JP5229777B2

JP5229777B2 - 評価方法

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Publication number: JP5229777B2
Application number: JP2007254938A
Authority: JP
Inventors: 郁尚藤田; 秀作山; 文裕岡田; 義雄辻野; 真琴富永
Original assignee: Mandom Corp; Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Current assignee: Mandom Corp; Inter University Research Institute Corp National Institute of Natural Sciences
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: JP2009082053A

Description

本発明は、評価方法に関する。詳しくは、本発明は、アルカリ剤の刺激を抑制する物質の評価方法に関する。

皮膚に対して用いられる外用剤は、当該外用剤に含まれる有効成分の特性によっては、その機能を発現させるために、当該外用剤をアルカリ性の状態（ｐＨ７を超えるｐＨ）に維持する必要がある場合がある。前記外用剤のなかでも、石鹸、洗顔料、酸化染毛剤、体毛脱色剤、パーマ剤などに用いられる外用剤の場合、機能を十分に発現させるために、当該外用剤は、アルカリ性の状態に維持されている。特に、前記酸化染毛剤及び前記体毛脱色剤の場合、機能を十分に発現させるに適したｐＨは、毛髪、皮膚などのメラニンを加水分解する程の高いｐＨ（強いアルカリ性）となっている。このような外用剤には、アルカリ性の状態を維持するために、アルカリ剤が配合されている。

しかしながら、アルカリ剤が配合された外用剤を使用したときに、まれに、当該アルカリ剤によって、使用者が、不快感を伴う一過性の刺激感を引き起こす場合がある。また、消費者における昨今の安全性志向の高まりから、高い機能を有していても、前記刺激感などを引き起こす外用剤は、使用が避けられる傾向がある。

そこで、前記アルカリ剤が配合された外用剤に対して、例えば、パーマ剤については、チオール化合物又はその塩を配合することにより、皮膚における前記刺激感などの発生を抑制すること（特許文献１を参照）、酸化染毛剤については、アニオン性界面活性剤（特許文献２を参照）、サンショウ抽出物（特許文献３を参照）又はフィチン酸を配合すること（特許文献４を参照）などにより、皮膚における前記刺激感などの発生を抑制することが試みられている。

しかしながら、前記特許文献１〜４に記載の発明では、使用者によっては、アルカリ剤による皮膚に対する刺激感の発生を抑制できない場合があり、十分とはいえないのが現状である。

一方、生体内における刺激の伝達メカニズムには、例えば、イオンチャネル型ＡＴＰ受容体（Ｐ２Ｘ受容体）、温度受容体としても機能している一過性受容体電位チャネル（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｃｈａｎｎｅｌ）などが刺激受容体として関与することが知られている。これらの中で、ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１は、シナモンに含まれる成分であるシンナムアルデヒド、マスタードに含まれる成分であるアリルイソチオシアネート、ニンニクに含まれる成分であるアリシン、及びブラジキニンのそれぞれにより活性化されること及び機械刺激感受性であることが知られている（非特許文献１を参照のこと）。また、前記ＴＲＰＡ１は、冷刺激による痛みに関与することが報告されている（非特許文献２）

しかしながら、前記ＴＲＰＡ１は、前記非特許文献２のように、冷刺激による痛みに関与することが報告されている一方で、冷刺激により活性化しないという報告もある。このように、刺激の伝達メカニズムは、未だ不明な部分が多いのが現状である。
特開平５−３９２１１号公報特開２００４−３３９１７９号公報特表２００６−２５６９８１号公報特開２００７−３９３５１号公報日本薬理学雑誌（ＦｏｌｉａＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）、第１２４巻、第２１９頁−第２２７頁、２００４年、社団法人日本薬理学会発行ザジャーナルオブクリニカルインベスティゲーション（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌＯｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、第１１５巻、第２３９３頁−第２４０１頁、２００５年、アメリカンソサエティーフォアクリニカルインベスティゲーション（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）発行

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、アルカリ剤の刺激を抑制する物質を簡便にスクリーニングすること及びアルカリ剤の刺激に対する抑制効果を簡便に評価することの少なくとも１つを達成することができる、アルカリ剤の刺激を抑制する物質の評価方法を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕被験物質と、アルカリ剤と、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とを接触させ、前記アルカリ剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする、アルカリ剤の刺激を抑制する物質の評価方法、
〔２〕前記生理学的事象が、細胞内カルシウムイオン濃度の変化である前記〔１〕記載の評価方法、
〔３〕前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞である前記〔１〕又は〔２〕記載の評価方法、並びに
〔４〕前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞からなる群より選ばれた細胞である前記〔３〕記載の評価方法、
に関する。

本発明のアルカリ剤の刺激を抑制する物質の評価方法によれば、アルカリ剤の刺激を抑制する物質を簡便にスクリーニングすること及びアルカリ剤の刺激に対する抑制効果を簡便に評価することの少なくとも１つを達成することができるという優れた効果を奏する。

本発明のアルカリ剤の刺激を抑制する物質の評価方法は、被験物質と、アルカリ剤と、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とを接触させ、前記アルカリ剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする方法である。

本発明の評価方法では、ＴＲＰＡ１を発現する細胞が用いられているため、アルカリ剤による皮膚などへの刺激を、前記アルカリ剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象として簡便に評価することができるという優れた効果を奏する。

また、本発明の評価方法では、被験物質と、アルカリ剤と、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とを接触させるため、当該アルカリ剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を指標として、アルカリ剤の刺激を抑制する物質を簡便にスクリーニングすることができるとともに、アルカリ剤の刺激に対する被験物質の抑制効果を簡便に評価することができる。

なお、前記ＴＲＰＡ１は、一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰチャネル）の１つである。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列は、配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７３３２）に示される。また、前記ＴＲＰＡ１のアミノ酸配列は、配列番号：２に示される。

本発明の評価方法において、前記被験物質と、アルカリ剤と、ＴＲＰＡ１を発現する細胞との接触は、例えば、ＴＲＰＡ１を発現する細胞の培養物に、種々の濃度の被験物質と種々の濃度のアルカリ剤とを添加すること、ＴＲＰＡ１を発現する細胞を、種々の濃度の被験物質と種々の濃度のアルカリ剤とを含む培地で培養することなどにより行なわれる。

前記被験物質としては、特に限定されないが、例えば、無機化合物、低分子有機化合物、高分子有機化合物、植物抽出物、微生物培養物、微生物抽出物、ペプチド、核酸などが挙げられる。

本明細書において、前記アルカリ剤とは、例えば、石鹸、洗顔料、酸化染毛剤、体毛脱色剤、パーマ剤などに用いられる外用剤に通常配合することができるアルカリ性物質、アルカリ性緩衝液を含む溶液（アルカリ性溶液）などをいう。前記アルカリ剤としては、特に限定されないが、例えば、アンモニア、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ｐＨ８〜１１のトリス塩酸緩衝液を含む溶液（アルカリ性溶液）などが挙げられる。

前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞は、ＴＲＰＡ１を本質的に発現する野生型の細胞であってもよく、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞であってもよい。

本発明の評価方法において、ＴＲＰＡ１を本質的に発現する野生型の細胞を用いる場合、アルカリ剤の刺激に対する被験物質の抑制効果をより確実に評価する観点から、被験物質非存在下において、アルカリ剤単独によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を比較対照として用いることが望ましい。前記ＴＲＰＡ１を本質的に発現する野生型の細胞としては、特に限定されないが、例えば、感覚神経細胞などが挙げられる。

本明細書において、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞とは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が、染色体外要素として前記核酸が複製可能となるように導入されている細胞、又は前記核酸が、染色体組み込みにより当該核酸が複製可能となるように導入されている細胞をいう。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞は、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸と、用いられる宿主細胞におけるＴＲＰＡ１の発現に適したベクターとを連結させることにより得られたＴＲＰＡ１発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得ることができる。宿主細胞へのＴＲＰＡ１をコードする核酸の導入は、例えば、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールドスプリングハーバープレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などに記載された形質転換、トランスフェクションなどの方法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、ウイルスを利用した方法などに準じて行なうことができる。

前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、ＴＲＰＡ１をコードする核酸に対応する既知の塩基配列の情報、例えば、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸に対応する既知の塩基配列の情報〔ジャクマー（Ｊａｑｕｅｍａｒ，Ｄ．）ら、ザジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７４巻、第１１号、第７３２５頁〜第７３３３頁、１９９９年発行〕などに基づき、前記塩基配列から作製した適切なプライマー対を用いたＰＣＲ法及び／又は前記塩基配列から作製した適切なプローブとｃＤＮＡライブラリーとを用いたハイブリダイゼーション法などにより得ることができる。なお、ヒトＴＲＰＡ１をコードする核酸の塩基配列は、配列表の配列番号：１に示される配列である。

前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸は、細胞への導入後に、前記核酸によりコードされるポリペプチドが、刺激受容体としての機能を発現するのであれば、前記核酸に含まれるＴＲＰＡ１遺伝子の構造遺伝子の塩基配列の内部又は末端の一部に、少なくとも１個、例えば、１個又は数個のヌクレオチド残基の挿入、置換又は欠失を有していてもよい。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸の誘導体などが挙げられる。前記配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸の誘導体としては、例えば、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブページ〔アドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／〕にて利用できるＮＣＢＩＢＬＡＳＴにより、Ｃｏｓｔｔｏｏｐｅｎｇａｐ１１、Ｃｏｓｔｔｏｅｘｔｅｎｄｇａｐ１、ｅｘｐｅｃｔｖａｌｕｅ１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ１１の条件（デフォルト値）下、評価対象の配列をアライメントし、算出される値として、少なくとも６０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上の配列相同性を有する塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、少なくとも１個、好ましくは、１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を少なくとも発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される塩基配列に完全に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
などが挙げられる。前記核酸は、ヒト由来の核酸であってもよく、他の動物に由来する核酸であってもよい。

前記ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５重量％ＳＤＳと５×デンハルト溶液と１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡと５０体積％ホルムアミドとを含む溶液中、室温、よりストリンジェントな条件では、４２℃以上、一層ストリンジェントな条件では、６０℃以上の温度条件で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件では、０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、４２℃以上、よりストリンジェントな条件では、６０℃以上の温度条件下での洗浄を行なう条件などが挙げられる。本明細書においては、前記ストリンジェントな条件は、好ましくは、配列番号：１との配列相同性が、少なくとも６５％である塩基配列からなる核酸との特異的なハイブリダイゼーションが達成される条件であることが望ましい。

前記ＴＲＰＡ１発現ベクターは、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸と、用いられる宿主細胞におけるＴＲＰＡ１の発現に適したベクターとを連結させることにより得られる。前記ベクターは、調製が容易であり、用いられる宿主細胞に効率よく導入でき、当該宿主細胞においてＴＲＰＡ１を発現させることができるベクターであればよく、好ましくは、大腸菌のプラスミド、酵母のプラスミド、レトロウイルスベクターなどの動物ウイルスベクターが望ましい。

また、前記宿主細胞としては、前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、細菌の細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられ、より具体的には、大腸菌細胞、酵母細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。なかでも、ヒトの組織などにおいて、アルカリ剤の刺激に対する抑制効果を十分に発現する物質を効率よくスクリーニングする観点及びよりヒトへの適用を反映させて、被験物質によるアルカリ剤の刺激に対する抑制効果を簡便に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。

本発明の評価方法に用いることができる前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞は、例えば、当該細胞におけるＴＲＰＡ１の機能の発現、タンパク質レベルでの発現、蛍光物質の導入などを指標として、選択することができる。前記ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞の選択には、適切な選択培地などを用いることができる。

前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞の培養に用いられる培地としては、当該ＴＲＰＡ１を発現する細胞が生育するのに適した成分、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質）、血清（例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳなど）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどを成分とする培地であればよい。前記培地は、市販されている培地であってもよい。前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞の培養に用いられる培地としては、かかる細胞に適した培地であればよく、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などが挙げられる。例えば、用いられる宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である場合、１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。

本発明の評価方法において、用いられる細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞であって、ＴＲＰＡ１の一過性発現を行なう細胞である場合には、アルカリ剤により引き起こされるＴＲＰＡ１を介する生理学的事象を十分に評価する観点から、好ましくは、ＴＲＰＡ１をコードする核酸を導入した後２４時間〜４８時間に、当該生理学的事象を測定することが望ましい。

また、本発明の評価方法では、前記ＴＲＰＡ１は、前記（Ａ）〜（Ｃ）の核酸によりコードされるポリペプチドであってもよい。前記ポリペプチドは、ＰＣＲ法などによる部位特異的変異導入法などにより人為的に配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に変異を導入することにより作製された核酸によりコードされるポリペプチドであってもよく、天然に存在するポリペプチドであってもよい。

前記アルカリ剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象としては、特に限定されないが、例えば、細胞内カルシウムイオン濃度の変化、ＴＲＰＡ１を介する電位の変化、これらの組み合わせなどが挙げられる。

本発明の評価方法では、生理学的事象を、より簡便に、定量的に測定できる観点から、前記アルカリ剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象は、細胞内カルシウムイオン濃度の変化であることが好ましい。ＴＲＰＡ１を発現する細胞に対してアルカリ剤を接触させると、ＴＲＰＡ１を介して細胞内へのカルシウムイオンの流入が発生する。本発明の評価方法では、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とアルカリ剤とを接触させることにより発生する細胞内へのカルシウムイオンの流入を、細胞内カルシウムイオン濃度又はその変化を指標として、アルカリ剤の刺激を抑制する物質をスクリーニングすること及び被験物質によるアルカリ剤の刺激に対する抑制効果を評価することができる。ここで、前記細胞内カルシウムイオン濃度の変化は、アルカリ剤非存在下でのＴＲＰＡ１を発現する細胞における細胞内カルシウムイオン濃度と、アルカリ剤存在下でのＴＲＰＡ１を発現する細胞における細胞内カルシウムイオン濃度との間における細胞内カルシウムイオン濃度の差異としても求められる。

ＴＲＰＡ１を発現する細胞とアルカリ剤と被験物質との接触に際して、アルカリ剤は、必要に応じて、例えば、エタノール、生理的食塩水、水などに溶解させて、ＴＲＰＡ１を発現する細胞の培養物又は前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞の培養に用いる培地に添加してもよく、そのまま添加してもよい。また、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とアルカリ剤と被験物質との接触に際して、被験物質は、必要に応じて、例えば、エタノール、生理的食塩水、水などに溶解させて、ＴＲＰＡ１を発現する細胞の培養物又は前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞の培養に用いる培地に添加してもよく、そのまま添加してもよい。

ＴＲＰＡ１を発現する細胞に接触させるアルカリ剤の量は、アルカリ剤の種類に応じて適宜設定することができ、前記生理学的事象が測定可能な程度に変化する範囲であればよく、特に限定されないが、前記生理学的事象を測定可能な程度に発現させる観点から、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とアルカリ剤と被験物質との接触により得られる混合物のｐＨが、好ましくは、ｐＨ７．５以上、より好ましくは、ｐＨ８以上であり、細胞を良好な状態に維持する観点から、好ましくは、ｐＨ１２以下、より好ましくは、ｐＨ１０以下になる量であることが望ましい。

また、ＴＲＰＡ１を発現する細胞に接触させる被験物質の量は、被験物質の種類に応じて適宜設定することができ、前記生理学的事象が測定可能な程度に変化する範囲であればよく、特に限定されないが、前記生理学的事象を測定可能な程度に発現させる観点から、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とアルカリ剤と被験物質との接触により得られる混合物中における濃度が、好ましくは１μＭ以上、より好ましくは１０μＭ以上であり、同様の観点から、好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１０ｍＭ以下であることが望ましい。

前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞は、５×１０⁷細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁させて用いることができる。

本発明の評価方法では、アルカリ剤により引き起こされるＴＲＰＡ１を介する生理学的事象に対する被験物質の効果を簡便、かつ迅速に評価する観点から、好ましくは、前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞をカバーグラス上で培養して用いることが望ましい。

なお、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とアルカリ剤と被験物質とを接触させる場合、必要に応じて、ＴＲＰＡ１を発現する細胞を、前記生理学的事象を測定するに適した状態に維持するために、前記生理学的事象の測定に先立ち、当該ＴＲＰＡ１を発現する細胞を任意の時間培養してもよい。

前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞の培養方法は、用いられる細胞の種類に応じた方法であればよく、例えば、単層静置培養法、浮遊培養法、回転培養法、三次元担体培養法などの方法が挙げられる。また、培養温度、培養時間、培養液のｐＨ、二酸化炭素（ＣＯ₂濃度）などの培養条件は、用いられる宿主細胞に応じて適宜設定される。例えば、用いられる宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である場合、培養条件としては、３６℃〜３８℃（細胞を良好に生育させる観点から、好ましくは、３６．５℃〜３７．５℃、特に好ましくは、３７℃）で、５体積％ＣＯ_２などの条件が挙げられる。

本発明の評価方法においては、前記細胞内カルシウムイオン濃度の測定は、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）を細胞内に取り込ませて、細胞内のカルシウムイオンに前記蛍光カルシウム指示薬を結合させ、結合した蛍光カルシウム指示薬に基づく蛍光の強度を測定することにより行なわれる。前記蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンに対する結合量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよく、特に限定されないが、例えば、ＦＵＲＡ２（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）、ＦＵＲＡ２−ＡＭ（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）、Ｆｌｕｏ−３（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）などが挙げられる。

本発明の評価方法において、細胞内カルシウムイオン濃度を測定する場合、例えば、アルカリ剤と被験物質とを接触させたＴＲＰＡ１を発現する細胞内におけるカルシウムイオン濃度と、被験物質の非存在下にアルカリ剤を単独で接触させたＴＲＰＡ１を発現する細胞内におけるカルシウムイオン濃度と、被験物質とアルカリ剤との非存在下でのＴＲＰＡ１を発現する細胞内におけるカルシウムイオン濃度とを測定する。

本発明の評価方法では、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とアルカリ剤と被験物質とを接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度が、被験物質非存在下、アルカリ剤単独とＴＲＰＡ１を発現する細胞とを接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度よりも減少していること、又は被験物質及びアルカリ剤それぞれの非存在下におけるＴＲＰＡ１を発現する細胞と接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度と、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とアルカリ剤と被験物質とを接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度との間における変化（例えば、カルシウムイオン濃度の上昇（カルシウムイオン濃度の増加量））が、被験物質及びアルカリ剤それぞれの非存在下におけるＴＲＰＡ１を発現する細胞と接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度と、アルカリ剤単独とＴＲＰＡ１を発現する細胞とを接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度との間における変化（例えば、カルシウムイオン濃度の上昇（カルシウムイオン濃度の増加量））よりも小さくなっていることが、前記被験物質にアルカリ剤の刺激に対する抑制効果があることの指標となる。一方、アルカリ剤と被験物質とを接触させた細胞内におけるカルシウム濃度と、アルカリ剤を単独で接触させた細胞内におけるカルシウム濃度とが同程度であること、又は被験物質とアルカリ剤との非存在下におけるＴＲＰＡ１を発現する細胞と接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度と、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とアルカリ剤と被験物質とを接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度との間における変化（例えば、カルシウムイオン濃度の上昇（カルシウムイオン濃度の増加量））が、被験物質とアルカリ剤との非存在下におけるＴＲＰＡ１を発現する細胞と接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度と、アルカリ剤単独とＴＲＰＡ１を発現する細胞とを接触させた場合の細胞内のカルシウムイオン濃度との間での変化（例えば、カルシウムイオン濃度の上昇（カルシウムイオン濃度の増加量））と同程度であることが、前記被験物質にアルカリ剤の刺激に対する抑制効果がないことの指標となる。このように、本発明の評価方法において、細胞内カルシウムイオン濃度を測定する場合には、被験物質について、アルカリ剤の刺激、すなわち、アルカリ剤による細胞内カルシウムイオン濃度の変化に対する被験物質による抑制率を求めて評価してもよい。この場合、アルカリ剤の刺激に対する被験物質による抑制率（刺激抑制率）は、式（Ｉ）：

又は、式（ＩＩ）：

により求められる。

前記陰性対照としては、特に限定されないが、例えば、アルカリ剤を含まない溶液などが挙げられる。

なお、前記抑制率の算出に際しては、蛍光強度比に基づく式（Ｉ）及び蛍光強度に基づく式（ＩＩ）は、用いられるカルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬の励起波長により適宜選択できる。例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬の励起波長が１種である場合には、当該励起波長における蛍光強度が用いられ、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬の励起波長が励起波長Ａと励起波長Ｂとの２種である場合には、励起波長Ａにおける蛍光強度と励起波長Ｂにおける蛍光強度との蛍光強度比（例えば、励起波長Ａにおける蛍光強度／励起波長Ｂにおける蛍光強度）が用いられる。具体的には、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬がＦＵＲＡ２−ＡＭである場合、励起波長が、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍであるため、式（Ｉ）においては、「蛍光強度比」として、励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度との蛍光強度比（励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度）が用いられる。

なお、細胞内カルシウムイオン濃度を測定する評価方法は、例えば、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞と、前記細胞を良好な状態で維持できる適切な培地と、前記蛍光カルシウム指示薬とを良好な状態で保存できる容器に封入したキットにより、より容易に実施できる。前記キットにおいては、前記細胞は、使用時において、ＴＲＰＡ１の機能を十分に発揮できるように復帰させることができるように、例えば、液体窒素中での保存、凍結保存等の状態で、滅菌された容器に封入されていてもよい。また、前記培地は、滅菌された容器に封入されていてもよい。前記蛍光カルシウム指示薬は、使用時において、前記細胞への導入を容易に行なうことができるように、測定に用いられる量を予め分注して容器に封入されていてもよい。また、前記蛍光カルシウム指示薬は、当該蛍光カルシウム指示薬を溶解させることができ、蛍光強度を測定するに適した溶媒、例えば、エタノールなどに溶解されていてもよい。さらに、前記キットには、蛍光強度の測定に用いられる測定用セル、マトリックスが含まれていてもよい。

本発明の評価方法において、前記アルカリ剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象として、ＴＲＰＡ１を介する電位の変化を測定する場合、パッチクランプ法により電位を測定することにより、アルカリ剤により引き起こされるＴＲＰＡ１を介する電位の変化を抑制する物質として、アルカリ剤の刺激を抑制する物質をスクリーニングすること、及びアルカリ剤により引き起こされるＴＲＰＡ１を介する電位の変化に対する被験物質の抑制効果として、アルカリ剤の刺激に対する被験物質の抑制効果を評価することができる。

本発明の評価方法によれば、例えば、外用剤に用いられるアルカリ剤による刺激を抑制する物質をスクリーニングすることができる。本発明の評価方法によりスクリーニングされた前記アルカリ剤による刺激を抑制する物質を、例えば、外用剤に配合することにより、使用感に優れた外用剤を得ることができる。

以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、発現ベクターの構築は、ジャケマー（Ｊａｑｕｅｍａｒ，Ｄ．）ら〔ザジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２７４巻、第１１号、第７３２５頁−第７３３３頁、１９９９年発行〕に準じて行なった。また、細胞への発現ベクターの導入は、フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．）ら、プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシーズザユナイテッドステーツオブアメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８４巻、第７４１３頁〜第７４１７頁、１９８７年）に準じて行なった。

（製造例１）
ＴＲＰＡ１を発現する細胞の作製
ヒトＴＲＰＡ１をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２）の６３位〜３８８８位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクターである商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）のＫｐｎＩ／ＸｂａＩサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを得た。

得られたヒトＴＲＰＡ１発現ベクター（１μｇ相当量）とプラスリージェント（商品名、カタログ番号：１１５１４−０１５、インビトロジェン社製）６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、リポフェクタミン（登録商標、カタログ番号：１８３２４−０１２、インビトロジェン社製）４μｌとＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）ＩＲｅｄｕｃｅｄ−ＳｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１、インビトロジェン社製）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。

一方、ＨＥＫ２９３細胞（５×１０^５個／直径３５ｍｍシャーレ）を１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて、５体積％ＣＯ_２下、３７℃で７０％のコンフルエンシーまで培養した。

その後、得られた細胞に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとの混合物を添加した。これにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＡ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。

（実施例１）
被験物質を、アルカリ剤としての溶液Ａ〔組成：１４０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭＣａＣｌ_２、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）〕に添加し、試験液を作製した。また、前記溶液Ａを標準試験液として用いた。

前記被験物質として、ＴＲＰＡ１の既知のアンタゴニストであるカンファー（シグマアルドリッチジャパン株式会社製、実験番号１）、ルテニウムレッド（シグマアルドリッチジャパン株式会社製、実験番号２）及びガドリニウムクロライド（シグマアルドリッチジャパン株式会社製、実験番号３）、並びにグリセリン（和光純薬工業株式会社製、実験番号４）、１，３−ブタンジオール（和光純薬工業株式会社製、実験番号５）及びポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（和光純薬工業株式会社製、実験番号６）を用いた。各試験液中における被験物質の濃度は、それぞれ、カンファー（実験番号１）が５ｍＭ、ルテニウムレッド（実験番号２）が１０μＭ、ガドリニウムクロライド（実験番号３）が１００μＭ、グリセリン（実験番号４）が５ｍＭ、１，３−ブタンジオール（実験番号５）が５ｍＭ、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（実験番号６）が５００μＭとした。

前記製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、室温下、１〜２０μｇ／ｍｌのＦＵＲＡ２−ＡＭを含む１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で２０〜４０分間インキュベーションして、ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ２−ＡＭを導入した。

ＦＵＲＡ２−ＡＭ導入後のＴＲＰＡ１発現細胞を、循環定温チャンバー付蛍光測定装置（商品名：ＡＲＧＵＳ−５０、浜松ホトニクス株式会社製）のチャンバーに入れ、溶液Ｂ〔組成：１４０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭＣａＣｌ_２、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、（ｐＨ７．４）〕にて洗浄した。つぎに、前記試験液をチャンバーに入れて循環させながら、励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度とを測定した。その後、前記試験液を用いた場合の励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度との蛍光強度比（３４０ｎｍでの蛍光強度／３８０ｎｍでの蛍光強度）を算出した。

また、前記試験液の代わりに、標準試験液を用いたことを除き、同様に、励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度との蛍光強度比を算出した。さらに、また、前記試験液の代わりに、陰性対照として、溶液Ｂを用いたことを除き、同様に、励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度と励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度との蛍光強度比を算出した。

細胞内カルシウムイオン濃度の変化（カルシウムイオン濃度の増加）に対する被験物質による抑制率を、式（Ｉ）：

に基づき算出した。ここで、抑制率が５％以上である場合、被験物質が、アルカリ剤の刺激に対する抑制効果を発揮する物質であると判断した。さらに、前記抑制率が２０％以上である場合、被験物質が、細胞内カルシウムイオン濃度の変化（カルシウムイオン濃度の増加）に対して、高い抑制効果を発揮する物質であると判断した。各被験物質とアルカリ剤の刺激の抑制率（刺激抑制率）との関係を示すグラフを図１に示す。

被験物質を含まず、アルカリ剤としての、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を含む溶液である前記標準試験液を用いた場合（アルカリ性条件）の蛍光強度比は、１．０６であり、被験物質と前記アルカリ剤とを含まない溶液である溶液Ｂ（陰性対照）を用いた場合の蛍光強度比は、０．７８であった。このように、被験物質を含まず、前記アルカリ剤を含む溶液である標準試験液を用いた場合の蛍光強度比は、被験物質と前記アルカリ剤とを含まない溶液である溶液Ｂ（陰性対照）を用いた場合の蛍光強度比よりも高くなっていた。したがって、アルカリ剤により、細胞内カルシウムイオン濃度が増加することが示唆される。

また、図１に示される結果から、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストではないグリセリン（実験番号４）、１，３−ブタンジオール（実験番号５）及びポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（実験番号６）を用いた場合、細胞内カルシウムイオン濃度が上昇しているが、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるカンファー（実験番号１）、ガドリニウム（実験番号２）及びルテニウムレッド（実験番号３）を用いた場合、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が、それぞれ、４６．９％、２１．７％及び６７．３％の抑制率で抑制されていることがわかる。

これらの結果から、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストの存在により、ＴＲＰＡ１のアンタゴニスト非存在下の場合に比べ、細胞内カルシウムイオン濃度の増加量が減少しているため、前記アルカリ剤による細胞内カルシウムイオン濃度の増加は、ＴＲＰＡ１を介して引き起こされることがわかる。

このように、アルカリ剤により、ＴＲＰＡ１を介する細胞内カルシウムイオン濃度の増加が引き起こされるため、アルカリ剤による刺激を、ＴＲＰＡ１を介する生理学的事象を指標として評価できることが示唆される。

また、図１に示される結果から、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるカンファー（実験番号１）、ガドリニウム（実験番号２）及びルテニウムレッド（実験番号３）により、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が抑制されているが、ＴＲＰＡ１のアンタゴニストではないグリセリン（実験番号４）、１，３−ブタンジオール（実験番号５）又はポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（実験番号６）では、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇の抑制効果を発揮しないことが判断できることがわかる。

このように、アルカリ剤による刺激を、ＴＲＰＡ１を介する生理学的事象を指標とすることにより、アルカリ剤の刺激を抑制する物質をスクリーニングすることができることがわかる。

さらに、図１に示される結果から、前記ＴＲＰＡ１のアンタゴニストであるカンファー（実験番号１）、ガドリニウム（実験番号２）及びルテニウムレッド（実験番号３）は、抑制率が、それぞれ、４６．９％、２１．７％及び６７．３％であるため、いずれも、アルカリ剤の刺激に対して、高い抑制効果を有する物質であると判断できる。また、図１に示される結果から、被験物質として、ガドリニウム（実験番号２）を用いた場合、他のアンタゴニストであるカンファー（実験番号１）又はルテニウムレッド（実験番号３）を用いた場合に比べ、前記抑制率が低くなっているため、アルカリ剤の刺激に対するガドリニウム（実験番号２）の抑制効果は、アルカリ剤の刺激に対するカンファー（実験番号１）又はルテニウムレッド（実験番号３）の抑制効果に比べ、低いことがわかる。

このように、被験物質及びアルカリ剤の存在下に、前記製造例１で得られたＴＲＰＡ１発現細胞内におけるＴＲＰＡ１を介する挙動の指標として細胞内におけるカルシウムイオン濃度を測定することにより、アルカリ剤の刺激に対する被験物質による抑制効果が容易に評価できることがわかる。

各被験物質とアルカリ剤の刺激の抑制率（刺激抑制率）との関係を示すグラフである。

Claims

被験物質と、アルカリ剤と、ＴＲＰＡ１を発現する細胞とを接触させ、前記アルカリ剤によりＴＲＰＡ１を介して引き起こされる生理学的事象を測定することを特徴とする、アルカリ剤の刺激を抑制する物質の評価方法。
前記生理学的事象が、細胞内カルシウムイオン濃度の変化である請求項１記載の評価方法。
前記ＴＲＰＡ１を発現する細胞が、ＴＲＰＡ１をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞である請求項１又は請求項２記載の評価方法。
前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞からなる群より選ばれた細胞である請求項３記載の評価方法。