CN109844128A - 层粘连蛋白511产生促进剂、表皮基底膜稳定剂和/或表皮干细胞减少抑制或增加促进剂的筛选方法 - Google Patents

层粘连蛋白511产生促进剂、表皮基底膜稳定剂和/或表皮干细胞减少抑制或增加促进剂的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供简单地进行使MCSP阳性表皮基底干细胞增殖的药剂、或减少抑制的药剂的筛选的方法。提供以层粘连蛋白511的表达作为指标的层粘连蛋白511表达促进剂的筛选方法。另外，提供包含选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物的皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的改善剂。

Description

层粘连蛋白511产生促进剂、表皮基底膜稳定剂和/或表皮干 细胞减少抑制或增加促进剂的筛选方法
技术领域
本发明涉及表皮基底膜中的表皮干细胞的减少抑制或增加促进的技术领域。
背景技术
表皮是存在于皮肤最外层的皮肤组织。表皮主要由角质层、颗粒层、有棘层、和基底层构成。存在于基底层的基底细胞分裂，向外层移动。在该移动的过程中细胞发生去核而扁平化从而分化成角质层，角质层最终剥落。据说该周转的时间约为45天左右。但是，在老化的皮肤中，周转速度变慢，表皮整体变薄。已知其结果是产生屏障功能降低、水分含量降低等皮肤功能的降低。基底细胞是富于分裂性的细胞，但并不是无限地反复增殖，而是分裂一定次数就不再分裂。基底细胞通过存在于基底膜上的表皮基底干细胞的一部分分化而被重新供给。然而，已知随着老化表皮基底干细胞数减少，如果表皮基底干细胞数减少，则会表现表皮薄化、表皮干燥、屏障功能降低等老化征候。
近年，开发了作为表皮基底干细胞标志物的MCSP抗体，通过使用该抗体，能够识别表皮基底干细胞。在各年龄男女的非露光部皮肤使用MCSP抗体进行表皮基底细胞可视化显示，随着老化MCSP阳性的表皮基底干细胞数减少(非专利文献1)。要求开发具有MCSP阳性表皮基底干细胞数的增加促进作用或减少抑制作用的药剂。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Giangreco A,et al.,J Invest Dermatol.2010,130(2):604-8
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供MCSP阳性表皮基底干细胞数的增加促进或减少抑制方法。
用于解决课题的手段
本发明者们对于MCSP阳性表皮基底干细胞进行了深入研究，结果发现了MCSP阳性表皮基底干细胞与存在于基底膜附近的层粘连蛋白511的相关性。即，首次发现了，如果基底膜附近的层粘连蛋白511减少，则MCSP阳性表皮基底干细胞数也相应地减少，通过使层粘连蛋白511的表达量增加，能够增加MCSP阳性表皮基底干细胞数。另外发现，层粘连蛋白是层粘连蛋白α、β和γ的复合体，从而能够以层粘连蛋白α5、β1、和γ1的表达量作为指标来确定层粘连蛋白511的存在量。
基于该见解，完成了涉及以层粘连蛋白511的表达作为指标的层粘连蛋白511表达促进剂的筛选方法的发明。由于层粘连蛋白511表达促进剂能够将基底膜稳定化，因而层粘连蛋白511表达促进剂的筛选方法也可以说是基底膜稳定剂的筛选方法。另外，如果层粘连蛋白511的存在量增加、基底膜稳定化，则产生表皮基底干细胞的增加作用或减少抑制作用，因此层粘连蛋白511表达促进剂的筛选方法也可以说是表皮基底干细胞的增加促进剂或减少抑制剂的筛选方法。
更具体地涉及下述发明：
[1]层粘连蛋白511表达促进剂的筛选方法，以表皮细胞中的层粘连蛋白511的表达量作为指标。
[2]根据项目1所述的方法，包括：
在包含候选药剂的培养基中培养表皮细胞的工序，
测定表皮细胞中的层粘连蛋白511的表达量的工序，和
在与对照中的层粘连蛋白511表达量相比，层粘连蛋白511的表达增加的情况下，判定候选药剂具有层粘连蛋白511表达促进效果的工序。
[3]根据项目1或2所述的方法，所述层粘连蛋白511的表达量由层粘连蛋白511的蛋白质的量、或选自层粘连蛋白α5的mRNA量、层粘连蛋白β1的mRNA量和层粘连蛋白γ1的mRNA量中的1种以上mRNA量确定。
[4]根据项目1～3的任一项所述的方法，层粘连蛋白511的表达量由层粘连蛋白α5的mRNA量、层粘连蛋白β1的mRNA量和层粘连蛋白γ1的mRNA量的合计量确定。
[5]根据项目1～4的任一项所述的方法，所述层粘连蛋白511表达促进剂是表皮基底膜稳定剂。
[6]根据项目1～5的任一项所述的方法，表皮基底膜稳定剂是表皮干细胞的减少抑制或增加促进剂。
[7]根据项目1～6的任一项所述的方法，表皮细胞包含表皮干细胞。
[8]根据项目1～7的任一项所述的方法，表皮干细胞包含表皮基底干细胞。
[9]根据项目1～8的任一项所述的方法，表皮细胞包含MCSP表达细胞。
[10]根据项目1～9的任一项所述的方法，表皮细胞还包含表达整联蛋白的细胞。
[11]根据项目1～10的任一项所述的方法，表皮细胞来源于胎儿。
[12]层粘连蛋白511的表达促进剂，以选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮作为有效成分。
[13]利用层粘连蛋白511的表达促进的表皮基底膜稳定剂，以选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮作为有效成分。
[14]利用层粘连蛋白511的表达促进的表皮干细胞的减少抑制或增加剂，以选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮作为有效成分。
[15]细胞外基质分解酶的活性抑制剂，包含1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮。
[16]根据项目15所述的细胞外基质分解酶的活性抑制剂，细胞外基质分解酶是基质金属蛋白酶或乙酰肝素酶。
[17]根据项目15所述的细胞外基质分解酶的活性抑制剂，细胞外基质分解酶是基质金属蛋白酶9。
[18]层粘连蛋白511分解抑制剂，包含项目15～17的任一项所述的细胞外基质分解酶的活性抑制剂。
[19]表皮基底膜稳定剂，包含项目15～17的任一项所述的细胞外基质分解酶的活性抑制剂。
[20]表皮基底干细胞减少抑制或增加促进剂，包含项目15～17的任一项所述的细胞外基质分解酶的活性抑制剂。
[21]表皮中的层粘连蛋白511的表达的增进方法，包括施与选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮的步骤。
[22]表皮基底膜的稳定化方法，施与选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮，通过层粘连蛋白511的表达促进作用，来使表皮基底膜稳定化。
[23]表皮基底干细胞的减少抑制或增加促进方法，施与选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮，通过层粘连蛋白511的表达促进作用，来抑制表皮基底干细胞的减少或促进其增加。
[24]美容方法，施与选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮，使表皮中的层粘连蛋白511的表达增进。
[25]美容方法，施与选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮，使表皮中的层粘连蛋白511的表达增进，通过层粘连蛋白511的表达促进作用而使表皮基底膜稳定化。
[26]美容方法，施与选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮，使表皮中的层粘连蛋白511的表达增进，通过层粘连蛋白511的表达促进作用而抑制表皮基底干细胞的减少或促进其增加。
[27]选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮的应用，用于制造用于层粘连蛋白511的表达促进的化妆品或药品。
[28]选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮的应用，用于制造用于使表皮基底膜稳定化的化妆品或药品。
[29]选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮的应用，用于制造用于表皮基底干细胞的减少抑制或增加促进的化妆品或药品。
[30]介由层粘连蛋白511的表达促进而用于抗老化治疗的选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮。
[31]介由表皮基底膜稳定化而用于抗老化治疗的选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮。
[32]介由表皮基底干细胞的减少抑制或增加而用于抗老化治疗的选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮。
[33]介由细胞外基质分解酶的活性抑制而用于抗老化治疗的1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮。
[34]根据项目33所述的1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮，细胞外基质分解酶是基质金属蛋白酶或乙酰肝素酶。
[35]根据项目33所述的1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮，细胞外基质分解酶是基质金属蛋白酶9。
[36]皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的改善剂，包含选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物。
[37]炎症抑制剂，包含选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物。
[38]选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物的应用，用于制造皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的改善剂。
[39]选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物的应用，用于制造炎症抑制剂。
[40]用于改善皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的美容方法，包括将包含选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物的化妆料应用于需要改善皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的对象的步骤。
[41]用于炎症抑制的美容方法，包括对患有炎症的对象应用包含选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物的化妆料。
发明的效果
通过以层粘连蛋白511作为指标，能够用更简单的细胞实验进行使MCSP阳性表皮基底干细胞增加的药剂的筛选。
附图说明：
图1：图1A是显示20多岁的腹部(非露光部)和面部(露光部)、与60多岁的腹部(非露光部)和面部(露光部)中的MCSP的表达的图。图1B是对各年龄段的受检者的腹部(非露光部)和面部(露光部)的皮肤切片，测量相对于基底膜的长度的MCSP阳性细胞数并进行比较而得的图。图1C是各年龄段的受检者的皮肤切片中的MCSP的表达量的比较图。
图2：图2A是显示20多岁的腹部(非露光部)和面部(露光部)、与60多岁的腹部(非露光部)和面部(露光部)中的层粘连蛋白332、层粘连蛋白551和β1整联蛋白的表达的图。图2B是各年龄段的受检者的皮肤切片中的层粘连蛋白α5的表达量的比较图。
图3：图3A是显示在表皮培养时将培养板用层粘连蛋白511进行了涂覆的情况下对MCSP的表达的影响的图。图3B是显示在表皮培养时将培养板用层粘连蛋白511进行了涂覆的情况下对包含CD46、Lrig1、DLL1、CD44的干细胞标志物的基因表达的影响的图。
图4：图4A是显示通过人皮肤组织培养而层粘连蛋白511显示减少，在添加了MMP抑制剂(N-羟基-2(R)-[[(4-甲氧基-苯基)磺酰基](3-吡啶甲基)氨基]-3-甲基丁酰胺盐酸盐、以下记为CGS27023A)和乙酰肝素酶抑制剂(1-[4-(1H-苯并咪唑-2-基)苯基]-3-[4-(1H-苯并咪唑-2-基)苯基]脲、以下记为BIPBIPU)的情况下，层粘连蛋白511被增强的图。图4B是显示通过人皮肤组织培养而MCSP显示减少，在添加了MMP抑制剂(CGS27023A)和乙酰肝素酶抑制剂(BIPBIPU)的情况下，MCSP被维持或增强的图。
图5：图5A是显示通过添加アルジェレックス，层粘连蛋白α5、层粘连蛋白β1、和层粘连蛋白γ1的基因表达用量依赖性地增加的图。图5B是显示通过添加アルジェレックス，层粘连蛋白α5链的蛋白质的量用量依赖性地增加的图。
图6：图6是显示通过アルジェレックス添加带来的基因表达的变化的图。调查了乙酰肝素酶(HPA)基因(图6A)、PDGF-BB基因(图6B)、透明质酸合成酶2(HAS2)基因(图6C)、透明质酸酶1(HYAL1)(图6D)、和白细胞介素8(IL-8)基因(图6E)的表达量的变化。
图7：图7是显示离体(ex vivo)人皮肤的器官培养中的1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮(HEI)的添加对层粘连蛋白511和MCSP的蛋白质表达的影响的图。
图8：图8是显示1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮(HEI)的乙酰肝素酶抑制活性的图。
图9：图9是显示1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮(HEI)的MMP9抑制活性的图。
图10：图10A是显示离体(ex vivo)人皮肤的器官培养中由1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮(HEI)的添加带来的丝聚蛋白蛋白质表达的变化的图。图10B和C是显示离体(exvivo)人皮肤的器官培养中由1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮(HEI)的添加带来的TEWL和角质层水分含量的变化的图。图10D和E是显示体内(in vivo)一重遮蔽人连用试验中由1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮(HEI)带来的TEWL和角质层水分含量的变化的图。
图11：图11A是显示在皮肤组织的器官培养中添加MMP抑制剂(CGS27023A)和乙酰肝素酶抑制剂(BIPBIPU)的情况下基底膜紧下方的电子显微镜照片。在基底膜的下部映现着胶原纤维的剖面。图11B是显示在电子显微镜照片上测定的胶原纤维的直径和频率的直方图。图11C显示电子显微镜照片上的纤维的直径的平均值。图11D是显示电子显微镜照片上的纤维的密度的平均值的图。
图12A：图12A是显示从青年(29岁)和老年(60岁)的对象获得的皮肤试样中的V型胶原的表达、与表示角质形成细胞的K-14的表达的荧光显微镜照片。
图12B：图12B是显示从青年对象获得的角质形成细胞和成纤维细胞、以及从老年对象获得的角质形成细胞和成纤维细胞中基因COL5A1相对于V型胶原的表达量的图。
图13A：图13A是显示皮肤组织的器官培养和皮肤三维模型中由MMP抑制剂(CGS27023A)和乙酰肝素酶抑制剂(BIPBIPU)的添加带来的V型胶原的表达、与表示角质形成细胞的K-14的表达的荧光显微镜照片。
图13B：图13B是显示皮肤三维模型的真皮中的V型胶原的基因COL5A1表达的图。
图13C：图13C是在皮肤组织的器官培养中添加MMP抑制剂(CGS27023A)和乙酰肝素酶抑制剂(BIPBIPU)的情况下，着眼于基底膜紧下方的成纤维细胞的电子显微镜照片。
图14：图14是显示将从添加MMP抑制剂(CGS27023A)和乙酰肝素酶抑制剂(BIPBIPU)培养而得的皮肤三维模型的培养物采集的培养上清添加到培养后的真皮成纤维细胞中的情况下的V型胶原的基因COL5A1表达的图。
图15：图15是显示对培养人成纤维细胞添加了PDGF-BB的情况下的V型胶原的基因COL5A1表达的图。
图16A：图16A是显示从青年(32岁)和老年(68岁)的对象获得的皮肤试样中的PDGFRβ的表达、与表示角质形成细胞的K-14的表达的荧光显微镜照片。
图16B：图16B是显示各年龄的正常人表皮细胞中的PDGF-BB蛋白质的基因PDGFB的表达量的图。
具体实施方式
本发明涉及以表皮细胞中的层粘连蛋白511的表达作为指标的层粘连蛋白511表达促进剂的筛选方法。更具体地，层粘连蛋白511表达促进剂的筛选方法包括以下工序：
在包含候选药剂的培养基中培养表皮细胞的工序，
测定表皮细胞中的层粘连蛋白511的表达量的工序，和
在与对照中的层粘连蛋白511表达量相比，层粘连蛋白511的表达增加的情况下，判定候选药剂具有层粘连蛋白511表达促进效果的工序。
还可以包含对培养表皮细胞照射紫外线的工序。通过紫外线的照射，层粘连蛋白511的表达量减少。关于紫外线的照射，作为一例，可以通过对培养细胞以1mJ/cm2～200mJ/cm2照射来进行。紫外线的照射能够增强基质金属蛋白酶的活性，造成层粘连蛋白的分解。于是在紫外线照射下，在候选药剂能够抑制层粘连蛋白511的蛋白质的量的减少的情况下，可知候选药剂具有层粘连蛋白511的分解抑制效果和表达促进效果。通过调查候选药剂对基质金属蛋白酶的活性的抑制效果，能够确定候选药剂是否具有层粘连蛋白511的表达促进效果。
在包含候选药剂的培养基中培养表皮细胞的工序，只要包含候选药剂的培养基与培养表皮细胞接触，就可以以任意的方式进行。可以在进行培养的培养基中直接添加候选药剂或其稀释液，也可以置换成包含候选药剂的培养基。培养在人表皮细胞的培养所使用的通常条件下进行。作为一例，在37℃、5％CO2加湿气氛下的孵卵器内培养。添加候选药剂之后的培养时间可以根据候选药剂的效果任意设定。从充分发挥候选药剂的效果的观点，例如可以培养300分钟以上、优选为6小时以上、更优选为48小时以上。另外，从防止候选药剂的效果饱和的观点，例如可以培养7天以下、优选为5天以下、更优选为72小时以下的时间。
培养表皮细胞中的层粘连蛋白511的表达的测定可以使用识别层粘连蛋白511的抗体、使用分子生物学的任意方法进行测定。层粘连蛋白511的蛋白质的量的测定可以使用例如蛋白质印迹(Western Blot)、免疫染色法。另外，层粘连蛋白511的表达可以基于层粘连蛋白511的构成亚基(α5、β1、γ1)的mRNA转录量来测定。mRNA的转录量作为一例可以通过进行RNA印迹(Northern Blot)、定量PCR来测定。可以基于任意1个构成亚基的转录量来测定，也可以作为2个或3个构成亚基的转录量的组合来测定。在1种方式中，可以通过将层粘连蛋白α5、层粘连蛋白β1、和层粘连蛋白γ1各自的表达量合计，来测定表达量。另外在别的方式中，可以以最低表达量的构成亚基的量作为层粘连蛋白511的表达量。
与对照中的层粘连蛋白511表达量进行比较，在用包含候选药剂的培养基培养而得的表皮细胞中层粘连蛋白511的表达增加的情况下，可以判定候选药剂具有层粘连蛋白511表达促进效果。在一种方式中，在表达量有显著性差异的情况下，可以判定候选药剂具有层粘连蛋白511表达促进效果。另外，在别的方式中，在表达量以指定的比例增加的情况下，可以判定候选药剂具有层粘连蛋白511表达促进效果。指定的比例只要是本领域技术人员就能够任意确定，例如选择相对于对照的表达量为10％、更优选为20％、进一步优选为30％、进一步更优选为50％作为指定的比例。该判定可以由实验者进行，也可以通过软件分析来进行。从大规模进行本发明的筛选方法的观点考虑，判定工序优选通过进行表达测定的仪器、或包含从该仪器获得数据的处理器的计算机来进行。对照中的层粘连蛋白511表达量是指除了不包含候选药剂的点之外，进行了相同操作的表皮细胞中的层粘连蛋白511的表达量。因此，前述的培养工序和表达测定工序也可以包括用不包含候选药剂的培养基培养对照的表皮细胞，测定对照的表皮细胞中的层粘连蛋白511的表达的工序。对于对照的培养工序和表达工序可以与使用包含候选药剂的培养基的培养工序和表达工序同时平行地进行，也可以预先进行。
本发明的筛选工序除了前述的工序之外，也可以包括在用包含候选药剂的培养基培养表皮细胞的工序之前进行的预培养工序；在用包含候选药剂的培养基培养表皮细胞的工序之后用不包含候选药剂的培养基进行培养的后培养工序；回收细胞的回收工序；将回收的细胞、或从回收的细胞提取的蛋白质、mRNA、或从mRNA逆转录而得的DNA进行储藏的工序这样的任意附加工序。
层粘连蛋白是属于层粘连蛋白家族的蛋白质，是构成基底膜的蛋白质的一种。在层粘连蛋白家族中，已知特别是由α3β3γ2亚基构成的层粘连蛋白332、由α5β1γ1亚基构成的层粘连蛋白511存在于基底膜。层粘连蛋白被在细胞上表达的整联蛋白识别，作为细胞骨架发挥功能。以存在于基底膜的层粘连蛋白作为骨架，由表皮基底细胞形成层。
层粘连蛋白511是参与细胞粘附、增殖的蛋白质，主要存在于表皮基底膜。层粘连蛋白511与β1整联蛋白、特别是α6β1整联蛋白具有结合性。在细胞实验中，与表达β1整联蛋白的干细胞的增殖相关，用于iPS细胞、ES细胞的培养。已知在生物体中，层粘连蛋白511随着老化而减少。本发明者们搞清楚了层粘连蛋白511除了老化以外还受紫外线的影响而减少(图1)。虽然不受理论限制，但认为通过紫外线，基质金属蛋白酶(MMP)被激活，由此层粘连蛋白量减少。但是，本发明者们显示，层粘连蛋白332受年龄增长、紫外线影响较少，另一方面层粘连蛋白511伴随年龄增长而减少，进一步由于紫外线的影响而减少(图2A)。该倾向与在干细胞中表达的β1整联蛋白显示相同倾向，进一步对于MCSP表达干细胞也观察到相同倾向(图1A)。
层粘连蛋白511表达促进剂可以最广义地解释，只要是能够增大层粘连蛋白511的蛋白质的量的药剂，就可以包含任意的药剂。因此，不仅能够促进层粘连蛋白511的基因表达的药剂，通过乙酰肝素酶抑制作用、MMP抑制作用而增大层粘连蛋白511的蛋白质的量的药剂也可以称作层粘连蛋白511表达促进剂。层粘连蛋白511的表达可以通过蛋白质的量或mRNA量来确定。层粘连蛋白511因为是复合体蛋白质，所以层粘连蛋白511表达促进剂可以分别促进构成亚基的各mRNA的表达。层粘连蛋白511表达促进剂通过增加表皮基底膜中的层粘连蛋白511的表达，能够发挥表皮基底膜稳定化作用、表皮干细胞减少抑制作用、和表皮干细胞增加促进作用。因此，层粘连蛋白511表达促进剂也可以称为表皮基底膜稳定剂、表皮干细胞减少抑制剂、或表皮干细胞增加促进剂。
表皮基底膜存在于表皮最下层，构成表皮与真皮的边界。表皮基底膜是主要由胶原、蛋白聚糖、巢蛋白1(entactin)、层粘连蛋白构成的薄膜状的细胞外基质。基底膜上配置有基底细胞，包含基底膜和基底细胞而称作表皮的基底层。基底膜中作为胶原主要包含I型胶原、IV型胶原、和VII型胶原。基底膜中作为层粘连蛋白主要包含层粘连蛋白511、层粘连蛋白332。基底膜受基质金属蛋白酶、乙酰肝素酶等细胞外基质分解酶的影响部分被分解而不稳定化。在发生了不稳定化的基底膜中，层粘连蛋白减少，以层粘连蛋白作为细胞骨架而增殖的表皮细胞、例如β1整联蛋白表达细胞可以丧失。在表皮细胞中，表皮干细胞、特别是表皮基底干细胞被认为是β1整联蛋白表达细胞，随着层粘连蛋白减少，这些细胞可以丧失。
真皮所含的胶原根据真皮中的位置而形状不同，构成的胶原的种类也不同。表皮基底膜区域包含I型胶原、IV型胶原、和VII型胶原，被称为网状纤维板的细的胶原纤维束位于基底膜紧下方的区域，胶原细纤维位于更深部，粗的胶原纤维位于最深部。基底膜紧下方区域的网状纤维板主要由V型胶原构成，胶原细纤维由III型胶原和V型胶原构成，最深部的胶原纤维由I型和III型胶原构成。
基底膜紧下方的V型胶原由真皮层的真皮成纤维细胞产生，但根据本发明者们的研究显示，其年龄依赖性地减少(图12)。更令人惊讶的是，发现了V型胶原的存在与基底膜的存在密切相关(图13A)。另一方面，作为真皮层整体的胶原产生量不受保护基底膜的MMP抑制剂、乙酰肝素酶抑制剂的添加的影响(图13B)。根据这些结果，本发明者们提出了通过由基底膜侧分泌某种因子，仅基底膜紧下方的真皮成纤维细胞被激活，产生V型胶原这样的假说。为了证实该假说，对于包含真皮层、基底膜、和表皮层的皮肤三维模型，采集在培养基中添加了保护基底膜的MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂的培养物的培养基，将该培养基添加到成纤维细胞培养物中，从而调查V型胶原的表达(图14)，结果发现，从添加了保护基底膜的MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂的培养物得到的培养基具有V型胶原表达促进作用。
从添加了保护基底膜的MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂的皮肤三维模型的培养物回收表皮，着眼于根据抑制剂的添加的有无而表达变化的生长因子，结果特定了PDGF-BB作为具有V型胶原表达促进作用的生长因子(图15)。显示作为PDGF-BB的受体的PDGFRβ在基底膜紧下方的真皮成纤维细胞中表达。虽然不受理论限定，但由这些见解可以说明，随着老化，基底膜受到损伤，结果PDGF-BB的产生量减少，与此相伴地V型胶原的表达量降低，从而皮肤的弹性丧失这样的老化模型。如果参照该老化模型，则本发明所特定的层粘连蛋白511表达促进剂、表皮基底膜稳定剂、表皮干细胞的减少抑制或增加促进剂也可以说是PDGF-BB的产生促进剂，另外也可以作为胶原产生促进剂、特别优选为V型胶原的产生促进剂使用，可以作为弹性改善剂配合到化妆料中。
表皮基底膜稳定剂是指能够使表皮基底膜稳定化的药剂。基底膜稳定剂既可以是分解基底膜的细胞外基质分解酶的抑制剂，也可以是基底膜构成分子的表达促进剂。作为细胞外基质分解酶的抑制剂，可列举乙酰肝素酶抑制剂，已知例如无患子提取物粉末、阔叶缬草提取物E、陈皮提取物BG、白百合、滨海前胡提取物、IBR、S-173、BIBIPU这样的药剂。另外，作为细胞外基质分解酶的抑制剂，还可列举基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，已知例如姜黄提取物BG、洋委陵菜提取物、山竹提取物BG、CGS27023A这样的药剂。介由表皮基底膜的稳定化能够抑制表皮基底干细胞的减少、或使其增殖。因此，表皮基底膜稳定剂也可以称作表皮基底干细胞的减少抑制剂、或增加促进剂。表皮基底干细胞的减少抑制或增加促进剂是指能够发挥表皮基底干细胞的增殖、减少的抑制、或维持作用的药剂。另外介由表皮基底干细胞的减少抑制剂或增加促进剂，能够发挥表皮的老化防止作用。因此，表皮基底膜稳定剂也可以称为皮肤老化防止剂。
本发明的表皮干细胞减少抑制或增加促进剂是指能够实现皮肤中的表皮干细胞的减少抑制、维持、或增加促进的药剂。表皮干细胞随着老化、紫外线照射，数量减少，但通过应用本发明的表皮干细胞减少抑制或增加促进剂，能够实现表皮干细胞的减少抑制或维持。另外在别的方式中，也能够增加表皮干细胞数。
本发明中使用的表皮细胞可以使用培养表皮细胞。培养表皮细胞也可以使用进行分化诱导而得的3维表皮模型。表皮细胞可以包含角质形成细胞、朗格汉斯细胞、梅克尔细胞、黑素细胞、表皮基底细胞，进一步优选包含表皮干细胞。进一步优选该表皮干细胞是表达MCSP的表皮干细胞、即表皮基底干细胞。认为表皮细胞中除了表皮基底干细胞之外，在隆突(bulge)部、皮脂腺中也存在表皮干细胞，但其中仅表皮基底干细胞能够表达MCSP。因此，MCSP表达表皮干细胞通常是指表皮基底干细胞。
表皮细胞优选表达整联蛋白。作为所表达的整联蛋白，可列举α整联蛋白、β整联蛋白等。特别是表皮干细胞优选是表达β1整联蛋白的。表皮细胞可以是任意动物种来源的细胞，但为了排除由不同种带来的影响，优选是人的细胞。人培养细胞可以是成人、儿童、幼儿、婴儿、新生儿、胎儿等任意的来源，但从使用包含较多基底干细胞的细胞的观点，优选为胎儿来源。
表皮细胞中表达的整联蛋白是指存在于细胞膜中、作为细胞外基质的受体发挥功能的分子。整联蛋白由α链和β链构成。α链发现了18种，β链发现了8种。β1整联蛋白是指β链为β1亚基、α链为任意亚基的整联蛋白。包含β1亚基的整联蛋白与层粘连蛋白的结合性高。虽然不受理论限定，但由于老化、紫外线的影响，层粘连蛋白511丧失，从而表达β1整联蛋白的干细胞也丧失，作为结果MCSP表达干细胞数减少。
候选药剂可以使用化妆品、药品的任意文库所含的药剂。作为这些文库，可以使用化合物文库、提取物文库等任意文库。通过选择候选药剂中能够增加层粘连蛋白511的表达的药剂，可以作为层粘连蛋白511表达促进剂、表皮基底膜稳定剂、表皮基底干细胞的减少抑制或增加促进剂筛选。
对照是指带来判定工序中为了判定候选药剂的层粘连蛋白511表达促进效果而使用的成为用于比较的基准的层粘连蛋白511表达量的实验组。因此，使用仅不包含候选药剂、在相同条件下培养相同时间的培养细胞确定的层粘连蛋白511的表达量，作为对照的表达量而供于比较。这样的对照的表达量可以通过与用包含候选药剂的培养基培养表皮细胞的工序平行地培养细胞，测定层粘连蛋白511的表达来确定，也可以通过预先另外在相同条件下培养相同时间，测定层粘连蛋白511的表达来确定。
将本发明的筛选方法对化妆品原料进行，结果アルジェレックス作为具有层粘连蛋白511产生促进效果的药剂而被选择。这样选择的药剂是层粘连蛋白511的表达促进剂，也是表皮基底膜稳定剂，另外也是表皮基底干细胞的减少抑制剂，另外也是表皮基底干细胞的增加促进剂。
アルジェレックス是由一丸ファルコス株式会社销售的化妆品原料，涉及海藻提取物。更具体地，アルジェレックス涉及褐藻、红藻、绿藻的混合提取物。将褐藻的全藻在50％1,3-丁二醇中浸泡3天、过滤而得的褐藻提取液，与将褐藻、红藻、和绿藻的全藻在50％1,3-丁二醇中浸泡3天、过滤而得的褐藻、红藻和绿藻的提取液混合，从而获得。アルジェレックス被认为能够改善水分含量，另外针对肌肤粗糙发挥抑制效果。用于アルジェレックス的褐藻是昆布属和裙带菜属的藻类，作为一例为狭叶海带、裙带菜。用于アルジェレックス的红藻是蜈蚣藻属的藻类，作为一例为麒麟菜、山茶。用于アルジェレックス的绿藻是石蓴属的藻类，作为一例为缘管浒苔。
本发明中，海藻提取物涉及从选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种藻类提取的提取物。在进一步优选的方式中，海藻提取物涉及褐藻、红藻、和绿藻的提取物。进一步更优选为昆布属和裙带菜属的褐藻、蜈蚣藻属的红藻、和石蓴属的绿藻的提取物，最优选为アルジェレックス。所使用的溶剂可以是任意溶剂，可以将水、醇、醚、酯等单独或混合使用。作为所使用的醇，可以使用甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等1元醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇等2元醇、和甘油等3元醇。作为醚，可以使用甲醚、乙醚、乙基甲基醚、四氢呋喃等。作为酯，可以使用乙酸甲酯、乙酸乙酯等。作为混合物使用时，可以以任意的混合比使用。例如水与1,3-丁二醇的混合液可以在1:10～10:1的范围使用，进一步优选在3:10～10:3的范围使用。也可以使用1:1混合液。海藻提取物可以配合在化妆料中。可以将例如0.0001％～10％的量、优选为0.001％～1.0％的海藻提取物配合在化妆料中。作为一例，可以将0.01％的海藻提取物配合在例如美容液、化妆水、乳液、霜等化妆料中。
作为层粘连蛋白511表达促进剂筛选而得的本发明的海藻提取物发挥层粘连蛋白511表达促进效果、基底膜稳定化效果、和表皮干细胞增殖促进或减少抑制效果。另外，起因于这些效果、或独立地，海藻提取物抑制乙酰肝素酶基因的表达。由此发挥皮肤屏障功能的改善作用。因此，包含海藻提取物的层粘连蛋白511表达促进剂还可以作为乙酰肝素酶基因的表达抑制剂或皮肤屏障功能改善剂使用。另外，起因于这些效果、或独立地，海藻提取物在增加透明质酸合成酶2基因的表达的同时，抑制透明质酸酶基因的表达。由此，肌肤的湿润提高。因此，包含海藻提取物的层粘连蛋白511表达促进剂还可以作为透明质酸增加促进剂或肌肤湿润提高剂使用。另外，起因于这些效果、或独立地，海藻提取物增加PDGF-BB的表达。PDGF-BB通过作用于真皮成纤维细胞而促进胶原、特别是V型胶原的产生，因此包含海藻提取物的层粘连蛋白511表达促进剂发挥弹性的改善作用(生体医工学(2017)55(2):97-102)。另外，已知PDGF-BB有助于间充质系干细胞的稳定化。间充质系干细胞中也包含真皮干细胞，PDGF-BB作用于真皮干细胞，发挥弹性的改善作用。因此，包含海藻提取物的层粘连蛋白511表达促进剂还可以作为PDGF-BB的表达促进剂或弹性改善剂使用。另外，起因于这些效果、或独立地，海藻提取物抑制IL-8的表达。由此发挥炎症抑制作用。因此，层粘连蛋白511表达促进剂还可以作为IL-8的表达抑制剂、炎症抑制剂使用。因此，海藻提取物也可以称为皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的改善剂，能够应用于患有皮肤屏障、弹性、湿润和炎症相关疾病或需要改善皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的对象。
在本发明的别的方式中，本发明涉及用于皮肤屏障、弹性、湿润和炎症中的至少1种、优选为全部的改善的美容方法。该美容方法包括将包含选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物的化妆料应用于患有皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的至少1种、优选为全部相关疾病，或需要改善皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的至少1种、优选为全部的对象。这样的对象可以具有1)皮肤中的透明质酸降低、2)皮肤屏障功能的降低、3)炎症的开始、4)乳头层中的纤维量的降低、和5)PDGF-BB产生降低中的至少1种、或全部的症状。在进一步别的方式中，患有皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的至少1种、优选为全部相关疾病，或需要改善皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的至少1种、优选为全部的对象，也是患有皮肤水分量降低、肌肤粗糙、色素沉着和肌肤黑化、皮肤的柔软性降低等症状的对象。本发明的美容方法中，可以对所述对象，1天至少1次、优选为至少2次，将适量应用于脸面和体表面，特别优选的方式可以在入浴后、就寝前、和/或起床后应用。
1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮(HEI)是用下述的化学式：
表示的化合物。HEI显示具有乙酰肝素酶抑制活性和MMP9抑制活性(图8和9)。另外，HEI具有层粘连蛋白511的表达促进效果和αMCSP阳性的干细胞维持效果(图7)。虽然不受理论限定，但通过乙酰肝素酶抑制和MMP9抑制活性，发挥层粘连蛋白511的表达促进效果，由此能够发挥αMCSP阳性的干细胞维持效果。于是，本发明涉及包含HEI的层粘连蛋白511表达促进剂。乙酰肝素酶和MMP9均是细胞外基质分解酶，因此HEI也可以称为细胞外基质分解酶抑制剂。已知乙酰肝素酶、MMP9在癌转移时表达时被利用。癌细胞通过这些酶的作用而破坏基底膜随着血流发生转移。另外MMP9也参与血管新生。因此，MMP9抑制剂作为血管新生抑制剂使用，由此具有癌细胞的增殖抑制作用。因此，本发明中的乙酰肝素酶和MMP9的活性抑制剂、基底膜稳定剂不仅能够配合在化妆料中，还可以作为癌的转移抑制剂、血管新生抑制剂、癌细胞增殖抑制剂用于医药。在配合在化妆料、药品中的情况下，作为一例，可以以0.00001％～10％的范围、优选为0.0001％～5％的范围、更优选为0.001％～3％的范围配合。作为一例，还可以对化妆水、美容液、乳液、霜等化妆料以1.5％配合。
本发明所筛选的层粘连蛋白511的表达促进剂、表皮基底膜稳定剂、和表皮基底干细胞的减少抑制或增加促进剂可以分别作为化妆品原料配合在化妆料中。配合了该化妆品原料的化妆料介由层粘连蛋白511的表达促进，介由表皮基底膜的稳定化，或介由表皮基底干细胞的减少抑制或增加促进，能够对表皮发挥抗老化作用或抗紫外线作用。作为化妆料，可以配合在任意的化妆料中，可以在例如美容液、化妆水、乳液、霜、身体乳、入浴剂、防晒、妆底、彩妆商品、护肤液、须后霜等中使用。另外，也可以配合在药品、准药品等中。这样的药品可以通过经口、经皮、肌肉内、静脉内等任意途径施与，但从直接作用于皮肤的观点，优选通过经皮施与来施与。为了通过经皮施与来施与，优选皮肤外用剂、皮肤贴剂等剂型。特别是可以配合在皮肤外用剂中。这些化妆品、药品中可以包含一般可以添加的药剂、例如保湿剂、美白剂、抗氧化剂、油性成分、紫外线吸收剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、着色剂、香料、水、溶剂、防腐剂、保存剂、pH调节剂、胶凝剂、其他活性成分。
通过HEI的施与，确认了丝聚蛋白的基因表达量增加，另外皮肤屏障功能的提高、水分含量的提高。认为这些作用起因于通过层粘连蛋白511的表达促进而基底膜稳定化。表皮干细胞的减少能够从所有方面参与表皮的老化现象。表皮的老化作为一例可列举湿润降低、肌肤粗糙、颜色不均匀、和皮肤的弹性降低等。这些老化现象分别由于透明质酸降低、皮肤屏障功能的降低、炎症发生、和乳头层纤维和/或PDGF-BB的产生减少而发生。这些老化现象全部能够通过表皮基底干细胞数的减少抑制或增加促进来解决。因此，层粘连蛋白511表达促进剂、表皮基底膜稳定剂、和表皮基底干细胞的减少抑制或增加促进剂分别也可以说是具有选自丝聚蛋白基因表达促进作用、皮肤屏障功能提高作用、水分含量提高作用、透明质酸增加作用、炎症镇静作用、和乳头层纤维和/或PDGF-BB产生促进作用中的1种以上作用的抗老化剂。另外，层粘连蛋白511表达促进剂、表皮基底膜稳定剂、和表皮基底干细胞的减少抑制或增加促进剂分别也可以称为丝聚蛋白基因表达促进剂、皮肤屏障功能提高剂、水分含量提高剂、透明质酸增加剂、炎症镇静剂、和乳头层纤维和/或PDGF-BB产生促进剂。
实施例
实施例1：人皮肤中的MCSP阳性表皮基底干细胞的年龄增长变化和紫外线的影响的测定
样品
取得进行了知情同意的20多岁至70多岁的受检者(20多岁：9名、30多岁：10名、40多岁：10名、50多岁：9名、60多岁：10名、和70多岁：9名)的脸面和腹部的皮肤样品，按照AMex法使用冷丙酮固定，然后包埋在石蜡中。
将包埋后的组织制成厚度3μm的切片，使用黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)抗体(MAB2029,Chemicon,Billerica,MA)作为一抗，作为二抗使用Alexa488标记抗小鼠IgG抗体(Lifetechnologies,Carlsbad,CA)进行染色。进一步使用DAPI进行核染色，进一步使用抗α6整联蛋白抗体(GOH3,SantaCruz,Dallas,TX)作为一抗，作为二抗使用Alexa594标记抗大鼠IgG抗体(Lifetechnologies,Carlsbad,CA)进行染色。使用Olympus BX51显微镜进行可视化，用DPControl数码相机获得图像。20多岁的受检者和60多岁的面部和腹部的染色结果示于图1A。
由图1A的结果可知，在20多岁的受检者、与60多岁的受检者中，存在于表皮基底层的MCSP阳性的基底细胞(以下称为表皮基底干细胞)的数在面部和腹部两方均随着年龄增长而减少。另外，由相同受检者中的面部(露光部)与腹部(非露光部)的比较可知，在面部(露光部)表皮基底干细胞数较少。另外，在各受检者中测定相对于基底膜的长度的表皮基底干细胞数，将其平均作图而显示(图1B)。
接着，将从0岁至60多岁的各年龄段的受检者获得的角质形成细胞培养后，进行分离、回收，使用RNeasy mini kit(QIAGEN,Tokyo,Japan)按照产品说明书提取、纯化mRNA。
对于角质形成细胞中的MCSP基因的表达量，使用Platinum SYBR GreenqPCRsuper MIX-UDG(Invitrogen Japan,Tokyo Jaqpan)进行定量PCR。所使用的引物如下：
表1
各年龄段中的表达量的变化示于图1C。
由图1A的结果可知，年龄增长和紫外线分别助长了表皮基底干细胞数的减少。另外，由图1B和C的结果显示，随着年龄增长，在获得MCSP阳性细胞数的同时，MCSP的表达量也降低。
将包埋后的组织制成厚度3μm的切片，分别使用抗层粘连蛋白332抗体(制成：BM165,小鼠单克隆抗体)、抗层粘连蛋白511抗体(4C7、Abacam,Cambridge,UK)、和抗β1整联蛋白抗体(销售方：P5D2,Santa Cruz,CA)作为一抗，作为二抗使用Alexa488标记抗小鼠IgG抗体(销售方：Lifetechnologies,Carlsbad,CA)进行染色。进一步使用DAPI进行核染色。使用Olympus BX51显微镜进行可视化，用DPControl数码相机获得图像。20多岁的受检者和60多岁的面部和腹部的染色结果示于图2A。
另外，将从各年龄段的受检者获得的角质形成细胞进行分离、回收，使用RNeasymini kit(QIAGEN,Tokyo,Japan)按照产品说明书提取、纯化mRNA。对于角质形成细胞中的层粘连蛋白α5基因的表达量，使用Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG(InvitrogenJapan,Tokyo Jaqpan)进行定量PCR。所使用的引物如下：
表2
各年龄段中的表达量的变化示于图2B。由图1A～C、以及图2A和2B的结果可知，关于针对年龄增长和紫外线的影响，层粘连蛋白551和β1整联蛋白的表达量、与表皮基底干细胞数显示相同倾向。
实施例2：层粘连蛋白511与干细胞标志物的关连
对于人表皮角质形成细胞，使用Humedia-KG2培养基(Kurabo Col,Ltd,Japan)，在用iMatrix-511(和光纯药工业株式会社)涂覆后的Primeria烧瓶(Coaster,Tokyo,Japan)中培养6天。作为对照，在未涂覆的烧瓶中进行培养。将增殖到汇合的细胞用Typsin(Nakarai co,ltd,Japan)剥离，接种在经iMatrix-511涂覆的腔室载玻片(Thermo FisherScience,Waltham,MA)上，进行培养。对照组用未涂覆的腔室载玻片进行培养。
培养后，将细胞用4％PFA固定，使用MCSP抗体(MAB2029,Chemicon,Billerica,MA)作为一抗，作为二抗使用Alexa488标记抗小鼠IgG抗体(Lifetechnologies,Carlsbad,CA)进行染色。进一步使用DAPI进行核染色。使用Olympus BX51显微镜进行可视化，用DPControl数码相机获得图像。可知与未涂覆对照相比，iMatrix511涂覆组中MCSP阳性细胞更多地维持(图3A)。
接着在培养后弃去培养基，用PBS洗涤。使用RNeasy mini kit(QIAGEN,Tokyo,Japan)按照产品说明书从回收的细胞提取、纯化mRNA。为了测定作为干细胞标志物的CD46、DLL1、Lrig1和CD44的基因的表达量，使用Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG(Invitrogen Japan,Tokyo Jaqpan)进行定量PCR。所使用的引物如下：
表3
与对照中的CD46、DLL1、Lrig1和CD44的基因的表达量相比，层粘连蛋白511涂覆组中CD46、DLL1、Lrig1和CD44的基因的表达量增加(图3B)，显示层粘连蛋白511有助于干细胞的维持。
实施例3：通过层粘连蛋白分解抑制剂的添加带来的MCSP阳性表皮基底干细胞数的维持
获得进行了知情同意的受检者(20多岁至30多岁)的腹部的皮肤样品。将获得的样品用包含作为MMP9抑制剂的CGS270234(10μM)和作为乙酰肝素酶抑制剂的BIPBIU(10μM)的培养基培养4天。培养基使用William’s E培养基(Thermo Fisher Science,Waltham,MA)。CGS270234和BIPBIU分别是用下述的化学式表示的化合物，已知能够作为MMP9抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂使用(Iriyama S,et al.,Exp Dermatol.2011；20(11):953-5)。
将培养前的皮肤样品、培养4天后的样品(对照：添加等量的溶剂DMSO)、和培养4天后的样品(添加药剂)按照AMex法使用冷丙酮固定，然后包埋在石蜡中。
将包埋后的组织制成3μm的切片，使用抗层粘连蛋白551抗体(4C7、Abacam,Cambridge,UK)作为一抗，接着作为二抗使用Alexa488标记抗mouseIgG抗体(销售方：Lifetechnologies,Carlsbad,CA)进行共染色。进一步使用DAPI进行核染色。结果作为图4(A)显示。接着，对于包埋后的皮肤样品，使用抗MCSP抗体(MAB2029,Chemicon,Billerica,MA)作为一抗，接着作为二抗使用Alexa488标记抗小鼠IgG抗体(Lifetechnologies,Carlsbad,CA)进行共染色。进一步使用DAPI进行核染色。结果作为图4(B)显示。
由非培养组(第0天)、和对照的药剂未添加组(第4天:对照)的比较可知，通过4天的组织培养，存在于基底膜的层粘连蛋白551减少，并且MCSP阳性细胞也减少。另一方面，如果添加分解层粘连蛋白的基质金属蛋白酶9(MMP9)和乙酰肝素酶的抑制剂进行培养，则在层粘连蛋白551维持的同时，MCSP阳性细胞也维持。
实施例4：有层粘连蛋白511产生促进效果的药剂的筛选
将从胎儿获得的表皮细胞使用Humedia-KG2培养基(Kurabo Col,Ltd,Japan)，在经iMatrix-511(和光纯药工业株式会社)涂覆的Primeria烧瓶(Coaster,Tokyo,Japan)中培养6天。当细胞变成亚汇合时，用Trypsin剥离细胞，接种在6孔板中，1天后替换成溶解有候选药剂的培养基，进行48小时培养。作为候选药剂使用化妆品登录原料178品(明细：提取物类135品和单品化合物43品)。丢弃培养并用PBS洗涤，使用RNeasy mini kit(QIAGEN,Tokyo,Japan)按照产品说明书提取、纯化mRNA。对于层粘连蛋白α5、层粘连蛋白β1、和层粘连蛋白γ1基因的表达量，使用Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG(InvitrogenJapan,Tokyo Jaqpan)进行定量PCR。所使用的引物如下：
表4
与对照中的层粘连蛋白α5、层粘连蛋白β1、和层粘连蛋白γ1的基因的表达量相比，作为使层粘连蛋白α5、层粘连蛋白β1、和层粘连蛋白γ1的基因的表达量全部增加的候选药剂，发现了アルジェレックス(一丸ファルコス株式会社)。
对于筛选到的アルジェレックス，将药剂浓度变为0.001％、0.01％、和0.10％进行试验，调查用量依赖性的层粘连蛋白511表达促进效果。所使用的细胞、培养基、培养条件、和PCR条件与实施例4的药剂筛选方法中使用的相同。结果示于图5A。进而，在相同条件下使用抗层粘连蛋白511抗体(销售方：cloud-clone corp)，通过ELISA进行蛋白质定量分析。结果示于图5B。
实施例5：利用アルジェレックス的皮肤改善功能的检验
将从胎儿获得的表皮细胞使用Humedia-KG2培养基(Kurabo Col,Ltd,Japan)，在经iMatrix-511(和光纯药工业株式会社)涂覆的Primeria烧瓶(Coaster,Tokyo,Japan)中培养。当细胞变成亚汇合时，用Trypsin剥离细胞，接种在6孔板中，1天后替换成包含0.01％アルジェレックス的培养基，进行48小时培养。作为对照，使用不包含アルジェレックス的培养基。丢弃培养基并用PBS洗涤，使用RNeasy mini kit(QIAGEN,Tokyo,Japan)按照产品说明书提取、纯化mRNA。对于乙酰肝素酶(HPA)基因、PDGF-BB基因、透明质酸合成酶2(HAS2)基因、透明质酸酶1(HYAL1)、和白细胞介素8(IL-8)基因的表达量，使用Platinum SYBR GreenqPCRsuper MIX-UDG(Invitrogen Japan,Tokyo Jaqpan)进行定量PCR。所使用的引物如下：
表5
各个表达量的变化示于图6A～E。アルジェレックス在培养表皮细胞中使乙酰肝素酶(HPA)基因的表达显著地降低(p＜0.01)，使PDGF-BB基因的表达显著地增加(p＜0.001)，使透明质酸合成酶2(HAS2)基因的表达显著地增加(p＜0.01)，使透明质酸酶1(HYAL1)基因的表达显著地降低(p＜0.01)，并且使白细胞介素8(IL-8)基因的表达降低(p＜0.05)。
实施例6：HEI的层粘连蛋白的分解抑制和MCSP阳性表皮基底干细胞的维持效果
获得进行了知情同意的受检者(20多岁至30多岁)的腹部的皮肤样品。将获得的样品用包含0.01％1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮(HEI或S-173)的培养基培养5天。培养基使用William’s E培养基(Thermo Fisher Science,Waltham,MA)。对照使用未添加HEI的培养基进行培养。将培养后的皮肤样品按照AMex法使用冷丙酮固定，然后包埋在石蜡中。
将包埋后的组织制成3μm的切片，使用MCSP抗体(MAB2029,Chemicon,Billerica,MA)作为一抗，作为二抗使用Alexa488标记抗小鼠IgG抗体(Lifetechnologies,Carlsbad,CA)进行染色。进一步使用DAPI进行核染色，进一步使用抗层粘连蛋白551抗体(4C7、Abacam,Cambridge,UK)作为一抗，作为二抗使用Alexa488标记抗小鼠IgG抗体(Lifetechnologies,Carlsbad,CA)进行染色。使用Olympus BX51显微镜进行可视化，用DPControl数码相机获得图像并示于图7A。通过进行培养，在对照中层粘连蛋白511减少，进而MCSP阳性细胞数也减少。另一方面，在添加0.01％HEI培养的情况下，层粘连蛋白511的量能够维持，另外基底膜上的MCSP阳性细胞数也能够维持。
实施例7：HEI的乙酰肝素酶抑制作用
使用Behzad F,et al.,Analytical Biochemistry,320,pp.207-213,2003中记载的硫酸乙酰肝素固定化板进行乙酰肝素酶测定。具体地，通过使硫酸乙酰肝素(Sieikagaku,Tokyo,Japan)与光敏生物素反应，从而制备生物素化硫酸乙酰肝素。将生物素化硫酸乙酰肝素固定在碳水化合物结合表面板(Coastar,Tokyo,Japan)上。与A431细胞溶解产物(50μg/ml)一起将0％HEI、0.0005％HEI、0.005％HEI、和0.05％HEI添加在生物素化硫酸乙酰肝素固定化板上，在37℃孵育3小时，用PBS-T洗涤。然后，与过氧化物酶-亲和素(Vector Laboratories,Inc.CA,USA)在37℃孵育1小时。加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液(Bio-Rad,Tokyo,Japan)，然后将板进一步在室温孵育30分钟。测量450nm的吸光度，确定乙酰肝素酶的抑制作用。显示HEI用量依赖性地抑制乙酰肝素酶的活性(图8)。
实施例8：HEI的MMP9抑制作用
使用Matrix Metalloproteinase-9(MMP-9)colorimetric drug discovery kit(Enzo life sience Inc.)进行MMP9测定。具体地，在重组人MMP-9酶的溶液中加入HEI使其为0.0001％、0.001％、0.01％。混合MMP-9显色底物后，每隔1分钟测定412nm的吸光度。从吸光度的斜率(OD/min)计算出HEI的MMP-9抑制率(％)。显示HEI用量依赖性地抑制MMP9的活性(图9)。
实施例9：HEI的表皮改善效果
获得进行了知情同意的受检者(20多岁至30多岁)的腹部的皮肤样品。将获得的样品用包含0.01％HEI的培养基培养5天。培养基使用William’s E培养基(Thermo FisherScience,Waltham,MA)。对照使用未添加HEI的培养基进行培养。将培养后的皮肤样品上所附着的多余的水分用纸巾擦除，放置5分钟后，使用VapomeTer测定TEWL，CorneomeTer测定角质层水分量。结果示于图10B和C。另外，将培养后的皮肤样品按照AMex法使用冷丙酮固定，然后包埋在石蜡中。
将包埋后的组织制成3μm的切片，使用丝聚蛋白抗体(销售方：AKH-1,SantaCruzBiotechnology,Dallas,TX)作为一抗，作为二抗使用Alexa488标记抗mouseIgG抗体(Lifetechnologies,Carlsbad,CA)进行染色。进一步使用DAPI进行核染色。使用OlympusBX51显微镜进行可视化，用DPControl数码相机获得图像并示于图10A。
接着，对20～50岁的20名男性，将1.5％HEI水溶液应用于脸的一面，将水应用于脸的另一面，1天2次，应用4周。在应用前、应用后2周、和应用后4周的时间点使用VapomeTer测定TEWL，使用CorneomeTer测定角质层水分量。结果示于图10D和E。
在HEI的添加组中，在离体(ex vivo)实验中，观察到丝聚蛋白的增加倾向。并且，在离体(ex vivo)实验和体内(in vivo)实验的任一者中，都由于TEWL减少而皮肤屏障功能改善，并且角质层水分含量也增加。
实施例10：通过添加MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂而带来的基底膜紧下方的胶原的变化
将从Bio Predic社购买的皮肤组织制成皮肤组织片，在添加了CGS27023A(终浓度10-5M)和BIPBIPU(终浓度10-5M)的William’s E培养基中培养。对照在不包含这些抑制剂的条件下进行培养。每天交换培养基，在培养第5天回收皮肤组织片。将回收的皮肤组织片浸泡在Zamboni固定液中，用1％锇进行后固定。皮肤试样用环氧树脂包埋。制成超薄切片，用透射型电子显微镜(JEOL JEM1230)进行观察(图11A)。
观察各组6个皮肤切片，由1个切片拍摄30张照片。将全部照片的真皮部位中存在的胶原纤维的大小和根数使用图像分析软件“Win ROOF2013”进行计算，制成直方图(图11B)。另外，同样地使用图像分析软件“Win ROOF 2013”提取真皮的面积，计算出真皮中的胶原纤维的密度、和每1根的粗细，导出平均值(图11C)。
实施例11：V型胶原的表达
将从Bio Predic社购买的皮肤供于AMeX法，制成蜡块。以3μm的厚度制成切片，使用针对V型胶原的抗体(ORIGENE社，CaT#：AM1015PU-N)和针对细胞角蛋白14(K-14)的抗体(FiTzgerald，CaT#；20R-CP002)进行荧光免疫染色(图12A)。基底膜区域被细胞角蛋白14染色，显示在其紧下方存在V型胶原，通过年龄增长而其量减少。
从Kurabo社、Bio Predic社购买正常人表皮细胞和正常人成纤维细胞。分别购买从20～30多岁的受检者获得的6个样本、从50-60多岁的受检者获得的6个样本。将表皮细胞在无血清培养基Humedia-KG2中培养，将成纤维细胞在包含10％血清的DMEM培养基中培养。1次传代之后，将各样品接种在6孔板中。形成汇合后，回收各细胞，制备cDNA，使用下述引物通过实时PCR评价V型胶原的基因COL5A1的基因表达量(图12B)。显示V型胶原不由表皮细胞表达，由成纤维细胞表达，随着年龄增长其表达量降低。
表6
将从Bio Predic社购买的皮肤组织制成皮肤组织片，在添加了CGS27023A(终浓度10-5M)和BIPBIPU(终浓度10-5M)的William’s E培养基中培养。对照在不包含这些抑制剂的条件下进行培养。每天交换培养基，在培养第5天回收皮肤组织片。将回收的皮肤组织片供于AMeX法，制成石蜡块。以3μm的厚度制成切片，使用针对V型胶原的抗体(ORIGENE社，CaT#：AM1015PU-N)和针对细胞角蛋白14(K-14)的抗体(FiTzgerald，CaT#；20R-CP002)进行荧光免疫染色(图13A)。
将从MaTTeK社购买的皮肤三维模型(EFT-400)在添加了CGS27023A(终浓度10-5M)、BIPBIPU(终浓度10-5M)的专用培养基(EFT400-ASY)中培养。对照在不包含这些抑制剂的条件下进行培养。每2天进行1次培养基交换，第7天回收组织片，按照AMeX法制成石蜡块。以3μm的厚度制成切片，使用针对V型胶原的抗体(ORIGENE社，CaT#：AM1015PU-N)和针对细胞角蛋白14(K-14)的抗体(FiTzgerald，CaT#；20R-CP002)进行荧光免疫染色(图13A)。
将皮肤三维模型分别在抑制剂的添加和非添加(对照)组中培养4天和7天培养。培养后，剥离表皮，仅将真皮放入Trizol中提取mRNA。迅速制成cDNA，使用上述的引物通过实时PCR评价V型胶原的基因COL5A1的基因表达量(图13B)。
在皮肤组织的器官培养和皮肤三维模型的两方，与对照相比，添加了MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂的情况下V型胶原的表达增加。另一方面，真皮层整体中未发现通过添加MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂而造成V型胶原的表达显著变化。
在实施例10的TEM图像中，着眼于存在于基底膜紧下方的成纤维细胞(图13C)。在图13C的对照(抑制剂的非添加组)中，成纤维细胞内基本没观察到胶原纤维，在抑制剂添加组中，在成纤维细胞内的小泡内观察到胶原纤维。提示该小泡是胶原分泌过程。由此提示，基底膜紧下方的成纤维细胞通过添加MMP抑制剂和乙酰肝素酶抑制剂而积极地产生胶原。
将从MaTTeK社购买的皮肤三维模型(EFT-400)在添加了CGS27023A(终浓度10-5M)、BIPBIPU(终浓度10-5M)的专用培养基(EFT400-ASY)中培养。对照在不包含这些抑制剂的条件下进行培养。采集培养第2天、第4天、第7天的培养上清。另外将从Bio Predic社购买的从14个月的孩子采集的皮肤来源的正常人成纤维细胞在添加了10％FBS的DMEM中培养24小时，在所得的培养物中添加从皮肤三维模型的培养物采集的培养上清。添加1天后回收细胞，用Trizol提取mRNA。迅速制成cDNA，使用上述的引物，通过实时PCR评价V型胶原的基因COL5A1的基因表达量(图14)。通过添加皮肤三维模型的培养上清，V型胶原的表达显著地增加。由此显示，皮肤三维模型的培养上清中包含促进V型胶原的产生的因子。
实施例12：促进V型胶原表达的因子的探索
将从MaTTeK社购买的皮肤三维模型(EFT-400)在添加了CGS27023A(终浓度10-5M)、BIPBIPU(终浓度10-5M)的专用培养基(EFT400-ASY)中培养。从培养第2天、第4天、第7天的皮肤模型回收表皮，使用ナカライ社制RIPA缓冲液制备蛋白质提取液。使用Abcam社制membrane array kit(ab134002)，使用FUJIFILM社制LAS-1000UVmini检测蛋白质提取液中的各种细胞因子量，用附带的软件进行数值化制成图(数据未披露)。筛选与对照相比量增大的细胞因子作为促进V型胶原表达的候选细胞因子。作为该候选细胞因子，筛选包含PDGF-BB的3种细胞因子。
从R&D社购买所筛选的重组细胞因子蛋白质。将从14个月的孩子采集的皮肤来源的正常人成纤维细胞在添加了10％FBS的DMEM中培养24小时，对所得的培养物，用在包含25％血清的DMEM培养基中添加了各细胞因子使其为指定浓度的培养基进行置换，进一步培养24小时。培养后，回收细胞，用Trizol提取mRNA。迅速制成cDNA，使用上述的引物通过实时PCR评价V型胶原的基因COL5A1的基因表达量(图15)。在3种细胞因子中，仅PDGF-BB显著地增加V型胶原产生。由此考虑，PDGF-BB是由表皮侧产生的细胞因子，并且是作用于基底膜紧下方的成纤维细胞而促进V型胶原表达的因子。
实施例13：PDGF-BB的作用位置和PDGF-BB的表达变化
对于与实施例11同样地获得的石蜡块，以3μm的厚度制成切片，使用针对PDGFR-β的抗体(R&D SysTems，CaT#；MAB1263)和针对细胞角蛋白14(K-14)的抗体(FiTzgerald，CaT#；20R-CP002)进行荧光免疫染色(图16A)。可知无论年龄如何，都在基底膜紧下方存在大量表达PDGFR-β的细胞。由此确认，由基底膜或表皮侧分泌的PDGF-BB能够作用于基底膜紧下方的成纤维细胞。
将从KAC社、Bio Predic社购买的各年龄的正常人表皮细胞进行培养，提取mRNA。迅速制备cDNA，使用下述引物通过实时PCR来评价PDGFB的基因表达量(图16B)。
表7

Claims (22)

1.层粘连蛋白511表达促进剂的筛选方法，以表皮细胞中的层粘连蛋白511的表达量作为指标。
2.根据权利要求1所述的方法，包括：
在包含候选药剂的培养基中培养表皮细胞的工序，
测定表皮细胞中的层粘连蛋白511的表达量的工序，和
在与对照中的层粘连蛋白511表达量相比，层粘连蛋白511的表达量增加的情况下，判定候选药剂具有层粘连蛋白511表达促进效果的工序。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述层粘连蛋白511的表达量由层粘连蛋白511的蛋白质的量、或选自层粘连蛋白α5的mRNA量、层粘连蛋白β1的mRNA量和层粘连蛋白γ1的mRNA量中的1种以上mRNA量确定。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，层粘连蛋白511的表达量由层粘连蛋白α5的mRNA量、层粘连蛋白β1的mRNA量和层粘连蛋白γ1的mRNA量的合计量确定。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的方法，所述层粘连蛋白511表达促进剂是表皮基底膜稳定剂。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的方法，表皮基底膜稳定剂是表皮干细胞的减少抑制或增加促进剂。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的方法，表皮细胞包含表皮干细胞。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的方法，表皮干细胞包含表皮基底干细胞。
9.根据权利要求1～8的任一项所述的方法，表皮细胞包含MCSP表达细胞。
10.根据权利要求1～9的任一项所述的方法，表皮细胞还包含表达整联蛋白的细胞。
11.根据权利要求1～10的任一项所述的方法，表皮细胞来源于胎儿。
12.层粘连蛋白511的表达促进剂，以选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮作为有效成分。
13.利用层粘连蛋白511的表达促进的表皮基底膜稳定剂，以选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮作为有效成分。
14.利用层粘连蛋白511的表达促进的表皮干细胞的减少抑制或增加促进剂，以选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物或1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮作为有效成分。
15.细胞外基质分解酶的活性抑制剂，包含1-(2-羟基乙基)-2-咪唑烷酮。
16.根据权利要求15所述的细胞外基质分解酶的活性抑制剂，细胞外基质分解酶是基质金属蛋白酶或乙酰肝素酶。
17.根据权利要求15所述的细胞外基质分解酶的活性抑制剂，细胞外基质分解酶是基质金属蛋白酶9。
18.层粘连蛋白511分解抑制剂，包含权利要求15～17的任一项所述的细胞外基质分解酶的活性抑制剂。
19.表皮干细胞的减少抑制或增加促进剂，包含权利要求15～17的任一项所述的细胞外基质分解酶的活性抑制剂。
20.皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的改善剂，包含将选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物应用于需要改善皮肤屏障、弹性、湿润和炎症的对象。
21.IL-8表达抑制剂，包含选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物。
22.炎症抑制剂，包含选自褐藻、红藻和绿藻中的至少1种的提取物。
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