KR100840144B1 - 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 단백질의 활성 변화를 측정하고, 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
선단 흑자성 흑색종(Acral lentiginous melanoma) 환자로부터 분리한 흑색종 세포가 정상의 멜라닌 세포나 다른 흑색종 세포의 흑색 멜라닌에 비해 훨씬 옅은 색깔(밝은 갈색)을 나타내며, 이러한 차이가 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 NQO1 및 그의 변이체들(isoforms)의 발현 감소에 기인한다는 것이 본 발명에 의해 새롭게 밝혀졌다. 따라서, 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 NQO1 또는 그의 변이체들(isoforms)은 미백 활성을 갖는 물질 탐색을 위한 신규 표적(target)으로서 기능할 수 있다.
NQO1, 미백

Description

미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법{Screening methods for candidate materials having whitening activity}
도 1은 정상인으로부터 분리한 색소세포, 실시예 1에서 얻은 PML-1 및 공지의 흑색종 세포주인 MNT-1 melanoma 세포주를 사용하여 웨스턴 블럿팅을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2는 정상 색소 세포를 NQO1 억제제로 처리할 경우, 색소형성에 관여하는 것으로 알려져 있는 유전자들의 발현을 측정한 결과를 나타낸다.
본 발명은 NQO1 또는 그의 변이체를 이용한 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
인체에서 색소세포(melanocyte)는 외부에서 들어오는 자외선에 대한 방어 기작의 일환으로 멜라닌 합성을 하는 세포로서, 피부가 자외선에 의해 사멸되는 것으로부터 막아주는 역할을 한다. 외부로부터의 자외선이 피부에 노출되게 되면 피부조직 세포들 중에 색소세포가 자외선에 반응하여 멜라닌을 합성하게 된다. 자외선에 의한 멜라닌 합성은 자외선에 의해서 멜라닌 자극 호르몬(melanin stimulating hormone, MSH)이 분비되고 MSH는 MC1R이라는 수용체에 반응하여 색소세포 내에 cAMP를 향상시켜 멜라닌 합성을 위한 유전자들의 반응을 유도하여 멜라닌을 합성하고 합성된 멜라닌은 색소세포의 외부로 멜라닌을 분비하여 자외선으로부터 피부를 보호하는 역할을 담당하게 된다. 멜라닌의 생합성에 관여하는 단백질로는 mitf, tyr, trp1, trp2 등이 알려져 있다.
흑색종(melanoma)이란 멜라닌 세포의 악성종양으로서 멜라닌 세포가 존재하는 곳에는 어느 부위에서나 발생할 수 있으나 피부에 가장 많이 발생한다. 흑색종은 피부의 어느 부위에나 발생할 수 있지만 동양인에서는 발바닥, 손바닥, 손톱 밑과 같은 신체의 말단부에 특히 호발한다. 흑색종의 발생 원인은 아직 명확치 않으나 유전적 요인과 자외선 노출과 같은 환경적 요인으로 대별된다. 예를 들면 흑색종의 6%에서 가족력이 있으며 부모나 자식에 흑색종이 있는 경우에는 흑색종이 없는 경우보다 8배의 높은 발생률을 나타낸다. 또한 유색 인종보다 백인에서 발생률이 높으며 이들 중에도 피부색이 희고 푸른 눈과 금발 또는 붉은 모발을 가진 사람으로 특히 야외에서 많은 시간을 보내는 경우가 흑색종의 위험률이 높은 것으로 알려져 있다. 흑색종은 모양, 발생양상, 분포 등의 특성에 따라 4가지 형태, 즉 선단 흑자성 흑색종(Acral Lentiginous Melanoma), 결절성 흑색종(Nodular Melanoma), 표재 확장성 흑색종(Superficial Spreading Melanoma), 악성 흑자 흑색종(Lentigo Maligna Melanoma)으로 분류된다.
한편, NQO1 (NADPH quinone reductase 1)은 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 또는 벤조(a)피렌 퀴논 등의 퀴논류를 환원시키는 효소로서 다양한 종류의 기질에 반응하는 단백질로 알려져 있다. NQO1 유전자가 파괴된 마우스는 NAD(P)H의 축적, 변형된 탄수화물, 지질 및 핵산 대사, 골수의 과다증식(myelogenous hyperplasia) 등으로 인하여 세포간 redox 상태에 있어서의 변형을 초래한다 (Gaikwad A, et al. J Biol Chem 2001;276:22559-64; Long DJ II, et al. Cancer Res 2002;62:3030-6). 또한 NQO1-null 마우스는 p53 및 p73의 감소 및 골수에서의 세포사멸(apoptosis)의 감소를 나타냄으로써 결과적으로 골수의 과다증식을 나타낸다 (Long DJ II, et al. Cancer Res 2002;62:3030-6). 또한, NQO1-null 마우스는 피부 종양에 대한 감수성을 유의성 있게 증가시킨다 (Long DJ II, et al. Cancer Res 2000;60:5913-5; Long DJ II, et al. J Natl Cancer Inst 2001;93:1166-70; Karim Iskander et al. Cancer Res 2005; 65: (6). 2054-59).
본 발명자들은 다양한 흑색종(melanoma)에 대한 분자생물학적 수준의 발병기전을 연구하던 중, 선단 흑자성 흑색종(Acral lentiginous melanoma) 환자로부터 분리한 흑색종 세포가 정상의 멜라닌 세포나 다른 흑색종 세포의 흑색 멜라닌에 비해 훨씬 옅은 색깔(밝은 갈색)을 나타내며, 이러한 차이가 NQO1 및 그의 변이체들(isoforms)의 발현 감소에 기인한다는 것을 발견하였다. 이는 상기 NQO1 또는 그의 변이체들(isoforms)의 활성을 감소시킬 경우, 미백 활성을 증진시킬 수 있음을 나타낸다.
따라서 본 발명은 NQO1 또는 그의 변이체를 이용한 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 단백질의 활성 변화를 측정하고, 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a') 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현하는 세포에 후보 물질을 처리하고 배양하는 단계; 및 (b') 단계(a')에서 배양물 중의 상기 단백질의 생성량을 측정하고, 상기 단백질의 생성량을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
선단 흑자성 흑색종(Acral lentiginous melanoma) 환자로부터 분리한 흑색종 세포가 정상의 멜라닌 세포나 다른 흑색종 세포의 흑색 멜라닌에 비해 훨씬 옅은 색깔(밝은 갈색)을 나타내며, 이러한 차이가 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 NQO1 및 그의 변이체들(isoforms)의 발현 감소에 기인한다는 것이 본 발명에 의해 새롭게 밝혀졌다. 따라서, NQO1의 활성 및/또는 그 유전자의 발현을 감소시킬 경우, 미백 효과를 달성할 수 있다. 즉, 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 NQO1 또는 그의 변이체들(isoforms)은 미백 활성을 갖는 물질 탐색을 위한 신규 표적(target)으로서 기능할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 NQO1 또는 그의 변이체나 상기 NQO1 또는 그의 변이체를 발현하는 세포에 후보물질을 처리하고, NQO1의 활성 변화 또는 세포로부터의 NQO1 생성량을 측정함으로써 NQO1의 활성을 감소시키는 물질을 선별하는 과정을 포함한다. 상기 NQO1 또는 그의 변이체의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2, 및 3과 같으며, 이들의 염기 서열은 각각 서열번호 4, 5, 및 6과 같다.
본 발명은 (a) 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 단백질의 활성 변화를 측정하고, 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 포함한다.
상기 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질에 후보물질을 처리하는 단계는 상기 단백질을 적절한 매질 (예를 들어, PBS 등)에 분산시킨 후, 후보 물질을 가함으로써 수행될 수 있다.
상기 후보 물질 처리 후, 단백질(즉, NQO1)의 활성 변화의 측정은 NQO1의 활성 변화를 측정할 수 있는 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 벤조(a)피렌(benzo(a)pyrene quinones)-환원 분석법, 또는 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 벤조(a)피렌 퀴논-환원 분석법은 기질로서 벤조(a)피렌-3,6-퀴논(BP-3,6-Q), 벤조(a)피렌-1,6-퀴논(BP-1,6-Q), 벤조(a)피렌-6,1-퀴논(BP-6,12-Q) 등의 벤조(a)피렌 퀴논을 적절한 완충액(예를 들어, 인산 식염수 완충액(PBS) 등)에 가한 후, 후보물질을 처리한 서열번호 1, 2, 또는 3의 NQO1 또는 그의 변이체를 가하여 환원 활성을 분석함으로써 수행될 수 있다. 또한, 웨스턴 블롯팅은 서열번호 1, 2, 또는 3의 NQO1 또는 그의 변이체에 후보물질을 처리한 후, 통상의 방법에 따라 웨스턴 블럿을 수행함으로써 상기 단백질의 발현량을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a') 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현하는 세포에 후보 물질을 처리하고 배양하는 단계; 및 (b') 단계(a')에서 배양물 중의 상기 단백질의 생성량을 측정하고, 상기 단백질의 생성량을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법을 포함한다.
상기 단백질을 발현하는 세포로는 공지의 흑색종 세포주인 MNT-1 세포(PNAS, 2001;98 (19) 10698-10703)를 사용할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 발현하는 세포는 상기 서열번호 4 내지 6의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포일 수 있다. 상기 형질전환된 세포는 서열번호 4 내지 6의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열을 갖는 유전자를 예를 들어 pLNCX2, pENTR, pcDNA, pCS2+ pAd/PL DEST 등의 벡터에 통상의 제한효소, 예를 들어, kpn I, Xba I, Xho I, Hind III, Nco I, EcoR I, Sal I 등을 사용하여 삽입시켜 통상의 유전공학적 방법에 따라 제조할 수 있으며, 당업자는 상기 염기 서열, 벡터, 제한효소 등을 사용하여 아무런 어려움 없이 형질전환된 세포를 제작할 수 있을 것이다.
얻어진 형질전환된 세포에 후보 물질을 처리한 후, 배양하는 단계는 통상의 세포 배양 조건하에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 Toxicol Lett. 2006 Oct 25;166(3):261-7. Epub 2006 Aug 15 에 개시된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다.
배양물 중의 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 NQO1 또는 그의 변이체의 생성량을 측정하고, 이들의 생성량을 감소시키는 물질을 선별하는 단계[즉, 단계(b')]는 NQO1의 활성 변화를 측정할 수 있는 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 벤조(a)피렌(benzo(a)pyrene quinones)-환원 분석법, 또는 웨스턴 블롯팅(Western Blotting) 방법에 의해서 수행될 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. 2차원 전기영동 및 마이크로어레이를 이용한 멜라닌 합성과 관련된 유전자의 동정
선단 흑자성 흑색종(Acral lentiginous melanoma) 환자의 림프절로부터 선단 흑자성 흑색종 조직을 절개한 후 절개된 선단 흑자성 흑색종 조직을 단일 세포로 분리한 다음 흑색종 세포를 제외한 모든 세포들을 제거하여 흑색종 세포주(PML-1 세포주)를 분리하였다. 또한, 동일한 환자로부터 피부 조직을 절개한 후 절개된 정상 피부 조직의 모든 세포들을 단일 세포로 분리한 후 정상 멜라닌 세포를 제외한 다른 모든 세포를 제거하여 색소 세포(melanocyte)를 분리하였다. 얻어진 PML-1 세포주 및 색소 세포에 대하여 2차원 전기영동 및 마이크로어레이 분석을 수행하였으며, 2차원 전기영동 및 마이크로어레이 분석에 의해 탐색된 단백질을 분석하여 동일한 변화를 나타내는 유전자를 선별한 결과, 약 5.6 배의 감소를 나타내는 NQO1을 동정하였다.
상기 흑색종 환자의 색소세포에서 총 RNA를 분리해 내기 위하여 색소세포를 트리졸(trizol) 용액으로 클로로포름을 첨가하여 약 1 분간 흔들어 준 뒤 12000 rpm, 4 ℃의 조건에서 15분간 원심분리하였다. 상층액 만을 분리하고 여기에 이소프로판올을 첨가한 후 -20 ℃에서 3 시간 동안 방치하고 다시 12000 rpm, 4 ℃의 조건에서 15 분간 원심분리하여 총 RNA를 분리하였다. 상기 흑색종 환자의 흑색종 세포주와 동일 환자에서 얻어진 정상 멜라닌세포에서 얻어진 총 RNA 2㎍과 2.5uM Oligo dT 프라이머를 넣고, 20uM dNTP와 200 unit MMLV 역전사중합효소를 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 95℃에서 5분간 반응을 종결하였다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은 각각 1uM의 정방향 프라이머(5'-ATGGTCGGCAGAAGAGCACTGATC-3', 서열번호 7)와 역방향 프라이머(5'-TCATTTTCTAGCTTTGATCTGG-3', 서열번호 8)를 넣어주고 여기에 2uM dNTP 그리고 1 unit의 Taq 중합효소를 첨가하여 전체 반응액을 10 ㎕로 하였다. 94 ℃에서 30 초, 58 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 1 분간 25주기를 반응시킨 후 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키고 PCR 반응을 종결하였다.
PCR 반응물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 겔 상에서 위치를 확인한 후 확인된 겔 부위를 오려내어 용리(elution)시켰다. 용리된 DNA를 주형으로 하여 그 밴드의 증폭에 사용된 동일한 프라이머(즉, 서열번호 7 및 8의 프라이머)를 사용하여 재중합시켰다. 이때의 중합효소연쇄반응 조건은 상기와 같다. 증폭된 DNA를 pGEM-T EASY cloning vector (Promega) 에 삽입한 후 박테리아를 이용하여 클로닝하였다. 클로닝된 유전자의 염기서열 분석한 결과, cDNA로부터 NQO1 전체 유전자(서열번호 4) 및 엑손 5 및 4가 결실된 변이체(isoforms)들(각각 서열번호 5 및 6)을 획득하였다. 얻어진 유전자의 산물인 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 내지 3과 같다.
실시예 2. 멜라닌 합성과 NQO1 유전자 발현의 상관관계 분석-1
웨스턴 블럿팅을 수행하여 NQO1 단백질의 양적 변화를 평가하였다. 정상인으로부터 분리한 색소세포, 실시예 1에서 얻은 PML-1 및 공지의 흑색종 세포주인 MNT-1 melanoma 세포주(PNAS, 2001;98 (19) 10698-10703)에서 분리한 색소세포를 각각 용혈 완충액(lysis buffer)(62.5mM Tris (pH6.75), 10% 글리세롤, 2% SDS, 5% β-머캅토에탄올)에 넣은 후 분쇄하였다. 15000 rpm으로 원심분리한 후 상층액을 취한 다음, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동하고 PVDF 막으로 18시간 동안 전사하였다. PVDF 막을 블록킹 용액(skim milk)에 넣어 1시간 동안 반응시키고, NQO1에 대한 특이적 항체(Santa Cruz, 1:1000)를 넣어준 후 1시간 동안 반응시키었다. 반응이 끝난 후 0.1% 트윈 20이 들어 있는 50mM Tris 용액으로 7회 세척하고, HRP(Horseradish peroxidase)가 붙어 있는 2차 항체(1:1000)를 이용하여 반응시킨 후 동일한 방법으로 세척하였다. 이를 X-ray 필름을 이용하여 감광 후 분석하였다. 그 결과는 도 1과 같다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 공지의 멜라노마 세포주인 MNT-1 melanoma 세포주와 달리, PML-1 세포주에서 NQO1의 발현이 없어졌다. PML-1 세포주에서는 또한 멜라닌 합성에 관여하는 단백질인 tyr, trp1의 발현이 감소되었다. 선단 흑자성 흑색종이 손바닥, 발바닥, 및 손끝에서 호발하는 것을 감안할 때, 햇빛 노출부에 흔히 발생하는 통상의 흑색종과는 상이한 메커니즘으로 선단 흑자성 흑색종이 발생하며, 상기 결과는 NQO1의 발현 감소에 기인하는 것임을 알 수 있다.
실시예 3. 멜라닌 합성과 NQO1 유전자 발현의 상관관계 분석-2
실시예 2의 결과를 바탕으로, NQO1의 억제제로서 알려져 있는 디쿠마롤(dicoumarol) 및 ES936을 정상인으로부터 분리한 색소 세포에 처리한 다음, 실시예 2와 동일한 방법으로 웨스턴 블럿팅을 수행하였으며, 그 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 엔도세린-1 및 PMA는 멜라닌세포 배양시 첨가제로서 사용하였다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 정상 색소 세포를 NQO1 억제제로 처리할 경우, 색소형성에 관여하는 것으로 알려져 있는 mitf(microphthalmia transcription factor), tyr(tyrosinase), trp1(tyrosinase-related protein 1) 단백질 양이 감소되었다. 따라서, NQO1은 생체 내에서 색소형성 과정에 관여함으로써, 피부 미백 활성을 갖는 물질 탐색을 위한 신규 표적(target)으로서 기능할 수 있음을 나타낸다.
선단 흑자성 흑색종(Acral lentiginous melanoma) 환자로부터 분리한 흑색종 세포가 정상의 멜라닌 세포나 다른 흑색종 세포의 흑색 멜라닌에 비해 훨씬 옅은 색깔(밝은 갈색)을 나타내며, 이러한 차이가 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 NQO1 및 그의 변이체들(isoforms)의 발현 감소에 기인한다는 것이 본 발명에 의해 새롭게 밝혀졌다. 따라서, 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 NQO1 또는 그의 변이체들(isoforms)은 미백 활성을 갖는 물질 탐색을 위한 신규 표적(target)으로서 기능할 수 있다.
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Claims (4)

  1. (a) 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질에 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻어진 단백질의 활성 변화를 측정하고, 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 활성 변화 측정이 벤조(a)피렌 퀴논(benzo(a)pyrene quinones)-환원 분석법 또는 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  3. (a') 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현하는 세포에 후보 물질을 처리하고 배양하는 단계; 및 (b') 단계(a')에서 배양물 중의 상기 단백질의 생성량을 측정하고, 상기 단백질의 생성량을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 미백 활성을 갖는 물질의 스크리닝 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단백질을 발현하는 세포가 서열번호 4 내지 6의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포임을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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