JP7059193B2 - ラミニン５１１産生促進剤、表皮基底膜安定化剤及び／又は表皮幹細胞減少抑制又は増加促進剤のスクリーニング方法 - Google Patents

ラミニン５１１産生促進剤、表皮基底膜安定化剤及び／又は表皮幹細胞減少抑制又は増加促進剤のスクリーニング方法 Download PDF

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Description

本発明は、表皮基底膜における表皮幹細胞の減少抑制又は増加促進の技術分野に関する。
表皮は、皮膚最外層に存在する皮膚組織である。表皮は、角層、顆粒層、有棘層、及び基底層から主に構成されている。基底層に存在する基底細胞が分裂し、外層へと移動する。この移動の過程で細胞において脱核が生じて扁平化し角層へと分化し、角層は最終的に剥がれ落ちる。このターンオーバーの期間はおよそ４５日程度といわれている。しかし、老化した皮膚では、ターンオーバー速度が遅くなり、表皮全体が薄くなる。その結果、バリア機能低下、水分含量の低下などの皮膚機能の低下が生じることが知られている。基底細胞は、分裂性に富む細胞であるが、無限に増殖を繰り返す訳ではなく、一定回数分裂すると分裂しなくなる。基底細胞は、基底膜上に存在する表皮基底幹細胞の一部が分化することにより、新たに供給される。しかしながら、老化に伴い、表皮基底幹細胞の数が減少することが知られており、表皮基底幹細胞の数が減少すると、表皮の薄化、表皮の乾燥、バリア機能低下などの老化の徴候を示すようになる。
近年、表皮基底幹細胞マーカーであるＭＣＳＰ抗体が開発されており、この抗体を用いることで、表皮基底幹細胞の識別が可能になっている。各年代の男女の非露光部の皮膚において、ＭＣＳＰ抗体を用いた表皮基底細胞可視化が行われており、老化に伴いＭＣＳＰ陽性の表皮基底幹細胞数が減少することが示されている（非特許文献１）。ＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞数の増加の促進作用又は減少の抑制作用を有する薬剤の開発が求められている。
Giangreco A, et al., J Invest Dermatol. 2010, 130(2): 604-8
本発明は、ＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞数を増加促進させるか、又は減少抑制する手法を提供することを目的とする。
本発明者らが、ＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞について鋭意研究を行ったところ、ＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞と基底膜付近に存在するラミニン５１１との関係性を見いだした。すなわち、基底膜付近のラミニン５１１が減少すると、それに応じてＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞の数も減少し、ラミニン５１１の発現量を増加させることで、ＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞数を増加できることを初めて見いだした。また、ラミニンは、ラミニンα、β及びγの複合体であるところ、ラミニン５１１の存在量を、ラミニンα５、β１、及びγ１の発現量を指標とすることで決定することができることを見いだした。
この知見に基づき、ラミニン５１１の発現を指標とした、ラミニン５１１発現促進剤のスクリーニング方法に関する発明に至った。ラミニン５１１発現促進剤は、基底膜を安定化することができることから、ラミニン５１１発現促進剤のスクリーニング方法は、基底膜安定化剤のスクリーニング方法ということもできる。また、ラミニン５１１の存在量が増し、基底膜が安定化されると、表皮基底幹細胞を増加作用又は減少抑制作用が生じることから、ラミニン５１１発現促進剤のスクリーニング方法は、表皮基底幹細胞の増加促進剤又は減少抑制剤のスクリーニング方法ということもできる。
より具体的には下記の発明に関する：
［１］ 表皮細胞におけるラミニン５１１の発現量を指標とする、ラミニン５１１発現促進剤のスクリーニング方法。
［２］ 候補薬剤を含む培養培地中で表皮細胞を培養する工程、
表皮細胞におけるラミニン５１１の発現量を測定する工程、
対照におけるラミニン５１１発現量と比較して、ラミニン５１１の発現が増加した場合に、候補薬剤がラミニン５１１発現促進効果を有すると判定する工程
を含む、項目１に記載の方法。
［３］ 前記ラミニン５１１の発現量が、ラミニン５１１のタンパク質量又はラミニンα５のｍＲＮＡ量、ラミニンβ１のｍＲＮＡ量、及びラミニンγ１のｍＲＮＡ量からなる群から選ばれる１以上のｍＲＮＡ量から決定される、項目１又は２に記載の方法。
［４］ ラミニン５１１の発現量が、ラミニンα５のｍＲＮＡ量、ラミニンβ１のｍＲＮＡ量、及びラミニンγ１のｍＲＮＡ量の合計量から決定される、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
［５］ 前記ラミニン５１１発現促進剤が、表皮基底膜安定化剤である、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
［６］ 表皮基底膜安定化剤が、表皮基底幹細胞の減少抑制又は増加剤である、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
［７］ 表皮細胞が表皮幹細胞を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
［８］ 表皮幹細胞が表皮基底幹細胞を含む、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
［９］ 表皮細胞がＭＣＳＰ発現細胞を含む、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
［１０］ 表皮細胞が、さらにインテグリンを発現している細胞を含む、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
［１１］ 表皮細胞が胎児由来である、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
［１２］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンを有効成分とする、ラミニン５１１の発現促進剤。
［１３］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンを有効成分とする、ラミニン５１１の発現促進による表皮基底膜安定化剤。
［１４］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンを有効成分とする、ラミニン５１１の発現促進による表皮基底幹細胞の減少抑制又は増加剤。
［１５］ 1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンを含む、細胞外マトリックス分解酵素の活性阻害剤。
［１６］ 細胞外マトリックス分解酵素が、マトリックスメタロプロテイナーゼ又はヘパラナーゼである、項目１５に記載の細胞外マトリックス分解酵素の活性阻害剤。
［１７］ 細胞外マトリックス分解酵素が、マトリックスメタロプロテイナーゼ９である、項目１５に記載の細胞外マトリックス分解酵素の活性阻害剤。
［１８］ 項目１５～１７のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス分解酵素の活性阻害剤を含む、ラミニン５１１分解抑制剤。
［１９］ 項目１５～１７のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス分解酵素の活性阻害剤を含む、表皮基底膜安定化剤。
［２０］ 項目１５～１７のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス分解酵素の活性阻害剤を含む、表皮基底幹細胞減少抑制又は増加促進剤。
［２１］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンを投与することを含む、表皮においてラミニン５１１の発現を亢進方法。
［２２］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンを投与し、ラミニン５１１の発現促進作用によって、表皮基底膜を安定化する方法。
［２３］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンを投与し、ラミニン５１１の発現促進作用によって、表皮基底幹細胞の減少を抑制するか又は増加を促進する方法。
［２４］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は１－（２－ヒドロキシエチル）－２－イミダゾリジノンを投与し、表皮においてラミニン５１１の発現を亢進させる、美容方法。
［２５］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は１－（２－ヒドロキシエチル）－２－イミダゾリジノンを投与し、表皮においてラミニン５１１の発現を亢進させ、ラミニン５１１の発現促進作用によって表皮基底膜を安定化する、美容方法。
［２６］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は１－（２－ヒドロキシエチル）－２－イミダゾリジノンを投与し、表皮においてラミニン５１１の発現を亢進させ、ラミニン５１１の発現促進作用によって表皮基底幹細胞の減少を抑制するか又は増加を促進する、美容方法。
［２７］ ラミニン５１１の発現促進するための化粧品又は医薬品を製造のための、褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンの使用。
［２８］ 表皮基底膜を安定化するための化粧品又は医薬品を製造のための、褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンの使用。
［２９］ 表皮基底幹細胞の減少を抑制するか又は増加を促進するための化粧品又は医薬品を製造のための、褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノンの使用。
［３０］ ラミニン５１１の発現促進を介して抗老化治療に用いるための褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノン。
［３１］ 表皮基底膜安定化を介して抗老化治療に用いるための褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノン。
［３２］ 表皮基底幹細胞の減少抑制又は増加を介して抗老化治療にもちいるための褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキス又は1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノン。
［３３］ 細胞外マトリックス分解酵素の活性阻害を介して抗老化治療にもちいるための1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノン。
［３４］ 細胞外マトリックス分解酵素が、マトリックスメタロプロテイナーゼ又はヘパラナーゼである、項目３３に記載の1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノン。
［３５］ 細胞外マトリックス分解酵素が、マトリックスメタロプロテイナーゼ９である、項目３３に記載の1-(2-ヒドロキシエチル)-2-イミダゾリジノン。
［３６］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキスを含む、皮膚バリア、ハリ、潤い、及び炎症の改善剤。
［３７］ 褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキスを含む、炎症抑制剤。
［３８］皮膚バリア、ハリ、潤い、及び炎症の改善剤の製造のための、褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキスの使用。
［３９］炎症抑制剤の製造のための、褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキスの使用。
［４０］褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキスを含む化粧料を皮膚バリア、ハリ、潤い、及び炎症の改善を必要とする対象に適用することを含む、皮膚バリア、ハリ、潤い、及び炎症の改善のための美容方法。
［４１］炎症を患う対象に褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキスを含む化粧料を適用することを含む、炎症抑制のための美容方法。
ＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞を増加させる薬剤のスクリーニングを、ラミニン５１１を指標とすることでより簡単な細胞実験で行うことが可能になる。
図１Ａは、２０代の腹部（非露光部）及び顔面部（露光部）と、６０代の腹部（非露光部）及び顔面部（露光部）におけるＭＣＳＰの発現を示した図である。図１Ｂは、各年代の被験者の腹部（非露光部）及び顔面部（露光部）の皮膚切片において、基底膜の長さに対するＭＣＳＰ陽性細胞の数を計測し比較したグラフである。図１Ｃは、各年代の被験者の皮膚切片におけるＭＣＳＰの発現量を比較したグラフである。 図２Ａは、２０代の腹部（非露光部）及び顔面部（露光部）と、６０代の腹部（非露光部）及び顔面部（露光部）におけるラミニン３３２、ラミニン５５１、及びβ１インテグリンの発現を示した図である。図２Ｂは、各年代の被験者の皮膚切片におけるラミニンα５の発現量を比較したグラフである。 図３Ａは、表皮培養の際に、培養プレートをラミニン５１１でコートした場合の、ＭＣＳＰの発現に対する影響を示す図である。図３Ｂは、表皮培養の際に、培養プレートをラミニン５１１でコートした場合の、ＣＤ４６、Ｌｒｉｇ１、ＤＬＬ１、ＣＤ４４からなる幹細胞マーカーの遺伝子発現に対する影響を示すグラフである。 図４Ａは、ヒト皮膚組織培養によりラミニン５１１が減少することを示しており、ＭＭＰ阻害剤（N-hydroxy-2(R)-[[(4-methoxy- phenyl)sulfonyl](3-picolyl)amino]-3-methylbutanamide hydrochloride、以下ＣＧＳ２７０２３Ａ）及びヘパラナーゼ阻害剤（1-[4-(1H-Benzoimidazol-2-yl)phenyl]-3-[4-(1H-benzoimidazol-2-yl)phenyl]urea、以下ＢＩＰＢＩＰＵ）を添加した場合に、ラミニン５１１が増強されていることを示す図である。図４Ｂは、ヒト皮膚組織培養によりＭＣＳＰが減少することを示しており、ＭＭＰ阻害剤（ＣＧＳ２７０２３Ａ）及びヘパラナーゼ阻害剤（ＢＩＰＢＩＰＵ）を添加した場合に、ＭＣＳＰが維持又は増強されていることを示す図である。 図５Ａは、アルジェレックスの添加により、ラミニンα５、ラミニンβ１、及びラミニンγ１の遺伝子発現が、用量依存的に増加することを示すグラフである。図５Ｂは、アルジェレックスの添加により、ラミニンα５鎖のタンパク質量が、用量依存的に増加することを示すグラフである。 図６は、アルジェレックスの添加による遺伝子発現の変化を示すグラフである。ヘパラナーゼ（ＨＰＡ）遺伝子（図６Ａ）、ＰＤＧＦ－ＢＢ遺伝子（図６Ｂ）、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）遺伝子（図６Ｃ）、ヒアルロニダーゼ１（ＨＹＡＬ１）（図６Ｄ）、及びインターロイキン８（ＩＬ－８）遺伝子（図６Ｅ）の発現量の変化が調べられた。 図７は、ex vivoヒト皮膚の器官培養における１－（２－ヒドロキシエチル）-２-イミダゾリジノン（ＨＥＩ）の添加による、ラミニン５１１及びＭＣＳＰのタンパク質発現に対する影響を示す図である。 図８は、１－（２－ヒドロキシエチル）-２-イミダゾリジノン（ＨＥＩ）のヘパラナーゼ阻害活性を示すグラフである。 図９は、１－（２－ヒドロキシエチル）-２-イミダゾリジノン（ＨＥＩ）のＭＭＰ９の阻害活性を示す図である。 図１０Ａは、ex vivoヒト皮膚の器官培養における１－（２－ヒドロキシエチル）-２-イミダゾリジノン（ＨＥＩ）の添加による、フィラグリンタンパク質発現の変化を示す図である。図１０Ｂ及びＣは、ex vivoヒト皮膚の器官培養における１－（２－ヒドロキシエチル）-２-イミダゾリジノン（ＨＥＩ）の添加による、ＴＥＷＬ及び角層水分含量の変化を示すグラフである。図１０Ｄ及びＥは、in vivo一重遮蔽ヒト連用試験における１－（２－ヒドロキシエチル）-２-イミダゾリジノン（ＨＥＩ）による、ＴＥＷＬ及び角層水分含量の変化を示すグラフである。 図１１Ａは、皮膚組織の器官培養において、ＭＭＰ阻害剤（ＣＧＳ２７０２３Ａ）及びヘパラナーゼ阻害剤（ＢＩＰＢＩＰＵ）を添加した場合に、基底膜直下における電子顕微鏡写真である。基底膜の下部にコラーゲン線維の断面が写っている。図１１Ｂは、電子顕微鏡写真上で測定されたコラーゲン線維の直径と頻度を示すヒストグラムである。図１１Ｃは、電子顕微鏡写真上における線維の直径の平均値を示す。図１１Ｄは、電子顕微鏡写真上における線維の密度の平均値を示すグラフである。 図１２Ａは、若齢（２９歳）と老齢（６０歳）の対象から取得された皮膚試料における、Ｖ型コラーゲンの発現と、ケラチノサイトを示すＫ－１４の発現とを示す蛍光顕微鏡写真である。 図１２Ｂは、若齢対象から取得されたケラチノサイト及び線維芽細胞、並びに老齢対象から取得されたケラチノサイト及び線維芽細胞におけるＶ型コラーゲンに対する遺伝子ＣＯＬ５Ａ１の発現量を示すグラフである。 図１３Ａは、皮膚組織の器官培養及び皮膚三次元モデルにおける、ＭＭＰ阻害剤（ＣＧＳ２７０２３Ａ）及びヘパラナーゼ阻害剤（ＢＩＰＢＩＰＵ）の添加による、Ｖ型コラーゲンの発現と、ケラチノサイトを示すＫ－１４の発現とを示す蛍光顕微鏡写真である。 図１３Ｂは、皮膚三次元モデルの真皮におけるＶ型コラーゲンの遺伝子ＣＯＬ５Ａ１発現を示すグラフである。 図１３Ｃは、皮膚組織の器官培養において、ＭＭＰ阻害剤（ＣＧＳ２７０２３Ａ）及びヘパラナーゼ阻害剤（ＢＩＰＢＩＰＵ）を添加した場合に、基底膜直下の線維芽細胞に着目した電子顕微鏡写真である。 図１４は、ＭＭＰ阻害剤（ＣＧＳ２７０２３Ａ）及びヘパラナーゼ阻害剤（ＢＩＰＢＩＰＵ）を添加されて培養された皮膚三次元モデルの培養物から採取された培養上清を、培養された真皮線維芽細胞に添加した場合のＶ型コラーゲンの遺伝子ＣＯＬ５Ａ１発現を示すグラフである。 図１５は、培養ヒト線維芽細胞に対して、ＰＤＧＦ－ＢＢを添加した場合における、Ｖ型コラーゲンの遺伝子ＣＯＬ５Ａ１発現を示すグラフである。 図１６Ａは、若齢（３２歳）と老齢（６８歳）の対象から取得された皮膚試料における、ＰＤＧＦＲβの発現と、ケラチノサイトを示すＫ－１４の発現とを示す蛍光顕微鏡写真である。 図１６Ｂは、各年齢の正常ヒト表皮細胞におけるＰＤＧＦ－ＢＢたんぱく質の遺伝子ＰＤＧＦＢの発現量を示すグラフである。
本発明は、表皮細胞におけるラミニン５１１の発現を指標とした、ラミニン５１１発現促進剤のスクリーニング方法に関する。より具体的には、ラミニン５１１発現促進剤のスクリーニング方法は、以下の：
候補薬剤を含む培養培地で表皮細胞を培養する工程、
表皮細胞におけるラミニン５１１の発現を測定する工程、
対照におけるラミニン５１１発現量と比較して、ラミニン５１１の発現が増加した場合に、候補薬剤がラミニン５１１発現促進効果を有すると判定する工程
を含む。さらに、培養表皮細胞に対し、紫外線を照射する工程を含んでもよい。紫外線の照射により、ラミニン５１１の発現量は減少する。紫外線の照射は、一例として、培養細胞に対し、１ｍＪ/ｃｍ2～２００ｍＪ/ｃｍ2で照射することにより行われうる。紫外線の照射は、マトリクスメタロプロテイナーゼの活性を増強し、ラミニンの分解をもたらしうる。よって紫外線照射下において、候補薬剤が、ラミニン５１１のタンパク質量の減少を抑制できる場合には、候補薬剤がラミニン５１１の分解抑制効果および発現促進効果を有することがわかる。候補薬剤によるマトリクスメタノプロテイナーゼの活性に対する阻害効果を調べることで、候補薬剤がラミニン５１１の発現促進効果を有することを決定することができる。
候補薬剤を含む培養培地で表皮細胞を培養する工程は、候補薬剤を含む培地と培養表皮細胞が接触すれば任意の方式で行われてもよい。培養している培地に候補薬剤又はその希釈液を直接添加してもよいし、候補薬剤が含まれた培地に置換されてもよい。培養は、ヒト表皮細胞の培養に用いる通常の条件下で行われる。一例としては、３７℃、５％ＣＯ2加湿雰囲気下のインキュベーター内で培養される。候補薬剤の添加後の培養時間は、候補薬剤の効果に応じて任意に設定することができる。候補薬剤の効果を十分に発揮させる観点から、例えば３００分以上、好ましくは６時間以上、より好ましくは４８時間以上培養することができる。また、候補薬剤の効果の飽和を防ぐ観点から、例えば７日以下、好ましくは５日以下、より好ましくは７２時間以下の期間培養することができる。
培養表皮細胞におけるラミニン５１１の発現の測定は、ラミニン５１１を認識する抗体を用いて、分子生物学の任意の手法を用いて測定することができる。ラミニン５１１のタンパク質量の測定には、例えばウエスタンブロットや免疫染色法を用いることができる。また、ラミニン５１１の発現は、ラミニン５１１の構成サブユニット（α５、β１、γ１）のｍＲＮＡ転写量に基づき測定することができる。ｍＲＮＡの転写量は、一例として、ノーザンブロットや定量的ＰＣＲを行うことにより測定することができる。構成サブユニットは、任意の１つの転写量に基づき測定することもできるし、２つ又は３つの転写量の組合せとして測定することもできる。１の態様では、ラミニンα５、ラミニンβ１、及びラミニンγ１のそれぞれの発現量を合計することで、発現量を測定することができる。また別の態様では、最も低い発現量の構成サブユニットの量を、ラミニン５１１の発現量とすることもできる。
対照におけるラミニン５１１発現量と比較して、候補薬剤を含む培養培地で培養された表皮細胞においてラミニン５１１の発現が増加した場合、候補薬剤がラミニン５１１発現促進効果を有すると判定することができる。一の態様では、発現量に有意差がある場合に、候補薬剤がラミニン５１１発現促進効果を有すると判定することができる。また、別の態様では、発現量が、所定の割合で増加した場合に、候補薬剤がラミニン５１１発現促進効果を有すると判定することができる。所定の割合は、当業者であれば任意に決定することができるが、例えば対照の発現量に比較して、１０％、より好ましくは２０％、さらに好ましくは３０％、さらにより好ましくは５０％を、所定の割合として選択することができる。この判定は、実験者が行ってもよいし、ソフトウェアが解析することで行ってもよい。本発明のスクリーニング方法を大規模に行う観点から、判定工程は、発現測定を行った機器、又は当該機器からデータを取得したプロセッサを含むコンピュータにより行われることが好ましい。対照におけるラミニン５１１発現量とは、候補薬剤が含まれない点を除いて、同じ操作を行った表皮細胞におけるラミニン５１１の発現量のことをいう。したがって、前述の培養工程及び発現測定工程は、候補薬剤を含まない培養培地で対照の表皮細胞を培養し、対照の表皮細胞におけるラミニン５１１の発現を測定する工程が含まれてもよい。対照についての培養工程及び発現工程は、候補薬剤を含む培養培地を用いた培養工程及び発現工程と同時平行で行われてもよいし、予め行われていてもよい。
本発明のスクリーニング工程は、前述の工程の他に、候補薬剤を含む培養培地で表皮細胞を培養する工程の前に行われる前培養工程、候補薬剤を含む培養培地で表皮細胞を培養する工程の後にさらに候補薬剤を含まない培養培地で培養される後培養工程、細胞を回収する回収工程、回収された細胞、或いは回収された細胞から抽出されたタンパク質、ｍＲＮＡ、若しくはｍＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを貯蔵する工程といった任意の付加的工程を含むことができる。
ラミニンは、ラミニンファミリーに属するタンパク質であり、基底膜を構成するタンパク質の一つである。ラミニンファミリーの中で、特にα３β３γ２のサブユニットから構成されるラミニン３３２やα５β１γ１サブユニットから構成されるラミニン５１１が、基底膜に存在することが知られている。ラミニンは、細胞上に発現するインテグリンにより認識され、細胞足場として機能する。基底膜に存在するラミニンを足場にして、表皮基底細胞が層を形成する。
ラミニン５１１は、細胞接着や増殖に関与するタンパク質であり、主に表皮基底膜に存在する。ラミニン５１１は、β１インテグリン、特にα6β1インテグリンと結合性を有する。細胞実験では、β１インテグリンを発現する幹細胞の増殖と関与しており、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の培養に用いられている。生体では、ラミニン５１１は、老化とともに減少することが知られている。本発明者らは、ラミニン５１１が、老化以外にも紫外線の影響により、減少することを明らかにした（図１）。理論により制限することを意図するものではないが、紫外線により、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が活性化され、それによりラミニン量が減少すると考えられる。ところが、本発明者らにより、ラミニン３３２は加齢や紫外線による影響が少ない一方で、ラミニン５１１は加齢に伴い減少し、さらに紫外線の影響により減少することが示された（図２Ａ）。この傾向は、幹細胞において発現されるβ１インテグリンと同傾向を示しており、さらにＭＣＳＰ発現幹細胞についても同傾向が見られた（図１Ａ）。
ラミニン５１１発現促進剤とは、最も広義に解釈することができ、ラミニン５１１のタンパク質量を増大させることができる薬剤であれば、任意の薬剤を含むことができる。したがって、単にラミニン５１１の遺伝子発現を促進することができる薬剤のみならず、ヘパラナーゼ阻害作用やＭＭＰ阻害作用により、ラミニン５１１のタンパク質量を増大させる薬剤もラミニン５１１発現促進剤ということができる。ラミニン５１１の発現は、タンパク質量又はｍＲＮＡ量により決定できる。ラミニン５１１は、複合体タンパク質であるので、ラミニン５１１発現促進剤は、構成サブユニットの各ｍＲＮＡをそれぞれ発現促進することができる。ラミニン５１１発現促進剤は、表皮基底膜におけるラミニン５１１の発現を増加させることにより、表皮基底膜安定化作用、表皮幹細胞減少抑制作用、及び表皮幹細胞増加促進作用を発揮することができる。したがって、ラミニン５１１発現促進剤は、表皮基底膜安定化剤、表皮幹細胞減少抑制剤、又は表皮幹細胞増加促進剤と言うこともできる。
表皮基底膜は、表皮最下層に存在し、表皮と真皮の境界を構成する。表皮基底膜は、コラーゲン、プロテオグリカン、エンタクチン、ラミニンから主に構成される薄い膜状の細胞外マトリックスである。基底膜上に、基底細胞が配置されており、基底膜と基底細胞を含めて表皮の基底層と呼ばれる。基底膜には、コラーゲンとしてＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、及びＶＩＩ型コラーゲンが主に含まれる。基底膜には、ラミニンとしては、ラミニン５１１やラミニン３３２が主に含まれる。基底膜は、マトリックスメタロプロテイナーゼやヘパラナーゼなどの細胞外マトリックス分解酵素の影響により、部分的に分解されて不安定化する。不安定化された基底膜では、ラミニンが減少し、ラミニンを細胞足場として増殖する表皮細胞、例えばβ１インテグリン発現細胞が失われうる。表皮細胞の中では、表皮幹細胞、特に表皮基底幹細胞がβ１インテグリン発現細胞と考えられており、ラミニン減少と共に、これらの細胞が失われうる。
真皮に含まれるコラーゲンは、真皮中の位置に応じて形状が異なり、構成するコラーゲンの種類も異なる。表皮基底膜領域には、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、及びＶＩＩ型コラーゲンが含まれており、基底膜直下の領域には、線維細網板と呼ばれる細いコラーゲン線維束が位置し、深部にいくにつれて、コラーゲン細線維が位置し、最深部には太いコラーゲン線維が位置する。基底膜直下領域の線維細網板は、主にＶ型コラーゲンにより構成され、コラーゲン細線維は、ＩＩＩ型コラーゲンとＶ型コラーゲンにより構成されており、最深部のコラーゲン線維は、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンにより構成される。
基底膜直下のＶ型コラーゲンは、真皮層の真皮線維芽細胞により産生されるが、本発明者らの研究により、年齢依存的に減少することが示された（図１２）。さらに、驚くべきことに、Ｖ型コラーゲンの存在が、基底膜の存在と密接に関わっていることを見出した（図１３Ａ）。その一方で、真皮層全体としてのコラーゲン産生量は、基底膜を保護するＭＭＰ阻害剤やヘパラナーゼ阻害剤の添加による影響を受けなかった（図１３Ｂ）。これらの結果を受けて、本発明者らは、基底膜側からなんらかの因子が分泌されることで、基底膜直下の真皮線維芽細胞のみが活性化され、Ｖ型コラーゲンを産生するという仮説に至った。この仮説を実証するため、真皮層、基底膜、及び表皮層を含む皮膚三次元モデルにおいて、培地に基底膜を保護するＭＭＰ阻害剤及びヘパラナーゼ阻害剤を添加した培養物の培地を採取し、かかる培地を線維芽細胞培養物に添加することで、Ｖ型コラーゲンの発現を調べたところ（図１４）、基底膜を保護するＭＭＰ阻害剤及びヘパラナーゼ阻害剤を添加した培養物から得た培地が、Ｖ型コラーゲン発現促進作用を有することを見出した。
基底膜を保護するＭＭＰ阻害剤及びヘパラナーゼ阻害剤を添加した皮膚三次元モデルの培養物から表皮を回収し、阻害剤の添加の有無で発現が変化した成長因子に着目したところ、ＰＤＧＦ－ＢＢを、Ｖ型コラーゲン発現促進作用を有する成長因子として特定した（図１５）。ＰＤＧＦ－ＢＢの受容体であるＰＤＧＦＲβは、基底膜直下の真皮線維芽細胞において発現することが示された。理論に限定されることを意図するものではないが、これらの知見から、老化にしたがい、基底膜がダメージを受けると、ＰＤＧＦ－ＢＢの産生量がへり、それに伴いＶ型コラーゲンの発現量が低下することで、皮膚のハリが失われるという老化モデルを説明することができる。この老化モデルを参照すると、本発明により特定されたラミニン５１１発現促進剤、表皮基底膜安定化剤、表皮幹細胞の減少抑制または増加促進剤は、ＰＤＧＦ－ＢＢの産生促進剤ということもでき、またコラーゲン産生促進剤、特に好ましくはＶ型コラーゲンの産生促進剤として用いることもでき、ハリ改善剤として、化粧料に配合しうる。
表皮基底膜安定化剤とは、表皮基底膜を安定化できる薬剤をいう。基底膜安定化剤は、基底膜を分解する細胞外マトリックス分解酵素の阻害剤であってもよく、また基底膜構成分子の発現促進剤であってもよい。細胞外マトリックス分解酵素の阻害剤としては、ヘパラナーゼ阻害剤が挙げられ、例えばムクロジエキスパウダー、カノコソウエキスＥ、陳皮エキスＢＧ、ホワイトリリー、長命草エキス、ＩＢＲ、Ｓ－１７３、ＢＩＢＩＰＵといった薬剤が知られている。また、細胞外マトリックス分解酵素の阻害剤として、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤も挙げられ、例えばウコンエキスＢＧ、トルメンチラエキス、マンゴスチンエキスＢＧ、ＣＧＳ２７０２３Ａといった薬剤が知られている。表皮基底膜の安定化を介して表皮基底幹細胞の減少抑制、又は増殖させることができる。したがって、表皮基底膜安定化剤は、表皮基底幹細胞の減少抑制剤、又は増加促進剤ということもできる。表皮基底幹細胞の減少抑制又は増加促進剤は、表皮基底幹細胞の増殖、減少の抑制、又は維持作用を発揮することができる薬剤をいう。また表皮基底幹細胞の減少抑制剤又は増加促進剤を介して、表皮の老化防止作用を発揮することができる。したがって、表皮基底膜安定化剤は、皮膚老化防止剤ということもできる。
本発明の表皮幹細胞減少抑制又は増加促進剤とは、皮膚において表皮幹細胞の減少抑制、維持、又は増加促進することができる薬剤をいう。表皮幹細胞は、老化や紫外線照射にともない数が減少するが本発明の表皮幹細胞減少抑制又は増加促進剤を適用することで、表皮幹細胞の減少抑制又は維持することができる。また別の態様では、表皮幹細胞の数を増加することもできる。
本発明に使用される表皮細胞は、培養表皮細胞を用いることができる。培養表皮細胞は、分化誘導を行って得られた３次元表皮モデルを用いることもできる。表皮細胞は、ケラチノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、メラノサイト、表皮基底細胞を含むことができ、さらに、表皮幹細胞を含むことが好ましい。さらに好ましくは、かかる表皮幹細胞は、ＭＣＳＰを発現する表皮幹細胞、すなわち表皮基底幹細胞であることが好ましい。表皮細胞の中には、表皮基底幹細胞の他にも、バルジ領域や皮脂腺にも表皮幹細胞が存在すると考えられるが、これらの中で、表皮基底幹細胞のみが、ＭＣＳＰを発現することができる。したがって、ＭＣＳＰ発現表皮幹細胞は、通常、表皮基底幹細胞のことを指す。
表皮細胞は、インテグリンを発現していることが好ましい。発現されるインテグリンとしては、αインテグリン、βインテグリンなどがあげられる。特に表皮幹細胞は、β１インテグリンを発現しているものが好ましい。表皮細胞は、任意の動物種由来の細胞であってよいが、種毎の影響を排除する目的で、ヒトの細胞であることが好ましい。ヒト培養細胞は、成人、小児、幼児、乳児、新生児、胎児など任意の由来であってよいが、基底幹細胞が多く含まれる細胞を用いる観点から、胎児由来であることが好ましい。
表皮細胞において発現されるインテグリンは、細胞膜に存在し、細胞外マトリックスのレセプターとして機能する分子をいう。インテグリンは、α鎖とβ鎖とから構成される。α鎖は、１８種ほど見つかっており、β鎖は８種ほど見つかっている。β１インテグリンとは、β鎖が、β１サブユニットであり、α鎖は任意のサブユニットであるインテグリンをいう。β１サブユニットを含むインテグリンは、ラミニンとの結合性が高い。理論に限定されることを意図しないが、老化や紫外線の影響によりラミニン５１１が失われることで、β１インテグリンを発現する幹細胞も失われ、結果としてＭＣＳＰ発現幹細胞の数が減少すると考えられる。
候補薬剤は、化粧品や医薬品の任意のライブラリーに含まれる薬剤を用いることができる。これらのライブラリーとしては、化合物ライブラリー、抽出物ライブラリーなど任意のライブラリーを用いることができる。候補薬剤のうち、ラミニン５１１の発現を増加できる薬剤を選択することで、ラミニン５１１発現促進剤、表皮基底膜安定化剤、表皮基底幹細胞の減少抑制又は増加促進剤としてスクリーニングすることができる。
対照とは、判定工程において候補薬剤のラミニン５１１発現促進効果を判定するために使用される比較のための基準となるラミニン５１１発現量をもたらす実験群を指す。したがって、候補薬剤のみを含まずに、同条件で、同期間培養された培養細胞を用いて決定されたラミニン５１１の発現量が、対照の発現量として比較のために供される。このような対照の発現量は、候補薬剤を含む培養培地で表皮細胞を培養する工程と平行して細胞を培養し、ラミニン５１１の発現を測定することで決定されてもよいし、予め別に同条件で同期間培養し、ラミニン５１１の発現を測定することで決定されてもよい。
本発明のスクリーニング方法を、化粧品原料に対して行ったところ、アルジェレックスがラミニン５１１産生促進効果を有する薬剤として選択された。このようにして選択された薬剤は、ラミニン５１１の発現促進剤であり、表皮基底膜安定化剤でもあり、また表皮基底幹細胞の減少抑制剤でもあり、また表皮基底幹細胞の増加促進剤でもある。
アルジェレックスとは、一丸ファルコス株式会社から販売される化粧品原料であり、海藻抽出エキスに関する。より具体的に、アルジェレックスは、褐藻・紅藻・緑藻の混合抽出エキスに関する。褐藻の全藻を、５０％１，３－ブチレングリコール中に３日間浸漬をし、ろ過してえられた褐藻抽出液と、褐藻、紅藻、及び緑藻の全藻を、５０％１，３－ブチレングリコール中に３日間浸漬をし、ろ過してえられた褐藻、紅藻、及び緑藻の抽出液とを混合して得られる。アルジェレックスは、水分含量を改善し、また肌荒れに対する抑制効果を発揮すると考えられている。アルジェレックスに用いられる褐藻は、コンブ属及びワカメ属の藻類であり、一例としてミツイシコンブやワカメである。アルジェレックスに用いられる紅藻は、ムカデノリ属の藻類であり、一例としてキリンサイやヒジリメンである。アルジェレックスに用いられる緑藻は、アオサ属の藻類であり、一例としてウスバアオノリである。
本発明において、海藻抽出エキスは、褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の藻類から抽出されたエキスに関する。さらに好ましい態様では、海藻抽出エキスは、褐藻、紅藻、及び緑藻の抽出エキスに関する。さらにより好ましくは、コンブ属及びワカメ属の褐藻、ムカデノリ属の紅藻、及びアオサ属の緑藻の抽出エキスであり、最も好ましくは、アルジェレックスである。使用される溶媒は、任意の溶媒であってよく、水、アルコール、エーテル、エステルなどを単独で又は混合して用いることができる。使用されるアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの１価アルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコールなどの２価アルコール、及びグリセリンなどの３価アルコールが用いられてもよい。エーテルとしては、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、エチルメチルエーテル、テトラヒドロフランなどが用いられてもよい。エステルとしては、酢酸メチル、酢酸エチルなどが用いられてもよい。混合物として使用される場合、任意の混合比で使用することができる。例えば水と１，３－ブチレングリコールの混合液は、１：１０～１０：１の範囲で使用することができ、さらに好ましくは３：１０～１０：３の範囲で使用できる。１：１混合液を使用してもよい。海藻抽出エキスは、化粧料に配合することができる。例えば０．０００１％～１０％の量、好ましくは０．００１％～１．０％の海藻抽出エキスを化粧料に配合することができる。一例として、０．０１％の海藻抽出エキスを、例えば美容液、化粧水、乳液、クリーム等の化粧料に配合することができる。
ラミニン５１１発現促進剤として、スクリーニングされた本発明の海藻抽出エキスは、ラミニン５１１発現促進効果、基底膜安定化効果、及び表皮幹細胞増殖促進又は減少抑制効果を発揮する。また、これらの効果に起因して、又は独立に、海藻抽出エキスは、ヘパラナーゼ遺伝子の発現を抑制する。これにより、皮膚バリア機能の改善作用を発揮する。したがって、海藻抽出エキスを含むラミニン５１１発現促進剤は、ヘパラナーゼ遺伝子の発現抑制剤又は皮膚バリア機能改善剤として使用することもできる。また、これらの効果に起因して、又は独立に、海藻抽出エキスは、ヒアルロン酸合成酵素２遺伝子の発現を増加するとともに、ヒアルロニダーゼ遺伝子の発現を抑制する。これにより、肌のうるおいが向上する。したがって、海藻抽出エキスを含むラミニン５１１発現促進剤は、ヒアルロン酸増加促進剤又は肌うるおい向上剤として使用することもできる。また、これらの効果に起因して、又は独立に、海藻抽出エキスは、ＰＤＧＦ－ＢＢの発現を増加する。ＰＤＧＦ－ＢＢは、真皮線維芽細胞に作用することで、コラーゲン、特にＶ型コラーゲンの産生を促進することから、海藻抽出エキスを含むラミニン５１１発現促進剤は、ハリの改善作用を発揮する（生体医工学(2017) 55(2):97-102)。また、ＰＤＧＦ－ＢＢは、間葉系幹細胞の安定化に寄与することが知られている。間葉系幹細胞には真皮幹細胞も含まれ、ＰＤＧＦ－ＢＢは真皮幹細胞に作用して、ハリの改善作用を発揮する。したがって、海藻抽出エキスを含むラミニン５１１発現促進剤は、ＰＤＧＦ－ＢＢの発現促進剤又はハリ改善剤として使用することもできる。また、これらの効果に起因して、又は独立に、海藻抽出エキスは、ＩＬ－８の発現を抑制する。これにより、炎症抑制作用を発揮する。したがって、ラミニン５１１発現促進剤は、ＩＬ－８の発現抑制剤、炎症抑制剤として使用することもできる。したがって、海藻抽出エキスは皮膚バリア、ハリ、潤い、及び炎症の改善剤ということもでき、皮膚バリア、ハリ、潤い、及び炎症を患うか、又は改善を必要とする対象に適用されうる。
本発明の別の態様では、本発明は、皮膚バリア、ハリ、潤い、及び炎症のうちの少なくとも１、好ましくは全ての改善のための美容方法に関する。かかる美容方法は、褐藻、紅藻、及び緑藻からなる群から選ばれる少なくとも１の抽出エキスを含む化粧料を、皮膚バリア、ハリ、潤い、及び炎症の少なくとも１、好ましくは全てを患うか、又は改善を必要とする対象に適用することを含む。このような対象は、１）皮膚におけるヒアルロン酸低下、２）皮膚バリア機能の低下、３）炎症の開始、４）乳頭層における線維量の低下、及び ５）ＰＤＧＦ－ＢＢ産生低下のうちの少なくとも１、または全ての症状を有しうる。さらに別の態様では、皮膚バリア、ハリ、潤い、及び炎症の少なくとも１、好ましくは全てを患うか、又は改善を必要とする対象は、皮膚水分量低下、肌荒れ、色素沈着及び肌の黒化、皮膚の柔軟性の低下などの症状を患っている対象でもある。本発明の美容方法では、かかる対象に対し、１日少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回、適量を顔面及び体表面に適用することができる、特に好ましい態様は、入浴後、就寝前、及び/又は起床後に適用することができる。
１－（２－ヒドロキシエチル）-２-イミダゾリジノン（ＨＥＩ）は、下記の化学式：
Figure 0007059193000001
 で表される化合物である。ＨＥＩは、ヘパラナーゼ阻害活性及びＭＭＰ９阻害活性を有することが示された（図８及び９）。また、ＨＥＩは、ラミニン５１１の発現促進効果及びαＭＣＳＰ陽性の幹細胞維持効果を有する（図７）。理論に限定されることを意図するものではないが、ヘパラナーゼ阻害及びＭＭＰ９阻害活性により、ラミニン５１１の発現促進効果を発揮し、それによりαＭＣＳＰ陽性の幹細胞維持効果が発揮されうる。よって、本発明は、ＨＥＩを含むラミニン５１１発現促進剤に関する。ヘパラナーゼとＭＭＰ９は、ともに細胞外マトリックス分解酵素であるため、ＨＥＩは、細胞外マトリックス分解酵素阻害剤ということもできる。ヘパラナーゼやＭＭＰ９は、癌が転移する際に発現する際に利用されることが知られている。癌細胞がこれらの酵素の働きにより基底膜を破壊して血流にのり転移が生じる。またＭＭＰ９は、血管新生にも関与している。したがって、ＭＭＰ９阻害剤は、血管新生抑制剤として使用することができ、それにより癌細胞の増殖抑制作用を有する。したがって、本発明におけるヘパラナーゼとＭＭＰ９の活性阻害剤、基底膜安定化剤は、化粧料への配合のみならず、癌の転移抑制剤、血管新生抑制剤、癌細胞増殖抑制剤として医薬に使用することもできる。化粧料や医薬品に配合される場合には、一例として、０．００００１％～１０％の範囲、好ましくは０．０００１％～５％の範囲、より好ましくは０．００１％～３％の範囲で配合することができる。一例として、化粧水、美容液、乳液、クリームなどの化粧料にたいし、１．５％で配合することもできる。
本発明でスクリーニングされた、ラミニン５１１の発現促進剤、表皮基底膜安定化剤、及び表皮基底幹細胞の減少抑制又は増加促進剤は、それぞれ、化粧品素材として化粧料に配合することができる。この化粧品素材が配合された化粧料は、ラミニン５１１の発現促進を介して、表皮基底膜の安定化を介して、又は表皮基底幹細胞の減少抑制若しくは増加促進を介して、表皮に対して抗老化作用又は抗紫外線作用を発揮することができる。化粧料としては、任意の化粧料に配合することができ、例えば美容液、化粧水、乳液、クリーム、ボディミルク、入浴剤、日焼け止め、化粧下地、メークアップ商品、ローション、アフターシェービングクリームなどに使用することができる。また、医薬品、医薬部外品などに配合することもできる。こうした医薬品は、経口、経皮、筋肉内、静脈内など、任意の経路で投与することができるが、皮膚に直接作用される観点からは、経皮投与で投与することが好ましい。経皮投与で投与するための、皮膚外用剤、皮膚パッチなどに剤形されることが好ましい。特に皮膚外用剤に配合することができる。これらの化粧品や医薬品に一般に添加できる薬剤、例えば保湿剤、美白剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、着色剤、香料、水、溶媒、防腐剤、保存剤、ｐH調整剤、ゲル化剤、その他活性成分を含むことができる。
ＨＥＩの投与により、フィラグリンの遺伝子発現量が増加し、また皮膚バリア機能の向上、水分含量の向上が確認された。これらの作用は、ラミニン５１１の発現促進により、基底膜が安定化したことに起因すると考えられる。表皮幹細胞の減少は、あらゆる面から表皮の老化現象に関わりうる。表皮の老化とは、一例として、潤いの低下、肌荒れ、色むら、及び皮膚のハリの低下などが挙げられる。これらの老化現象は、それぞれ、ヒアルロン酸低下、皮膚バリア機能の低下、炎症惹起、及び乳頭層線維やＰＤＧＦ－ＢＢの産生減少が原因となって生じている。これらの老化現象は、すべて表皮基底幹細胞の数の減少抑制又は増加促進により解決することができる。したがって、ラミニン５１１発現促進剤、表皮基底膜安定化剤、及び表皮基底幹細胞の減少抑制又は増加促進剤は、それぞれ、フィラグリン遺伝子発現促進作用、皮膚バリア機能向上作用、水分含量向上作用、ヒアルロン酸増加作用、炎症鎮静作用、及び乳頭層線維やＰＤＧＦ－ＢＢ産生促進作用からなる群から選ばれる１以上の作用を有する抗老化剤ということもできる。また、ラミニン５１１発現促進剤、表皮基底膜安定化剤、及び表皮基底幹細胞の減少抑制又は増加促進剤は、それぞれ、フィラグリン遺伝子発現促進剤、皮膚バリア機能向上剤、水分含量向上剤、ヒアルロン酸増加剤、炎症鎮静剤、及び乳頭層線維やＰＤＧＦ－ＢＢ産生促進剤ということもできる。
実施例１：ヒト皮膚におけるＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞の加齢変化及び紫外線の影響の測定
サンプル
インフォームドコンセントを行った２０代から７０代の被験者（２０代：９名、３０代：１０名、４０代：１０名、５０代：：９名、６０代：１０名、及び７０代：９名）の顔面及び腹部の皮膚サンプルを取得し、ＡＭｅｘ法に従って冷アセトンを用いて固定し、そしてパラフィンに包埋した。
包埋された組織を厚さ３μｍの切片にし、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）抗体（MAB2029,Chemicon, Billerica, MA）を１次抗体として用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（Lifetechnologies, Carlsbad, CA）を用いて染色した。さらにＤＡＰＩを用いて核染色を行い、さらに抗α６インテグリン抗体（GOH3, SantaCruz, Dallas, TX)を１次抗体として用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ５９４標識抗ラットＩｇＧ抗体（Lifetechnologies, Carlsbad, CA）を用いて染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡を用いて可視化し、画像をＤＰコントロールデジタルカメラで取得した。２０代の被験者及び６０代の顔面部及び腹部の染色結果を図１Ａに示す。
図１Ａの結果から、２０代の被験者と、６０代の被験者において、表皮基底層に存在するＭＣＳＰ陽性の基底細胞（以下、表皮基底幹細胞という）の数は、顔面部及び腹部の両方で、加齢により減少することがわかった。また、同じ被験者における顔面部（露光部）と腹部（非露光部）との比較から、顔面部（露光部）において表皮基底幹細胞の数が少ないことがわかった。また、各被験者において、基底膜の長さに対する表皮基底幹細胞の数を測定し、その平均をグラフ化して示した（図１Ｂ）。
次に、０才から６０代の各年代の被験者から取得されたケラチノサイトを培養後、分離・回収し、RNeasy mini kit (QIAGEN, Tokyo, Japan)を製品説明書に従って使用して、ｍＲＮＡを抽出・精製した。
ケラチノサイトにおけるＭＣＳＰ遺伝子の発現量を、Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG (Invitrogen Japan, Tokyo Jaqpan)を用いて定量的ＰＣＲを行った。使用したプライマーは下記の通りである：
Figure 0007059193000002
 各年代における発現量の変化を図１Ｃに示す。
図１Ａの結果から、加齢と紫外線は、それぞれ、表皮基底幹細胞の数の減少に寄与することがわかった。また、図１Ｂ及びＣの結果から、加齢により、ＭＣＳＰ陽性細胞の数が得ると共に、ＭＣＳＰの発現量も低下することが示された。
包埋された組織を厚さ３μｍの切片にし、抗ラミニン３３２抗体（作成：BM165, mouse monoclonal antibody）、抗ラミニン５１１抗体（4C7、Abacam, Cambridge, UK）、及び抗β１インテグリン抗体（販売元：P5D2, Santa Cruz, CA）をそれぞれ１次抗体として用い、２次抗体としてAlexa488標識抗マウスＩｇＧ抗体（販売元：Lifetechnologies, Carlsbad, CA）を用いて染色した。さらにＤＡＰＩを用いて核染色を行った。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡を用いて可視化し、画像をＤＰコントロールデジタルカメラで取得した。２０代の被験者及び６０代の顔面部及び腹部の染色結果を図２Ａに示す。
また、各年代の被験者から取得されたケラチノサイトを分離・回収し、RNeasy mini kit (QIAGEN, Tokyo, Japan)を製品説明書に従って使用して、ｍＲＮＡを抽出・精製した。ケラチノサイトにおけるラミニンα５遺伝子の発現量を、Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG (Invitrogen Japan, Tokyo Jaqpan)を用いて定量的ＰＣＲを行った。使用したプライマーは下記の通りである：
Figure 0007059193000003
 各年代における発現量の変化を図２Ｂに示す。図１Ａ～Ｃ、並びに図２Ａ及び２Ｂの結果から、加齢及び紫外線に対する影響について、ラミニン５５１及びβ１インテグリンの発現量と、表皮基底幹細胞の数とは同傾向を示すことが分かった。
実施例２：ラミニン５１１と、幹細胞マーカーとの関連
ヒト表皮ケラチノサイトを、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地（Kurabo Col, Ltd, Japan)を用い、iMatrix-511（和光純薬工業株式会社）でコートされたPrimeria フラスコ（Coaster, Tokyo, Japan)中で6日培養した。対照として、未コートのフラスコ中で培養した。サブコンフレントまで増殖した細胞をTypsin（Nakarai co, ltd, Japan）で剥がし、iMatrix-511でコートしたchamber slide（Thermo Fisher Science, Waltham, MA）に播種し、培養した。対照群は、未コートのchamber slideで培養した。
培養後、細胞を4％PFAで固定し、MCSP抗体（MAB2029,Chemicon, Billerica, MA）を１次抗体として用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（Lifetechnologies, Carlsbad, CA）を用いて染色した。さらにＤＡＰＩを用いて核染色を行った。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡を用いて可視化し、画像をＤＰコントロールデジタルカメラで取得した。未コート対照と比較して、iMatrix511コート群では、MCSP陽性細胞がより多く維持されていることがわかった（図３Ａ）。
次に培養後に培地を捨て、ＰＢＳで洗浄した。RNeasy mini kit (QIAGEN, Tokyo, Japan)を製品説明書に従って用いて、回収された細胞からｍＲＮＡを抽出・精製した。幹細胞マーカーであるＣＤ４６、ＤＬＬ１、Ｌｒｉｇ１及びＣＤ４４の遺伝子の発現量を測定するため、Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG (Invitrogen Japan, Tokyo Jaqpan)を用いて定量的ＰＣＲを行った。使用したプライマーは下記の通りである：
Figure 0007059193000004
 対照におけるＣＤ４６、ＤＬＬ１、Ｌｒｉｇ１及びＣＤ４４の遺伝子の発現量と比較して、ラミニン５１１コート群では、ＣＤ４６、ＤＬＬ１、Ｌｒｉｇ１及びＣＤ４４の遺伝子の発現量が増加しており（図３Ｂ）、ラミニン５１１が、幹細胞の維持に寄与することが示された。
実施例３：ラミニン分解抑制剤の添加によるＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞数の維持
インフォームドコンセントを行った被験者（２０代から３０代）の腹部の皮膚サンプルを取得した。取得されたサンプルをＭＭＰ９阻害剤であるＣＧＳ２７０２３４（10μM）及びヘパラナーゼ阻害剤であるＢＩＰＢＩＵ（10μM）を含む培養培地で４日間培養した。培養培地は、Ｗｉｌｌｉａｍ‘ｓ Ｅ培地（ Thermo Fisher Science, Waltham, MA)を用いた。ＣＧＳ２７０２３４及びＢＩＰＢＩＵは、それぞれ下記の化学式により表される化合物であり、ＭＭＰ９阻害剤及びヘパラナーゼ阻害剤として使用できることが知られている（Iriyama S, et al., Exp Dermatol. 2011; 20 (11): 953-5)。
Figure 0007059193000005
 培養前の皮膚サンプル、４日間培養後のサンプル（対照：溶媒ＤＭＳＯを等量添加）、及び４日間培養後のサンプル（薬剤添加）を、ＡＭｅｘ法に従って冷アセトンを用いて固定し、そしてパラフィンに包埋した。
包埋された組織を３μｍの切片にし、抗ラミニン５５１抗体（4C7、Abacam, Cambridge, UK）を１次抗体として用い、次に２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗mouseＩｇＧ抗体（販売元：Lifetechnologies, Carlsbad, CA）を用いて共染色した。さらにＤＡＰＩを用いて核染色を行った。結果を図４（Ａ）として示す。次に、包埋された皮膚サンプルを、抗ＭＣＳＰ抗体（MAB2029,Chemicon, Billerica, MA）を１次抗体として用い、次に２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（Lifetechnologies, Carlsbad, CA）を用いて共染色した。さらにＤＡＰＩを用いて核染色を行った。結果を図４（Ｂ）として示す。
非培養群（Day0）と、対照の薬剤未添加群(Day4: Control)との比較から、４日間の組織培養により、基底膜に存在していたラミニン５５１が減少すると共に、ＭＣＳＰ陽性細胞も減少することが分かった。その一方で、ラミニンを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）及びヘパラナーゼの阻害剤を添加して培養すると、ラミニン５５１が維持されると共に、ＭＣＳＰ陽性細胞も維持された。
実施例４：ラミニン５１１産生促進効果のある薬剤のスクリーニング
胎児から取得された表皮細胞を、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地（Kurabo Col, Ltd, Japan)を用い、iMatrix-511（和光純薬工業株式会社）でコートされたPrimeria フラスコ（Coaster, Tokyo, Japan)中で6日間培養した。細胞がサブコンフルエントになったら、Trypsinで細胞を剥がし、6well plateに播種し、1日後に候補薬剤を溶解した培地に置換し、48時間培養を行った。候補薬剤として、化粧品登録原料１７８品（内訳：エキス類１３５品及び単品化合物４３品）を用いた。培地を捨て、ＰＢＳで洗浄し、ｍＲＮＡを、RNeasy mini kit (QIAGEN, Tokyo, Japan)を、製品説明書に従って抽出・精製した。ラミニンα５、ラミニンβ１、及びラミニンγ１遺伝子の発現量を、Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG (Invitrogen Japan, Tokyo Jaqpan)を用いて定量的ＰＣＲを行った。使用したプライマーは下記の通りである：
Figure 0007059193000006
 対照におけるラミニンα５、ラミニンβ１、及びラミニンγ１の遺伝子の発現量と比較して、ラミニンα５、ラミニンβ１、及びラミニンγ１の遺伝子の発現量をすべて増加させた候補薬剤として、アルジェレックス（一丸ファルコス株式会社）を見いだした。
スクリーニングされたアルジェレックスについて、薬剤濃度を、０．００１％、０．０１％、及び０．１０％と変えて試験し、用量依存的のラミニン５１１発現促進効果を調べた。使用した細胞、培養培地、培養条件、及びＰＣＲ条件は実施例４の薬剤スクリーニング方法において使用されたものと同一であった。結果を図５Ａに示す。さらに、同条件で、抗ラミニン５１１抗体（販売元：cloud-clone corp）を使用して、ＥＬＩＳＡによりタンパク質定量解析を行った。結果を図５Ｂに示す。
実施例５：アルジェレックスによる皮膚改善機能の検証
胎児から取得された表皮細胞を、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地（Kurabo Col, Ltd, Japan)を用い、iMatrix-511（和光純薬工業株式会社）でコートされたPrimeria フラスコ（Coaster, Tokyo, Japan)中で培養した。細胞がサブコンフルエントになったら、Trypsinで細胞を剥がし、6well plateへ播種し、1日後に0.01％アルジェレックスを含む培地に置換し、48時間培養を行った。対照としては、アルジェレックスを含まない培地を用いた。培地を捨て、ＰＢＳで洗浄し、ｍＲＮＡを、RNeasy mini kit (QIAGEN, Tokyo, Japan)を、製品説明書に従って抽出・精製した。ヘパラナーゼ（ＨＰＡ）遺伝子、ＰＤＧＦ－ＢＢ遺伝子、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）遺伝子、ヒアルロニダーゼ１（ＨＹＡＬ１）、及びインターロイキン８（ＩＬ－８）遺伝子の発現量を、Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG (Invitrogen Japan, Tokyo Jaqpan)を用いて定量的ＰＣＲを行った。使用したプライマーは下記の通りである：
Figure 0007059193000007
 それぞれの発現量の変化を図６Ａ～Ｅに示す。アルジェレックスは、培養表皮細胞において、ヘパラナーゼ（ＨＰＡ）遺伝子の発現を有意に低減させ（ｐ＜０．０１）、ＰＤＧＦ－ＢＢ遺伝子の発現を有意に増加させ（ｐ＜０．００１）、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）遺伝子の発現を有意に増加させ（ｐ＜０．０１）、ヒアルロニダーゼ１（ＨＹＡＬ１）遺伝子の発現を有意に低減させ（ｐ＜０．０１）、そしてインターロイキン８（ＩＬ－８）遺伝子の発現を低減させた（ｐ＜０．０５）。
実施例６：ＨＥＩのラミニンの分解抑制及びＭＣＳＰ陽性表皮基底幹細胞の維持効果
インフォームドコンセントを行った被験者（20代から30代）の腹部の皮膚サンプルを取得した。取得されたサンプルを０．０１％１－（２－ヒドロキシエチル）-２-イミダゾリジノン（ＨＥＩ、又はＳ－１７３）を含む培養培地で５日間培養した。培養培地は、Ｗｉｌｌｉａｍ‘ｓ Ｅ培地（Thermo Fisher Science, Waltham, MA )を用いた。対照は、ＨＥＩを添加しない培養培地を用いて培養した。培養後の皮膚サンプルを、ＡＭｅｘ法に従って冷アセトンを用いて固定し、そしてパラフィンに包埋した。
包埋された組織を３μｍの切片にし、ＭＣＳＰ抗体（MAB2029,Chemicon, Billerica, MA）を１次抗体として用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（Lifetechnologies, Carlsbad, CA）を用いて染色した。さらにＤＡＰＩを用いて核染色を行い、さらに抗ラミニン５５１抗体（4C7、Abacam, Cambridge, UK）を１次抗体として用い、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（Lifetechnologies, Carlsbad, CA）を用いて染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡を用いて可視化し、画像をＤＰコントロールデジタルカメラで取得して図７Ａに示した。培養を行うことで、対照では、ラミニン５１１が減少し、さらにＭＣＳＰ陽性細胞数も減少する。その一方で、０．０１％ＨＥＩを添加して培養した場合には、ラミニン５１１の量が維持でき、また基底膜上のＭＣＳＰ陽性細胞数も維持できた。
実施例７：ＨＥＩのヘパラナーゼ阻害作用
ヘパラナーゼアッセイを、Behzad F, et al., Analytical Biochemistry, 320, pp.207-213, 2003に記載されるヘパラン硫酸固定化プレートを用いて行った。具体的に、へパラン硫酸（Sieikagaku, Tokyo, Japan）を、Photo-ビオチンと反応させることにより、ビオチン化へパラン硫酸を調製した。ビオチン化ヘパラン硫酸を、炭水化物結合表面プレート（Coastar, Tokyo, Japan）上に固定した。Ａ４３１細胞ライセート（５０μｇ／ｍｌ）と共に、０％ＨＥＩ、０．０００５％ＨＥＩ、０．００５％ＨＥＩ、及び０．０５％ＨＥＩをビオチン化ヘパラン硫酸固定化プレート上に添加して、３時間３７℃でインキュベートし、PBS-Tで洗浄した。その後、ペルオキシダーゼ―アビジン（Vector Laboratories, Inc. CA, USA）と３７℃で１時間インキュベートした。3，3’，５，５’－テトラメチルベンジジン（TMB)溶液（Bio-Rad, Tokyo, Japan)を加え、そしてプレートをさらに室温で３０分間インキュベートした。４５０ｎｍでの吸光度を計測し、ヘパラナーゼの阻害作用を決定した。ＨＥＩは、用量依存的にヘパラナーゼの活性を阻害することが示された（図８）。
実施例８：ＨＥＩのＭＭＰ９阻害作用
ＭＭＰ９アッセイを、Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) colorimetric drug discovery kit (Enzo life sience Inc.)を用いて行った。具体的に、recombinant human MMP-9 enzymeの溶液に、0.0001%, 0.001%, 0.01% となるようにHEIを加えた。chromogenic MMP-9 substrate混合後、1分おきに412nmの吸光度を測定した。吸光度の傾き（OD/min）から、HEIのMMP-9阻害率（％）を算出した。ＨＥＩは、用量依存的にＭＭＰ９の活性を阻害することが示された（図９）。
実施例９：ＨＥＩの表皮改善効果
インフォームドコンセントを行った被験者（20代から30代）の腹部の皮膚サンプルを取得した。取得されたサンプルを０．０１％ＨＥＩを含む培養培地で５日間培養した。培養培地は、Ｗｉｌｌｉａｍ‘ｓ Ｅ培地（Thermo Fisher Science, Waltham, MA )を用いた。対照は、ＨＥＩを添加しない培養培地を用いて培養した。培養後の皮膚サンプルに付着した余分な水分をキムタオルでふき取り、5分清置させた後に、Ｖａｐｏｍｅｔｅｒを用いてＴＥＷＬを測定し、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒを用いて角層水分量を測定した。結果を図１０Ｂ及びＣに示す。また、培養後の皮膚サンプルを、ＡＭｅｘ法に従って冷アセトンを用いて固定し、そしてパラフィンに包埋した。
包埋された組織を３μｍの切片にし、フィラグリン抗体（販売元：AKH-1, Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX）を１次抗体として用い、２次抗体としてAlexa488標識抗mouseＩｇＧ抗体（Lifetechnologies, Carlsbad, CA）を用いて染色した。さらにＤＡＰＩを用いて核染色を行った。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１顕微鏡を用いて可視化し、画像をＤＰコントロールデジタルカメラで取得して図１０Aに示した。
次に、２０～５０歳の２０名の男性に対し、１．５％ＨＥＩ水溶液を顔の片面に、水を顔のもう一方の片面に、１日２回４週間適用した。適用前、適用後２週間、及び適用後４週間の時点で、Ｖａｐｏｍｅｔｅｒを用いてＴＥＷＬを測定し、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒを用いて角層水分量を測定した。結果を図１０Ｄ及びＥに示した。
ＨＥＩの添加群では、ｅｘ ｖｉｖｏ実験において、フィラグリンの増加傾向が見られた。そして、ｅｘ ｖｉｖｏ実験及びｉｎ ｖｉｖｏ実験のいずれにおいても、ＴＥＷＬが減少することから、皮膚バリア機能の改善し、そして角層水分含量も増加した。
実施例１０：ＭＭＰ阻害剤及びヘパラナーゼ阻害剤の添加による基底膜直下のコラーゲンの変化
Ｂｉｏ Ｐｒｅｄｉｃ社から購入した皮膚組織を皮膚組織片とし、ＣＧＳ２７０２３Ａ（終濃度１０-5Ｍ）及びＢＩＰＢＩＰＵ（終濃度１０-5Ｍ）を添加したＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ培地中で培養した。対照ではこれらの阻害剤を含めないで培養を行った。培地を毎日交換し、培養５日目に皮膚組織片を回収した。回収した皮膚組織片をＺａｍｂｏｎｉ固定液に浸漬し、１％オスミウムで後固定した。皮膚試料はエポキシ樹脂で包埋した。超薄切片を作成し、透過型電子顕微鏡（JEOL JEM1230）にて観察した（図１１Ａ）。
各群６個の皮膚切片を観察し、１切片から３０枚写真を撮影した。すべての写真の真皮部位に存在するコラーゲン線維のサイズと本数を画像解析ソフト「ｗｉｎ ＲＯＯＦ ２０１３」を用いて算出しヒストグラムを作成した（図１１Ｂ）。また、同様に画像解析ソフト「ｗｉｎ ＲＯＯＦ ２０１３」を用いて、真皮の面積も抽出し、真皮中のコラーゲン線維の密度と、１本あたりの太さを算出し、平均値を導き出した（図１１Ｃ）。
実施例１１：Ｖ型コラーゲンの発現
Ｂｉｏ Ｐｒｅｄｉｃ社から購入した皮膚をＡＭｅＸ法に供して、パラフィンブロックを作成した。３μｍの厚さで切片を作成し、Ｖ型コラーゲンに対する抗体（ＯＲＩＧＥＮＥ社，Ｃａｔ＃：ＡＭ１０１５ＰＵ－Ｎ）及びサイトケラチン１４（Ｋ－１４）に対する抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｃａｔ＃；２０Ｒ－ＣＰ００２）を用いて蛍光免疫染色を行った（図１２Ａ）。基底膜領域がサイトケラチン１４により染色されており、その直下において、Ｖ型コラーゲンが存在することが示され、加齢によりその量が減少した。
Ｋｕｒａｂｏ社、Ｂｉｏ Ｐｒｅｄｉｃ社から正常ヒト表皮細胞及び正常ヒト線維芽細胞を購入した。それぞれ、２０～３０代の被験者から取得された６検体、５０－６０代の被験者から取得された６検体を購入した。表皮細胞を無血清培地Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２中で培養し、線維芽細胞を、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。１回継代した後、各サンプル６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。コンフルエントになった後に、各細胞を回収し、ｃＤＮＡを調製し、下記プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲによりＶ型コラーゲンの遺伝子ＣＯＬ５Ａ１の遺伝子発現量を評価した（図１２Ｂ）。Ｖ型コラーゲンは、表皮細胞からは発現されず、線維芽細胞から発現され、加齢に伴いその発現量が低下することが示された。
Figure 0007059193000008
Ｂｉｏ Ｐｒｅｄｉｃ社から購入した皮膚組織を皮膚組織片とし、ＣＧＳ２７０２３Ａ（終濃度１０-5Ｍ）及びＢＩＰＢＩＰＵ（終濃度１０-5Ｍ）を添加したＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ培地中で培養した。対照ではこれらの阻害剤を含めないで培養を行った。培地を毎日交換し、培養５日目に皮膚組織片を回収した。回収した皮膚組織片をＡＭｅＸ法に供して、パラフィンブロックを作成した。３μｍの厚さで切片を作成し、Ｖ型コラーゲンに対する抗体（ＯＲＩＧＥＮＥ社，Ｃａｔ＃：ＡＭ１０１５ＰＵ－Ｎ）及びサイトケラチン１４（Ｋ－１４）に対する抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｃａｔ＃；２０Ｒ－ＣＰ００２）を用いて蛍光免疫染色を行った（図１３Ａ）。
ＭａｔＴｅＫ社から購入した皮膚三次元モデル（ＥＦＴ－４００）を、ＣＧＳ２７０２３Ａ（終濃度１０-5Ｍ）、ＢＩＰＢＩＰＵ（終濃度１０-5Ｍ）を添加した専用培地（EFT400-ASY）中で培養した。対照ではこれらの阻害剤を含めないで培養を行った。２日に１回培地交換を行い、７日目に組織片を回収し、ＡＭｅＸ法に供して、パラフィンブロックを作成した。３μｍの厚さで切片を作成し、Ｖ型コラーゲンに対する抗体（ＯＲＩＧＥＮＥ社，Ｃａｔ＃：ＡＭ１０１５ＰＵ－Ｎ）及びサイトケラチン１４（Ｋ－１４）に対する抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｃａｔ＃；２０Ｒ－ＣＰ００２）を用いて蛍光免疫染色を行った（図１３Ａ）。
皮膚三次元モデルを阻害剤の添加及び非添加（対照）群それぞれにおいて４日間及び７日間培養した。培養後、表皮をはがし、真皮のみをＴｒｉｚｏｌに入れて、ｍＲＮＡを抽出した。速やかにｃＤＮＡを作成し、上述のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによりＶ型コラーゲンの遺伝子ＣＯＬ５Ａ１の遺伝子発現量を評価した（図１３Ｂ）。
皮膚組織の器官培養及び皮膚三次元モデルの両方において、対照と比較して、ＭＭＰ阻害剤及びヘパラナーゼ阻害剤を添加した場合にＶ型コラーゲンの発現が増加した。その一方で、真皮層全体では、ＭＭＰ阻害剤及びヘパラナーゼ阻害剤の添加によるＶ型コラーゲンの発現に有意な変化は見られなかった。
実施例１０のＴＥＭ画像において、基底膜直下に存在する線維芽細胞に着目をした（図１３Ｃ）。図１３Ｃの対照（阻害剤の非添加群）では、線維芽細胞内においてコラーゲン線維はあまり観察されない一方で、阻害剤添加群では、線維芽細胞内の小胞内にコラーゲン線維が観察される。この小胞は、コラーゲン分泌過程であることが示唆される。これにより、基底膜直下の線維芽細胞が、MMP阻害剤及びヘパラナーゼ阻害剤の添加により、コラーゲンを積極的に産生していることが示唆される。
ＭａｔＴｅＫ社から購入した皮膚三次元モデル（ＥＦＴ－４００）を、ＣＧＳ２７０２３Ａ（終濃度１０-5Ｍ）、ＢＩＰＢＩＰＵ（終濃度１０-5Ｍ）を添加した専用培地（EFT400-ASY）中で培養した。対照ではこれらの阻害剤を含めないで培養を行った。培養２日目、４日目、７日目の培養上清を採取した。別途、Ｂｉｏ Ｐｒｅｄｉｃ社から購入した１４ヶ月の子供から採取した皮膚由来の正常ヒト線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中で２４時間培養した培養物に、皮膚三次元モデルの培養物から採取された培養上清を添加した。添加1日後に細胞を回収し、ＴｒｉｚｏｌにてｍＲＮＡを抽出した。速やかにｃＤＮＡを作成し、上述のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによりＶ型コラーゲンの遺伝子ＣＯＬ５Ａ１の遺伝子発現量を評価した（図１４）。皮膚三次元モデルの培養上清の添加により、Ｖ型コラーゲンの発現が有意に増加した。これにより、皮膚三次元モデルの培養上清には、Ｖ型コラーゲンの産生を促進する因子が含まれていることが示唆された。
実施例１２：Ｖ型コラーゲン発現を促進する因子の探索
ＭａｔＴｅＫ社から購入した皮膚三次元モデル（ＥＦＴ－４００）を、ＣＧＳ２７０２３Ａ（終濃度１０-5Ｍ）、ＢＩＰＢＩＰＵ（終濃度１０-5Ｍ）を添加した専用培地（EFT400-ASY）中で培養した。培養２日目、４日目、７日目の皮膚モデルから表皮を回収し、ナカライ社製ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒを使って、たんぱく質抽出液を調製した。Ａｂｃａｍ社製ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｒｒａｙ ｋｉｔ（ａｂ１３４００２）を用いて、たんぱく質抽出液中の各種サイトカン量をＦＵＪＩＦＩＬＭ社製ＬＡＳ－１０００ＵＶｍｉｎｉを用いて検出し、付属のソフトウエアにて数値化しグラフを作成した（データ未掲載）。対照に比較して、量が増大したサイトカインを、Ｖ型コラーゲン発現を促進する候補サイトカインとして選別した。かかる候補サイトカインとして、ＰＤＧＦ－ＢＢを含む３種のサイトカインを選別した。
Ｒ＆Ｄ社から選別したリコンビナントサイトカインタンパク質を購入した。１４ヶ月の子供から採取した皮膚由来の正常ヒト線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中で２４時間培養した培養物において、各サイトカインが所定の濃度になるように２５％血清を含むＤＭＥＭ培地に添加した培地で置換し、さらに２４時間培養した。培養後、細胞を回収
し、ＴｒｉｚｏｌにてｍＲＮＡを抽出した。速やかにｃＤＮＡを作成し、上述のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによりＶ型コラーゲンの遺伝子ＣＯＬ５Ａ１の遺伝子発現量を評価した（図１５）。３種のサイトカインの中で、ＰＤＧＦ－ＢＢのみが、Ｖ型コラーゲン産生を有意に増加させた。これにより、ＰＤＧＦ－ＢＢが、表皮側から産生されるサイトカインであって、基底膜直下の線維芽細胞に作用してＶ型コラーゲン発現を促進する因子であると考えられる。
実施例１３：ＰＤＧＦ－ＢＢの作用箇所と、ＰＤＧＦ－ＢＢの発現変化
実施例１１と同様にして取得されたパラフィンブロックについて、３μｍの厚さで切片を作成し、ＰＤＧＦＲ－βに対する抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｔ＃；ＭＡＢ１２６３）及びサイトケラチン１４（Ｋ－１４）に対する抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｃａｔ＃；２０Ｒ－ＣＰ００２）を用いて蛍光免疫染色を行った（図１６Ａ）。年齢によらず、基底膜直下に、ＰＤＧＦＲ－βを発現する細胞が多く存在することが分かった。これにより、基底膜又は表皮側から分泌されたＰＤＧＦ－ＢＢが、基底膜直下の線維芽細胞に作用しうることが確かめられた。
ＫＡＣ社、Ｂｉｏ Ｐｒｅｄｉｃ社から購入した各年齢の正常ヒト表皮細胞を培養し、ｍＲＮＡを抽出した。速やかにｃＤＮＡを調製し、下記プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲによりＰＤＧＦＢの遺伝子発現量を評価した（図１６Ｂ）。
Figure 0007059193000009

Claims (10)

  1. 表皮細胞におけるラミニン５１１の発現量を指標とする、表皮基底膜安定化剤のスクリーニング方法。
  2. 前記表皮基底膜安定化剤が、表皮基底幹細胞の減少を抑制可能な薬剤であるか、又は増殖を促進可能な薬剤である、請求項１に記載の方法。
  3. 候補薬剤を含む培養培地中で表皮細胞を培養する工程、
    表皮細胞におけるラミニン５１１の発現量を測定する工程、
    対照におけるラミニン５１１発現量と比較して、ラミニン５１１の発現量が増加した場合に、候補薬剤が表皮基底膜安定化効果を有すると判定する工程
    を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ラミニン５１１の発現量が、ラミニン５１１のタンパク質量又はラミニンα５のｍＲＮＡ、ラミニンβ１のｍＲＮＡ量、及びラミニンγ１のｍＲＮＡ量からなる群から選ばれる１以上のｍＲＮＡ量から決定される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ラミニン５１１の発現量が、ラミニンα５のｍＲＮＡ量、ラミニンβ１のｍＲＮＡ量、及びラミニンγ１のｍＲＮＡ量の合計量から決定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 表皮細胞が表皮幹細胞を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 表皮幹細胞が表皮基底幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 表皮細胞がＭＣＳＰ発現細胞を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 表皮細胞が、さらにインテグリンを発現している細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 表皮細胞が胎児由来である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
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