KR102031161B1 - Screening System of candidate material for skin-whitening - Google Patents
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Abstract
본 발명은 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포를 포함하는 하나 이상의 층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템 및 상기 시스템을 이용하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 개시한다. 또한 본 발명은 상기 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 물질을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 개시한다.The present invention discloses a skin lightening material screening system comprising at least one layer comprising one or more cells of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes, and a method of screening skin lightening materials using the system. The present invention also discloses a composition for skin whitening comprising a substance screened according to the skin whitening substance screening method as an active ingredient.
Description
본 발명은 피부 미백 물질 스크리닝 시스템 및 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a skin lightening material screening system and a method for screening skin lightening material.
기존에는 신규 미백 물질을 개발함에 있어 후보 물질을 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트(melanocyte)에 직접 처리한 후 멜라닌 생성을 억제하는지 확인하거나, 멜라노사이트에 자외선을 조사하고 후보 물질이 이때 발생하는 멜라닌 생성 신호를 차단하는지 여부를 확인하는 방법을 사용해 왔다. 하지만 실제 피부에서 멜라노사이트는 단독으로 존재하지 않고, 다른 주변의 세포나 미세 환경으로부터 직접 또는 간접적으로 물리적 또는 화학적인 영향을 받아 멜라닌을 생성하게 되는데, 멜라노사이트만으로는 이러한 실제 피부 조직 상태를 재현할 수 없다.In developing a new whitening material, the candidate material is directly treated with melanocytes, melanocytes, to determine whether they inhibit melanin production, or the melanocytes are irradiated with UV rays, and the candidate material produces melanin signals. I've used a method to check whether or not to block. In real skin, however, melanocytes do not exist alone and produce melanin under physical or chemical effects directly or indirectly from other surrounding cells or microenvironments. none.
또한 기미, 점, 흑자, 검버섯과 같은 피부 과색소침착증은 그 발생 요인이나 기전이 자외선에 의한 멜라닌 생성 증가와 다르며, 비록 자외선에 의해 그 증상이 악화되는 경향이 있으나 자외선과 같은 자극이 없는 경우에도 멜라닌 생성과 분산이 계속적으로 증가한다. 따라서 기존의 자외선 조사 방법을 기초로 개발한 미백 물질의 경우, 실제 임상에서는 인간 피부 과색소침착증 억제 효과를 나타내지 않는 경우가 많다. 게다가 피부 과색소침착증을 연구하기 위해 피검자의 과색소침착 부위의 피부를 생검하여 사용하는 것은 그 비용과 노력이 매우 많이 들고 인간 피부 조직을 얻기도 쉽지 않을 뿐만 아니라, 자외선 조사 모델과 달리 피부 과색소침착증의 동물 모델도 구하기가 어렵다.In addition, skin hyperpigmentation such as blemishes, spots, surpluses and blotch is different from the cause or mechanism of the increase in melanin production by ultraviolet rays, even though the symptoms tend to be exacerbated by ultraviolet rays but there is no irritation such as ultraviolet rays. Melanin production and dispersion continue to increase. Therefore, in the case of the whitening material developed based on the existing UV irradiation method, in many cases, the clinical trial does not show the effect of inhibiting human skin hyperpigmentation. In addition, the use of biopsy of the skin of the subject's hyperpigmentation site to study skin hyperpigmentation is very costly and labor-intensive and difficult to obtain human skin tissue. Animal models of deposition are also difficult to obtain.
이에, 인간 피부 조직 구조, 특히 피부 과색소침착증을 나타내는 인간 피부 조직 구조와 매우 유사하면서도 간편하게 미백 물질을 스크리닝할 수 있는 시스템 및 스크리닝 방법에 대한 요구가 존재한다.Accordingly, there is a need for systems and screening methods that can screen whitening materials that are very similar to human skin tissue structures, particularly human skin tissue structures exhibiting skin hyperpigmentation.
본 발명의 일측면은 효과적이면서도 간편하게 임상적으로 유용한 피부 미백 물질을 스크리닝할 수 있는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템 및 이를 이용한 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.One aspect of the present invention is to provide a skin whitening material screening system that can screen effectively and simply clinically useful skin whitening material and a method for screening skin whitening material using the same.
본 발명의 다른 일측면은 상기 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 물질을 유효 성분으로 포함하여, 우수한 피부 미백 효과를 나타내는 피부 미백용 조성물을 제공하고자 한다.Another aspect of the present invention is to provide a skin whitening composition exhibiting excellent skin whitening effect, including the material screened according to the skin whitening material screening method as an active ingredient.
또한, 본 발명의 다른 일측면은 피부의 맬라닌생성 관여 유전자 자체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 또는 피부 외용제 조성물을 제공하고자 한다.In addition, another aspect of the present invention is to provide a composition for skin whitening or external composition for skin comprising the gene involved in the production of melanin of the skin itself as an active ingredient.
본 발명의 일측면은 섬유아세포(fibroblast), 케라티노사이트(keratinocyte) 및 멜라노사이트(melanocyte) 중 하나 이상의 세포를 포함하는 하나 이상의 층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다.One aspect of the invention provides a skin whitening material screening system comprising one or more layers comprising one or more cells of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes.
본 발명의 다른 일측면은 후보 물질을 처리한 상기 피부 미백 물질 스크리닝 시스템에서, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 WIF 1, WNT 1, WNT 5a 및 NFATC 2 중 하나 이상의 발현 정도 또는 인산화 정도를 확인하는 단계를 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 제공한다.In another aspect of the present invention, the skin whitening substance screening system treated with the candidate substance, the degree of expression of one or more of WIF 1, WNT 1, WNT 5a and NFATC 2 of at least one of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes Or it provides a skin whitening material screening method comprising the step of checking the degree of phosphorylation.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 물질을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 또는 WIF 1 자체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 및 피부 외용제 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a skin whitening composition comprising the material screened according to the skin whitening material screening method as an active ingredient or a skin whitening composition and WIF 1 itself as an active ingredient, and a composition for external application of the skin. .
본 발명에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 실제 피부 조직과 가깝게 설계되어 in vitro에서도 임상적으로 미백 효과가 있는 물질을 적은 시간과 비용으로 간편하게 스크리닝할 수 있다. 특히 멜라노사이트에 후보 물질을 처리한 후 자외선을 조사함으로써 미백 물질을 스크리닝하던 기존의 방법과 달리, 본 발명에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 과색소침착증을 나타내는 실제 피부 조직의 유전자 발현 정도 및 신호전달인자의 인산화 정도와 유사한 조건을 가지므로, 이를 이용하는 경우 피부 미백 물질, 특히 과색소침착증 개선에 효과적인 물질을 간편하게 스크리닝할 수 있다. 이는 과색소침착증 연구를 위한 인간 및 동물 모델을 구하기 어렵다는 점에서 새로운 피부 미백 물질, 구체적으로 과색소침착증 개선 물질 개발을 위한 유용한 시스템 또는 키트가 될 수 있을 것이다.Skin whitening material screening system according to the present invention is designed to be close to the actual skin tissue can be easily screened for clinically whitening material in less time and cost in vitro. In particular, unlike the conventional method of screening a whitening material by irradiating UV rays after treating candidate melanocytes with a candidate material, the skin whitening material screening system according to the present invention has a gene expression level and signal transduction of actual skin tissue showing hyperpigmentation. Since conditions similar to the degree of phosphorylation of the factor are used, it can be easily screened for skin whitening substances, especially substances effective for improving hyperpigmentation. This may be a useful system or kit for the development of new skin whitening materials, specifically hyperpigmentation improving materials, in that it is difficult to obtain human and animal models for hyperpigmentation studies.
도 1은 피험자의 정상 피부(N)와 피부 과색소침착 부위(L)의 WIF 1 유전자 발현 정도 차이를 비교한 그래프이다.
도 2는 피험자의 정상 피부(N)와 피부 과색소침착 부위(L)의 WNT 1 및 WNT 5a의 발현 정도 차이를 비교한 그래프이다.
도 3은 멜라노사이트(MC), 케라티노사이트(KC) 및 섬유아세포(FB)에서의 WIF 1 유전자 발현 정도 차이를 비교한 그래프이다.
도 4는 WIF 1 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 티로시나아제(tyrosinase)의 발현이 증가하는 것을 보여주는 결과이다.
도 5는 WIF 1 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 멜라노좀의 이동이 증가한 것을 보여주는 결과이다.
도 6은 WIF 1 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 NFATC 2가 탈인산화되는 것을 보여주는 결과이다.
도 7은 WIF 1 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 티로시나아제의 발현이 증가하는 것을 보여주는 실험 결과이다.
도 8은 WIF 1 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 멜라노좀의 이동이 증가한 것을 보여주는 결과이다.
도 9는 WIF 1 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 NFATC 2의 탈인산화되는 것을 보여주는 결과이다.
도 10은 유전자 재조합 기술로 만든 인간 WIF 1을 멜라노사이트에 처리했을 때 멜라노사이트의 WIF 1 발현이 증가함을 보여주는 결과이다.
도 11은 도 10과 같이 WIF 1의 발현을 유도한 멜라노사이트에서 티로시나아제의 발현이 감소하는 것을 보여주는 결과이다.
도 12는 유전자 재조합 기술로 만든 인간 WIF 1을 멜라노사이트를 포함하는 미백 스크리닝 시스템에서 처리했을 때 멜라노좀의 이동이 감소한 것을 보여주는 결과이다.
도 13은 도 10과 같이 WIF 1의 발현을 유도한 멜라노사이트에서 NFATC 2가 인산화되는 것을 보여주는 결과이다.1 is a graph comparing the difference in the expression level of WIF 1 gene between normal skin (N) and hyperpigmentation site (L) of a subject.
Figure 2 is a graph comparing the difference in the expression level of WNT 1 and WNT 5a of the normal skin (N) and hyperpigmentation site (L) of the subject.
Figure 3 is a graph comparing the difference in the degree of WIF 1 gene expression in melanocytes (MC), keratinocytes (KC) and fibroblasts (FB).
Figure 4 is a result showing that the expression of tyrosinase (tyrosinase) is increased in the whitening screening system containing fibroblasts that inhibited WIF 1 expression.
5 is a result showing that the movement of melanosomes increased in the whitening screening system including fibroblasts that inhibited WIF 1 expression.
FIG. 6 shows the dephosphorylation of NFATC 2 in a whitening screening system including fibroblasts that inhibited WIF 1 expression.
7 is an experimental result showing the increase in the expression of tyrosinase in the whitening screening system containing keratinocytes that inhibited WIF 1 expression.
8 is a result showing the increased movement of melanosomes in the whitening screening system including keratinocytes that inhibited WIF 1 expression.
9 is a result showing dephosphorylation of NFATC 2 in a whitening screening system containing keratinocytes that inhibited WIF 1 expression.
10 is a result showing the increase in WIF 1 expression of melanocytes when treated with melanocytes human WIF 1 made by genetic recombination technology.
11 is a result showing that the expression of tyrosinase in melanocytes induced the expression of WIF 1 as shown in FIG.
12 is a result showing that the movement of melanosomes is reduced when the human WIF 1 made by genetic recombination technology is treated in a whitening screening system including melanocytes.
FIG. 13 is a result showing that NFATC 2 is phosphorylated in melanocytes induced the expression of WIF 1 as shown in FIG. 10.
본 명세서에서 "피부"라 함은, 동물의 체표를 덮는 조직을 의미하는 것으로서, 얼굴 또는 바디 등의 체표를 덮는 조직뿐만 아니라, 두피와 모발을 포함하는 최광의의 개념이다.
As used herein, the term "skin" refers to a tissue covering the body surface of an animal, and is a broad concept including not only tissues covering the body surface such as the face or body, but also the scalp and hair.
피부의 멜라노사이트(melanocyte)는 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)을 만드는 세포로서, 피부의 진피와 표피의 경계선 역할을 하는 기저막 위에 위치한다. 발생학적으로 멜라노사이트는 뉴럴 클러스트 세포(neural-crest cells)에서 출발하여 멜라노사이트 줄기 세포(Melanocyte stem cell), 전구 세포인 멜라노블라스트(melanoblast)를 거쳐 피부로 이동하면서 최종적으로 멜라닌을 생성할 수 있는 색소 세포인 멜라노사이트로 분화한다고 알려져 있다.Melanocytes of the skin are cells that make melanin, which determines the color of the skin, and are located on the basement membrane, which serves as the boundary between the dermis and the epidermis of the skin. Developmentally, melanocytes start from neural-crest cells and travel to the skin through melanocyte stem cells, the melanoblasts that are precursor cells, and finally produce melanin. It is known to differentiate into melanocytes, which are pigment cells.
이렇게 분화한 멜라노사이트는 피부 속에서 혼자 존재하는 것이 아니라 그 위에 위치한 각질 형성 세포인 케라티노사이트와의 결합 및 아래에 위치한 진피에 있는 섬유아세포의 영향을 받아 멜라닌을 생성하게 된다. 멜라노사이트에서 만들어진 멜라닌은 세포 돌기(dendrite)를 통해 주변에 있는 케라티노사이트로 이동하여 피부 표면에 넓게 분산됨으로써 자외선과 같은 유해 인자로부터 피부를 보호하고 피부색을 나타낸다. 정상 피부는 자외선과 같은 자극이 왔을 때 평소보다 많은 멜라닌을 생성하고 멜라닌의 분산을 증가시켰다가, 그러한 자극이 소멸되면 멜라닌 생성과 분산을 다시 낮은 수준으로 되돌린다.This differentiated melanocytes do not exist alone in the skin but produce melanin under the influence of keratinocytes, keratinocytes located above, and fibroblasts in the dermis below. Melanin, produced from melanocytes, travels to the surrounding keratinocytes through dendrite and is widely dispersed on the skin surface to protect the skin from harmful factors such as ultraviolet rays and show skin color. Normal skin produces more melanin and increases the dispersion of melanin when stimuli such as ultraviolet light occur, and then returns melanin production and dispersion back to low levels when the stimulus is destroyed.
앞서 살펴본 바와 같이, 멜라노사이트가 피부 속 다른 세포들이나 주변 미세 환경의 물리적, 화학적 요인으로부터 복합적인 영향을 받아 멜라닌을 생성하는 실제 피부 조건을 반영하지 못하는 기존의 방법에 의해 개발된 미백 물질, 그 중에서도 특히 자외선 조사 방법에 의해 개발된 미백 물질은 피부 과색소침착증 개선에 있어 임상적으로 낮은 효과를 나타내는 경우가 많다. 피부 과색소침착증은 다양한 발생 원인과 특이적인 기작에 의한 피부 흑화이기 때문에 이를 효과적으로 개선할 수 있는 미백 물질을 개발하기 위해서는 실제 피부와 유사한 실험 모델을 만들고, 이를 이용하여 미백 물질을 개발하는 것이 필요하다.
As discussed above, whitening substances developed by existing methods that do not reflect the actual skin conditions that produce melanin, due to complex effects of melanocytes from the physical and chemical factors of other cells in the skin and the surrounding microenvironment, among others In particular, the whitening material developed by the UV irradiation method is often clinically low in improving skin hyperpigmentation. Since skin hyperpigmentation is a skin blackening due to various causes and specific mechanisms, in order to develop a whitening substance that can effectively improve it, it is necessary to make an experimental model similar to the actual skin and develop a whitening substance using the same. .
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, this invention is demonstrated in detail.
본 발명의 일측면은 섬유아세포(fibroblast), 케라티노사이트(keratinocyte) 및 멜라노사이트(melanocyte) 중 하나 이상의 세포를 포함하는 하나 이상의 층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다. 본 발명의 다른 일측면은 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포층; 케라티노사이트를 포함하는 케라티노사이트층 및 멜라노사이트를 포함하는 멜라노사이트층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다. 이때 실제 피부 조건과 유사하도록, 섬유아세포층이 가장 아래에 적층되고, 그 위에 멜라노사이트층이 적층되며, 그 위에 케라티노사이트층이 적층될 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포층; 및 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상을 포함하는 층을 포함하여, 케라티노사이트와 멜라노사이트를 동일한 층에 포함할 수 있다. 이 때 섬유아세포층이 아래에 적층되고, 그 위에 멜라노사이트와 케라티노사이트가 포함된 층이 적층될 수 있다. 상기 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 피부 세포층이 적층된 3차원 입체 구조의 시스템으로, 멜라노사이트뿐만 아니라 주변에 있는 세포들을 포함함으로써, 실제 피부 상태를 잘 반영할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포층은 제외하고, 멜라닌 생성에 보다 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 멜라노사이트와 케라티노사이트를 포함하는 층을 포함할 수 있다.One aspect of the invention provides a skin whitening material screening system comprising one or more layers comprising one or more cells of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes. Another aspect of the invention is a fibroblast layer comprising a fibroblast; Provided is a skin lightening material screening system comprising a keratinocyte layer comprising keratinocytes and a melanocyte layer comprising melanocytes. In this case, the fibroblast layer may be stacked on the bottom, the melanocyte layer may be stacked on top of the keratinocyte layer, and the keratinocyte layer may be stacked on the bottom of the skin. Skin whitening material screening system according to another aspect of the present invention comprises a fibroblast layer comprising fibroblasts; And keratinocytes and melanocytes in the same layer, including layers comprising one or more of keratinocytes and melanocytes. At this time, the fibroblast layer may be stacked below, and a layer containing melanocytes and keratinocytes may be stacked thereon. The skin whitening material screening system is a three-dimensional three-dimensional structure system in which the skin cell layer is stacked, and may include not only melanocytes but also surrounding cells, so that the actual skin condition may be well reflected. The skin lightening material screening system according to another aspect of the present invention may include a layer including melanocytes and keratinocytes, which are known to play a more important role in melanogenesis, except for the fibroblast layer.
본 발명의 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템의 섬유 아세포층은 진피층을 재현한 것으로, 콜라겐에 섬유아세포가 포함된 층을 포함한다. 구체적으로 상기 섬유아세포층은 콜라겐 액에 섬유아세포를 넣고 굳혀 제조한 층일 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 콜라겐은 피부 미백 물질 스크리닝 시스템 전체 중량을 기초로 0.001 중량% 내지 30 중량%, 구체적으로 0.01 중량% 내지 20 중량%, 더 구체적으로 0.1 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절하고, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 사용하는 것이 적절할 수 있다.The fibroblast layer of the skin lightening material screening system according to an aspect of the present invention reproduces the dermal layer, and includes a layer containing fibroblasts in collagen. Specifically, the fibroblast layer may be a layer prepared by putting fibroblasts into collagen solution and hardening. In another aspect of the invention, the collagen is 0.001 to 30% by weight, specifically 0.01 to 20% by weight, more specifically 0.1 to 10% by weight based on the total weight of the skin lightening material screening system May be included. When included in the above range it is appropriate to exhibit the intended effect of the present invention, it may be appropriate to use in the above range in terms of cost-effectiveness.
본 발명의 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템에서 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 인간, 마우스, 기니아피그, 닭과 같은 조류 및 돼지 중 선택된 하나 이상에서 유래한 세포를 포함한다.In the skin lightening material screening system according to an aspect of the present invention, one or more cells of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes include cells derived from one or more selected from birds, such as humans, mice, guinea pigs, chickens, and pigs. do.
본 발명의 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 피부 미백 효과가 있는 물질, 구체적으로 자외선에 의한 피부 흑화 개선 효과가 있는 물질뿐만 아니라 특히 기미, 점, 흑자 또는 검버섯과 같은 피부 과색소침착증 개선 효과가 있는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.
Skin whitening material screening system according to an aspect of the present invention is not only a material that has a skin whitening effect, in particular, a material for improving skin blackening by ultraviolet light, but also a skin hyperpigmentation effect such as spots, spots, surpluses or scabs Effectively screening materials with
본 발명자들은 과색소침착증을 나타내는 피부에서, 배아 성장조절과 연관된 세포외 신호 분자인 WIF 1(Wnt inhibitory factor 1, ACCESSION NP_009122, VERSION NP_009122.2 GI:111125011) 유전자 발현이 감소하며, 구체적으로 WIF 1 유전자 발현은 피부 세포 중에서도 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트가 아닌 케라티노사이트와 섬유아세포에서 감소함으로써, 멜라노사이트의 멜라닌 생성에 영향을 준다는 것을 밝혔다. 또한 WIF 1 유전자의 발현이 감소된 피부에서, 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제의 발현이 증가함과 동시에 케라티노사이트로의 멜라닌 확산이 증가함을 밝혀, WIF 1과 피부 과색소침착증 간에 밀접한 관련이 있음을 확인하였다. 이때 WIF 1 유전자의 발현은 GSK-3β(Glycogen synthase kinase-3β)와 β-카테닌(β-catenin)의 인산화, MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 발현에 관여해 피부 과색소 침착에 영향을 준다는 것도 확인하였다.In the skin showing hyperpigmentation, the present inventors have shown that WIF 1 (Wnt inhibitory factor 1, ACCESSION NP_009122, VERSION NP_009122.2 GI: 111125011) gene expression, which is an extracellular signal molecule associated with embryonic growth regulation, is specifically reduced. Gene expression was reduced in keratinocytes and fibroblasts, but not melanocytes, which are melanocytes, affecting melanocyte production of melanocytes. In skin with decreased expression of the WIF 1 gene, we found an increase in the expression of tyrosinase involved in melanogenesis and an increase in melanin diffusion to keratinocytes, indicating a close association between WIF 1 and skin hyperpigmentation. It was confirmed that there is. The expression of WIF 1 gene is involved in phosphorylation of GSK-3β (Glycogen synthase kinase-3β) and β-catenin, and expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), which affects skin hyperpigmentation. Also confirmed.
이에 본 발명의 일측면은, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 WIF 1 발현이 억제된 피부 미백 물질 스크리닝 시스템, 구체적으로 케라티노사이트 또는 섬유아세포의 WIF 1 발현이 억제된 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 siRNA를 이용하여 WIF 1 발현이 억제된 세포를 포함한다. 상기 스크리닝 시스템은 케라티노사이트 또는 섬유아세포의 WIF 1 발현이 감소된 과색소침착증 피부 상태를 반영한 것으로, 과색소침착증을 나타내는 피부 상태를 실제와 거의 유사하게 재현할 수 있다. 따라서 상기 스크리닝 시스템을 이용하는 경우 피부 미백 효능이 있는 물질, 특히 피부 과색소침착증 개선에 효능이 있는 물질을 효과적으로 선별할 수 있다. Accordingly, an aspect of the present invention is a skin whitening substance screening system in which WIF 1 expression of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes is suppressed, in particular, skin in which WIF 1 expression of keratinocytes or fibroblasts is suppressed. Provides a whitening material screening system. In another aspect of the present invention, the skin lightening material screening system includes cells in which WIF 1 expression is suppressed using siRNA. The screening system reflects the hyperpigmentation skin condition with reduced WIF 1 expression of keratinocytes or fibroblasts, and can reproduce the skin condition indicative of hyperpigmentation almost similar to the reality. Therefore, in the case of using the screening system, it is possible to effectively select a material that is effective in improving skin whitening, particularly a skin pigmentation effect.
또한 본 발명자들은 과색소침착증을 나타내는 피부에서 원발암유전자(proto-oncogene)전구체 WNT 1(Wingless-type MMTV integration site family, member 1, ACCESSION NP_005421, VERSION NP_005421.1 GI:4885655) 및 단백질 WNT 5a(Wingless-type MMTV integration site family, member 5a, ACCESSION NP_001243034, VERSION NP_001243034.1 GI: 371502087) 유전자 발현이 증가하고, 신호 전달 인자인 NFATC2 (nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2)가 탈인산화됨을 밝혔으며, 이에 본 발명의 일측면은 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포가 WNT 1 및 WNT 5a 발현이 증가된 세포 또는 NFATC 2가 탈인산화된 세포인 피부 미백 물질 스크리닝 시스템을 제공한다. 상기 스크리닝 시스템은 과색소침착층을 나타내는 피부 상태를 실제와 가깝게 재현할 수 있으므로, 피부 미백 효능이 있는 물질, 특히 피부 과색소침착증 개선에 효능이 있는 물질을 효과적으로 선별할 수 있다.
In addition, the present inventors also found that the proto-oncogene precursor WNT 1 (Wingless-type MMTV integration site family, member 1, ACCESSION NP_005421, VERSION NP_005421.1 GI: 4885655) and the protein WNT 5a (in the skin showing hyperpigmentation). Wingless-type MMTV integration site family, member 5a, ACCESSION NP_001243034, VERSION NP_001243034.1 GI: 371502087) Gene expression is increased and signal transduction factor NFATC2 (nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2) In one aspect of the present invention, the skin whitening material screening system is one of at least one of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes, or cells in which WNT 1 and WNT 5a expression is increased or NFATC 2 is dephosphorylated. To provide. Since the screening system can reproduce the skin condition showing the hyperpigmentation layer close to reality, it is possible to effectively select a substance that is effective in improving skin hyperpigmentation, particularly a substance having skin whitening efficacy.
기존에는 천연물, 그 추출물 또는 화학 합성 물질과 같은 후보 물질을 멜라노사이트에만 처리하여 미백 효능 유무를 평가하였다. 이러한 기존의 방법에 의하는 경우, 세포 배양액에 희석한 후보 물질을 세포에 직접 처리해야 하며, 크림이나 로션과 같이 실제 사용하는 제형에 후보 물질을 적용한 상태로는 멜라노사이트에 처리할 수 없다. 따라서 기존의 방법으로는 임상 실험을 실시하여야만 비로소 후보 미백 물질을 포함한 제형이 임상적으로 실제 미백 효과가 있는지를 확인할 수 있다. 반면, 본 발명에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 기존의 방법과 같이 후보 물질을 배양액에 희석하여 사용함으로써 그 미백 효과 유무를 평가할 수 있음은 물론, 후보 물질을 함유하는 크림이나 로션과 같은 제형을 사용하여 그 미백 효과 유무를 평가할 수도 있다. 이 때 제형에 대해 미백 효과 유무를 평가하기 위한 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 섬유아세포, 멜라노사이트 및 케라티노사이트 중 하나 이상을 포함하는 복수 개의 층을 적층한 후 공기에 노출시켜 인공 피부로 제조한 것일 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따른 피부 미백 스크리닝 시스템은 실제 피부와 유사한 생리적, 화학적 특징을 가지며, 실제 사용하는 제형을 사용하여서도 그 미백 효과에 대한 평가가 가능하므로 실제 임상적으로 미백 효과가 있는 물질을 보다 짧은 시간 안에 적은 비용으로 효율적이고 간편하게 선별할 수 있게 한다.
In the past, candidates such as natural products, extracts thereof, or chemical synthetic materials were treated only with melanocytes to evaluate the whitening efficacy. In this conventional method, the candidate substance diluted in the cell culture should be treated directly with the cells, and the melanocytes cannot be treated with the candidate substance applied to the actual formulation, such as cream or lotion. Therefore, it is only possible to confirm whether the formulation containing the candidate whitening material has a clinically effective whitening effect by conducting a clinical experiment by the conventional method. On the other hand, the skin whitening material screening system according to the present invention can evaluate the presence or absence of the whitening effect by diluting the candidate substance in the culture medium as in the conventional method, as well as using a formulation such as cream or lotion containing the candidate substance. The presence of the whitening effect can be evaluated. At this time, the skin whitening material screening system for evaluating the whitening effect on the formulation is made of artificial skin by laminating a plurality of layers including at least one of fibroblasts, melanocytes and keratinocytes and then exposing to air. Can be. As described above, the skin whitening screening system according to the present invention has physiological and chemical characteristics similar to those of the actual skin, and the evaluation of the whitening effect is possible even using a formulation that is actually used. It allows for efficient and simple sorting in a short time at low cost.
본 발명의 일측면은 후보 물질을 처리한 상기 피부 미백 물질 스크리닝 시스템에서 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 WIF 1, WNT 1, WNT 5a 및 NFATC 2 중 하나 이상의 발현 정도 또는 인산화 정도를 확인하는 단계를 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 살펴본 바와 같이, WIF 1, WNT 1, WNT 5a 및 NFATC 2는 모두 피부 멜라닌 색소의 발현 및 확산 정도와 관련이 있다. 구체적으로 WIF 1의 발현이 감소하거나, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현이 증가하거나 혹은 NFATC 2의 탈인산화 정도가 증가함은, 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 티로시나아제 발현이 증가하고, 케라티노사이트로의 멜라닌 확산이 증가함을 의미한다. 따라서 후보 물질이 WIF 1, WNT 1, WNT 5a 및 NFATC 2 중 하나 이상의 발현 정도 또는 인산화 정도에 어떠한 영향을 주는지를 확인함으로써, 상기 후보 물질이 피부 미백 효과가 있는지 여부를 평가할 수 있다.One aspect of the invention is the expression level or phosphorylation of at least one of WIF 1, WNT 1, WNT 5a and NFATC 2 of the fibroblasts, keratinocytes and melanocytes in the skin whitening substance screening system treated with the candidate substance Provided is a method for screening a skin lightening material comprising the step of checking the degree. As discussed above, WIF 1, WNT 1, WNT 5a and NFATC 2 are all related to the degree of expression and diffusion of skin melanin pigment. Specifically, decreased expression of WIF 1, increased expression of WNT 1 or WNT 5a, or increased degree of dephosphorylation of NFATC 2 resulted in increased expression of tyrosinase, an enzyme involved in melanogenesis, and keratinocytes. Melanin diffusion into the furnace is increased. Therefore, by identifying how the candidate substance affects the expression level or phosphorylation degree of one or more of WIF 1, WNT 1, WNT 5a, and NFATC 2, it is possible to evaluate whether the candidate substance has a skin lightening effect.
본 발명의 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 방법은 WIF 1의 발현 정도를 확인하는 단계 이후에, WIF 1의 발현 정도를 증가시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 방법은 WNT 1 또는 WNT 5a의 발현 정도를 확인하는 단계 이후에, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현 정도를 감소시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 방법은 NFATC 2의 인산화 정도를 확인하는 단계 이후에, NFATC 2의 인산화 정도를 증가시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특히 WIF 1의 발현이 감소하거나, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현이 증가하거나, NFATC 2의 탈인산화가 이루어진 섬유아세포, 멜라노사이트 및 케라티노사이트 중 하나 이상의 세포를 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 피부 흑화가 이루어진 실제 피부 조건을 재현하고 있는 것이므로, 후보 물질이 상기와 같이 조절된 시스템의 WIF 1, WNT 1 또는 WNT 5a 유전자 발현 정도 또는 신호 전달인자 NFATC 2의 인산화 정도를 어떻게 변화시키는지 여부를 평가함으로써, 후보 물질이 미백 효과가 있는 물질인지 여부, 특히 피부 과색소침착증을 개선할 수 있는 물질인지 여부를 확인할 수 있다.
The skin whitening material screening method according to an aspect of the present invention may further include determining a substance for increasing the expression level of WIF 1 as a skin whitening substance after confirming the expression level of WIF 1. According to another aspect of the present invention, a method for screening a skin whitening substance is determined after determining the expression level of WNT 1 or WNT 5a, and determining a substance that reduces the expression level of WNT 1 or WNT 5a as a skin whitening substance. It may further include. According to another aspect of the present invention, a method for screening a skin lightening material may further include determining a substance for increasing the degree of phosphorylation of NFATC 2 as a skin lightening material after determining the degree of phosphorylation of NFATC 2. . In particular, skin whitening material screening systems comprising at least one of fibroblasts, melanocytes and keratinocytes, which have reduced expression of WIF 1, increased expression of WNT 1 or WNT 5a, or dephosphorylation of NFATC 2, As it reproduces the actual skin condition with blackening, it is evaluated whether the candidate substance changes the degree of expression of the WIF 1, WNT 1 or WNT 5a gene or the phosphorylation of the signal transducing factor NFATC 2 in the above regulated system. By doing so, it is possible to confirm whether the candidate substance is a substance having a whitening effect, especially whether the substance can improve skin hyperpigmentation.
본 발명의 일측면은 상기 피부 미백 물질 스크리닝 방법에 따라 스크리닝된 물질을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다. 앞서 살펴 본 바와 같이 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포에서 WIF 1의 발현을 증가시키거나, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현을 감소시키거나 혹은 NFATC 2의 탈인산화 정도를 증가시키는 물질은 피부 미백 효과, 구체적으로 피부 과색소침착증 개선 효과가 있는 물질이라고 판단할 수 있으므로, 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물은 피부 미백 효과, 구체적으로 피부 과색소침착증 개선 효과를 나타낼 수 있다.One aspect of the present invention provides a composition for skin whitening comprising a material screened according to the skin whitening material screening method as an active ingredient. As discussed above, substances that increase the expression of WIF 1, decrease the expression of WNT 1 or WNT 5a, or increase the degree of dephosphorylation of NFATC 2 in one or more of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes Since it may be determined that the material has a skin whitening effect, specifically, a skin hyperpigmentation improvement effect, a composition including the same as an active ingredient may exhibit a skin whitening effect, specifically, a skin hyperpigmentation improvement effect.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기와 같은 본 발명에 따른 유전자인 WIF 1 자체를 포함하는 피부 미백용 조성물 또는 피부 외용제 조성물을 제공함으로써, WIF 1의 티로시나아제의 발현을 억제시키고 케라티노사이트로의 멜라닌 확산을 억제에 의한 피부 미백 및 피부 과색소침착증 개선효과를 나타낼 수 있다.Another aspect of the present invention by inhibiting the expression of tyrosinase of WIF 1 and providing keratinocytes by providing a skin whitening composition or an external skin composition comprising the WIF 1 itself gene according to the present invention as described above It can exhibit the effect of improving skin whitening and skin hyperpigmentation by inhibiting melanin diffusion.
본 발명의 다른 일측면에 따른 피부 미백용 조성물은 화장품 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
Skin whitening composition according to another aspect of the present invention includes a cosmetic composition, a pharmaceutical composition or a food composition.
본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
Examples of the formulation of the composition according to one aspect of the present invention will be described below, but can be applied to other various formulations, which are intended to explain in detail only and not intended to limit the present invention.
[제형예 1] 영양화장수Formulation Example 1 Nutritional Cosmetics
하기 표 1에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조할 수 있다.According to the composition shown in Table 1 it can be prepared by the conventional method.
[제형예 2] 영양로션Formulation Example 2 Nutritional Lotion
하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양로션을 제조할 수 있다.According to the composition shown in Table 2 it can be prepared nutrition lotion in a conventional manner.
[제형예 3] 영양크림Formulation Example 3 Nutrition Cream
하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조할 수 있다.Nutritional creams may be prepared by conventional methods according to the composition described in Table 3.
[제형예 4] 팩[Formulation Example 4] Pack
하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조할 수 있다.The pack can be prepared according to the composition described in Table 4 below in a conventional manner.
[제형예 5] 연고Formulation Example 5 Ointment
하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조할 수 있다.Ointments can be prepared according to the compositions described in Table 5 below in a conventional manner.
이하, 실험예, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예, 실시예 및 비교예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the configuration and effects of the present invention will be described in more detail with reference to experimental examples, examples and comparative examples. However, the following Experimental Examples, Examples and Comparative Examples are provided only for the purpose of illustration in order to facilitate understanding of the present invention, but the scope and scope of the present invention is not limited thereto.
[실험예 1] 피부 과색소침착 부위에서의 WIF 1 유전자 발현 변화Experimental Example 1 Changes in WIF 1 Gene Expression in Skin Hyperpigmentation Sites
피험자 13명의 정상 피부 조직(N)과 과색소침착 부위의 피부 조직(L)을 생검(biopsy)하여 조직 내 RNA를 추출하고, 이를 이용하여 실시간(real-time) PCR 방법으로 유전자 발현 변화를 조사하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.Biopsy of 13 normal skin tissues (N) and skin tissues of hyperpigmentation sites to extract bioRNAs and investigate gene expression changes using real-time PCR It was. The results are shown in FIG.
도 1에서 볼 수 있듯이, 과색소침착 부위의 피부 조직에서 WIF 1의 발현은 정상 피부 조직에 비해 감소된다. 이를 통해 WIF 1이 피부 과색소침착과 관련 있음을 확인할 수 있다.
As can be seen in Figure 1, the expression of WIF 1 in the skin tissue of the hyperpigmentation site is reduced compared to normal skin tissue. This confirms that WIF 1 is associated with skin hyperpigmentation.
[실험예 2] 피부 과색소침착 부위에서의 WNT 1과 WNT 5a 발현 변화Experimental Example 2 Expression of WNT 1 and WNT 5a in the Hyperpigmented Skin
피험자 13명의 정상 피부 조직(N)과 과색소침착 부위의 피부 조직(L)을 생검하여 조직 내 RNA를 추출하고 이를 이용하여 실시간 PCR 방법으로 WNT 1과 WNT 5a 유전자의 발현 변화를 조사하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.Normal skin tissues (N) and skin tissues (L) of hyperpigmentation sites of 13 subjects were biopsied and RNA was extracted from the tissues, and the expression changes of WNT 1 and WNT 5a genes were examined by real-time PCR. The results are shown in FIG.
도 2에서 볼 수 있듯이, 과색소침착 부위의 피부 조직에서 WNT 1과 WNT 5a의 발현은 정상 피부 조직에 비해 증가한다. 이를 통해 WNT 1과 WNT 5a가 피부 과색소 침착과 관련 있음을 확인할 수 있다.
As can be seen in Figure 2, the expression of WNT 1 and WNT 5a in the skin tissue of the hyperpigmentation site is increased compared to normal skin tissue. This confirms that WNT 1 and WNT 5a are associated with skin hyperpigmentation.
[실험예 3] 피부 세포에서의 WIF 1 유전자 발현Experimental Example 3 WIF 1 Gene Expression in Skin Cells
캐스캐이드 바이로직스(Cascade Biologics) 사로부터 입수한 미디움 254(Medium 254)에 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate) 10 ng/ml을 함유한 인간 멜라노사이트 성장 보충제(HMGs, human melanocyte growth supplement)를 넣고, 이를 배지로 사용하여 신생아의 표피에서 분리한 인간 피부 멜라노사이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 또한 캐스캐이드 바이로직스 사에서 입수한 미디움 EpiLife(#M-EPI-500-CA)에 인간 케라티노사이트 성장 보충제(HKGS, human keratinocyte growth supplement)를 넣고, 이를 배지로 사용하여 신생아의 표피에서 분리한 인간 피부 케라티노사이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 우태아혈청이 10% 들어간 DMEM(Dulbecco? Modified Eagles medium)에 신생아의 표피에서 분리한 인간 피부 섬유아세포(fibroblast)를 넣고 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 위와 같이 배양한 각 피부 세포에서 RNA를 분리하여 실시간 PCR로 WIF 1의 유전자 발현을 조사하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.Growth of human melanocytes containing 10 ng / ml of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) in Medium 254 obtained from Cascade Biologics. Human melanocyte growth supplement (HMGs) was added and used as a medium. Human skin melanocytes isolated from the epidermis of newborns were cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. In addition, human keratinocyte growth supplement (HKGS) was added to Medium EpiLife (# M-EPI-500-CA) obtained from Cascade Virologics, and isolated from the epidermis of newborns. One human skin keratinocyte was incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator. Human dermal fibroblasts isolated from the epidermis of newborns were placed in DMEM (Dulbecco® Modified Eagles medium) containing 10% fetal calf serum and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 . RNA was isolated from each of the skin cells cultured as described above, and the gene expression of WIF 1 was examined by real-time PCR, and the results are shown in FIG. 3.
도 3에서 볼 수 있듯이, 섬유아세포(FB)와 케라티노사이트(KC)에서는 WIF 1이 발현되며, 멜라노사이트(MC)에서는 발현되지 않았다. 이를 통해, 피부 세포에서 WIF 1는 멜라노사이트가 아닌 섬유아세포와 케라티노사이트에서 발현됨을 알 수 있다.
As shown in FIG. 3, WIF 1 was expressed in fibroblasts (FB) and keratinocytes (KC), but not in melanocytes (MC). Through this, it can be seen that WIF 1 is expressed in fibroblasts and keratinocytes, but not melanocytes.
[실시예 1 내지 3 및 비교예 1과 2] 시스템의 제조Examples 1-3 and Comparative Examples 1 and 2 Preparation of System
진피의 중요 구성 성분인 콜라겐 1(collagen I, 1 mg/ml) 용액에 2.5 X 105/ml의 섬유아세포를 넣고, 이를 6-웰 플레이트에 웰 당 2 ml씩 넣은 후 37℃ 배양기에서 한 시간 이상 굳혀 3차원 인공 진피를 제조하였다. 그 위에 1:1로 섞은 총 2.5 X 105개의 멜라노사이트 및 케라티노사이트층을 올려 3차원 시스템을 제조하였다. 이때 siRNA를 처리하여 WIF 1의 발현을 억제시킨 섬유아세포를 사용한 시스템을 실시예 1로 하고, 인간 피부의 정상 섬유아세포를 사용한 시스템을 비교예 1로 하였다.2.5 x 10 5 / ml of fibroblasts were added to the collagen 1 (collagen I, 1 mg / ml) solution, which is an important component of the dermis, and 2 ml per well was put into a 6-well plate, followed by an hour at 37 ° C incubator. It solidified above to prepare a three-dimensional artificial dermis. A total of 2.5 × 10 5 melanocytes and keratinocytes were mixed on a 1: 1 basis to prepare a three-dimensional system. At this time, the system using the fibroblasts which suppressed the expression of WIF 1 by treating siRNA was set to Example 1, and the system using normal fibroblasts of human skin was set to Comparative Example 1.
또한 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 siRNA를 처리하여 WIF 1의 발현을 억제시킨 케라티노사이트와 멜라노사이트를 이용하여 제조한 3차원 시스템을 실시예 2로 하고, 정상 케라티노사이트와 멜라노사이트를 이용하여 제조한 시스템을 비교예 2로 하였다.In addition, a three-dimensional system prepared by using keratinocytes and melanocytes that inhibited the expression of WIF 1 by treating siRNA in substantially the same manner as Example 1 was used as Example 2, and normal keratinocytes and melanocytes were used. The system manufactured by using this was made into the comparative example 2.
그리고 인간 재조합 유전자를 사용하여 만든 WIF 1을 50 ng/ml로 배양 배지에 처리하여 WIF1의 발현을 증가시킨 멜라노사이트에 케라티노사이트를 섞은 후, 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 제조한 인공 진피 위에 올려 제조한 시스템을 실시예 3으로 하였다.
In addition, artificial dermis prepared by substantially the same method as Example 1 after mixing keratinocytes with melanocytes which increased the expression of WIF1 by treating WIF 1 made with human recombinant gene at 50 ng / ml in the culture medium. The system prepared on the top was made into Example 3.
[실험예 4] WIF 1의 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 시스템에 대한 평가Experimental Example 4 Evaluation of a System Including Fibroblasts Inhibiting WIF 1 Expression
본 발명에 따른 시스템인 실시예 1이 실제 피부 상태를 잘 반영하는지 여부를 아래와 같이 비교예 1과 대비하여 평가하였다.Whether or not Example 1, a system according to the present invention, reflects the actual skin condition was evaluated in comparison with Comparative Example 1 as follows.
WIF 1의 발현을 억제시킨 섬유아세포를 포함하는 실시예 1의 시스템은 실제 피부 과색소침착 부위와 마찬가지로 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 티로시나아제의 발현이 비교예 1이 비해 현저히 증가되어 있는 것을 단백질 전기영동을 통한 웨스턴 블랏팅(western blotting) 방법으로 확인하였다(도 4 참조). The system of Example 1, which contains fibroblasts that inhibited the expression of WIF 1, has a markedly increased expression of tyrosinase, an enzyme that plays an important role in melanogenesis, as in the skin hyperpigmentation site. This was confirmed by Western blotting method by protein electrophoresis (see FIG. 4).
또한 케라티노사이트에서만 발현되는 케라틴 14 (keratin 14)를 인식하는 형광이 붙은 항체로 케라티노사이트를 염색하고, 멜라노사이트에서 발현되는 티로시나아제 유사 단백질 1(tyrosinase-related protein 1, TRP 1)을 인식하는 다른 색의 형광이 결합된 항체로 멜라노사이트를 염색하여, 두 가지 형광을 모두 가지고 있는 케라티노사이트의 수를 FACS (Fluorescence-activated cell sorting)를 이용해 확인한 결과, 실시예 1은 피부 과색소침착 부위처럼 케라티노사이트로의 멜라닌 확산이 비교예 1에 비해 증가되어 있었다(도 5 참조). 또한 이때 단백질 전기영동을 통한 웨스턴 블랏팅 방법을 통해 실시예 1의 시스템에서 신호 전달 인자인 NFATC 2 (nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2)의 인산화된 형태 (p-NFATC 2)가 감소되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 6 참조).In addition, staining keratinocytes with a fluorescent antibody that recognizes keratin 14, which is expressed only in keratinocytes, and tyrosinase-related protein 1 (TRP 1) expressed in melanocytes. By staining melanocytes with antibodies of different fluorescence to recognize different colors, and confirming the number of keratinocytes having both fluorescence using FACS (Fluorescence-activated cell sorting), Example 1 hyperpigmentation Melanin diffusion into keratinocytes was increased as compared to Comparative Example 1 (see FIG. 5). In addition, the phosphorylated form of the signal transduction factor NFATC 2 (nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 2) in the system of Example 1 by Western blotting through protein electrophoresis (p-NFATC 2) It can be observed that is reduced (see Fig. 6).
이를 기초로 섬유아세포, 멜라노사이트 및 케라티노사이트를 적층하여 3차원으로 제조한 본 발명에 따른 시스템은 실제 피부 상태와 유사하며, 특히 피부 과색소침착 부위를 재현할 수 있음을 확인할 수 있다.
Based on the fibroblasts, melanocytes and keratinocytes laminated on the basis of the three-dimensional system according to the present invention is similar to the actual skin condition, it can be seen that can reproduce the skin hyperpigmentation site in particular.
[실험예 5] WIF 1의 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 시스템에 대한 평가Experimental Example 5 Evaluation of a System Containing Keratinocytes with Inhibition of WIF 1 Expression
본 발명에 따른 시스템인 실시예 2가 실제 피부 상태를 잘 반영하는지 여부를 아래와 같이 비교예 2와 대비하여 평가하였다.Whether or not Example 2, a system according to the present invention, reflects the actual skin condition was evaluated in comparison with Comparative Example 2 as follows.
WIF 1의 발현을 억제시킨 케라티노사이트를 포함하는 실시예 2의 시스템에 대해 실험예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 평가한 결과, 실제 피부 과색소침착 부위와 마찬가지로 멜라닌 생성에 중요한 역할을 하는 효소인 티로시나아제의 발현이 비교예 2에 비해 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다(도 7 참조).Evaluation of the system of Example 2 comprising keratinocytes that inhibited the expression of WIF 1 was carried out in substantially the same manner as in Experiment 4. As a result, an enzyme that plays an important role in the production of melanin as well as the actual skin hyperpigmentation site It was confirmed that the expression of tyrosinase was significantly increased compared to Comparative Example 2 (see Fig. 7).
또한 실험예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 평가하여, 실시예 2에서도 피부 과색소침착 부위처럼 멜라닌 확산이 증가되어 있음을 확인하였다(도 8 참조). 그리고 이때 NFATC 2의 인산화된 형태인 p-NFATC 2가 감소하였음을 확인하여, NFATC 2가 탈인산화 되어 있음을 확인하였다(도 9 참조).In addition, the evaluation was conducted in substantially the same manner as in Experimental Example 4, and it was confirmed that the melanin diffusion was increased in Example 2 like the skin hyperpigmentation site (see FIG. 8). In this case, it was confirmed that p-NFATC 2, which is a phosphorylated form of NFATC 2, was reduced, confirming that NFATC 2 was dephosphorylated (see FIG. 9).
이를 통해 멜라노사이트, 케라티노사이트를 이용하여 3차원으로 제조한 본 발명에 따른 시스템 역시 실제 피부 상태와 유사하며, 특히 피부 과색소침착 부위를 재현할 수 있음을 확인할 수 있다.
Through this, the system according to the present invention manufactured in three dimensions using melanocytes and keratinocytes is also similar to the actual skin condition, and in particular, it can be seen that skin hyperpigmentation sites can be reproduced.
[실험예 6] 인간 재조합 유전자를 이용하여 만든 WIF 1을 직접 배양 배지에 처리하여 세포 자체의 WIF1 발현을 증가시킨 멜라노사이트를 포함하는 시스템에 대한 평가Experimental Example 6 Evaluation of a System Containing Melanosite Increasing WIF1 Expression in Cells by Directly Treating WIF 1 Made with Human Recombinant Gene in Culture Medium
인간 재조합 유전자를 사용하여 만든 WIF 1을 세포 배양 배지에 50 ng/ml이 되도록 처리한 멜라노사이트를 포함하는 실시예 3의 시스템에 대해 단백질 전기 영동을 통한 웨스턴 블랏팅 방법으로 WIF 1의 발현이 증가된 것을 확인하였다(도 10 참조). 이때 실험예 4와 실질적으로 동일한 방법으로 실시예 3의 시스템에서 티로시나아제의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 11 참조). 또한 비교예 1과 비교한 결과, 실시예 3에서 멜라닌 확산이 감소함을 확인할 수 있었으며(도 12 참조), NFATC 2의 인산화가 증가되는 것 또한 확인하였다(도 13 참조).The expression of WIF 1 was increased by Western blotting through protein electrophoresis for the system of Example 3 containing melanocytes treated with WIF 1 made using a human recombinant gene to be 50 ng / ml in the cell culture medium. It was confirmed (see FIG. 10). In this case, it was confirmed that the expression of tyrosinase was reduced in the system of Example 3 in substantially the same manner as in Experimental Example 4 (see FIG. 11). In addition, as compared with Comparative Example 1, it was confirmed that the melanin diffusion in Example 3 is reduced (see Fig. 12), it was also confirmed that the phosphorylation of NFATC 2 is increased (see Fig. 13).
이를 통해 WIF 1와 NFATC 2는 멜라닌 색소 생성과 밀접한 관련성이 있으므로, 본 발명에 따른 시스템에 후보 물질을 처리하고, 이후 WIF 1의 발현 증가 정도와 그 하위 신호전달인자인 NFATC 2의 인산화 정도를 평가함을 통해 피부 미백 물질을 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.
Through this, since WIF 1 and NFATC 2 are closely related to melanin pigment production, the candidate system is treated in the system according to the present invention, and then the degree of expression of WIF 1 is increased and the level of phosphorylation of NFATC 2, which is a lower signaling factor thereof, is evaluated. It can be seen that the screening can be used to screen the skin whitening substance.
이와 같이, 본 발명에 따른 피부 미백 물질 스크리닝 시스템은 실제 피부를 재현할 수 있으므로, in vitro에서도 임상적으로 우수한 피부 미백 효과를 나타내는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있게 한다. 나아가 이는 인간의 실제 피부 조직을 잘 반영하고 있으므로, 백반증 또는 백모와 같은 색소 결여증의 메커니즘 또는 개선 방법 연구에도 사용될 수 있을 것이다.As described above, the skin whitening material screening system according to the present invention can reproduce the actual skin, thereby effectively screening the material exhibiting clinically excellent skin whitening effect even in vitro. Furthermore, since it reflects the actual human skin tissue, it may be used to study the mechanism or improvement of pigment deficiency such as vitiligo or white hair.
Claims (17)
상기 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 정상 피부 세포에 비하여 WNT 1 또는 WNT5a의 발현이 증가된 세포인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
One or more layers comprising one or more cells of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes,
At least one cell of the fibroblasts, keratinocytes and melanocytes is a structure for screening skin whitening material is a cell with increased expression of WNT 1 or WNT5a compared to normal skin cells.
섬유아세포를 포함하는 섬유아세포층; 및
케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상을 포함하는 층을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
The method of claim 1,
A fibroblast layer comprising fibroblasts; And
A structure for screening skin whitening material comprising a layer comprising at least one of keratinocytes and melanocytes.
섬유아세포층은 콜라겐에 섬유아세포가 포함된 층인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
The method of claim 2,
Fibroblast layer is a structure for screening skin whitening substance that is a layer containing fibroblasts in collagen.
콜라겐은 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체 전체 중량을 기초로 0.001 중량% 내지 30 중량%로 포함되는 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
The method of claim 3, wherein
Collagen is a skin whitening material screening structure comprising 0.001% to 30% by weight based on the total weight of the skin lightening material screening structure.
섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 WIF 1(Wnt inhibitory factor 1)의 발현이 억제된 세포인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
The method of claim 1,
At least one of the fibroblasts, keratinocytes and melanocytes is a structure for screening skin whitening material is a cell in which the expression of WIF 1 (Wnt inhibitory factor 1) is suppressed.
섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 NFATC 2(nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic 2)가 탈인산화된 세포인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
The method of claim 1,
At least one of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes is a structure for screening skin whitening material is a cell dephosphorylated NFATC 2 (nuclear factor of activated T cells, cytoplasmic 2).
섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포는 인간, 마우스, 기니아피그, 닭 및 돼지 중 선택된 하나 이상에서 유래한 세포인 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
The method of claim 1,
At least one of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes is a cell whitening substance screening construct which is a cell derived from at least one selected from human, mouse, guinea pig, chicken and pig.
피부 미백 물질은 피부 과색소침착증을 개선하는 미백 물질을 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체.
The method of claim 1,
Skin whitening material is a structure for screening skin whitening material comprising a whitening material to improve skin hyperpigmentation.
발현 정도를 확인하는 단계 이후에, WNT 1 또는 WNT 5a의 발현 정도를 감소시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계를 더 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
In the construct for screening skin whitening substances according to any one of claims 1 to 5 and 7 to 9, wherein the candidate substance is treated, WNT 1 of at least one of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes. Or confirming the expression level of WNT 5a,
After the step of checking the expression level, further comprising the step of determining the substance to reduce the expression level of WNT 1 or WNT 5a as a skin whitening material screening method.
상기 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체에서, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 WIF 1의 발현 정도를 확인하는 단계; 및
발현 정도를 확인하는 단계 이후에, WIF 1의 발현 정도를 증가시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계;를 더 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법.
The method of claim 10,
Confirming the expression level of WIF 1 in one or more cells of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes in the skin whitening material screening construct; And
After the step of checking the expression level, the step of determining the substance to increase the expression level of WIF 1 as a skin whitening material; skin whitening material screening method further comprising.
상기 피부 미백 물질 스크리닝용 구조체에서, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 멜라노사이트 중 하나 이상의 세포의 NFATC 2의 인산화 정도를 확인하는 단계; 및
발현 정도 또는 인산화 정도를 확인하는 단계 이후에, NFATC 2의 인산화 정도를 증가시키는 물질을 피부 미백 물질로 판단하는 단계;를 더 포함하는 피부 미백 물질 스크리닝 방법.The method of claim 10,
Confirming the degree of phosphorylation of NFATC 2 in at least one of fibroblasts, keratinocytes and melanocytes in the structure for screening the skin whitening substance; And
After the step of determining the degree of expression or phosphorylation, determining the substance to increase the phosphorylation level of NFATC 2 as a skin whitening material; skin whitening material screening method further comprising.
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