JP2016030750A - 皮膚外用剤 - Google Patents

Abstract

【課題】皮膚用化粧料、頭髪用化粧料などに有用であり、シワを効果的に改善することができる皮膚外用剤を提供すること。
【解決手段】抗シワ用の皮膚外用剤であって、ラミニン−５１１の分泌を促進する分泌促進剤とインテグリンα６β１の発現を促進する発現促進剤とを含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚外用剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、例えば、皮膚用化粧料、頭髪用化粧料などに有用な皮膚外用剤に関する。

ヒトの身体の恒常性機能および生理的機能が低下した場合、皮膚にシワが生じる。前記シワは、例えば、真皮を構成するコラーゲン繊維、エラスチン繊維およびヒアルロン酸の量の減少、表皮の菲薄化などに起因すると考えられている。

一方、レチノイン酸は、表皮細胞の増殖を促進して表皮の厚さを増加させることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。そこで、シワを改善するための皮膚外用剤にレチノイン酸を配合することが考えられる。

しかし、前記レチノイン酸は、細胞の核内の特異的受容体に結合して、一過的にシグナルが伝達されるため、表皮細胞を持続的に増殖させることが困難であることから、レチノイン酸が配合された皮膚外用剤は、シワを効果的に改善することが困難であるという欠点がある。

ゲイリー・ジェイ・フィシャー（Ｇａｒｙ Ｊ Ｆｉｓｈｅｒ）ら、「局所レチノイン酸処理ヒト皮膚の細胞、免疫学的および生化学的特徴づけ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｐｉｃａｌ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ-Ｔｒｅａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｋｉｎ）」、ジャーナル・オブ・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー、１９９１年発行、第９６巻、ｐｐ．６９９−７０７

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、シワを効果的に改善することができる皮膚外用剤を提供することを目的とする。

すなわち、本発明の要旨は、
（１）抗シワ用の皮膚外用剤であって、ラミニン−５１１の分泌を促進する分泌促進剤とインテグリンα６β１の発現を促進する発現促進剤とを含有することを特徴とする皮膚外用剤、および
（２）抗表皮性シワ用の皮膚外用剤である前記（１）に記載の皮膚外用剤
に関する。

本発明の皮膚外用剤によれば、シワを効果的に改善することができるという優れた効果が奏される。

試験例１において、被験試料の種類とラミニン−５１１分泌率との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例２において、インテグリンα６およびインテグリンβ１の発現パターンを解析した結果を示すスキャッタグラムである。

本発明の皮膚外用剤は、抗シワ用の皮膚外用剤であって、ラミニン−５１１の分泌を促進する分泌促進剤（以下、「ラミニン−５１１分泌促進剤」ともいう）とインテグリンα６β１の発現を促進する発現促進剤（以下、「インテグリンα６β１発現促進剤」ともいう）とを含有することを特徴とする。

前記ラミニン−５１１は、α鎖とβ鎖とγ鎖とから構成されるヘテロ三量体構造を有するラミニンファミリーのタンパク質の１つである。前記ラミニンファミリーは、基底膜に存在する細胞外マトリックスである。前記ラミニンファミリーには、１５種類のアイソフォームが含まれている。前記１５種類のアイソフォームは、互いに異なる機能を有している。前記１５種類のアイソフォームは、ヘテロ３量体構造を構成するα鎖、β鎖およびγ鎖それぞれの種類に基づいて分類されている。ここで、α鎖は、通常、５種類のα鎖（α１〜α５）に分類されている。また、β鎖は、通常、３種類のβ鎖（β１〜β３）に分類されている。さらに、γ鎖は、通常、３種類のγ鎖（γ１〜γ３）に分類されている。前記ラミニン−５１１は、α５とβ１とγ１とから構成されている。前記ラミニン−５１１は、細胞の増殖指令の情報などを有している。なお、前記ラミニン−５１１は、ラミニン１０と同義である。

前記インテグリンα６β１は、α鎖とβ鎖とから構成されるヘテロ２量体構造を有するインテグリンファミリーのタンパク質の１つである。前記インテグリンファミリーには、２４種類のアイソフォームが含まれている。前記２０種類以上のアイソフォームは、互いに異なる機能を有している。これらののアイソフォームは、ヘテロ２量体構造を構成するα鎖およびβ鎖それぞれの種類に基づいて分類されている。ここで、α鎖は、通常、１８種類のα鎖に分類されている。また、β鎖は、通常、８種類のβ鎖に分類されている。前記インテグリンα６β１は、α６とβ１とから構成されている。前記インテグリンα６β１は、細胞表面の原形質膜に存在するラミニン−５１１が結合することができるレセプターである。前記インテグリンα６β１は、前記ラミニン−５１１と結合することによって前記ラミニン−５１１が有する前記増殖指令の情報を表皮細胞内に伝達する機能を有している。

本発明の皮膚外用剤は、ラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤とを含有している点に１つの大きな特徴を有する。このように、本発明の皮膚外用剤は、ラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤とを含有しているので、皮膚内におけるラミニン−５１１およびインテグリンα６β１それぞれの量を増加させることができ、表皮細胞に対する増殖指令の情報がインテグリンα６β１を介して表皮細胞内に伝達され、表皮細胞が増殖すると考えられる。また、一旦、ラミニン−５１１およびインテグリンα６β１の発現量が増加すると、インテグリンα６β１を介する表皮細胞内への前記情報の伝達が持続的に行なわれるため、表皮細胞が持続的に増殖すると考えられる。したがって、本発明の皮膚外用剤によれば、シワを効果的に改善することができる。

前記ラミニン−５１１分泌促進剤は、ラミニン−５１１の分泌を促進する成分を有効成分として含有している。前記ラミニン−５１１の分泌を促進する成分としては、例えば、ゴボウ抽出物、冬虫夏草抽出物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの成分のなかでは、ラミニン−５１１の分泌促進効果を十分に発揮させる観点から、ゴボウ抽出物および冬虫夏草抽出物が好ましい。これらの成分は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。

前記ラミニン−５１１の分泌促進効果は、例えば、被験試料の存在下または非存在下に正常ヒト表皮角化細胞を培養して得られる培養上清中におけるラミニン−５１１の含有量を用いて評価することができる。前記培養上清中におけるラミニン−５１１の含有量は、ラミニン−５１１を構成するサブユニットのγ１（以下、「ラミニンγ１」ともいう）の含有量を測定することによって求めることができる。前記ラミニン−５１１の分泌促進効果の評価は、例えば、
（Ａ１）被験試料の存在下または非存在下に正常ヒト表皮角化細胞を培養するステップ、
（Ａ２）前記ステップ（Ａ１）で得られた細胞培養物の培養上清を回収するステップ、
（Ａ３）前記ステップ（Ａ２）で得られた培養上清中におけるラミニン−γ１の含有量を測定するステップ、
（Ａ４）式（Ｉ）：

にしたがってラミニン−５１１分泌率を求めるステップ、
を行ない、ラミニン−５１１分泌率が、好ましくは１０５％以上、より好ましくは１１０％以上であるかどうかを調べることなどによって行なうことができる。前記ラミニン−５１１分泌率が、好ましくは１０５％以上、より好ましくは１１０％以上である場合、被験試料がラミニン−５１１の分泌促進効果を発揮するものであることの指標となる。なお、ラミニンγ１とは、ラミニン−５１１を構成するサブユニットγ１（以下、「ラミニンγ１」ともいう）の量を指標として用いることなどによって評価することができる。

前記ゴボウ抽出物の原料となるゴボウの部位としては、例えば、根などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。抽出に際しては、原料をそのまま用いてもよく、乾燥させて用いてもよい。また、原料は、粉砕して用いてもよい。抽出は、例えば、原料を抽出溶媒に浸漬させ、必要により加熱および／または加圧することなどにより行なうことができる。また、抽出温度および抽出時間は、抽出溶媒の種類などにより異なるので一概には決定することができないことから、抽出溶媒の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記抽出溶媒としては、例えば、精製水、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコールなどの低級アルコール；プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール；ジエチルエーテル、ジプロピルエーテルなどのエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル類；アセトン、エチルメチルケトンなどのケトン類などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみ限定されるものではない。これらの抽出溶媒のなかでは、ラミニン−５１１の分泌促進効果を十分に発揮させる観点から、１，３−ブチレングリコールが好ましい。これらの抽出溶媒は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。ゴボウ抽出物は、例えば、ゴボウの根などと、抽出溶媒とを用いて抽出を行なうことによって得られる。前記ゴボウ抽出物は、乾燥状態であってもよく、液体状態であってもよい。また、前記抽出物の状態は、製剤のしやすさなどに応じて適宜選択することができる。なお、本発明においては、ゴボウ抽出物として市販のゴボウ抽出物を用いてもよい。

前記冬虫夏草抽出物の原料となる冬虫夏草の部位としては、例えば、子実体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。抽出に際しては、原料をそのまま用いてもよく、乾燥させて用いてもよい。また、原料は、粉砕して用いてもよい。抽出は、例えば、原料を抽出溶媒に浸漬させ、必要により加熱および／または加圧することなどにより行なうことができる。また、抽出温度および抽出時間は、抽出溶媒の種類などにより異なるので一概には決定することができないことから、抽出溶媒の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記抽出溶媒は、ゴボウ抽出物の製造に用いられる抽出溶媒と同様のものが挙げられる。前記抽出溶媒は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。前記抽出溶媒のなかでは、ラミニン−５１１の分泌促進効果を十分に発揮させる観点から、ゴボウ抽出物の製造に用いられる抽出溶媒と同様の抽出溶媒が好ましい。前記冬虫夏草抽出物は、例えば、冬虫夏草の子実体などと、抽出溶媒とを用いて抽出を行なうことによって得られる。前記冬虫夏草抽出物は、乾燥状態であってもよく、液体状態であってもよい。また、前記抽出物の状態は、製剤のしやすさなどに応じて適宜選択することができる。なお、本発明においては、冬虫夏草抽出物として市販の冬虫夏草抽出物を用いてもよい。

本発明の皮膚外用剤中におけるラミニン−５１１分泌促進剤の含有量は、皮膚外用剤の用途などに応じて異なるので一概に決定することができないことから、皮膚外用剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。本発明の皮膚外用剤中におけるラミニン−５１１分泌促進剤の含有量は、通常、ラミニン−５１１の分泌促進効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、ラミニン−５１１の分泌促進効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは５質量％以下、より好ましくは２質量％以下である。なお、本明細書において、「本発明の皮膚外用剤中におけるラミニン−５１１分泌促進剤の含有量」は、ラミニン−５１１分泌促進剤に含まれる有効成分の乾燥状態での質量（乾燥質量）を用いて求められたものである。

前記インテグリンα６β１発現促進剤は、インテグリンα６β１の発現を促進する成分を有効成分として含有している。前記インテグリンα６β１の発現を促進する成分としては、例えば、オリーブ葉抽出物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの成分のなかでは、インテグリンα６β１の発現促進効果を十分に発揮させる観点から、オリーブ葉抽出物が好ましい。

前記インテグリンα６β１の発現促進効果は、例えば、被験試料の存在下または非存在下に正常ヒト表皮角化細胞を培養して得られた細胞集団中におけるインテグリンα６およびインテグリンβ１の発現量を調べることなどによって評価することができる。前記インテグリンα６β１の発現促進効果の評価は、例えば、
（Ｂ１）被験試料の存在下または非存在下に正常ヒト表皮角化細胞を培養して細胞集団を得るステップ、
（Ｂ２）前記ステップ（Ｂ１）で得られた細胞集団にインテグリンα６結合標識抗体およびインテグリンβ１結合標識抗体と接触させるステップ、および
（Ｂ３）前記ステップ（Ｂ２）で得られた細胞集団をセルソータに供してセルソーティングを行ない、インテグリンα６およびインテグリンβ１の発現パターンを解析するステップ
を行ない、被験試料を接触させた細胞集団中におけるインテグリンα６およびインテグリンβ１の発現パターンと、被験試料を接触させていない細胞集団中におけるインテグリンα６およびインテグリンβ１の発現パターンとを比較することによって評価することができる。被験試料を接触させた細胞集団中におけるインテグリンα６およびインテグリンβ１を高発現する細胞（以下、「インテグリンα６^hiβ１^hi細胞」ともいう）の割合が、被験試料を接触させていない細胞集団中におけるインテグリンα６^hiβ１^hi細胞の割合よりも大きい場合、被験試料がインテグリンα６β１の発現促進効果を発揮するものであることの指標となる。

前記オリーブ葉抽出物の原料となるオリーブの部位は、オリーブ葉である。抽出に際しては、原料をそのまま用いてもよく、乾燥させて用いてもよい。また、原料は、粉砕して用いてもよい。抽出は、例えば、原料を抽出溶媒に浸漬させ、必要により加熱および／または加圧することなどにより行なうことができる。また、抽出温度および抽出時間は、抽出溶媒の種類などにより異なるので一概には決定することができないことから、抽出溶媒の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記抽出溶媒は、ゴボウ抽出物の製造に用いられる抽出溶媒と同様のものが挙げられる。前記抽出溶媒は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。前記抽出溶媒のなかでは、インテグリンα６β１の発現促進効果を十分に発揮させる観点から、１，３−ブチレングリコールが好ましい。前記オリーブ葉抽出物は、例えば、オリーブ葉と、抽出溶媒とを用いて抽出を行なうことによって得られる。前記オリーブ葉抽出物は、乾燥状態であってもよく、液体状態であってもよい。また、前記抽出物の状態は、製剤のしやすさなどに応じて適宜選択することができる。なお、本発明においては、オリーブ葉抽出物として市販のオリーブ葉抽出物を用いてもよい。

本発明の皮膚外用剤中におけるインテグリンα６β１発現促進剤の含有量は、皮膚外用剤の用途などに応じて異なるので一概に決定することができないことから、皮膚外用剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。本発明の皮膚外用剤中におけるインテグリンα６β１発現促進剤の含有量は、通常、インテグリンα６β１の発現促進効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、よりインテグリンα６β１の発現促進効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは５質量％以下、より好ましくは２質量％以下である。なお、本明細書において、「本発明の皮膚外用剤中におけるインテグリンα６β１発現促進剤の含有量」は、インテグリンα６β１発現促進剤に含まれる有効成分の乾燥状態での質量（乾燥質量）を用いて求められたものである。

本発明の皮膚外用剤に含まれるラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤との質量比（ラミニン−５１１分泌促進剤の質量／インテグリンα６β１発現促進剤の質量）は、皮膚外用剤の用途などに応じて異なるので一概に決定することができないことから、皮膚外用剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。なお、本明細書において、「ラミニン−５１１分泌促進剤の質量」とは、ラミニン−５１１分泌促進剤に含まれる有効成分の乾燥質量をいう。また、「インテグリンα６β１発現促進剤の質量」とは、インテグリンα６β１発現促進剤に含まれる有効成分の乾燥質量をいう。

シワの改善は、例えば、シワのレプリカを取り、当該レプリカを皮膚用非接触３Ｄ測定システム〔ＧＦメステクニーク ゲーエムベーハー（ＧＦＭｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ）製、商品名：ＰＲＩＭＯＳ〕などに供してシワに関するパラメーターを測定し、シワ面積率、最大シワ平均深さ、最大シワ最大深さ、総シワ平均深さなどを算出することなどによって評価することができる。本発明の皮膚外用剤によるシワの改善は、例えば、
（ｉ）本発明の皮膚外用剤を用いたときのシワ面積率（以下、「シワ面積率Ａ」という）と本発明の皮膚外用剤を用いていないときのシワ面積率（以下、「シワ面積率ａ」という）との間の差、
（ｉｉ）本発明の皮膚外用剤を用いたときの最大シワ平均深さ（以下、「最大シワ平均深さＢ」という）と本発明の皮膚外用剤を用いていないときの最大シワ平均深さ（以下、「最大シワ平均深さｂ」という）との間の差、
（ｉｉｉ）本発明の皮膚外用剤を用いたときの最大シワ最大深さ（以下、「最大シワ最大深さＣ」という）と本発明の皮膚外用剤を用いていないときの最大シワ最大深さ（以下、「最大シワ最大深さｃ」という）との間の差、
（ｉｖ）本発明の皮膚外用剤を用いたときの総シワ平均深さ（以下、「総シワ平均深さＤ」という）と本発明の皮膚外用剤を用いていないときの総シワ平均深さ（以下、「総シワ平均深さｄ」という）との間の差
などを求めることにによって評価することができる。この場合、
（ｉ）シワ面積率Ａがシワ面積率ａよりも小さいこと、
（ｉｉ）最大シワ平均深さが最大シワ平均深さｂよりも小さいこと、
（ｉｉｉ）最大シワ最大深さＣが最大シワ最大深さｃよりも小さいこと、および
（ｉｖ）総シワ平均深さＤが総シワ平均深さｄよりも小さいこと
のいずれかを満たした場合、本発明の皮膚外用剤により、皮膚のシワが改善されていることを示す。

本発明の皮膚外用剤の適用箇所としては、例えば、顔などの皮膚などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

本発明の皮膚外用剤の適用対象となるシワは、本発明の皮膚外用剤によるシワの改善効果を十分に発揮することができることから、好ましくは表皮性シワである。したがって、本発明の皮膚外用剤は、シワの改善効果を十分に発揮することができることから、抗表皮シワ用の皮膚外用剤である。

本発明の皮膚外用剤と適用箇所との接触時における当該皮膚外用剤の使用量は、皮膚外用剤の用途、皮膚外用剤に含まれるラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤との合計質量などに応じて異なるので一概に決定することができないことから、皮膚外用剤の用途、皮膚外用剤に含まれるラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤との合計質量などに応じて適宜設定することが好ましい。本発明の皮膚外用剤と適用箇所との接触時における本発明の皮膚外用剤の使用量は、通常、適用箇所１ｃｍ²あたりに使用されるラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤との合計質量に換算すると、シワの発生を効果的に抑制する観点から、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは０．５ｍｇ以上であり、ラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤の効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは１０ｍｇ以下、より好ましくは５ｍｇ以下である。なお、本明細書において、「ラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤との合計質量」とは、ラミニン−５１１分泌促進剤に含まれる有効成分の乾燥質量とインテグリンα６β１発現促進剤に含まれる有効成分の乾燥質量とを合計した質量をいう。

本発明の皮膚外用剤には、本発明の目的が阻害されない範囲内で、医薬部外品または医薬品に配合されるその他の成分が配合されていてもよい。前記成分としては、例えば、保湿剤、着色剤、界面活性剤、殺菌剤、安定化剤、防腐剤、粘度調整剤、ｐＨ調整剤、香料、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤などが挙げられる。本発明の皮膚外用剤中における前記成分の含有量は、当該成分の種類などによって異なるので、一概には決定することができないことから、前記成分の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。

前記皮膚外用剤としては、皮膚化粧料、医薬部外品および医薬品が挙げられる。前記皮膚化粧料としては、例えば、化粧水、ジェル、乳液、クリームなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記化粧水としては、例えば、柔軟化粧水、保湿化粧水、マッサージローション、メーキャップローション、ハンドローション、ボディローションなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ジェルとしては、例えば、マッサージジェル、ハンドジェル、ボディジェルなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記乳液としては、例えば、マッサージミルク、ハンドミルク、ボディーミルクなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記クリームとしては、メーキャップクリーム、ベースクリーム、プレメーキャップクリーム、ファンデーションクリーム、マッサージクリーム、ボディクリーム、デオドラントクリームなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記医薬部外品としては、例えば、軟膏、クリーム、ローション、ジェルなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、医薬品としては、例えば、軟膏、クリームなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。

以上説明したように、本発明の皮膚外用剤は、表皮細胞を持続的に増殖させ、シワを効果的に改善することができることから、抗シワ用の皮膚外用剤、好ましくは抗表皮性シワ用の皮膚外用剤として好適に使用することができる。

つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。

（実験例１〜３）
無血清培地〔ＤＳファーマバイオメディカル（株）製、商品名：正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地ＫＢＫＪＢ２００〕に、被験試料としてゴボウ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：ゴボウ抽出液ＢＧ〕を当該ゴボウ抽出物の濃度が０．１体積％となるように添加し、被験試料含有培地（実験例１）を得た。

また、実験例１において、被験試料としてゴボウ抽出物を用いる代わりに冬虫夏草抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：冬虫夏草抽出液〕（実験例２）またはオリーブ葉抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：オリーブ葉抽出物ＢＧ〕（実験例３）を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、被験試料含有培地を得た。

（比較例１〜２１）
実験例１において、被験試料としてゴボウ抽出物を用いる代わりにプルーン抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：プルーン抽出液ＷＣ〕（比較例１）、ブクリョク抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：ブクリョク抽出液ＢＧ−Ｊ〕（比較例２）、ジオウ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：ジオウ抽出液ＢＧ−Ｊ〕（比較例３）、ヨクイニン抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：ヨクイニン抽出液ＢＧ〕（比較例４）、トウキンセンカ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：トウキンセンカ抽出液ＢＧ−Ｊ〕（比較例５）、ニンジン抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：ニンジン抽出液ＢＧ〕（比較例６）、ビワ葉エキス〔丸善製薬（株）製、商品名：ビワ葉エキスＣＡ〕（比較例７）、イラクサ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：イラクサ抽出液ＢＧ〕（比較例８）、センブリ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：センブリ抽出リキッドＳＳ〕（比較例９）、ユキノシタ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：ユキノシタ抽出液ＢＧ〕（比較例１０）、酵母抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：酵母抽出液ＢＧ〕（比較例１１）、ペパーミント抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：ペパーミント抽出液ＢＧ〕（比較例１２）、カミツレ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：カミツレ抽出液ＢＧ−Ｊ〕（比較例１３）、ゲンチアナ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：ゲンチアナ抽出液ＢＧ−Ｊ〕（比較例１４）、オトギリソウ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：オトギリソウ抽出液ＢＧ〕（比較例１５）、サンザシ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：サンザシ抽出液ＢＧ−Ｊ〕（比較例１６）、オウゴン抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：オウゴン抽出液ＢＧ−ＪＣ〕（比較例１７）、スギナ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：スギナ抽出液ＢＧ〕（比較例１８）、メリッサ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：メリッサ抽出液ＢＧ−Ｊ〕（比較例１９）、ゲンノショウコ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：ゲンノショウコ抽出液ＢＧ−Ｊ〕（比較例２０）またはエイジツ抽出物〔丸善製薬（株）製、商品名：エイジツ抽出液ＢＧ−０１〕（比較例２１）を用いたことを除き、実験例１と同様の操作を行ない、被験試料含有培地を得た。

（試験例１）
（１）ラミニン−５１１分泌率の測定
正常ヒト表皮角化細胞〔プロモセル（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）供給〕を、１２マルチウェルプレート上の無血清培地〔ＤＳファーマバイオメディカル（株）製、商品名：正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地ＫＢＫＪＢ２００〕に、０．５×１０⁴細胞／ｃｍ²となるように播種した。正常ヒト表皮角化細胞を、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された１２マルチウェルプレート上の前記無血清培地中において２４時間培養した。

得られた細胞培養物中の無血清培地を、実験例１、実験例２または比較例１で得られた被験試料含有培地に置換した後、正常ヒト表皮角化細胞を、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された１２マルチウェルプレート上の被験試料含有培地中において５日間培養することにより、正常ヒト表皮角化細胞に被験試料を接触させた。その後、培養上清を回収した。得られた培養上清中におけるラミニンγ１の含有量を、ラミニン定量キット〔タカラバイオ（株）製、商品名：Ｌａｍｉｎｉｎ ＥＩＡ ｋｉｔ〕を用いて測定した。なお、ラミニンγ１は、ラミニン−５１１の指標である。

また、前記において、実験例１〜３または比較例１〜２１で得られた被験試料含有培地を用いる代わりに対照として無血清培地〔ＤＳファーマバイオメディカル（株）製、商品名：正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地ＫＢＫＪＢ２００〕を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、培養上清中におけるラミニンγ１含有量を測定した。

その後、式（Ｉ）：

にしたがってラミニン−５１１分泌率を求めた。

試験例１において、被験試料の種類と、ラミニン−５１１分泌率との関係を調べた結果を図１に示す。図中、１はゴボウ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、２は冬虫夏草抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、３はプルーン抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、４はブクリョク抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、５はジオウ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、６はヨクイニン抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、７はトウキンセンカ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、８はニンジン抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、９はビワ葉エキスを用いたときのラミニン−５１１分泌率、１０はイラクサ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、１１はセンブリ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、１２はユキノシタ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、１３は酵母抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、１４はペパーミント抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、１５はカミツレ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、１６はゲンチアナ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、１７はオトギリソウ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、１８はサンザシ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、１９はオウゴン抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、２０はスギナ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、２１はメリッサ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、２２はゲンノショウコ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率、２３はエイジツ抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率を示す。

図１に示された結果から、ゴボウ抽出物または冬虫夏草抽出物を用いたときのラミニン−５１１分泌率は、１１５％を超えていることがわかる。これらの結果から、ゴボウ抽出物および冬虫夏草抽出物によれば、ラミニン−５１１の分泌を促進させることができることがわかる。

これに対し、プルーン抽出物（試料番号３）、ブクリョク抽出物（試料番号４）、ジオウ抽出物（試料番号５）、ヨクイニン抽出物（試料番号６）、トウキンセンカ抽出物（試料番号７）、ニンジン抽出物（試料番号８）、ビワ葉エキス（試料番号９）、イラクサ抽出物（試料番号１０）、センブリ抽出物（試料番号１１）、ユキノシタ抽出物（試料番号１２）、酵母抽出物（試料番号１３）、ペパーミント抽出物（試料番号１４）、カミツレ抽出物（試料番号１５）、ゲンチアナ抽出物（試料番号１６）、オトギリソウ抽出物（試料番号１７）、サンザシ抽出物（試料番号１８）、オウゴン抽出物（試料番号１９）、スギナ抽出物（試料番号２０）、メリッサ抽出物（試料番号２１）、ゲンノショウコ抽出物（試料番号２２）またはエイジツ抽出物（試料番号２３）を用いたときのラミニン−５１１分泌率は、９０％未満であることがわかる。これらの結果から、試料番号３〜２３の抽出物は、ラミニン−５１１の分泌を促進しないことがわかる。

（２）インテグリンα６およびインテグリンβ１の発現パターンの解析
正常ヒト表皮角化細胞を、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された１２マルチウェルプレート上の無血清培地〔ＤＳファーマバイオメディカル（株）製、商品名：正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地ＫＢＫＪＢ２００〕中において２４時間培養した。つぎに、得られた正常ヒト表皮角化細胞を０．２５質量％Ｔｒｙｐｓｉｎ−エチレンジアミン四酢酸溶液に懸濁し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液と、ＦＩＴＣ結合抗ヒトインテグリンα６抗体およびＡＰＣ結合抗ヒトインテグリンβ１抗体とを接触させることにより、抗原抗体反応を行なった。つぎに、得られた細胞をセルソータ〔ＢＤ製、商品名：ＦＡＣＳＡｒｉａ〕に供してセルソーティングを行ない、前記細胞からすでに分化している細胞を除去してインテグリンα６^hiβ１^hi細胞を単離した。

得られたインテグリンα６^hiβ１^hi細胞を、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された１２マルチウェルプレート上の無血清培地〔ＤＳファーマバイオメディカル（株）製、商品名：正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地ＫＢＫＪＢ２００〕中において２４時間培養した。つぎに、得られた細胞培養物中の無血清培地を、実験例３または比較例２、４、７、１０、１２、２２〜２４で得られた被験試料含有培地に置換した後、インテグリンα６^hiβ１^hi細胞を、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された１２マルチウェルプレート上の無血清培地〔ＤＳファーマバイオメディカル（株）製、商品名：正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地ＫＢＫＪＢ２００〕中において２４時間培養することにより、インテグリンα６^hiβ１^hi細胞と被験試料とを接触させた。その後、細胞を回収した。

また、実験例３または比較例２、４、７、１０、１２、２２〜２４で得られた被験試料含有培地を用いる代わりに対照として無血清培地〔ＤＳファーマバイオメディカル（株）製、商品名：正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地ＫＢＫＪＢ２００〕を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、細胞を回収した。

得られた細胞を、ＦＩＴＣ結合抗ヒトインテグリンα６抗体〔バイオレジェンド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）製、商品名：ＦＩＴＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅ ＣＤ４９ｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ〕およびＡＰＣ結合抗ヒトインテグリンβ１抗体〔ＢＤ製、商品名：ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＤ２９〕と接触させることにより、抗原抗体反応を行なった。つぎに、得られた細胞をセルソータ〔ＢＤ製、商品名：ＦＡＣＳＡｒｉａ〕に供してセルソーティングを行ない、インテグリンα６およびインテグリンβ１の発現パターンを解析した。試験例１において、インテグリンα６およびインテグリンβ１の発現パターンを解析した結果を図２に示す。図中、（Ａ）はオリーブ葉抽出物を用いたときのスキャッタグラム、（Ｂ）は対照を用いたときのスキャッタグラム、（Ｃ）はビワ抽出物を用いたときのスキャッタグラム、（Ｄ）はペパーミント抽出物を用いたときのスキャッタグラム、（Ｅ）はユキノシタ抽出物を用いたときのスキャッタグラム、（Ｆ）ヨクイニン抽出物を用いたときのスキャッタグラム、（Ｇ）はハス抽出物を用いたときのスキャッタグラム、（Ｈ）はヒマラヤンラズベリー抽出物を用いたときのスキャッタグラム、（Ｉ）はブクリョク抽出物を用いたときのスキャッタグラム、（Ｊ）はマタタビ抽出物を用いたときのスキャッタグラムを示す。

図２に示された結果から、オリーブ葉抽出液を接触させた細胞集団中におけるインテグリンα６^hiβ１^hi細胞の割合は、対照として無血清培地を接触させたときの細胞集団中におけるインテグリンα６^hiβ１^hi細胞の割合と比べて多いことがわかる。これに対して、ヤグルマギク抽出物を接触させた接触させた細胞集団中におけるインテグリンα６^hiβ１^hi細胞の割合は、対照として無血清培地を接触させた細胞集団中におけるインテグリンα６^hiβ１^hi細胞の割合と比べて少ないことがわかる。したがって、これらの結果から、オリーブ葉抽出液は、インテグリンα６β１の発現を促進する発現促進剤であることがわかる。

表皮細胞は、ラミニン−５１１がインテグリンα６β１と結合し、ラミニン−５１１が有する増殖指令のシグナルがインテグリンα６β１を介して表皮細胞内に伝達されることによって増殖する。したがって、ラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤とを併用するにより、皮膚内におけるラミニン−５１１およびインテグリンα６β１それぞれの量が増加し、表皮細胞が増殖すると考えられる。また、一旦、ラミニン−５１１が基底膜に組み込まれると、インテグリンα６β１を介する表皮細胞内への前記情報の伝達が持続的に行なわれるため、表皮細胞が持続的に増殖すると考えられる。したがって、ラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤と含有する皮膚外用剤によれば、表皮細胞を持続的に増殖させることができるので、シワ、好ましくは表皮性シワを効果的に改善することができると考えられる。これに対し、他のラミニンファミリーとインテグリンファミリーとの組み合わせとして、細胞の接着に関与するラミニン−３２２（ラミニン５）とそのレセプターであるインテグリンα６β４とを用いた場合、当該ラミニン−３２２（ラミニン５）およびインテグリンα６β４の主な機能が菲薄化した表皮の表皮細胞を増殖させることよりも、細胞の剥離を防ぐことであるため、ラミニン−５１１とインテグリンα６β１による増殖効果を得ることが困難であると考えられる。

実施例１および２
ゴボウ抽出物（実施例１）または冬虫夏草抽出物（実施例２）と、オリーブ葉抽出物と、他の原料とを、下記組成となるように混合し、皮膚外用剤（乳液）を得る。
（乳液の組成）
ゴボウ抽出物または冬虫夏草抽出物 ０．１質量％
オリーブ葉抽出物 ０．１質量％
流動パラフィン １５．０質量％
ミツロウ ２．０質量％
ラノリン １．５質量％
セスキオレイン酸ソルビタン ２．５質量％
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル １．０質量％
１，２−オクタンジオール ０．０５質量％
１，３−ブチレングリコール １３．０質量％
キサンタンガム ０．５質量％
精製水 残部
合計 １００．０質量％

得られた実施例１または２で得られた皮膚外用剤を、シワ部位に連日塗布する。その後、皮膚外用剤の塗布部位のレプリカを作製する。得られたレプリカを皮膚用非接触３Ｄ測定システム〔ＧＦメステクニーク ゲーエムベーハー（ＧＦＭｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ）製、商品名：ＰＲＩＭＯＳ〕に供してシワに関するパラメーターを測定する。得られたパラメーターを用いて、実施例１または２で得られた皮膚外用剤を用いたときのシワ面積率Ａ、最大シワ平均深さＢ、最大シワ最大深さＣおよび総シワ平均深さＤを算出する。

また、前記乳液の組成において、ゴボウ抽出物（実施例１）または冬虫夏草抽出物（実施例２）と、オリーブ葉抽出物とを用いる代わりに、精製水を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、対照の皮膚外用剤（乳液）を得る。つぎに、前記において、実施例１または２で得られた皮膚外用剤を用いる代わりに対照の皮膚外用剤を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、対照の皮膚外用剤を用いたときのシワ面積率ａ、最大シワ平均深さｂ、最大シワ最大深さｃおよび総シワ平均深さｄを算出する。

その後、シワ面積率Ａとシワ面積率ａとの比較、最大シワ平均深さＢと最大シワ平均深さｂとの比較、最大シワ最大深さＣと最大シワ最大深さｃとの比較、および総シワ平均深さＤと総シワ平均深さｄとの比較のそれぞれを行なう。その結果、シワ面積率Ａがシワ面積率ａよりも小さいこと、最大シワ平均深さＢが最大シワ平均深さｂよりも小さいこととの比較、最大シワ最大深さＣが最大シワ最大深さｃ小さいことおよび総シワ平均深さＤが総シワ平均深さｄよりも小さいことが確認されることから、実施例１または２で得られた皮膚外用剤によってシワが改善されていることがわかる。

以上説明したように、ラミニン−５１１分泌促進剤、好ましくはゴボウ抽出物および冬虫夏草抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有する分泌促進剤と、インテグリンα６β１発現促進剤、好ましくはオリーブ葉抽出物を有効成分として含有する発現促進剤とを併用することにより、シワ、好ましくは表皮性シワを効果的に改善することができることがわかる。したがって、ラミニン−５１１分泌促進剤とインテグリンα６β１発現促進剤とを含有する皮膚外用剤は、シワ、好ましくは表皮性シワを効果的に改善する抗シワ用の皮膚外用剤として有用であることがわかる。

（処方例）
以下、本発明の皮膚外用剤の処方例を示す。

（処方例１：乳液）
下記原料を下記組成となるように混合し、乳液とした。
ゴボウ抽出物 ０．１質量％
オリーブ葉抽出物 ０．１質量％
流動パラフィン １５．０質量％
ミツロウ ２．０質量％
ラノリン １．５質量％
セスキオレイン酸ソルビタン ２．５質量％
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル １．０質量％
１，２−オクタンジオール ０．０５質量％
１，３−ブチレングリコール １３．０質量％
キサンタンガム ０．５質量％
精製水 残部
合計 １００．０質量％

（処方例２ 化粧水）
下記原料を下記組成となるように混合し、化粧水とした。
ゴボウ抽出物 ０．１質量％
オリーブ葉抽出物 ０．１質量％
１，３−ブチレングリコール ６．０質量％
グリセリン ４．０質量％
加水分解ヒアルロン酸 ０．１質量％
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル
０．２質量％
エチレングリコールフェニルエーテル ０．３質量％
エチルアルコール ３．０質量％
香料 適量
精製水 残部
合計 １００．０質量％

（処方例３ スキンケアクリーム）
下記原料を下記組成となるように混合し、スキンケアクリームとした。
ゴボウ抽出物 ０．１質量％
オリーブ葉抽出物 ０．１質量％
流動パラフィン ５．０重量％
パラフィン ５．０重量％
水素添加パーム油 ３．０重量％
ベヘニルアルコール ３．０重量％
ステアリン酸 １．０重量％
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル ５．０重量％
キサンタンガム ０．０５重量％
カルボキシビニルポリマー ０．４重量％
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン １．５重量％
ステアリン酸グリセリル ０．５重量％
１，３−ブチレングリコール １０．０重量％
１，２−オクタンジオール ０．２重量％
グリセリンモノ２−エチルヘキシルエーテル ０．３５重量％
グリセリン ５．０重量％
水酸化カリウム 適量
トコフェロール 適量
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム 適量
香料 適量
精製水 残部
合計 １００．０重量％

また、処方例１〜３において、ゴボウ抽出物を用いる代わりに、冬虫夏草抽出物を用いることを除き、処方例１〜３に示された組成と同様の組成となるように各原料を混合することにより、乳液、化粧水およびスキンケアクリームを得ることができる。

これらの乳液、化粧水およびスキンケアクリームについて、使用時および未使用時それぞれの皮膚におけるシワの状態およびシワの数を評価することにより、皮膚外用剤を用いることによって皮膚におけるシワの発生が抑制されていることが確認される。

Claims (2)

1. 抗シワ用の皮膚外用剤であって、ラミニン−５１１の分泌を促進する分泌促進剤とインテグリンα６β１の発現を促進する発現促進剤とを含有することを特徴とする皮膚外用剤。
2. 抗表皮性シワ用の皮膚外用剤である請求項１に記載の皮膚外用剤。