KR20240014626A - 라미닌 511 생성 촉진제, 표피 기저막 안정화제 및/또는 표피 줄기 세포 감소 억제 또는 증가 촉진제의 스크리닝 방법 - Google Patents

라미닌 511 생성 촉진제, 표피 기저막 안정화제 및/또는 표피 줄기 세포 감소 억제 또는 증가 촉진제의 스크리닝 방법 Download PDF

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šœ스케 이리야마
사오리 단노
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Abstract

본 발명은 MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포를 증식시키는 약제, 또는 감소 억제하는 약제의 스크리닝을 간단히 행하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 라미닌 511의 발현을 지표로 한, 라미닌 511 발현 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스를 포함하는, 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증의 개선제를 제공한다.

Description

라미닌 511 생성 촉진제, 표피 기저막 안정화제 및/또는 표피 줄기 세포 감소 억제 또는 증가 촉진제의 스크리닝 방법{LAMININ 511 PRODUCTION PROMOTER, BASAL EPIDERMAL LAYER STABILIZER AND/OR SCREENING METHOD FOR AGENT TO MINIMIZE REDUCTION IN OR PROMOTE INCREASE IN EPIDERMAL STEM CELLS}
본 발명은 표피 기저막에 있어서의 표피 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가 촉진의 기술분야에 관한 것이다.
표피는 피부 최외층에 존재하는 피부 조직이다. 표피는 각층, 과립층, 유극층 및 기저층으로 주로 구성되어 있다. 기저층에 존재하는 기저 세포가 분열하여, 외층으로 이동한다. 이 이동의 과정에서 세포에 있어서 탈핵이 생겨 편평화하여 각층으로 분화되고, 각층은 최종적으로 박리된다. 이 턴오버의 기간은 대략 45일 정도라고 되어 있다. 그러나, 노화한 피부에서는, 턴오버 속도가 늦어져, 표피 전체가 얇아진다. 그 결과, 배리어 기능 저하, 수분 함량의 저하 등의 피부 기능의 저하가 생기는 것이 알려져 있다. 기저 세포는 분열성이 풍부한 세포이지만, 무한하게 증식을 반복하는 것이 아니며, 일정 회수 분열하면 분열하지 않게 된다. 기저 세포는 기저막 상에 존재하는 표피 기저 줄기 세포의 일부가 분화함으로써, 새롭게 공급된다. 그러나, 노화에 따라, 표피 기저 줄기 세포의 수가 감소하는 것이 알려져 있고, 표피 기저 줄기 세포의 수가 감소하면, 표피의 박화, 표피의 건조, 배리어 기능 저하 등의 노화의 징후를 나타내게 된다.
최근, 표피 기저 줄기 세포 마커인 MCSP 항체가 개발되어 있고, 이 항체를 이용함으로써, 표피 기저 줄기 세포의 식별이 가능하게 되어 있다. 각 연대의 남녀의 비노광부의 피부에 있어서, MCSP 항체를 이용한 표피 기저 세포 가시화가 행해져 있고, 노화에 따라 MCSP 양성의 표피 기저 줄기 세포수가 감소하는 것이 나타나 있다(비특허문헌 1). MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포수의 증가의 촉진 작용 또는 감소의 억제 작용을 갖는 약제의 개발이 요구되고 있다.
비특허문헌 1: Giangreco A, et al., J Invest Dermatol. 2010, 130(2): 604-8
본 발명은 MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포수를 증가 촉진시키거나, 또는 감소 억제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들이 MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포에 대해서 예의 연구를 행한 바, MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포와 기저막 부근에 존재하는 라미닌 511의 관계성을 발견하였다. 즉, 기저막 부근의 라미닌 511이 감소하면, 그에 따라 MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포의 수도 감소하고, 라미닌 511의 발현량을 증가시킴으로써, MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포수를 증가시킬 수 있는 것을 처음으로 발견하였다. 또한, 라미닌은 라미닌 α, β 및 γ의 복합체인 바, 라미닌 511의 존재량을, 라미닌 α5, β1 및 γ1의 발현량을 지표로 함으로써 결정할 수 있는 것을 발견하였다.
이 지견에 기초하여, 라미닌 511의 발현을 지표로 한, 라미닌 511 발현 촉진제의 스크리닝 방법에 관한 발명에 이르렀다. 라미닌 511 발현 촉진제는 기저막을 안정화할 수 있기 때문에, 라미닌 511 발현 촉진제의 스크리닝 방법은, 기저막 안정화제의 스크리닝 방법이라고도 할 수 있다. 또한, 라미닌 511의 존재량이 증가하여, 기저막이 안정화되면, 표피 기저 줄기 세포의 증가 작용 또는 감소 억제 작용이 생기기 때문에, 라미닌 511 발현 촉진제의 스크리닝 방법은, 표피 기저 줄기 세포의 증가 촉진제 또는 감소 억제제의 스크리닝 방법이라고도 할 수 있다.
보다 구체적으로는 하기의 발명에 관한 것이다:
[1] 표피 세포에 있어서의 라미닌 511의 발현량을 지표로 하는, 라미닌 511 발현 촉진제의 스크리닝 방법.
[2] 후보 약제를 포함하는 배양 배지 중에서 표피 세포를 배양하는 공정,
표피 세포에 있어서의 라미닌 511의 발현량을 측정하는 공정,
대조에 있어서의 라미닌 511 발현량과 비교하여, 라미닌 511의 발현이 증가한 경우에, 후보 약제가 라미닌 511 발현 촉진 효과를 갖는다고 판정하는 공정
을 포함하는, 항목 1에 기재된 방법.
[3] 상기 라미닌 511의 발현량이 라미닌 511의 단백질량 또는 라미닌 α5의 mRNA량, 라미닌 β1의 mRNA량 및 라미닌 γ1의 mRNA량으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 mRNA량으로부터 결정되는, 항목 1 또는 2에 기재된 방법.
[4] 라미닌 511의 발현량이 라미닌 α5의 mRNA량, 라미닌 β1의 mRNA량 및 라미닌 γ1의 mRNA량의 합계량으로부터 결정되는, 항목 1∼3 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[5] 상기 라미닌 511 발현 촉진제가 표피 기저막 안정화제인, 항목 1∼4 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[6] 표피 기저막 안정화제가 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가제인, 항목 1∼5 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[7] 표피 세포가 표피 줄기 세포를 포함하는, 항목 1∼6 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[8] 표피 줄기 세포가 표피 기저 줄기 세포를 포함하는, 항목 1∼7 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[9] 표피 세포가 MCSP 발현 세포를 포함하는, 항목 1∼8 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[10] 표피 세포가, 추가로 인테그린을 발현하고 있는 세포를 포함하는, 항목 1∼9 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[11] 표피 세포가 태아 유래인, 항목 1∼10 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[12] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 유효 성분으로 하는, 라미닌 511의 발현 촉진제.
[13] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 유효 성분으로 하는, 라미닌 511의 발현 촉진에 의한 표피 기저막 안정화제.
[14] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 유효 성분으로 하는, 라미닌 511의 발현 촉진에 의한 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가제.
[15] 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 포함하는, 세포외 매트릭스 분해 효소의 활성 저해제.
[16] 세포외 매트릭스 분해 효소가 매트릭스 메탈로프로테이나제 또는 헤파라나제인, 항목 15에 기재된 세포외 매트릭스 분해 효소의 활성 저해제.
[17] 세포외 매트릭스 분해 효소가 매트릭스 메탈로프로테이나제 9인, 항목 15에 기재된 세포외 매트릭스 분해 효소의 활성 저해제.
[18] 항목 15∼17 중 어느 한 항에 기재된 세포외 매트릭스 분해 효소의 활성 저해제를 포함하는, 라미닌 511 분해 억제제.
[19] 항목 15∼17 중 어느 한 항에 기재된 세포외 매트릭스 분해 효소의 활성 저해제를 포함하는, 표피 기저막 안정화제.
[20] 항목 15∼17 중 어느 한 항에 기재된 세포외 매트릭스 분해 효소의 활성 저해제를 포함하는, 표피 기저 줄기 세포 감소 억제 또는 증가 촉진제.
[21] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 투여하는 것을 포함하는, 표피에 있어서 라미닌 511의 발현을 항진시키는 방법.
[22] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 투여하여, 라미닌 511의 발현 촉진 작용에 의해, 표피 기저막을 안정화하는 방법.
[23] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 투여하여, 라미닌 511의 발현 촉진 작용에 의해, 표피 기저 줄기 세포의 감소를 억제하거나 또는 증가를 촉진하는 방법.
[24] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 투여하여, 표피에 있어서 라미닌 511의 발현을 항진시키는, 미용 방법.
[25] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 투여하여, 표피에 있어서 라미닌 511의 발현을 항진시켜, 라미닌 511의 발현 촉진 작용에 의해 표피 기저막을 안정화하는, 미용 방법.
[26] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 투여하여, 표피에 있어서 라미닌 511의 발현을 항진시켜, 라미닌 511의 발현 촉진 작용에 의해 표피 기저 줄기 세포의 감소를 억제하거나 또는 증가를 촉진하는, 미용 방법.
[27] 라미닌 511의 발현을 촉진하기 위한 화장품 또는 의약품을 제조를 위한, 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논의 용도.
[28] 표피 기저막을 안정화하기 위한 화장품 또는 의약품을 제조를 위한, 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논의 용도.
[29] 표피 기저 줄기 세포의 감소를 억제하거나 또는 증가를 촉진하기 위한 화장품 또는 의약품을 제조를 위한, 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논의 용도.
[30] 라미닌 511의 발현 촉진을 통해 항노화 치료에 이용하기 위한 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논.
[31] 표피 기저막 안정화를 통해 항노화 치료에 이용하기 위한 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논.
[32] 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가를 통해 항노화 치료에 이용하기 위한 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스 또는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논.
[33] 세포외 매트릭스 분해 효소의 활성 저해를 통해 항노화 치료에 이용하기 위한 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논.
[34] 세포외 매트릭스 분해 효소가 매트릭스 메탈로프로테이나제 또는 헤파라나제인, 항목 33에 기재된 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논.
[35] 세포외 매트릭스 분해 효소가 매트릭스 메탈로프로테이나제 9인, 항목 33에 기재된 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논.
[36] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스를 포함하는, 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증의 개선제.
[37] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스를 포함하는, 염증 억제제.
[38] 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증의 개선제의 제조를 위한, 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스의 용도.
[39] 염증 억제제의 제조를 위한, 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스의 용도.
[40] 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스를 포함하는 화장료를 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증의 개선을 필요로 하는 대상에 적용하는 것을 포함하는, 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증의 개선을 위한 미용 방법.
[41] 염증을 앓는 대상에게 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스를 포함하는 화장료를 적용하는 것을 포함하는, 염증 억제를 위한 미용 방법.
MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포를 증가시키는 약제의 스크리닝을, 라미닌 511을 지표로 함으로써 보다 간단한 세포 실험으로 행할 수 있게 된다.
도 1의 (A)는 20대의 복부(비노광부) 및 안면부(노광부)와, 60대의 복부(비노광부) 및 안면부(노광부)에 있어서의 MCSP의 발현을 나타낸 도면이다. 도 1의 (B)는 각 연대의 피험자의 복부(비노광부) 및 안면부(노광부)의 피부 절편에 있어서, 기저막의 길이에 대한 MCSP 양성 세포의 수를 계측하여 비교한 그래프이다. 도 1의 (C)는 각 연대의 피험자의 피부 절편에 있어서의 MCSP의 발현량을 비교한 그래프이다.
도 2의 (A)는 20대의 복부(비노광부) 및 안면부(노광부)와, 60대의 복부(비노광부) 및 안면부(노광부)에 있어서의 라미닌 332, 라미닌 551 및 β1 인테그린의 발현을 나타낸 도면이다. 도 2의 (B)는 각 연대의 피험자의 피부 절편에 있어서의 라미닌 α5의 발현량을 비교한 그래프이다.
도 3의 (A)는 표피 배양 시에, 배양 플레이트를 라미닌 511로 코트한 경우의, MCSP의 발현에 대한 영향을 나타내는 도면이다. 도 3의 (B)는 표피 배양 시에, 배양 플레이트를 라미닌 511로 코트한 경우의, CD46, Lrig1, DLL1, CD44로 이루어지는 줄기 세포 마커의 유전자 발현에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.
도 4의 (A)는 인간 피부 조직 배양에 의해 라미닌 511이 감소하는 것을 나타내고 있고, MMP 저해제(N-하이드록시-2(R)-[[(4-메톡시-페닐)술포닐](3-피콜릴)아미노]-3-메틸부탄아미드 하이드로클로라이드, 이하 CGS27023A) 및 헤파라나제 저해제(1-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)페닐]-3-[4-(1H-벤조이미다졸-2-일)페닐]우레아, 이하 BIPBIPU)를 첨가한 경우에, 라미닌 511이 증강되는 것을 나타내는 도면이다. 도 4의 (B)는 인간 피부 조직 배양에 의해 MCSP가 감소하는 것을 나타내고 있고, MMP 저해제(CGS27023A) 및 헤파라나제 저해제(BIPBIPU)를 첨가한 경우에, MCSP가 유지 또는 증강되는 것을 나타내는 도면이다.
도 5의 (A)는 알제렉스의 첨가에 의해, 라미닌 α5, 라미닌 β1 및 라미닌 γ1의 유전자 발현이, 용량 의존적으로 증가하는 것을 나타내는 그래프이다. 도 5의 (B)는 알제렉스의 첨가에 의해, 라미닌 α5쇄의 단백질량이, 용량 의존적으로 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 6은 알제렉스의 첨가에 의한 유전자 발현의 변화를 나타내는 그래프이다. 헤파라나제(HPA) 유전자[도 6의 (A)], PDGF-BB 유전자[도 6의 (B)], 하이알루론산 합성 효소 2(HAS2) 유전자[도 6의 (C)], 하이알루로니다제 1(HYAL1)[도 6의 (D)] 및 인터류킨 8(IL-8)유전자[도 6의 (E)]의 발현량의 변화가 조사되었다.
도 7은 ex vivo 인간 피부의 기관 배양에 있어서의 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논(HEI)의 첨가에 의한, 라미닌 511 및 MCSP의 단백질 발현에 대한 영향을 나타내는 도면이다.
도 8은 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논(HEI)의 헤파라나제 저해 활성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논(HEI)의 MMP9의 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 10의 (A)는 ex vivo 인간 피부의 기관 배양에 있어서의 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논(HEI)의 첨가에 의한, 필라그린 단백질 발현의 변화를 나타내는 도면이다. 도 10의 (B) 및 (C)는 ex vivo 인간 피부의 기관 배양에 있어서의 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논(HEI)의 첨가에 의한, TEWL 및 각층 수분 함량의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 10의 (D) 및 (E)는 in vivo 외겹 차폐 인간 연용 시험에 있어서의 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논(HEI)에 의한, TEWL 및 각층 수분 함량의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11의 (A)는 피부 조직의 기관 배양에 있어서, MMP 저해제(CGS27023A) 및 헤파라나제 저해제(BIPBIPU)를 첨가한 경우에, 기저막 직하에 있어서의 전자 현미경 사진이다. 기저막의 하부에 콜라겐 섬유의 단면이 찍혀 있다. 도 11의 (B)는 전자 현미경 사진 상에서 측정된 콜라겐 섬유의 직경과 빈도를 나타내는 히스토그램이다. 도 11의 (C)는 전자 현미경 사진 상에 있어서의 섬유의 직경의 평균값을 나타낸다. 도 11의 (D)는 전자 현미경 사진 상에 있어서의 섬유의 밀도의 평균값을 나타내는 그래프이다.
도 12a는 약령(29세)과 노령(60세)의 대상으로부터 취득된 피부 시료에 있어서의, V형 콜라겐의 발현과, 케라티노사이트를 나타내는 K-14의 발현을 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 12b는 약령 대상으로부터 취득된 케라티노사이트 및 섬유아세포 및 노령 대상으로부터 취득된 케라티노사이트 및 섬유아세포에 있어서의 V형 콜라겐에 대한 유전자 COL5A1의 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 13a는 피부 조직의 기관 배양 및 피부 3차원 모델에 있어서의, MMP 저해제(CGS27023A) 및 헤파라나제 저해제(BIPBIPU)의 첨가에 의한, V형 콜라겐의 발현과, 케라티노사이트를 나타내는 K-14의 발현을 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 13b는 피부 3차원 모델의 진피에 있어서의 V형 콜라겐의 유전자 COL5A1 발현을 나타내는 그래프이다.
도 13c는 피부 조직의 기관 배양에 있어서, MMP 저해제(CGS27023A) 및 헤파라나제 저해제(BIPBIPU)를 첨가한 경우에, 기저막 직하의 섬유아세포에 주목한 전자 현미경 사진이다.
도 14는 MMP 저해제(CGS27023A) 및 헤파라나제 저해제(BIPBIPU)가 첨가되어 배양된 피부 3차원 모델의 배양물로부터 채취된 배양 상청을, 배양된 진피 섬유아세포에 첨가한 경우의 V형 콜라겐의 유전자 COL5A1 발현을 나타내는 그래프이다.
도 15는 배양 인간 섬유아세포에 대하여, PDGF-BB를 첨가한 경우에 있어서의, V형 콜라겐의 유전자 COL5A1 발현을 나타내는 그래프이다.
도 16a는 약령(32세)과 노령(68세)의 대상으로부터 취득된 피부 시료에 있어서의, PDGFRβ의 발현과, 케라티노사이트를 나타내는 K-14의 발현을 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 16b는 각 연령의 정상 인간 표피 세포에 있어서의 PDGF-BB 단백질의 유전자 PDGFB의 발현량을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 표피 세포에 있어서의 라미닌 511의 발현을 지표로 한, 라미닌 511 발현 촉진제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 라미닌 511 발현 촉진제의 스크리닝 방법은, 이하의:
후보 약제를 포함하는 배양 배지로 표피 세포를 배양하는 공정,
표피 세포에 있어서의 라미닌 511의 발현을 측정하는 공정,
대조에 있어서의 라미닌 511 발현량과 비교하여, 라미닌 511의 발현이 증가한 경우에, 후보 약제가 라미닌 511 발현 촉진 효과를 갖는다고 판정하는 공정
을 포함한다. 또한, 배양 표피 세포에 대하여, 자외선을 조사하는 공정을 포함하여도 좋다. 자외선의 조사에 의해, 라미닌 511의 발현량은 감소한다. 자외선의 조사는 일례로서, 배양 세포에 대하여, 1 mJ/㎠∼200 mJ/㎠로 조사함으로써 행해질 수 있다. 자외선의 조사는 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성을 증강하여, 라미닌의 분해를 가져올 수 있다. 따라서 자외선 조사 하에 있어서, 후보 약제가 라미닌 511의 단백질량의 감소를 억제할 수 있는 경우에는, 후보 약제가 라미닌 511의 분해 억제 효과 및 발현 촉진 효과를 갖는 것을 알 수 있다. 후보 약제에 의한 매트릭스 메탈로프로테이나제의 활성에 대한 저해 효과를 조사함으로써, 후보 약제가 라미닌 511의 발현 촉진 효과를 갖는 것을 결정할 수 있다.
후보 약제를 포함하는 배양 배지로 표피 세포를 배양하는 공정은, 후보 약제를 포함하는 배지와 배양 표피 세포가 접촉하면 임의의 방식으로 행해져도 좋다. 배양하고 있는 배지에 후보 약제 또는 그 희석액을 직접 첨가하여도 좋고, 후보 약제가 포함된 배지로 치환되어도 좋다. 배양은 인간 표피 세포의 배양에 이용하는 통상의 조건 하에서 행해진다. 일례로서는, 37℃, 5% CO2 가습 분위기 하의 인큐베이터 내에서 배양된다. 후보 약제의 첨가 후의 배양 시간은 후보 약제의 효과에 따라 임의로 설정할 수 있다. 후보 약제의 효과를 충분히 발휘시키는 관점에서, 예컨대 300분 이상, 바람직하게는 6시간 이상, 보다 바람직하게는 48시간 이상 배양할 수 있다. 또한, 후보 약제의 효과의 포화를 막는 관점에서, 예컨대 7일 이하, 바람직하게는 5일 이하, 보다 바람직하게는 72시간 이하의 기간 배양할 수 있다.
배양 표피 세포에 있어서의 라미닌 511의 발현의 측정은, 라미닌 511을 인식하는 항체를 이용하여, 분자 생물학의 임의의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 라미닌 511의 단백질량의 측정에는, 예컨대 웨스턴 블롯이나 면역 염색법을 이용할 수 있다. 또한, 라미닌 511의 발현은 라미닌 511의 구성 서브유닛(α5, β1, γ1)의 mRNA 전사량에 기초하여 측정할 수 있다. mRNA의 전사량은 일례로서, 노던 블롯이나 정량적 PCR을 행함으로써 측정할 수 있다. 구성 서브유닛은 임의의 하나의 전사량에 기초하여 측정할 수도 있고, 2개 또는 3개의 전사량의 조합으로서 측정할 수도 있다. 1의 양태에서는, 라미닌 α5, 라미닌 β1 및 라미닌 γ1의 각각의 발현량을 합계함으로써, 발현량을 측정할 수 있다. 또한 별도의 양태에서는, 가장 낮은 발현량의 구성 서브유닛의 양을, 라미닌 511의 발현량으로 할 수도 있다.
대조에 있어서의 라미닌 511 발현량과 비교하여, 후보 약제를 포함하는 배양 배지로 배양된 표피 세포에 있어서 라미닌 511의 발현이 증가한 경우, 후보 약제가 라미닌 511 발현 촉진 효과를 갖는다고 판정할 수 있다. 하나의 양태에서는, 발현량에 유의차가 있는 경우에, 후보 약제가 라미닌 511 발현 촉진 효과를 갖는다고 판정할 수 있다. 또한, 별도의 양태에서는, 발현량이 소정의 비율로 증가한 경우에, 후보 약제가 라미닌 511 발현 촉진 효과를 갖는다고 판정할 수 있다. 소정의 비율은 당업자라면 임의로 결정할 수 있지만, 예컨대 대조의 발현량에 비교하여, 10%, 보다 바람직하게는 20%, 더욱 바람직하게는 30%, 더욱 보다 바람직하게는 50%를, 소정의 비율로서 선택할 수 있다. 이 판정은 실험자가 행하여도 좋고, 소프트웨어가 해석함으로써 행하여도 좋다. 본 발명의 스크리닝 방법을 대규모로 행하는 관점에서, 판정 공정은 발현 측정을 행한 기기, 또는 그 기기로부터 데이터를 취득한 프로세서를 포함하는 컴퓨터에 의해 행해지는 것이 바람직하다. 대조에 있어서의 라미닌 511 발현량이란, 후보 약제가 포함되지 않는 점을 제외하고, 동일한 조작을 행한 표피 세포에 있어서의 라미닌 511의 발현량을 말한다. 따라서, 전술한 배양 공정 및 발현 측정 공정은 후보 약제를 포함하지 않는 배양 배지로 대조의 표피 세포를 배양하여, 대조의 표피 세포에 있어서의 라미닌 511의 발현을 측정하는 공정이 포함되어도 좋다. 대조에 대한 배양 공정 및 발현 공정은, 후보 약제를 포함하는 배양 배지를 이용한 배양 공정 및 발현 공정과 동시 평행으로 행해져도 좋고, 미리 행해져 있어도 좋다.
본 발명의 스크리닝 공정은, 전술한 공정 외에, 후보 약제를 포함하는 배양 배지로 표피 세포를 배양하는 공정 전에 행해지는 전배양 공정, 후보 약제를 포함하는 배양 배지로 표피 세포를 배양하는 공정 후에 추가로 후보 약제를 포함하지 않는 배양 배지로 배양되는 후배양 공정, 세포를 회수하는 회수 공정, 회수된 세포, 또는 회수된 세포로부터 추출된 단백질, mRNA, 또는 mRNA로부터 역전사된 DNA를 저장하는 공정이라고 하는 임의의 부가적 공정을 포함할 수 있다.
라미닌은 라미닌 패밀리에 속하는 단백질이며, 기저막을 구성하는 단백질의 하나이다. 라미닌 패밀리 중에서, 특히 α3β3γ2의 서브유닛으로 구성되는 라미닌 332나 α5β1γ1 서브유닛으로 구성되는 라미닌 511이, 기저막에 존재하는 것이 알려져 있다. 라미닌은 세포 상에 발현되는 인테그린에 의해 인식되며, 세포 기반으로서 기능한다. 기저막에 존재하는 라미닌을 기반으로 하여, 표피 기저 세포가 층을 형성한다.
라미닌 511은 세포 접착이나 증식에 관여하는 단백질이고, 주로 표피 기저막에 존재한다. 라미닌 511은 β1 인테그린, 특히 α6β1 인테그린과 결합성을 갖는다. 세포 실험에서는, β1 인테그린을 발현하는 줄기 세포의 증식과 관여하고 있어, iPS 세포나 ES 세포의 배양에 이용되고 있다. 생체에서는, 라미닌 511은 노화와 함께 감소하는 것이 알려져 있다. 본 발명자들은, 라미닌 511이 노화 이외에도 자외선의 영향에 의해 감소하는 것을 밝혔다(도 1). 이론에 의해 제한하는 것을 의도하는 것은 아니지만, 자외선에 의해, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)가 활성화되고, 이에 의해 라미닌량이 감소한다고 생각된다. 그런데, 본 발명자들에 의해, 라미닌 332는 가령이나 자외선에 의한 영향이 적은 한편으로, 라미닌 511은 가령에 따라 감소하고, 또한 자외선의 영향에 의해 감소하는 것이 나타났다[도 2의 (A)]. 이 경향은 줄기 세포에 있어서 발현되는 β1 인테그린과 동경향을 나타내고 있고, 또한 MCSP 발현 줄기 세포에 대해서도 동경향이 보여졌다[도 1의 (A)].
라미닌 511 발현 촉진제란, 가장 광의로 해석할 수 있고, 라미닌 511의 단백질량을 증대시킬 수 있는 약제이면, 임의의 약제를 포함할 수 있다. 따라서, 단순히 라미닌 511의 유전자 발현을 촉진할 수 있는 약제뿐만 아니라, 헤파라나제 저해 작용이나 MMP 저해 작용에 의해, 라미닌 511의 단백질량을 증대시키는 약제도 라미닌 511 발현 촉진제라고 할 수 있다. 라미닌 511의 발현은 단백질량 또는 mRNA량에 따라 결정할 수 있다. 라미닌 511은 복합체 단백질이기 때문에, 라미닌 511 발현 촉진제는, 구성 서브유닛의 각 mRNA를 각각 발현 촉진시킬 수 있다. 라미닌 511 발현 촉진제는, 표피 기저막에 있어서의 라미닌 511의 발현을 증가시킴으로써, 표피 기저막 안정화 작용, 표피 줄기 세포 감소 억제 작용 및 표피 줄기 세포 증가 촉진 작용을 발휘할 수 있다. 따라서, 라미닌 511 발현 촉진제는 표피 기저막 안정화제, 표피 줄기 세포 감소 억제제, 또는 표피 줄기 세포 증가 촉진제라고 할 수도 있다.
표피 기저막은 표피 최하층에 존재하고, 표피와 진피의 경계를 구성한다. 표피 기저막은 콜라겐, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 라미닌으로부터 주로 구성되는 얇은 막형의 세포외 매트릭스이다. 기저막 상에, 기저 세포가 배치되어 있고, 기저막과 기저 세포를 포함하여 표피의 기저층이라고 불린다. 기저막에는 콜라겐으로서 I형 콜라겐, IV형 콜라겐 및 VII형 콜라겐이 주로 포함된다. 기저막에는, 라미닌으로서는, 라미닌 511이나 라미닌 332가 주로 포함된다. 기저막은 매트릭스 메탈로프로테이나제나 헤파라나제 등의 세포외 매트릭스 분해 효소의 영향에 의해, 부분적으로 분해되어 불안정화한다. 불안정화된 기저막으로서는, 라미닌이 감소하여, 라미닌을 세포 기반으로 하여 증식하는 표피 세포, 예컨대 β1 인테그린 발현 세포가 소실될 수 있다. 표피 세포 중에서는, 표피 줄기 세포, 특히 표피 기저 줄기 세포가 β1 인테그린 발현 세포라고 생각되고 있으며, 라미닌 감소와 함께, 이들 세포가 소실될 수 있다.
진피에 포함되는 콜라겐은 진피 중의 위치에 따라 형상이 상이하고, 구성하는 콜라겐의 종류도 상이하다. 표피 기저막 영역에는 I형 콜라겐, IV형 콜라겐 및 VII형 콜라겐이 포함되어 있고, 기저막 직하의 영역에는 섬유세망판이라고 불리는 가는 콜라겐 섬유 다발이 위치하고, 심부로 감에 따라, 콜라겐 세섬유가 위치하고, 최심부에는 굵은 콜라겐 섬유가 위치한다. 기저막 직하 영역의 섬유세망판은, 주로 V형 콜라겐에 의해 구성되고, 콜라겐 세섬유는 III형 콜라겐과 V형 콜라겐에 의해 구성되어 있고, 최심부의 콜라겐 섬유는 I형 및 III형 콜라겐에 의해 구성된다.
기저막 직하의 V형 콜라겐은 진피층의 진피 섬유아세포에 의해 생성되지만, 본 발명자들의 연구에 의해, 연령 의존적으로 감소하는 것이 나타났다(도 12). 또한, 놀랍게도 V형 콜라겐의 존재가, 기저막의 존재와 밀접하게 관여하고 있는 것을 발견하였다(도 13a). 한편, 진피층 전체로서의 콜라겐 생성량은, 기저막을 보호하는 MMP 저해제나 헤파라나제 저해제의 첨가에 의한 영향을 받지 않았다(도 13b). 이들 결과를 받아, 본 발명자들은 기저막측으로부터 어떠한 인자가 분비됨으로써, 기저막 직하의 진피 섬유아세포만이 활성화되어, V형 콜라겐을 생성한다고 하는 가설에 이르렀다. 이 가설을 실증하기 위해, 진피층, 기저막 및 표피층을 포함하는 피부 3차원 모델에 있어서, 배지에 기저막을 보호하는 MMP 저해제 및 헤파라나제 저해제를 첨가한 배양물의 배지를 채취하고, 이러한 배지를 섬유아세포 배양물에 첨가함으로써, V형 콜라겐의 발현을 조사한 바(도 14), 기저막을 보호하는 MMP 저해제 및 헤파라나제 저해제를 첨가한 배양물로부터 얻은 배지가, V형 콜라겐 발현 촉진 작용을 갖는 것을 발견하였다.
기저막을 보호하는 MMP 저해제 및 헤파라나제 저해제를 첨가한 피부 3차원 모델의 배양물로부터 표피를 회수하여, 저해제 첨가의 유무로 발현이 변화한 성장 인자에 착안한 바, PDGF-BB를, V형 콜라겐 발현 촉진 작용을 갖는 성장 인자로서 특정하였다(도 15). PDGF-BB의 수용체인 PDGFRβ는, 기저막 직하의 진피 섬유아세포에 있어서 발현하는 것이 나타났다. 이론에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 이들 지견으로부터, 노화에 따라, 기저막이 손상을 받으면, PDGF-BB의 생성량이 줄고, 그에 따른 V형 콜라겐의 발현량이 저하함으로써, 피부의 탄력이 손실된다고 하는 노화 모델을 설명할 수 있다. 이 노화 모델을 참조하면, 본 발명에 의해 특정된 라미닌 511 발현 촉진제, 표피 기저막 안정화제, 표피 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가 촉진제는, PDGF-BB의 생성 촉진제라고 할 수도 있고, 또한 콜라겐 생성 촉진제, 특히 바람직하게는 V형 콜라겐의 생성 촉진제로서 이용할 수도 있어, 탄력 개선제로서, 화장료에 배합할 수 있다.
표피 기저막 안정화제란, 표피 기저막을 안정화할 수 있는 약제를 말한다. 기저막 안정화제는 기저막을 분해하는 세포외 매트릭스 분해 효소의 저해제여도 좋고, 또한 기저막 구성 분자의 발현 촉진제여도 좋다. 세포외 매트릭스 분해 효소의 저해제로서는, 헤파라나제 저해제를 들 수 있고, 예컨대 무환자나무 엑기스 파우더, 쥐오줌풀 엑기스 E, 진피 엑기스 BG, 화이트 릴리, 장수초 엑기스, IBR, S-173, BIBIPU라고 하는 약제가 알려져 있다. 또한, 세포외 매트릭스 분해 효소의 저해제로서, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 저해제도 들 수 있고, 예컨대 울금 엑기스 BG, 토멘틸라 엑기스, 망고스틴 엑기스 BG, CGS27023A라고 하는 약제가 알려져 있다. 표피 기저막의 안정화를 통해 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제, 또는 증식시키는 것이 가능하다. 따라서, 표피 기저막 안정화제는 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제제, 또는 증가 촉진제라고도 할 수 있다. 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가 촉진제는 표피 기저 줄기 세포의 증식, 감소의 억제, 또는 유지 작용을 발휘할 수 있는 약제를 말한다. 또한 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제제 또는 증가 촉진제를 통해, 표피의 노화 방지 작용을 발휘할 수 있다. 따라서, 표피 기저막 안정화제는 피부 노화 방지제라고도 할 수 있다.
본 발명의 표피 줄기 세포 감소 억제 또는 증가 촉진제란, 피부에 있어서 표피 줄기 세포의 감소 억제, 유지, 또는 증가 촉진하는 것이 가능한 약제를 말한다. 표피 줄기 세포는 노화나 자외선 조사에 따라 수가 감소하지만 본 발명의 표피 줄기 세포 감소 억제 또는 증가 촉진제를 적용함으로써, 표피 줄기 세포의 감소 억제 또는 유지하는 것이 가능하다. 또한 별도의 양태에서는, 표피 줄기 세포의 수를 증가시킬 수도 있다.
본 발명에 사용되는 표피 세포는 배양 표피 세포를 이용할 수 있다. 배양 표피 세포는 분화 유도를 행하여 얻어진 3차원 표피 모델을 이용할 수도 있다. 표피 세포는 케라티노사이트, 랑게르한스 세포, 메르켈 세포, 멜라노사이트, 표피 기저 세포를 포함할 수 있고, 또한, 표피 줄기 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 이러한 표피 줄기 세포는 MCSP를 발현하는 표피 줄기 세포, 즉 표피 기저 줄기 세포인 것이 바람직하다. 표피 세포의 중에는, 표피 기저 줄기 세포 외에도, 벌지 영역이나 피지선에도 표피 줄기 세포가 존재한다고 생각되지만, 이들 중에서, 표피 기저 줄기 세포만이, MCSP를 발현할 수 있다. 따라서, MCSP 발현 표피 줄기 세포는 통상, 표피 기저 줄기 세포를 가리킨다.
표피 세포는 인테그린을 발현하고 있는 것이 바람직하다. 발현되는 인테그린으로서는, α 인테그린, β 인테그린 등을 들 수 있다. 특히 표피 줄기 세포는 β1 인테그린을 발현하고 있는 것이 바람직하다. 표피 세포는 임의의 동물종 유래의 세포여도 좋지만, 종마다의 영향을 배제할 목적으로, 인간의 세포인 것이 바람직하다. 인간 배양 세포는 성인, 소아, 유아(幼兒), 유아(乳兒), 신생아, 태아 등 임의의 유래여도 좋지만, 기저 줄기 세포가 많이 포함되는 세포를 이용하는 관점에서, 태아 유래인 것이 바람직하다.
표피 세포에 있어서 발현되는 인테그린은 세포막에 존재하고, 세포외 매트릭스의 리셉터로서 기능하는 분자를 말한다. 인테그린은 α쇄와 β쇄로 구성된다. α쇄는 18종 정도 발견되어 있고, β쇄는 8종 정도 발견되어 있다. β1 인테그린이란, β쇄가 β1 서브유닛이고, α쇄는 임의의 서브유닛인 인테그린을 말한다. β1 서브유닛를 포함하는 인테그린은 라미닌과의 결합성이 높다. 이론에 한정되는 것을 의도하지 않지만, 노화나 자외선의 영향에 의해 라미닌 511이 소실됨으로써, β1 인테그린을 발현하는 줄기 세포도 소실되어, 결과로서 MCSP 발현 줄기 세포의 수가 감소한다고 생각된다.
후보 약제는 화장품이나 의약품의 임의의 라이브러리에 포함되는 약제를 이용할 수 있다. 이들 라이브러리로서는, 화합물 라이브러리, 추출물 라이브러리 등 임의의 라이브러리를 이용할 수 있다. 후보 약제 중, 라미닌 511의 발현을 증가시킬 수 있는 약제를 선택함으로써, 라미닌 511 발현 촉진제, 표피 기저막 안정화제, 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가 촉진제로서 스크리닝할 수 있다.
대조란, 판정 공정에 있어서 후보 약제의 라미닌 511 발현 촉진 효과를 판정하기 위해 사용되는 비교를 위한 기준이 되는 라미닌 511 발현량을 가져오는 실험군을 가리킨다. 따라서, 후보 약제만을 포함하지 않고, 동조건으로, 동기간 배양된 배양 세포를 이용하여 결정된 라미닌 511의 발현량이, 대조의 발현량으로서 비교를 위해 제공된다. 이러한 대조의 발현량은, 후보 약제를 포함하는 배양 배지로 표피 세포를 배양하는 공정과 평행하게 세포를 배양하여, 라미닌 511의 발현을 측정함으로써 결정되어도 좋고, 미리 별도로 동조건으로 동기간 배양하여, 라미닌 511의 발현을 측정함으로써 결정되어도 좋다.
본 발명의 스크리닝 방법을 화장품 원료에 대하여 행한 바, 알제렉스가 라미닌 511 생성 촉진 효과를 갖는 약제로서 선택되었다. 이와 같이 하여 선택된 약제는 라미닌 511의 발현 촉진제이고, 표피 기저막 안정화제이기도 하며, 또한 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제제이기도 하고, 또한 표피 기저 줄기 세포의 증가 촉진제이기도 한다.
알제렉스란, 이치마루파르코스 가부시키가이샤에서 판매되는 화장품 원료이며, 해조 추출 엑기스에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 알제렉스는 갈조·홍조·녹조의 혼합 추출 엑기스에 관한 것이다. 갈조의 전조를, 50% 1,3-부틸렌글리콜 중에 3일간 침지를 하고, 여과하여 얻어진 갈조 추출액과, 갈조, 홍조 및 녹조의 전조를, 50% 1,3-부틸렌글리콜 중에 3일간 침지를 하고, 여과하여 얻어진 갈조, 홍조 및 녹조의 추출액을 혼합하여 얻어진다. 알제렉스는 수분 함량을 개선하고, 또한 피부 거칠음에 대한 억제 효과를 발휘한다고 생각되고 있다. 알제렉스에 이용되는 갈조는, 다시마속 및 미역속의 조류이고, 일례로서 사카리나 앙구스타타(Saccharina angustata)나 미역이다. 알제렉스에 이용되는 홍조는, 지누아리(Grateloupia)속의 조류이며, 일례로서 녹각채(Eucheuma muricatum)나 그라텔루피아 스파사(Grateloupia sparsa)이다. 알제렉스에 이용되는 녹조는 파래속의 조류이며, 일례로서 가시파래이다.
본 발명에 있어서, 해조 추출 엑기스는 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 해조류로부터 추출된 엑기스에 관한 것이다. 보다 바람직한 양태에서는, 해조 추출 엑기스는, 갈조, 홍조 및 녹조의 추출 엑기스에 관한 것이다. 또한 보다 바람직하게는, 다시마속 및 미역속의 갈조, 지누아리속의 홍조 및 파래속의 녹조의 추출 엑기스이고, 가장 바람직하게는 알제렉스이다. 사용되는 용매는 임의의 용매여도 좋고, 물, 알코올, 에테르, 에스테르 등을 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다. 사용되는 알코올로서는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 1가 알코올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 등의 2가 알코올 및 글리세린 등의 3가 알코올이 이용되어도 좋다. 에테르로서는, 디메틸에테르, 디에틸에테르, 에틸메틸에테르, 테트라히드로푸란 등이 이용되어도 좋다. 에스테르로서는, 초산메틸, 초산에틸 등이 이용되어도 좋다. 혼합물로서 사용되는 경우, 임의의 혼합비로 사용할 수 있다. 예컨대 물과 1,3-부틸렌글리콜의 혼합액은 1:10∼10:1의 범위로 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 3:10∼10:3의 범위로 사용할 수 있다. 1:1 혼합액을 사용하여도 좋다. 해조 추출 엑기스는 화장료에 배합할 수 있다. 예컨대 0.0001%∼10%의 양, 바람직하게는 0.001%∼1.0%의 해조 추출 엑기스를 화장료에 배합할 수 있다. 일례로서, 0.01%의 해조 추출 엑기스를, 예컨대 미용액, 화장수, 유액, 크림 등의 화장료에 배합할 수 있다.
라미닌 511 발현 촉진제로서, 스크리닝된 본 발명의 해조 추출 엑기스는, 라미닌 511 발현 촉진 효과, 기저막 안정화 효과 및 표피 줄기 세포 증식 촉진 또는 감소 억제 효과를 발휘한다. 또한, 이들 효과에 기인하여, 또는 독립적으로, 해조 추출 엑기스는 헤파라나제 유전자의 발현을 억제한다. 이에 의해, 피부 배리어 기능의 개선 작용을 발휘한다. 따라서, 해조 추출 엑기스를 포함하는 라미닌 511 발현 촉진제는, 헤파라나제 유전자의 발현 억제제 또는 피부 배리어 기능 개선제로서 사용할 수도 있다. 또한, 이들 효과에 기인하여, 또는 독립적으로, 해조 추출 엑기스는, 하이알루론산 합성 효소 2 유전자의 발현을 증가시키며, 하이알루로니다제 유전자의 발현을 억제한다. 이에 의해, 피부의 수분감이 향상된다. 따라서, 해조 추출 엑기스를 포함하는 라미닌 511 발현 촉진제는, 하이알루론산 증가 촉진제 또는 피부 수분감 향상제로서 사용할 수도 있다. 또한, 이들 효과에 기인하여, 또는 독립적으로, 해조 추출 엑기스는, PDGF-BB의 발현을 증가시킨다. PDGF-BB는 진피 섬유아세포에 작용함으로써, 콜라겐, 특히 V형 콜라겐의 생성을 촉진시키기 때문에, 해조 추출 엑기스를 포함하는 라미닌 511 발현 촉진제는, 탄력의 개선 작용을 발휘한다[생체 의공학(2017) 55(2): 97-102]. 또한, PDGF-BB는 간엽계 줄기 세포의 안정화에 기여하는 것이 알려져 있다. 간엽계 줄기 세포에는 진피 줄기 세포도 포함되고, PDGF-BB는 진피 줄기 세포에 작용하여, 탄력의 개선 작용을 발휘한다. 따라서, 해조 추출 엑기스를 포함하는 라미닌 511 발현 촉진제는, PDGF-BB의 발현 촉진제 또는 탄력 개선제로서 사용할 수도 있다. 또한, 이들 효과에 기인하여, 또는 독립적으로, 해조 추출 엑기스는 IL-8의 발현을 억제한다. 이에 의해, 염증 억제 작용을 발휘한다. 따라서, 라미닌 511 발현 촉진제는 IL-8의 발현 억제제, 염증 억제제로서 사용할 수도 있다. 따라서, 해조 추출 엑기스는 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증의 개선제라고도 할 수 있으며, 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증을 앓거나, 또는 개선을 필요로 하는 대상에게 적용될 수 있다.
본 발명의 별도의 양태에서는, 본 발명은 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증 중 적어도 1, 바람직하게는 모든 개선을 위한 미용 방법에 관한 것이다. 이러한 미용 방법은, 갈조, 홍조 및 녹조로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1의 추출 엑기스를 포함하는 화장료를, 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증 중 적어도 1, 바람직하게는 모두를 앓거나, 또는 개선을 필요로 하는 대상에게 적용하는 것을 포함한다. 이러한 대상은, 1) 피부에 있어서의 하이알루론산 저하, 2) 피부 배리어 기능의 저하, 3) 염증의 개시, 4) 유두층에 있어서의 섬유량의 저하 및 5) PDGF-BB 생성 저하 중 적어도 1, 또는 모든 증상을 가질 수 있다. 또한 다른 양태에서는, 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증 중 적어도 1, 바람직하게는 모두를 앓거나, 또는 개선을 필요로 하는 대상은, 피부 수분량 저하, 피부 거칠음, 색소 침착 및 피부의 흑화, 피부의 유연성의 저하 등의 증상을 앓고 있는 대상이기도 하다. 본 발명의 미용 방법에서는, 이러한 대상에 대하여, 1일 적어도 1회, 바람직하게는 적어도 2회, 적량을 안면 및 체표면에 적용할 수 있고, 특히 바람직한 양태는 입욕 후, 취침 전 및/또는 기상 후에 적용할 수 있다.
1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논(HEI)은, 하기 화학식:
로 나타내어지는 화합물이다. HEI는 헤파라나제 저해 활성 및 MMP9 저해 활성을 갖는 것이 나타났다(도 8 및 9). 또한, HEI는 라미닌 511의 발현 촉진 효과 및 αMCSP 양성의 줄기 세포 유지 효과를 갖는다(도 7). 이론에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 헤파라나제 저해 및 MMP9 저해 활성에 의해, 라미닌 511의 발현 촉진 효과를 발휘하고, 이에 의해 αMCSP 양성의 줄기 세포 유지 효과가 발휘될 수 있다. 따라서, 본 발명은 HEI를 포함하는 라미닌 511 발현 촉진제에 관한 것이다. 헤파라나제와 MMP9는, 모두 세포외 매트릭스 분해 효소이기 때문에, HEI는 세포외 매트릭스 분해 효소 저해제라고도 할 수 있다. 헤파라나제나 MMP9는, 암이 전이할 때에 발현할 때에 이용되는 것이 알려져 있다. 암 세포가 이들 효소의 동작에 의해 기저막을 파괴하여 혈류를 타고 전이가 생긴다. 또한 MMP9는 혈관 신생에도 관여하고 있다. 따라서, MMP9 저해제는, 혈관 신생 억제제로서 사용할 수 있고, 이에 의해 암 세포의 증식 억제 작용을 갖는다. 따라서, 본 발명에 있어서의 헤파라나제와 MMP9의 활성 저해제, 기저막 안정화제는, 화장료에의 배합뿐만 아니라, 암의 전이 억제제, 혈관 신생 억제제, 암 세포 증식 억제제로서 의약에 사용할 수도 있다. 화장료나 의약품에 배합되는 경우에는, 일례로서, 0.00001%∼10%의 범위, 바람직하게는 0.0001%∼5%의 범위, 보다 바람직하게는 0.001%∼3%의 범위로 배합할 수 있다. 일례로서, 화장수, 미용액, 유액, 크림 등의 화장료에 대하여, 1.5%로 배합할 수도 있다.
본 발명에서 스크리닝된, 라미닌 511의 발현 촉진제, 표피 기저막 안정화제 및 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가 촉진제는, 각각, 화장품 소재로서 화장료에 배합할 수 있다. 이 화장품 소재가 배합된 화장료는, 라미닌 511의 발현 촉진을 통해, 표피 기저막의 안정화를 통해, 또는 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가 촉진을 통해, 표피에 대하여 항노화 작용 또는 항자외선 작용을 발휘할 수 있다. 화장료로서는, 임의의 화장료에 배합할 수 있고, 예컨대 미용액, 화장수, 유액, 크림, 보디 밀크, 입욕제, 선 블록, 메이크업 베이스, 메이크업 상품, 로션, 애프터 쉐이빙 크림 등에 사용할 수 있다. 또한, 의약품, 의약부외품 등에 배합할 수도 있다. 이러한 의약품은 경구, 경피, 근육내, 정맥내 등, 임의의 경로로 투여할 수 있지만, 피부에 직접 작용되는 관점에서는, 경피 투여로 투여하는 것이 바람직하다. 경피 투여로 투여하기 위한, 피부 외용제, 피부 패치 등으로 제형되는 것이 바람직하다. 특히 피부 외용제에 배합할 수 있다. 이들 화장품이나 의약품에 일반적으로 첨가할 수 있는 약제, 예컨대 보습제, 미백제, 산화 방지제, 유성 성분, 자외선 흡수제, 계면 활성제, 증점제, 알코올류, 착색제, 향료, 물, 용매, 방부제, 보존제, pH 조정제, 겔화제, 그 외 활성 성분을 포함할 수 있다.
HEI의 투여에 의해, 필라그린의 유전자 발현량이 증가하고, 또한 피부 배리어 기능의 향상, 수분 함량의 향상이 확인되었다. 이들 작용은, 라미닌 511의 발현 촉진에 의해, 기저막이 안정화한 것에 기인한다고 생각된다. 표피 줄기 세포의 감소는 모든 면에서 표피의 노화 현상에 관계될 수 있다. 표피의 노화란, 일례로서, 수분감의 저하, 피부 거칠음, 색 얼룩 및 피부의 탄력의 저하 등을 들 수 있다. 이들 노화 현상은 각각, 하이알루론산 저하, 피부 배리어 기능의 저하, 염증 야기 및 유두층 섬유나 PDGF-BB의 생성 감소가 원인으로 되어 생기고 있다. 이들 노화 현상은 모두 표피 기저 줄기 세포의 수의 감소 억제 또는 증가 촉진에 의해 해결할 수 있다. 따라서, 라미닌 511 발현 촉진제, 표피 기저막 안정화제 및 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가 촉진제는 각각, 필라그린 유전자 발현 촉진 작용, 피부 배리어 기능 향상 작용, 수분 함량 향상 작용, 하이알루론산 증가 작용, 염증 진정 작용 및 유두층 섬유나 PDGF-BB 생성 촉진 작용으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 작용을 갖는 항노화제라고도 할 수 있다. 또한, 라미닌 511 발현 촉진제, 표피 기저막 안정화제 및 표피 기저 줄기 세포의 감소 억제 또는 증가 촉진제는 각각, 필라그린 유전자 발현 촉진제, 피부 배리어 기능 향상제, 수분 함량 향상제, 하이알루론산 증가제, 염증 진정제 및 유두층 섬유나 PDGF-BB 생성 촉진제라고도 할 수 있다.
실시예
실시예 1: 인간 피부에 있어서의 MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포의 가령 변화 및 자외선의 영향의 측정
샘플
사전 동의를 행한 20대부터 70대의 피험자(20대: 9명, 30대: 10명, 40대: 10명, 50대: 9명, 60대: 10명 및 70대: 9명)의 안면 및 복부의 피부 샘플을 취득하여, AMex법에 따라 냉아세톤을 이용하여 고정하고, 그리고 파라핀에 포매하였다.
포매된 조직을 두께 3 ㎛의 절편으로 하여, 멜라노마 콘드로이틴황산프로테오글리칸(MCSP) 항체(MAB2029, Chemicon, Billerica, MA)를 1차 항체로서 이용하고, 2차 항체로서 Alexa 488 표지 항마우스 IgG 항체(Lifetechnologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 염색하였다. 또한 DAPI를 이용하여 핵 염색을 행하고, 또한 항α6 인테그린 항체(GOH3, SantaCruz, Dallas, TX)를 1차 항체로서 이용하고, 2차 항체로서 Alexa 594 표지 항랫트 IgG 항체(Lifetechnologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 염색하였다. Olympus BX51 현미경을 이용하여 가시화하여, 화상을 DP 컨트롤 디지털 카메라로 취득하였다. 20대의 피험자 및 60대의 안면부 및 복부의 염색 결과를 도 1의 (A)에 나타낸다.
도 1의 (A)의 결과로부터, 20대의 피험자와, 60대의 피험자에게 있어서, 표피 기저층에 존재하는 MCSP 양성의 기저 세포(이하, 표피 기저 줄기 세포라고 함)의 수는, 안면부 및 복부의 양방에서, 가령에 따라 감소하는 것을 알았다. 또한, 동일한 피험자에게 있어서의 안면부(노광부)와 복부(비노광부)의 비교로부터, 안면부(노광부)에 있어서 표피 기저 줄기 세포의 수가 적은 것을 알았다. 또한, 각 피험자에게 있어서, 기저막의 길이에 대한 표피 기저 줄기 세포의 수를 측정하고, 그 평균을 그래프화하여 나타내었다[도 1의 (B)].
다음에, 0세부터 60대의 각 연대의 피험자로부터 취득된 케라티노사이트를 배양 후, 분리·회수하여, RNeasy mini kit(QIAGEN, Tokyo, Japan)를 제품 설명서에 따라 사용하여, mRNA를 추출·정제하였다.
케라티노사이트에 있어서의 MCSP 유전자의 발현량을, Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG(Invitrogen Japan, Tokyo, Japan)를 이용하여 정량적 PCR을 행하였다. 사용한 프라이머는 하기와 같다:
각 연대에 있어서의 발현량의 변화를 도 1의 (C)에 나타낸다.
도 1의 (A)의 결과로부터, 가령과 자외선은 각각, 표피 기저 줄기 세포의 수의 감소에 기여하는 것을 알았다. 또한, 도 1의 (B) 및 (C)의 결과로부터, 가령에 의해, MCSP 양성 세포의 수를 얻으며, MCSP의 발현량도 저하하는 것이 나타났다.
포매된 조직을 두께 3 ㎛의 절편으로 하고, 항라미닌 332 항체(작성: BM165, 마우스 모노클로널 항체), 항라미닌 511 항체(4C7, Abacam, Cambridge, UK) 및 항β1 인테그린 항체(판매원: P5D2, Santa Cruz, CA)를 각각 1차 항체로서 이용하고, 2차 항체로서 Alexa 488 표지 항마우스 IgG 항체(판매원: Lifetechnologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 염색하였다. 또한 DAPI를 이용하여 핵 염색을 행하였다. Olympus BX51 현미경을 이용하여 가시화하고, 화상을 DP 컨트롤 디지털 카메라로 취득하였다. 20대의 피험자 및 60대의 안면부 및 복부의 염색 결과를 도 2의 (A)에 나타낸다.
또한, 각 연대의 피험자로부터 취득된 케라티노사이트를 분리·회수하고, RNeasy mini kit(QIAGEN, Tokyo, Japan)를 제품 설명서에 따라 사용하여, mRNA를 추출·정제하였다. 케라티노사이트에 있어서의 라미닌 α5 유전자의 발현량을, Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG(Invitrogen Japan, Tokyo, Japan)를 이용하여 정량적 PCR을 행하였다. 사용한 프라이머는 하기와 같다:
각 연대에 있어서의 발현량의 변화를 도 2의 (B)에 나타낸다. 도 1의 (A)∼(C) 및 도 2의 (A) 및 (B)의 결과로부터, 가령 및 자외선에 대한 영향에 대해서, 라미닌 551 및 β1 인테그린의 발현량과, 표피 기저 줄기 세포의 수는 동경향을 나타내는 것을 알 수 있었다.
실시예 2: 라미닌 511과, 줄기 세포 마커의 관련
인간 표피 케라티노사이트를, Humedia-KG2 배지(Kurabo Col, Ltd, Japan)를 이용하여, iMatrix-511(와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤)로 코트된 Primeria 플라스크(Coaster, Tokyo, Japan) 중에서 6일 배양하였다. 대조로서, 미코트의 플라스크 중에서 배양하였다. 서브컨플루언트까지 증식한 세포를 트립신(Typsin)(Nakarai co, ltd, Japan)으로 박리하여, iMatrix-511로 코트한 챔버 슬라이드(Thermo Fisher Science, Waltham, MA)에 파종하여, 배양하였다. 대조군은 미코트의 챔버 슬라이드에서 배양하였다.
배양 후, 세포를 4% PFA로 고정하여, MCSP 항체(MAB2029, Chemicon, Billerica, MA)를 1차 항체로서 이용하고, 2차 항체로서 Alexa 488 표지 항마우스 IgG 항체(Lifetechnologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 염색하였다. 또한 DAPI를 이용하여 핵 염색을 행하였다. Olympus BX51 현미경을 이용하여 가시화하여, 화상을 DP 컨트롤 디지털 카메라로 취득하였다. 미코트 대조와 비교하여, iMatrix511 코트군에서는, MCSP 양성 세포가 보다 많이 유지되고 있는 것을 알았다[도 3의 (A)].
다음으로, 배양 후에 배지를 버리고, PBS로 세정하였다. RNeasy mini kit(QIAGEN, Tokyo, Japan)를 제품 설명서에 따라 이용하여, 회수된 세포로부터 mRNA를 추출·정제하였다. 줄기 세포 마커인 CD46, DLL1, Lrig1 및 CD44의 유전자의 발현량을 측정하기 위해, Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG(Invitrogen Japan, Tokyo, Japan)를 이용하여 정량적 PCR을 행하였다. 사용한 프라이머는 하기와 같다:
대조에 있어서의 CD46, DLL1, Lrig1 및 CD44의 유전자의 발현량과 비교하여, 라미닌 511 코트군에서는, CD46, DLL1, Lrig1 및 CD44의 유전자의 발현량이 증가하고 있어[도 3의 (B)], 라미닌 511이 줄기 세포의 유지에 기여하는 것이 나타났다.
실시예 3: 라미닌 분해 억제제의 첨가에 의한 MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포수의 유지
사전 동의를 행한 피험자(20대부터 30대)의 복부의 피부 샘플을 취득하였다. 취득된 샘플을 MMP9 저해제인 CGS270234(10 μM) 및 헤파라나제 저해제인 BIPBIU(10 μM)를 포함하는 배양 배지로 4일간 배양하였다. 배양 배지는 William's E 배지(Thermo Fisher Science, Waltham, MA)를 이용하였다. CGS270234 및 BIPBIU는 각각 하기 화학식에 의해 나타내어지는 화합물이고, MMP9 저해제 및 헤파라나제 저해제로서 사용할 수 있는 것이 알려져 있다[Iriyama S, et al., Exp Dermatol. 2011; 20(11): 953-5].
배양 전의 피부 샘플, 4일간 배양 후의 샘플(대조: 용매 DMSO를 등량 첨가) 및 4일간 배양 후의 샘플(약제 첨가)을, AMex법에 따라 냉아세톤을 이용하여 고정하고, 그리고 파라핀에 포매하였다.
포매된 조직을 3 ㎛의 절편으로 하여, 항라미닌 551 항체(4C7, Abacam, Cambridge, UK)를 1차 항체로서 이용하고, 다음으로 2차 항체로서 Alexa 488 표지 항마우스 IgG 항체(판매원: Lifetechnologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 공염색하였다. 또한 DAPI를 이용하여 핵 염색을 행하였다. 결과를 도 4의 (A)로서 나타낸다. 다음에, 포매된 피부 샘플을, 항MCSP 항체(MAB2029, Chemicon, Billerica, MA)를 1차 항체로서 이용하고, 다음으로 2차 항체로서 Alexa 488 표지 항마우스 IgG 항체(Lifetechnologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 공염색하였다. 또한 DAPI를 이용하여 핵 염색을 행하였다. 결과를 도 4의 (B)로서 나타낸다.
비배양군(Day0)과, 대조의 약제 미첨가군(Day4: 컨트롤)의 비교로부터, 4일간의 조직 배양에 의해, 기저막에 존재하고 있던 라미닌 551이 감소하며, MCSP 양성 세포도 감소하는 것을 알았다. 한편, 라미닌을 분해하는 매트릭스 메탈로프로테이나제 9(MMP9) 및 헤파라나제의 저해제를 첨가하여 배양하면, 라미닌 551이 유지되며, MCSP 양성 세포도 유지되었다.
실시예 4: 라미닌 511 생성 촉진 효과가 있는 약제의 스크리닝
태아로부터 취득된 표피 세포를, Humedia-KG2 배지(Kurabo Col, Ltd, Japan)를 이용하여, iMatrix-511(와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤)로 코트된 Primeria 플라스크(Coaster, Tokyo, Japan) 중에서 6일간 배양하였다. 세포가 서브컨플루언트가 되면, 트립신으로 세포를 박리하여, 6웰 플레이트에 파종하고, 1일 후에 후보 약제를 용해한 배지로 치환하여, 48시간 배양을 행하였다. 후보 약제로서, 화장품 등록 원료 178품(내역: 엑기스류 135품 및 단품 화합물 43품)을 이용하였다. 배지를 버리고, PBS로 세정하여, mRNA를, RNeasy mini kit(QIAGEN, Tokyo, Japan)를, 제품 설명서에 따라 추출·정제하였다. 라미닌 α5, 라미닌 β1 및 라미닌 γ1 유전자의 발현량을, Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG(Invitrogen Japan, Tokyo, Japan)를 이용하여 정량적 PCR을 행하였다. 사용한 프라이머는 하기와 같다:
대조에 있어서의 라미닌 α5, 라미닌 β1 및 라미닌 γ1의 유전자의 발현량과 비교하여, 라미닌 α5, 라미닌 β1 및 라미닌 γ1의 유전자의 발현량을 전부 증가시킨 후보 약제로서, 알제렉스(이치마루파르코스 가부시키가이샤)를 발견하였다.
스크리닝된 알제렉스에 대해서, 약제 농도를 0.001%, 0.01% 및 0.10%로 바꾸어 시험하여, 용량 의존적의 라미닌 511 발현 촉진 효과를 조사하였다. 사용한 세포, 배양 배지, 배양 조건 및 PCR 조건은 실시예 4의 약제 스크리닝 방법에 있어서 사용된 것과 동일하였다. 결과를 도 5의 (A)에 나타낸다. 또한, 동조건으로, 항라미닌 511 항체(판매원: cloud-clone corp)를 사용하여, ELISA에 의해 단백질 정량 해석을 행하였다. 결과를 도 5의 (B)에 나타낸다.
실시예 5: 알제렉스에 의한 피부 개선 기능의 검증
태아로부터 취득된 표피 세포를, Humedia-KG2 배지(Kurabo Col, Ltd, Japan)를 이용하여, iMatrix-511(와코쥰야쿠고교 가부시키가이샤)로 코트된 Primeria 플라스크(Coaster, Tokyo, Japan) 중에서 배양하였다. 세포가 서브컨플루언트가 되면, 트립신으로 세포를 박리하여, 6웰 플레이트에 파종하고, 1일 후에 0.01% 알제렉스를 포함하는 배지로 치환하여, 48시간 배양을 행하였다. 대조로서는, 알제렉스를 포함하지 않는 배지를 이용하였다. 배지를 버리고, PBS로 세정하여, mRNA를, RNeasy mini kit(QIAGEN, Tokyo, Japan)를, 제품 설명서에 따라 추출·정제하였다. 헤파라나제(HPA) 유전자, PDGF-BB 유전자, 하이알루론산 합성 효소 2(HAS2) 유전자, 하이알루로니다제 1(HYAL1) 및 인터류킨 8(IL-8) 유전자의 발현량을, Platinum SYBR Green qPCRsuper MIX-UDG(Invitrogen Japan, Tokyo, Japan)를 이용하여 정량적 PCR을 행하였다. 사용한 프라이머는 하기와 같다:
각각의 발현량의 변화를 도 6의 (A)∼(E)에 나타낸다. 알제렉스는 배양 표피 세포에 있어서, 헤파라나제(HPA) 유전자의 발현을 유의하게 저감시키고(p＜0.01), PDGF-BB 유전자의 발현을 유의하게 증가시키고(p＜0.001), 하이알루론산 합성 효소 2(HAS2) 유전자의 발현을 유의하게 증가시키고(p＜0.01), 하이알루로니다제 1(HYAL1) 유전자의 발현을 유의하게 저감시키고(p＜0.01), 그리고 인터류킨 8(IL-8) 유전자의 발현을 저감시킨다(p＜0.05).
실시예 6: HEI의 라미닌의 분해 억제 및 MCSP 양성 표피 기저 줄기 세포의 유지 효과
사전 동의를 행한 피험자(20대부터 30대)의 복부의 피부 샘플을 취득하였다. 취득된 샘플을 0.01% 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논(HEI, 또는 S-173)을 포함하는 배양 배지로 5일간 배양하였다. 배양 배지는 William's E 배지(Thermo Fisher Science, Waltham, MA)를 이용하였다. 대조는 HEI를 첨가하지 않은 배양 배지를 이용하여 배양하였다. 배양 후의 피부 샘플을, AMex법에 따라 냉아세톤을 이용하여 고정하고, 그리고 파라핀에 포매하였다.
포매된 조직을 3 ㎛의 절편으로 하여, MCSP 항체(MAB2029, Chemicon, Billerica, MA)를 1차 항체로서 이용하고, 2차 항체로서 Alexa 488 표지 항마우스 IgG 항체(Lifetechnologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 염색하였다. 또한 DAPI를 이용하여 핵 염색을 행하고, 또한 항라미닌 551 항체(4C7, Abacam, Cambridge, UK)를 1차 항체로서 이용하고, 2차 항체로서 Alexa 488 표지 항마우스 IgG 항체(Lifetechnologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 염색하였다. Olympus BX51 현미경을 이용하여 가시화하여, 화상을 DP 컨트롤 디지털 카메라로 취득하여 도 7의 (A)에 나타내었다. 배양을 행함으로써, 대조에서는, 라미닌 511이 감소하고, 또한 MCSP 양성 세포수도 감소한다. 한편, 0.01% HEI를 첨가하여 배양한 경우에는, 라미닌 511의 양을 유지할 수 있고, 또한 기저막 상의 MCSP 양성 세포수도 유지할 수 있었다.
실시예 7: HEI의 헤파라나제 저해 작용
헤파라나제 어세이를, Behzad F, et al., Analytical Biochemistry, 320, pp.207-213, 2003에 기재되는 헤파란황산 고정화 플레이트를 이용하여 행하였다. 구체적으로, 헤파란황산(Sieikagaku, Tokyo, Japan)을, Photo-비오틴과 반응시킴으로써, 비오틴화 헤파란황산을 조제하였다. 비오틴화 헤파란황산을, 탄수화물 결합 표면 플레이트(Coastar, Tokyo, Japan) 상에 고정하였다. A431 세포 라이세이트(50 ㎍/㎖)와 함께, 0% HEI, 0.0005% HEI, 0.005% HEI 및 0.05% HEI를 비오틴화 헤파란황산 고정화 플레이트 상에 첨가하여, 3시간 37℃에서 인큐베이트하고, PBS-T로 세정하였다. 그 후, 페록시다아제-아비딘(Vector Laboratories, Inc. CA, USA)과 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액(Bio-Rad, Tokyo, Japan)을 부가하고, 그리고 플레이트를 추가로 실온에서 30분간 인큐베이트하였다. 450 ㎚에서의 흡광도를 계측하여, 헤파라나제의 저해 작용을 결정하였다. HEI는 용량 의존적으로 헤파라나제의 활성을 저해하는 것이 나타났다(도 8).
실시예 8: HEI의 MMP9 저해 작용
MMP9 어세이를, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(Matrix Metalloproteinase-9; MMP-9) 컬러리메트릭 드럭 디스커버리 키트(colorimetric drug discovery kit)(Enzo life sience Inc.)를 이용하여 행하였다. 구체적으로, 재조합 인간 MMP-9 효소의 용액에, 0.0001%, 0.001%, 0.01%가 되도록 HEI를 부가하였다. 크로모제닉 MMP-9 기질 혼합 후, 1분 간격으로 412 ㎚의 흡광도를 측정하였다. 흡광도의 기울기(OD/min)로부터, HEI의 MMP-9 저해율(%)을 산출하였다. HEI는 용량 의존적으로 MMP9의 활성을 저해하는 것이 나타났다(도 9).
실시예 9: HEI의 표피 개선 효과
사전 동의를 행한 피험자(20대부터 30대)의 복부의 피부 샘플을 취득하였다. 취득된 샘플을 0.01% HEI를 포함하는 배양 배지로 5일간 배양하였다. 배양 배지는 William's E 배지(Thermo Fisher Science, Waltham, MA)를 이용하였다. 대조는 HEI를 첨가하지 않는 배양 배지를 이용하여 배양하였다. 배양 후의 피부 샘플에 부착된 여분의 수분을 킴타올로 닦아내고, 5분 정치시킨 후에, Vapometer를 이용하여 TEWL을 측정하고, Corneometer를 이용하여 각층 수분량을 측정하였다. 결과를 도 10의 (B) 및 (C)에 나타낸다. 또한, 배양 후의 피부 샘플을, AMex법에 따라 냉아세톤을 이용하여 고정하고, 그리고 파라핀에 포매하였다.
포매된 조직을 3 ㎛의 절편으로 하여, 필라그린 항체(판매원: AKH-1, Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX)를 1차 항체로서 이용하고, 2차 항체로서 Alexa 488 표지 항마우스 IgG 항체(Lifetechnologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 염색하였다. 또한 DAPI를 이용하여 핵 염색을 행하였다. Olympus BX51 현미경을 이용하여 가시화하고, 화상을 DP 컨트롤 디지털 카메라로 취득하여 도 10의 (A)에 나타내었다.
다음에, 20∼50세의 20명의 남성에 대하여, 1.5% HEI 수용액을 얼굴의 한쪽 면에, 물을 얼굴의 다른 한쪽 면에, 하루 2회 4주간 적용하였다. 적용 전, 적용 후 2주간 및 적용 후 4주간의 시점에서, Vapometer를 이용하여 TEWL을 측정하고, Corneometer를 이용하여 각층 수분량을 측정하였다. 결과를 도 10의 (D) 및 (E)에 나타내었다.
HEI의 첨가군에서는, ex vivo 실험에 있어서, 필라그린의 증가 경향이 보여졌다. 그리고, ex vivo 실험 및 in vivo 실험 중 어느 것에 있어서도, TEWL이 감소함으로써, 피부 배리어 기능이 개선되고, 그리고 각층 수분 함량도 증가하였다.
실시예 10: MMP 저해제 및 헤파라나제 저해제의 첨가에 의한 기저막 직하의 콜라겐의 변화
Bio Predic사로부터 구입한 피부 조직을 피부 조직편으로 하고, CGS27023A(종농도 10-5 M) 및 BIPBIPU(종농도 10-5 M)를 첨가한 William's E 배지 중에서 배양하였다. 대조로서는 이들 저해제를 포함하지 않고 배양을 행하였다. 배지를 매일 교환하여, 배양 5일째에 피부 조직편을 회수하였다. 회수한 피부 조직편을 Zamboni 고정액에 침지하고, 1% 오스뮴으로 후고정하였다. 피부 시료는 에폭시 수지로 포매하였다. 초박 절편을 작성하여, 투과형 전자 현미경(JEOL JEM1230)으로 관찰하였다[도 11의 (A)].
각 군 6개의 피부 절편을 관찰하여, 1절편으로부터 30장 사진을 촬영하였다. 모든 사진의 진피 부위에 존재하는 콜라겐 섬유의 사이즈와 개수를 화상 해석 소프트웨어 「win ROOF 2013」을 이용하여 산출하여 히스토그램을 작성하였다[도 11의 (B)]. 또한, 마찬가지로 화상 해석 소프트웨어 「win ROOF 2013」을 이용하여, 진피의 면적도 추출하여, 진피 중의 콜라겐 섬유의 밀도와, 1개당의 굵기를 산출하여, 평균값을 도출하였다[도 11의 (C)].
실시예 11: V형 콜라겐의 발현
Bio Predic사에서 구입한 피부를 AMeX법에 제공하여, 파라핀 블록을 작성하였다. 3 ㎛의 두께로 절편을 작성하여, V형 콜라겐에 대한 항체(ORIGENE사, Cat#: AM1015PU-N) 및 사이토케라틴 14(K-14)에 대한 항체(Fitzgerald, Cat#; 20R-CP002)를 이용하여 형광 면역 염색을 행하였다(도 12a). 기저막 영역이 사이토케라틴 14에 의해 염색되어 있고, 그 직하에 있어서, V형 콜라겐이 존재하는 것이 나타나고, 가령에 의해 그 양이 감소하였다.
Kurabo사, Bio Predic사로부터 정상 인간 표피 세포 및 정상 인간 섬유아세포를 구입하였다. 각각, 20∼30대의 피험자로부터 취득된 6검체, 50-60대의 피험자로부터 취득된 6검체를 구입하였다. 표피 세포를 무혈청 배지 Humedia-KG2 중에서 배양하여, 섬유아세포를, 10% 혈청을 포함하는 DMEM 배지로 배양하였다. 1회 계대한 후, 각 샘플 6웰 플레이트에 파종하였다. 컨플루언트가 된 후에, 각 세포를 회수하여, cDNA를 조제하고, 하기 프라이머를 이용하여 리얼 타임 PCR에 의해 V형 콜라겐의 유전자 COL5A1의 유전자 발현량을 평가하였다(도 12b). V형 콜라겐은 표피 세포로부터는 발현되지 않고, 섬유아세포로부터 발현되고, 가령에 따라 그 발현량이 저하하는 것이 나타났다.
Bio Predic사에서 구입한 피부 조직을 피부 조직편으로 하고, CGS27023A(종농도 10-5 M) 및 BIPBIPU(종농도 10-5 M)를 첨가한 William's E 배지 중에서 배양하였다. 대조로서는 이들 저해제를 포함하지 않고 배양을 행하였다. 배지를 매일 교환하여, 배양 5일째에 피부 조직편을 회수하였다. 회수한 피부 조직편을 AMeX법에 제공하여, 파라핀 블록을 작성하였다. 3 ㎛의 두께로 절편을 작성하여, V형 콜라겐에 대한 항체(ORIGENE사, Cat#: AM1015PU-N) 및 사이토케라틴 14(K-14)에 대한 항체(Fitzgerald, Cat#; 20R-CP002)를 이용하여 형광 면역 염색을 행하였다(도 13a).
MatTeK사로부터 구입한 피부 3차원 모델(EFT-400)을, CGS27023A(종농도 10-5 M), BIPBIPU(종농도 10-5 M)를 첨가한 전용 배지(EFT400-ASY) 중에서 배양하였다. 대조로서는 이들 저해제를 포함하지 않고 배양을 행하였다. 2일에 1회 배지 교환을 행하고, 7일째에 조직편을 회수하여, AMeX법에 제공하여, 파라핀 블록을 작성하였다. 3 ㎛의 두께로 절편을 작성하여, V형 콜라겐에 대한 항체(ORIGENE사, Cat#: AM1015PU-N) 및 사이토케라틴 14(K-14)에 대한 항체(Fitzgerald, Cat#; 20R-CP002)를 이용하여 형광 면역 염색을 행하였다(도 13a).
피부 3차원 모델을 저해제의 첨가 및 비첨가(대조)군 각각에 있어서 4일간 및 7일간 배양하였다. 배양 후, 표피를 박리하여, 진피만을 Trizol에 넣고, mRNA를 추출하였다. 조속히 cDNA를 작성하고, 전술한 프라이머를 이용하여, 리얼 타임 PCR에 의해 V형 콜라겐의 유전자 COL5A1의 유전자 발현량을 평가하였다(도 13b).
피부 조직의 기관 배양 및 피부 3차원 모델의 양방에 있어서, 대조와 비교하여, MMP 저해제 및 헤파라나제 저해제를 첨가한 경우에 V형 콜라겐의 발현이 증가하였다. 한편, 진피층 전체에서는, MMP 저해제 및 헤파라나제 저해제의 첨가에 의한 V형 콜라겐의 발현에 유의한 변화는 보이지 않았다.
실시예 10의 TEM 화상에 있어서, 기저막 직하에 존재하는 섬유아세포에 주목을 하였다(도 13c). 도 13c의 대조(저해제의 비첨가군)에서는, 섬유아세포 내에서 콜라겐 섬유는 그다지 관찰되지 않는 한편으로, 저해제 첨가군에서는, 섬유아세포 내의 소포 내에 콜라겐 섬유가 관찰된다. 이 소포는 콜라겐 분비 과정인 것이 시사된다. 이에 의해, 기저막 직하의 섬유아세포가, MMP 저해제 및 헤파라나제 저해제의 첨가에 의해, 콜라겐을 적극적으로 생성하고 있는 것이 시사된다.
MatTeK사로부터 구입한 피부 3차원 모델(EFT-400)을, CGS27023A(종농도 10-5 M), BIPBIPU(종농도 10-5 M)를 첨가한 전용 배지(EFT400-ASY) 중에서 배양하였다. 대조로서는 이들 저해제를 포함하지 않고 배양을 행하였다. 배양 2일째, 4일째, 7일째의 배양 상청을 채취하였다. 별도, Bio Predic사로부터 구입한 14개월의 아이로부터 채취한 피부 유래의 정상 인간 섬유아세포를, 10% FBS 첨가 DMEM 중에서 24시간 배양한 배양물에, 피부 3차원 모델의 배양물로부터 채취된 배양 상청을 첨가하였다. 첨가 1일 후에 세포를 회수하고, Trizol로 mRNA를 추출하였다. 조속히 cDNA를 작성하고, 전술한 프라이머를 이용하여, 리얼 타임 PCR에 의해 V형 콜라겐의 유전자 COL5A1의 유전자 발현량을 평가하였다(도 14). 피부 3차원 모델의 배양 상청의 첨가에 의해, V형 콜라겐의 발현이 유의하게 증가하였다. 이에 의해, 피부 3차원 모델의 배양 상청에는, V형 콜라겐의 생성을 촉진하는 인자가 포함되어 있는 것이 시사되었다.
실시예 12: V형 콜라겐 발현을 촉진하는 인자의 탐색
MatTeK사로부터 구입한 피부 3차원 모델(EFT-400)을, CGS27023A(종농도 10-5 M), BIPBIPU(종농도 10-5 M)를 첨가한 전용 배지(EFT400-ASY) 중에서 배양하였다. 배양 2일째, 4일째, 7일째의 피부 모델로부터 표피를 회수하여, 나카라이사 제조 RIPA 버퍼를 사용하여, 단백질 추출액을 조제하였다. Abcam사 제조 멤브레인 어레이 키트(membrane array kit)(ab134002)를 이용하여, 단백질 추출액 중의 각종 사이토카인량을 FUJIFILM사 제조 LAS-1000 UV mini를 이용하여 검출하고, 부속의 소프트웨어로 수치화하여 그래프를 작성하였다(데이터 미게재). 대조와 비교하여, 양이 증대한 사이토카인을, V형 콜라겐 발현을 촉진하는 후보 사이토카인으로서 선별하였다. 이러한 후보 사이토카인으로서, PDGF-BB를 포함하는 3종의 사이토카인을 선별하였다.
R&D사로부터 선별한 리콤비넌트 사이토카인 단백질을 구입하였다. 14개월의 아이로부터 채취한 피부 유래의 정상 인간 섬유아세포를, 10% FBS 첨가 DMEM 중에서 24시간 배양한 배양물에 있어서, 각 사이토카인이 소정의 농도가 되도록 25% 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 첨가한 배지로 치환하고, 추가로 24시간 배양하였다. 배양 후, 세포를 회수하여, Trizol로 mRNA를 추출하였다. 조속히 cDNA를 작성하고, 전술한 프라이머를 이용하여, 리얼 타임 PCR에 의해 V형 콜라겐의 유전자 COL5A1의 유전자 발현량을 평가하였다(도 15). 3종의 사이토카인 중에서, PDGF-BB만이, V형 콜라겐 생성을 유의하게 증가시켰다. 이에 의해, PDGF-BB가, 표피측으로부터 생성되는 사이토카인으로서, 기저막 직하의 섬유아세포에 작용하여 V형 콜라겐 발현을 촉진하는 인자라고 생각된다.
실시예 13: PDGF-BB의 작용 부분과, PDGF-BB의 발현 변화
실시예 11과 동일하게 하여 취득된 파라핀 블록에 대해서, 3 ㎛의 두께로 절편을 작성하고, PDGFR-β에 대한 항체(R&D Systems, Cat#; MAB1263) 및 사이토케라틴 14(K-14)에 대한 항체(Fitzgerald, Cat#; 20R-CP002)를 이용하여 형광 면역 염색을 행하였다(도 16a). 연령에 상관없이, 기저막 직하에, PDGFR-β를 발현하는 세포가 많이 존재하는 것을 알았다. 이에 의해, 기저막 또는 표피측으로부터 분비된 PDGF-BB가, 기저막 직하의 섬유아세포에 작용할 수 있는 것이 확인되었다.
KAC사, Bio Predic사로부터 구입한 각 연령의 정상 인간 표피 세포를 배양하여, mRNA를 추출하였다. 조속히 cDNA를 조제하고, 하기 프라이머를 이용하여 리얼 타임 PCR에 의해 PDGFB의 유전자 발현량을 평가하였다(도 16b).
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Claims (6)

1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 유효 성분으로 하는, 라미닌 511의 발현을 촉진하는 항노화 화장료 조성물.
1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 유효 성분으로 하는, 라미닌 511의 발현 촉진에 의해 표피 기저막 분해를 억제하는 항노화 화장료 조성물.
1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 유효 성분으로 하는, 라미닌 511의 발현 촉진에 의해 표피 줄기 세포의 감소를 억제하거나 또는 증가를 촉진하는 항노화 화장료 조성물.
1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 유효 성분으로 포함하는 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증을 개선하는 항노화 화장료 조성물로서, 1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논이 피부 배리어, 탄력, 수분감 및 염증의 개선을 필요로 하는 대상에 적용되는 것인 항노화 화장료 조성물.
1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 포함하는, IL-8 발현을 억제하는 항노화 화장료 조성물.
1-(2-하이드록시에틸)-2-이미다졸리디논을 포함하는, 염증을 억제하는 항노화 화장료 조성물.
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