KR102031161B1

KR102031161B1 - 피부 미백 물질 스크리닝 시스템

Info

Publication number: KR102031161B1
Application number: KR1020120114965A
Authority: KR
Inventors: 이애영; 이태룡; 최현정
Original assignee: (주)아모레퍼시픽; 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2019-10-14
Also published as: JP2015501152A; CN103857802A; KR20130043069A; JP6069334B2; CN103857802B

Abstract

본 발명은 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포를 포함하는 하나 이상의 층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템 및 상기 시스템을 이용하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 개시한다. 또한 본 발명은 상기 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 물질을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 개시한다.

Description

피부 미백 물질 스크리닝 시스템{Screening System of candidate material for skin-whitening}

본 발명은 피부 미백 물질 스크리닝 시스템 및 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

기존에는 신규 미백 물질을 개발함에 있어 후보 물질을 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트(melanocyte)에 직접 처리한 후 멜라닌 생성을 억제하는지 확인하거나, 멜라노사이트에 자외선을 조사하고 후보 물질이 이때 발생하는 멜라닌 생성 신호를 차단하는지 여부를 확인하는 방법을 사용해 왔다. 하지만 실제 피부에서 멜라노사이트는 단독으로 존재하지 않고, 다른 주변의 세포나 미세 환경으로부터 직접 또는 간접적으로 물리적 또는 화학적인 영향을 받아 멜라닌을 생성하게 되는데, 멜라노사이트만으로는 이러한 실제 피부 조직 상태를 재현할 수 없다.

또한 기미, 점, 흑자, 검버섯과 같은 피부 과색소침착증은 그 발생 요인이나 기전이 자외선에 의한 멜라닌 생성 증가와 다르며, 비록 자외선에 의해 그 증상이 악화되는 경향이 있으나 자외선과 같은 자극이 없는 경우에도 멜라닌 생성과 분산이 계속적으로 증가한다. 따라서 기존의 자외선 조사 방법을 기초로 개발한 미백 물질의 경우, 실제 임상에서는 인간 피부 과색소침착증 억제 효과를 나타내지 않는 경우가 많다. 게다가 피부 과색소침착증을 연구하기 위해 피검자의 과색소침착 부위의 피부를 생검하여 사용하는 것은 그 비용과 노력이 매우 많이 들고 인간 피부 조직을 얻기도 쉽지 않을 뿐만 아니라, 자외선 조사 모델과 달리 피부 과색소침착증의 동물 모델도 구하기가 어렵다.

이에, 인간 피부 조직 구조, 특히 피부 과색소침착증을 나타내는 인간 피부 조직 구조와 매우 유사하면서도 간편하게 미백 물질을 스크리닝할 수 있는 시스템 및 스크리닝 방법에 대한 요구가 존재한다.

한국등록특허 제10-0840144호(2008.06.16. 등록) 명세서

본 발명의 일측면은 효과적이면서도 간편하게 임상적으로 유용한 피부 미백 물질을 스크리닝할 수 있는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템 및 이를 이용한 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 일측면은 상기 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 물질을 유효 성분으로 포함하여, 우수한 피부 미백 효과를 나타내는 피부 미백용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 다른 일측면은 피부의 맬라닌생성 관여 유전자 자체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 또는 피부 외용제 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일측면은 섬유아세포(fibroblast), 케라티노사이트(keratinocyte) 및 멜라노사이트(melanocyte) 중 하나 이상의 세포를 포함하는 하나 이상의 층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다.

본 발명의 다른 일측면은 후보 물질을 처리한 상기 피부 미백 물질 스크리닝 시스템에서, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 WIF 1, WNT 1, WNT 5a 및 NFATC 2 중 하나 이상의 발현 정도 또는 인산화 정도를 확인하는 단계를 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일측면은 상기 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 물질을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 또는 WIF 1 자체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 및 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 실제 피부 조직과 가깝게 설계되어 in vitro에서도 임상적으로 미백 효과가 있는 물질을 적은 시간과 비용으로 간편하게 스크리닝할 수 있다. 특히 멜라노사이트에 후보 물질을 처리한 후 자외선을 조사함으로써 미백 물질을 스크리닝하던 기존의 방법과 달리, 본 발명에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 과색소침착증을 나타내는 실제 피부 조직의 유전자 발현 정도 및 신호전달인자의 인산화 정도와 유사한 조건을 가지므로, 이를 이용하는 경우 피부 미백 물질, 특히 과색소침착증 개선에 효과적인 물질을 간편하게 스크리닝할 수 있다. 이는 과색소침착증 연구를 위한 인간 및 동물 모델을 구하기 어렵다는 점에서 새로운 피부 미백 물질, 구체적으로 과색소침착증 개선 물질 개발을 위한 유용한 시스템 또는 키트가 될 수 있을 것이다.

도 1은 피험자의 정상 피부(N)와 피부 과색소침착 부위(L)의 WIF 1 유전자 발현 정도 차이를 비교한 그래프이다.
도 2는 피험자의 정상 피부(N)와 피부 과색소침착 부위(L)의 WNT 1 및 WNT 5a의 발현 정도 차이를 비교한 그래프이다.
도 3은 멜라노사이트(MC), 케라티노사이트(KC) 및 섬유아세포(FB)에서의 WIF 1 유전자 발현 정도 차이를 비교한 그래프이다.
도 4는 WIF 1 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 티로시나아제(tyrosinase)의 발현이 증가하는 것을 보여주는 결과이다.
도 5는 WIF 1 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 멜라노좀의 이동이 증가한 것을 보여주는 결과이다.
도 6은 WIF 1 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 NFATC 2가 탈인산화되는 것을 보여주는 결과이다.
도 7은 WIF 1 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 티로시나아제의 발현이 증가하는 것을 보여주는 실험 결과이다.
도 8은 WIF 1 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 멜라노좀의 이동이 증가한 것을 보여주는 결과이다.
도 9는 WIF 1 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 NFATC 2의 탈인산화되는 것을 보여주는 결과이다.
도 10은 유전자 재조합 기술로 만든 인간 WIF 1을 멜라노사이트에 처리했을 때 멜라노사이트의 WIF 1 발현이 증가함을 보여주는 결과이다.
도 11은 도 10과 같이 WIF 1의 발현을 유도한 멜라노사이트에서 티로시나아제의 발현이 감소하는 것을 보여주는 결과이다.
도 12는 유전자 재조합 기술로 만든 인간 WIF 1을 멜라노사이트를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 처리했을 때 멜라노좀의 이동이 감소한 것을 보여주는 결과이다.
도 13은 도 10과 같이 WIF 1의 발현을 유도한 멜라노사이트에서 NFATC 2가 인산화되는 것을 보여주는 결과이다.

본 명세서에서 "피부"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.

피부의 멜라노사이트(melanocyte)는 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)을 만드는 세포로서, 피부의 진피와 표피의 경계선 역할을 하는 기저막 위에 위치한다. 발생학적으로 멜라노사이트는 뉴럴 클러스트 세포(neural-crest cells)에서 출발하여 멜라노사이트 줄기 세포(Melanocyte stem cell), 전구 세포인 멜라노블라스트(melanoblast)를 거쳐 피부로 이동하면서 최종적으로 멜라닌을 생성할 수 있는 색소 세포인 멜라노사이트로 분화한다고 알려져 있다.

이렇게 분화한 멜라노사이트는 피부 속에서 혼자 존재하는 것이 아니라 그 위에 위치한 각질 형성 세포인 케라티노사이트와의 결합 및 아래에 위치한 진피에 있는 섬유아세포의 영향을 받아 멜라닌을 생성하게 된다. 멜라노사이트에서 만들어진 멜라닌은 세포 돌기(dendrite)를 통해 주변에 있는 케라티노사이트로 이동하여 피부 표면에 넓게 분산됨으로써 자외선과 같은 유해 인자로부터 피부를 보호하고 피부색을 나타낸다. 정상 피부는 자외선과 같은 자극이 왔을 때 평소보다 많은 멜라닌을 생성하고 멜라닌의 분산을 증가시켰다가, 그러한 자극이 소멸되면 멜라닌 생성과 분산을 다시 낮은 수준으로 되돌린다.

앞서 살펴본 바와 같이, 멜라노사이트가 피부 속 다른 세포들이나 주변 미세 환경의 물리적, 화학적 요인으로부터 복합적인 영향을 받아 멜라닌을 생성하는 실제 피부 조건을 반영하지 못하는 기존의 방법에 의해 개발된 미백 물질, 그 중에서도 특히 자외선 조사 방법에 의해 개발된 미백 물질은 피부 과색소침착증 개선에 있어 임상적으로 낮은 효과를 나타내는 경우가 많다. 피부 과색소침착증은 다양한 발생 원인과 특이적인 기작에 의한 피부 흑화이기 때문에 이를 효과적으로 개선할 수 있는 미백 물질을 개발하기 위해서는 실제 피부와 유사한 실험 모델을 만들고, 이를 이용하여 미백 물질을 개발하는 것이 필요하다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일측면은 섬유아세포(fibroblast), 케라티노사이트(keratinocyte) 및 멜라노사이트(melanocyte) 중 하나 이상의 세포를 포함하는 하나 이상의 층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다. 본 발명의 다른 일측면은 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포층; 케라티노사이트를 포함하는 케라티노사이트층 및 멜라노사이트를 포함하는 멜라노사이트층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다. 이때 실제 피부 조건과 유사하도록, 섬유아세포층이 가장 아래에 적층되고, 그 위에 멜라노사이트층이 적층되며, 그 위에 케라티노사이트층이 적층될 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포층; 및 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상을 포함하는 층을 포함하여, 케라티노사이트와 멜라노사이트를 동일한 층에 포함할 수 있다. 이 때 섬유아세포층이 아래에 적층되고, 그 위에 멜라노사이트와 케라티노사이트가 포함된 층이 적층될 수 있다. 상기 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 피부 세포층이 적층된 3차원 입체 구조의 시스템으로, 멜라노사이트뿐만 아니라 주변에 있는 세포들을 포함함으로써, 실제 피부 상태를 잘 반영할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포층은 제외하고, 멜라닌 생성에 보다 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 멜라노사이트와 케라티노사이트를 포함하는 층을 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템의 섬유 아세포층은 진피층을 재현한 것으로, 콜라겐에 섬유아세포가 포함된 층을 포함한다. 구체적으로 상기 섬유아세포층은 콜라겐 액에 섬유아세포를 넣고 굳혀 제조한 층일 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 콜라겐은 피부 미백 물질 스크리닝 시스템 전체 중량을 기초로 0.001 중량% 내지 30 중량%, 구체적으로 0.01 중량% 내지 20 중량%, 더 구체적으로 0.1 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절하고, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 사용하는 것이 적절할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템에서 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 인간, 마우스, 기니아피그, 닭과 같은 조류 및 돼지 중 선택된 하나 이상에서 유래한 세포를 포함한다.

본 발명의 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 피부 미백 효과가 있는 물질, 구체적으로 자외선에 의한 피부 흑화 개선 효과가 있는 물질뿐만 아니라 특히 기미, 점, 흑자 또는 검버섯과 같은 피부 과색소침착증 개선 효과가 있는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

본 발명자들은 과색소침착증을 나타내는 피부에서, 배아 성장조절과 연관된 세포외 신호 분자인 WIF 1(Wnt inhibitory factor 1, ACCESSION NP_009122, VERSION NP_009122.2 GI:111125011) 유전자 발현이 감소하며, 구체적으로 WIF 1 유전자 발현은 피부 세포 중에서도 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트가 아닌 케라티노사이트와 섬유아세포에서 감소함으로써, 멜라노사이트의 멜라닌 생성에 영향을 준다는 것을 밝혔다. 또한 WIF 1 유전자의 발현이 감소된 피부에서, 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제의 발현이 증가함과 동시에 케라티노사이트로의 멜라닌 확산이 증가함을 밝혀, WIF 1과 피부 과색소침착증 간에 밀접한 관련이 있음을 확인하였다. 이때 WIF 1 유전자의 발현은 GSK-3β(Glycogen synthase kinase-3β)와 β-카테닌(β-catenin)의 인산화, MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 발현에 관여해 피부 과색소 침착에 영향을 준다는 것도 확인하였다.

이에 본 발명의 일측면은, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 WIF 1 발현이 억제된 피부 미백 물질 스크리닝 시스템, 구체적으로 케라티노사이트 또는 섬유아세포의 WIF 1 발현이 억제된 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 siRNA를 이용하여 WIF 1 발현이 억제된 세포를 포함한다. 상기 스크리닝 시스템은 케라티노사이트 또는 섬유아세포의 WIF 1 발현이 감소된 과색소침착증 피부 상태를 반영한 것으로, 과색소침착증을 나타내는 피부 상태를 실제와 거의 유사하게 재현할 수 있다. 따라서 상기 스크리닝 시스템을 이용하는 경우 피부 미백 효능이 있는 물질, 특히 피부 과색소침착증 개선에 효능이 있는 물질을 효과적으로 선별할 수 있다.

또한 본 발명자들은 과색소침착증을 나타내는 피부에서 원발암유전자(proto-oncogene)전구체 WNT 1(Wingless-type MMTV integration site family, member 1, ACCESSION NP_005421, VERSION NP_005421.1 GI:4885655) 및 단백질 WNT 5a(Wingless-type MMTV integration site family, member 5a, ACCESSION NP_001243034, VERSION NP_001243034.1 GI: 371502087) 유전자 발현이 증가하고, 신호 전달 인자인 NFATC2 (nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2)가 탈인산화됨을 밝혔으며, 이에 본 발명의 일측면은 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포가 WNT 1 및 WNT 5a 발현이 증가된 세포 또는 NFATC 2가 탈인산화된 세포인 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다. 상기 스크리닝 시스템은 과색소침착층을 나타내는 피부 상태를 실제와 가깝게 재현할 수 있으므로, 피부 미백 효능이 있는 물질, 특히 피부 과색소침착증 개선에 효능이 있는 물질을 효과적으로 선별할 수 있다.

기존에는 천연물, 그 추출물 또는 화학 합성 물질과 같은 후보 물질을 멜라노사이트에만 처리하여 미백 효능 유무를 평가하였다. 이러한 기존의 방법에 의하는 경우, 세포 배양액에 희석한 후보 물질을 세포에 직접 처리해야 하며, 크림이나 로션과 같이 실제 사용하는 제형에 후보 물질을 적용한 상태로는 멜라노사이트에 처리할 수 없다. 따라서 기존의 방법으로는 임상 실험을 실시하여야만 비로소 후보 미백 물질을 포함한 제형이 임상적으로 실제 미백 효과가 있는지를 확인할 수 있다. 반면, 본 발명에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 기존의 방법과 같이 후보 물질을 배양액에 희석하여 사용함으로써 그 미백 효과 유무를 평가할 수 있음은 물론, 후보 물질을 함유하는 크림이나 로션과 같은 제형을 사용하여 그 미백 효과 유무를 평가할 수도 있다. 이 때 제형에 대해 미백 효과 유무를 평가하기 위한 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포, 멜라노사이트 및 케라티노사이트 중 하나 이상을 포함하는 복수 개의 층을 적층한 후 공기에 노출시켜 인공 피부로 제조한 것일 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따른 피부 미백 스크리닝 시스템은 실제 피부와 유사한 생리적, 화학적 특징을 가지며, 실제 사용하는 제형을 사용하여서도 그 미백 효과에 대한 평가가 가능하므로 실제 임상적으로 미백 효과가 있는 물질을 보다 짧은 시간 안에 적은 비용으로 효율적이고 간편하게 선별할 수 있게 한다.

본 발명의 일측면은 후보 물질을 처리한 상기 피부 미백 물질 스크리닝 시스템에서 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 WIF 1, WNT 1, WNT 5a 및 NFATC 2 중 하나 이상의 발현 정도 또는 인산화 정도를 확인하는 단계를 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 살펴본 바와 같이, WIF 1, WNT 1, WNT 5a 및 NFATC 2는 모두 피부 멜라닌 색소의 발현 및 확산 정도와 관련이 있다. 구체적으로 WIF 1의 발현이 감소하거나, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현이 증가하거나 혹은 NFATC 2의 탈인산화 정도가 증가함은, 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 티로시나아제 발현이 증가하고, 케라티노사이트로의 멜라닌 확산이 증가함을 의미한다. 따라서 후보 물질이 WIF 1, WNT 1, WNT 5a 및 NFATC 2 중 하나 이상의 발현 정도 또는 인산화 정도에 어떠한 영향을 주는지를 확인함으로써, 상기 후보 물질이 피부 미백 효과가 있는지 여부를 평가할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 방법은 WIF 1의 발현 정도를 확인하는 단계 이후에, WIF 1의 발현 정도를 증가시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 방법은 WNT 1 또는 WNT 5a의 발현 정도를 확인하는 단계 이후에, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현 정도를 감소시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 방법은 NFATC 2의 인산화 정도를 확인하는 단계 이후에, NFATC 2의 인산화 정도를 증가시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특히 WIF 1의 발현이 감소하거나, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현이 증가하거나, NFATC 2의 탈인산화가 이루어진 섬유아세포, 멜라노사이트 및 케라티노사이트 중 하나 이상의 세포를 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 피부 흑화가 이루어진 실제 피부 조건을 재현하고 있는 것이므로, 후보 물질이 상기와 같이 조절된 시스템의 WIF 1, WNT 1 또는 WNT 5a 유전자 발현 정도 또는 신호 전달인자 NFATC 2의 인산화 정도를 어떻게 변화시키는지 여부를 평가함으로써, 후보 물질이 미백 효과가 있는 물질인지 여부, 특히 피부 과색소침착증을 개선할 수 있는 물질인지 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 일측면은 상기 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 물질을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다. 앞서 살펴 본 바와 같이 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포에서 WIF 1의 발현을 증가시키거나, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현을 감소시키거나 혹은 NFATC 2의 탈인산화 정도를 증가시키는 물질은 피부 미백 효과, 구체적으로 피부 과색소침착증 개선 효과가 있는 물질이라고 판단할 수 있으므로, 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물은 피부 미백 효과, 구체적으로 피부 과색소침착증 개선 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면은 상기와 같은 본 발명에 따른 유전자인 WIF 1 자체를 포함하는 피부 미백용 조성물 또는 피부 외용제 조성물을 제공함으로써, WIF 1의 티로시나아제의 발현을 억제시키고 케라티노사이트로의 멜라닌 확산을 억제에 의한 피부 미백 및 피부 과색소침착증 개선효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 피부 미백용 조성물은 화장품 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 영양화장수

하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조할 수 있다.

원료명	함량 (중량%)
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
WIF 1	0.01
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 2] 영양로션

하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양로션을 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량 %)
정제수	잔량
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	5.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
WIF 1	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.5
방부제	적량
향	적량
색소	적량
트리에탄올아민	0.1
계	100

[제형예 3] 영양크림

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조할 수 있다.

원료명	함량 (중량%)
글리세린	3.5
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
WIF 1	0.01
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 4] 팩

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량%)
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히알루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
WIF 1	0.01
노닐 페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
에탄올 방부제	적량
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 5] 연고

하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.

원료명	함량(중량 %)
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
WIF 1	0.01
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
밀납	4.0
정제수	잔량
계	100

이하, 실험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실험예 1] 피부 과색소침착 부위에서의 WIF 1 유전자 발현 변화

피험자 13명의 정상 피부 조직(N)과 과색소침착 부위의 피부 조직(L)을 생검(biopsy)하여 조직 내 RNA를 추출하고, 이를 이용하여 실시간(real-time) PCR 방법으로 유전자 발현 변화를 조사하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 볼 수 있듯이, 과색소침착 부위의 피부 조직에서 WIF 1의 발현은 정상 피부 조직에 비해 감소된다. 이를 통해 WIF 1이 피부 과색소침착과 관련 있음을 확인할 수 있다.

[실험예 2] 피부 과색소침착 부위에서의 WNT 1과 WNT 5a 발현 변화

피험자 13명의 정상 피부 조직(N)과 과색소침착 부위의 피부 조직(L)을 생검하여 조직 내 RNA를 추출하고 이를 이용하여 실시간 PCR 방법으로 WNT 1과 WNT 5a 유전자의 발현 변화를 조사하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 과색소침착 부위의 피부 조직에서 WNT 1과 WNT 5a의 발현은 정상 피부 조직에 비해 증가한다. 이를 통해 WNT 1과 WNT 5a가 피부 과색소 침착과 관련 있음을 확인할 수 있다.

[실험예 3] 피부 세포에서의 WIF 1 유전자 발현

캐스캐이드 바이로직스(Cascade Biologics) 사로부터 입수한 미디움 254(Medium 254)에 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate) 10 ng/ml을 함유한 인간 멜라노사이트 성장 보충제(HMGs, human melanocyte growth supplement)를 넣고, 이를 배지로 사용하여 신생아의 표피에서 분리한 인간 피부 멜라노사이트를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 또한 캐스캐이드 바이로직스 사에서 입수한 미디움 EpiLife(#M-EPI-500-CA)에 인간 케라티노사이트 성장 보충제(HKGS, human keratinocyte growth supplement)를 넣고, 이를 배지로 사용하여 신생아의 표피에서 분리한 인간 피부 케라티노사이트를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 우태아혈청이 10% 들어간 DMEM(Dulbecco? Modified Eagles medium)에 신생아의 표피에서 분리한 인간 피부 섬유아세포(fibroblast)를 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 위와 같이 배양한 각 피부 세포에서 RNA를 분리하여 실시간 PCR로 WIF 1의 유전자 발현을 조사하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 볼 수 있듯이, 섬유아세포(FB)와 케라티노사이트(KC)에서는 WIF 1이 발현되며, 멜라노사이트(MC)에서는 발현되지 않았다. 이를 통해, 피부 세포에서 WIF 1는 멜라노사이트가 아닌 섬유아세포와 케라티노사이트에서 발현됨을 알 수 있다.

[실시예 1 내지 3 및 비교예 1과 2] 시스템의 제조

진피의 중요 구성 성분인 콜라겐 1(collagen I, 1 mg/ml) 용액에 2.5 X 10⁵/ml의 섬유아세포를 넣고, 이를 6-웰 플레이트에 웰 당 2 ml씩 넣은 후 37℃ 배양기에서 한 시간 이상 굳혀 3차원 인공 진피를 제조하였다. 그 위에 1:1로 섞은 총 2.5 X 10⁵개의 멜라노사이트 및 케라티노사이트층을 올려 3차원 시스템을 제조하였다. 이때 siRNA를 처리하여 WIF 1의 발현을 억제시킨 섬유아세포를 사용한 시스템을 실시예 1로 하고, 인간 피부의 정상 섬유아세포를 사용한 시스템을 비교예 1로 하였다.

또한 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 siRNA를 처리하여 WIF 1의 발현을 억제시킨 케라티노사이트와 멜라노사이트를 이용하여 제조한 3차원 시스템을 실시예 2로 하고, 정상 케라티노사이트와 멜라노사이트를 이용하여 제조한 시스템을 비교예 2로 하였다.

그리고 인간 재조합 유전자를 사용하여 만든 WIF 1을 50 ng/ml로 배양 배지에 처리하여 WIF1의 발현을 증가시킨 멜라노사이트에 케라티노사이트를 섞은 후, 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 제조한 인공 진피 위에 올려 제조한 시스템을 실시예 3으로 하였다.

[실험예 4] WIF 1의 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 시스템에 대한 평가

본 발명에 따른 시스템인 실시예 1이 실제 피부 상태를 잘 반영하는지 여부를 아래와 같이 비교예 1과 대비하여 평가하였다.

WIF 1의 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 실시예 1의 시스템은 실제 피부 과색소침착 부위와 마찬가지로 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 티로시나아제의 발현이 비교예 1이 비해 현저히 증가되어 있는 것을 단백질 전기영동을 통한 웨스턴 블랏팅(western blotting) 방법으로 확인하였다(도 4 참조).

또한 케라티노사이트에서만 발현되는 케라틴 14 (keratin 14)를 인식하는 형광이 붙은 항체로 케라티노사이트를 염색하고, 멜라노사이트에서 발현되는 티로시나아제 유사 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TRP 1)을 인식하는 다른 색의 형광이 결합된 항체로 멜라노사이트를 염색하여, 두 가지 형광을 모두 가지고 있는 케라티노사이트의 수를 FACS (Fluorescence-activated cell sorting)를 이용해 확인한 결과, 실시예 1은 피부 과색소침착 부위처럼 케라티노사이트로의 멜라닌 확산이 비교예 1에 비해 증가되어 있었다(도 5 참조). 또한 이때 단백질 전기영동을 통한 웨스턴 블랏팅 방법을 통해 실시예 1의 시스템에서 신호 전달 인자인 NFATC 2 (nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2)의 인산화된 형태 (p-NFATC 2)가 감소되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 6 참조).

이를 기초로 섬유아세포, 멜라노사이트 및 케라티노사이트를 적층하여 3차원으로 제조한 본 발명에 따른 시스템은 실제 피부 상태와 유사하며, 특히 피부 과색소침착 부위를 재현할 수 있음을 확인할 수 있다.

[실험예 5] WIF 1의 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 시스템에 대한 평가

본 발명에 따른 시스템인 실시예 2가 실제 피부 상태를 잘 반영하는지 여부를 아래와 같이 비교예 2와 대비하여 평가하였다.

WIF 1의 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 실시예 2의 시스템에 대해 실험예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 평가한 결과, 실제 피부 과색소침착 부위와 마찬가지로 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 티로시나아제의 발현이 비교예 2에 비해 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다(도 7 참조).

또한 실험예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 평가하여, 실시예 2에서도 피부 과색소침착 부위처럼 멜라닌 확산이 증가되어 있음을 확인하였다(도 8 참조). 그리고 이때 NFATC 2의 인산화된 형태인 p-NFATC 2가 감소하였음을 확인하여, NFATC 2가 탈인산화 되어 있음을 확인하였다(도 9 참조).

이를 통해 멜라노사이트, 케라티노사이트를 이용하여 3차원으로 제조한 본 발명에 따른 시스템 역시 실제 피부 상태와 유사하며, 특히 피부 과색소침착 부위를 재현할 수 있음을 확인할 수 있다.

[실험예 6] 인간 재조합 유전자를 이용하여 만든 WIF 1을 직접 배양 배지에 처리하여 세포 자체의 WIF1 발현을 증가시킨 멜라노사이트를 포함하는 시스템에 대한 평가

인간 재조합 유전자를 사용하여 만든 WIF 1을 세포 배양 배지에 50 ng/ml이 되도록 처리한 멜라노사이트를 포함하는 실시예 3의 시스템에 대해 단백질 전기 영동을 통한 웨스턴 블랏팅 방법으로 WIF 1의 발현이 증가된 것을 확인하였다(도 10 참조). 이때 실험예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 실시예 3의 시스템에서 티로시나아제의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 11 참조). 또한 비교예 1과 비교한 결과, 실시예 3에서 멜라닌 확산이 감소함을 확인할 수 있었으며(도 12 참조), NFATC 2의 인산화가 증가되는 것 또한 확인하였다(도 13 참조).

이를 통해 WIF 1와 NFATC 2는 멜라닌 색소 생성과 밀접한 관련성이 있으므로, 본 발명에 따른 시스템에 후보 물질을 처리하고, 이후 WIF 1의 발현 증가 정도와 그 하위 신호전달인자인 NFATC 2의 인산화 정도를 평가함을 통해 피부 미백 물질을 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 실제 피부를 재현할 수 있으므로, in vitro에서도 임상적으로 우수한 피부 미백 효과를 나타내는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있게 한다. 나아가 이는 인간의 실제 피부 조직을 잘 반영하고 있으므로, 백반증 또는 백모와 같은 색소 결여증의 메커니즘 또는 개선 방법 연구에도 사용될 수 있을 것이다.

Claims

섬유아세포(fibroblast), 케라티노사이트(keratinocyte) 및 멜라노사이트(melanocyte) 중 하나 이상의 세포를 포함하는 하나 이상의 층을 포함하고,
상기 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 정상 피부 세포에 비하여 WNT 1 또는 WNT5a의 발현이 증가된 세포인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
제 1 항에 있어서,
섬유아세포를 포함하는 섬유아세포층; 및
케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상을 포함하는 층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
제 2 항에 있어서,
섬유아세포층은 콜라겐에 섬유아세포가 포함된 층인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
제 3 항에 있어서,
콜라겐은 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체 전체 중량을 기초로 0.001 중량% 내지 30 중량%로 포함되는 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
제 1 항에 있어서,
섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 WIF 1(Wnt inhibitory factor 1)의 발현이 억제된 세포인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
삭제
제 1 항에 있어서,
섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 NFATC 2(nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic 2)가 탈인산화된 세포인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
제 1 항에 있어서,
섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 인간, 마우스, 기니아피그, 닭 및 돼지 중 선택된 하나 이상에서 유래한 세포인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
제 1 항에 있어서,
피부 미백 물질은 피부 과색소침착증을 개선하는 미백 물질을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
후보 물질을 처리한 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체에서, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 WNT 1 또는 WNT 5a의 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하고,
발현 정도를 확인하는 단계 이후에, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현 정도를 감소시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체에서, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 WIF 1의 발현 정도를 확인하는 단계; 및
발현 정도를 확인하는 단계 이후에, WIF 1의 발현 정도를 증가시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계;를 더 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
삭제
제 10 항에 있어서,
상기 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체에서, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 NFATC 2의 인산화 정도를 확인하는 단계; 및
발현 정도 또는 인산화 정도를 확인하는 단계 이후에, NFATC 2의 인산화 정도를 증가시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계;를 더 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
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