

（実施例１）
試験例１において、被験試料の代わりに１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａと被験物質との混合物を用いたことを除き、試験例２と同様に操作を行ない、蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmを測定した。被験物質としてルテニウムレッド〔シグマアルドリッチジャパン（株）製、カンファー〔シグマアルドリッチジャパン（株）製〕、グリセロールまたは１，３−ブチレングリコールを用いた。各混合物中における被験物質の濃度は、それぞれ、ルテニウムレッドが１０μＭ、カンファーが５ｍＭ、グリセロールが１ｍＭ、１，３−ブチレングリコールが１ｍＭである。前記ルテニウムレッドは、ＴＲＰチャネルに対する既知のアンタゴニストである。また、カンファーは、ＴＲＰＡ１に対してブロッカーとして作用する。なお、１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａと被験物質との混合物の代わりに対照である溶媒Ａを用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmを測定した。測定された蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmから、式（Ｉ）にしたがってΔ蛍光強度比_Ａを算出した。

また、前記被験試料の代わりに１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａを用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmを測定した。測定された蛍光強度_340nmおよび蛍光強度_380nmから、式（ＩＩ）にしたがってΔ蛍光強度比_Ｂを算出した。

算出されたΔ蛍光強度比_ＡおよびΔ蛍光強度比_Ｂを用い、シトラールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する被験物質による抑制率を、式（ＩＩＩ）に基づき算出した。実施例１において、試料と抑制率との関係を示すグラフを図１に示す。

図１において、試料番号１はルテニウムレッドを用いた場合の抑制率、試料番号２はカンファーを用いた場合の抑制率、試料番号３はグリセロールを用いた場合の抑制率、試料番号４は１，３−ブチレングリコールを用いた場合の抑制率を示す。

図１に示された結果から、ルテニウムレッドを用いた場合の抑制率（試料番号１）およびカンファーを用いた場合の抑制率（試料番号２）は、それぞれ６９．８％および７３．９％であることがわかる。これに対し、グリセロールを用いた場合の抑制率（試料番号３）および１，３−ブチレングリコールを用いた場合の抑制率（試料番号４）は、それぞれ５．８％および１．６％であることがわかる。これらの結果から、ルテニウムレッドおよびカンファーは、グリセロールおよび１，３−ブチレングリコールと比べて、香料であるシトラールによるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加を強く抑制することがわかる。したがって、香料によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、香料による刺激を抑制する物質を評価することができることが示唆される。

（実施例２）
実施例１において、１ｍＭシトラールを含有する溶媒Ａの代わりに０．０１体積％タイム油を含有する溶媒Ａを用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、Δ蛍光強度比_ＡおよびΔ蛍光強度比_Ｂを算出した。

算出されたΔ蛍光強度比_ＡおよびΔ蛍光強度比_Ｂを用い、タイム油によるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加に対する被験物質による抑制率を、式（ＩＩＩ）に基づき算出した。実施例２において、試料と抑制率との関係を示すグラフを図２に示す。

図２において、試料番号１はルテニウムレッドを用いた場合の抑制率、試料番号２はカンファーを用いた場合の抑制率、試料番号３はグリセロールを用いた場合の抑制率、試料番号４は１，３−ブチレングリコールを用いた場合の抑制率を示す。

図２に示された結果から、ルテニウムレッドを用いた場合の抑制率（試料番号１）およびカンファーを用いた場合の抑制率（試料番号２）は、それぞれ９２．４％および８１．５％であることがわかる。これに対し、グリセロールを用いた場合の抑制率（試料番号３）および１，３−ブチレングリコールを用いた場合の抑制率（試料番号４）は、それぞれ３．１％および４．１％であることがわかる。これらの結果から、ルテニウムレッドおよびカンファーは、グリセロールおよび１，３−ブチレングリコールと比べて、香油であるタイム油によるＴＲＰＡ１発現細胞内のカルシウムイオン濃度の増加を強く抑制することがわかる。したがって、香油によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、香油による刺激を抑制する物質を評価することができることが示唆される。

以上の結果から、香料および／または香油によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することにより、香料および／または香油による刺激を抑制する物質を評価することができることが示唆される。

Claims

被験物質が香料および／または香油により皮膚に与えられる不快な刺激を抑制する物質であるかどうかを評価する方法であって、メントン、シトロネラールおよびテルピネオールからなる群より選ばれた少なくとも１種の香料および／またはラベンダー油、セージ油およびローマカミツレ油からなる群より選ばれた少なくとも１種の香油と被験物質とをＴＲＰＡ１発現細胞に接触させ、前記被験物質によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、前記生理学的事象に基づき、前記被験物質が前記香料および／または前記香油により皮膚に与えられる不快な刺激を抑制する物質であるかどうかを評価する被験物質の評価方法。
前記生理学的事象が、前記香料および／または香油の存在下における前記被験物質との接触前後の細胞内カルシウムイオン濃度の変化である請求項１に記載の評価方法。