CN114981446A - 组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种通过新的构思来评价/筛选优异的保健材料、医药品的新的方法。用于解决上述问题的本发明是一种组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法,其特征在于,包括:在能够表达机械应力信号分子的组织或细胞中应用受试物质的工序;以及对上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位进行评价的工序。
Description
技术领域
本发明涉及组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法。
背景技术
作为各种疾病、老化的原因,指出了构成各组织的细胞功能的降低、变化。作为用于改善这些的药理学的方法,研究了低分子化合物、核酸、蛋白质等作为药物研发材料。但是,由于疾病的种类、症状等,大多也无法得到充分的治疗/改善效果,追求基于新的构思的解决方案。
另一方面,由近年来的研究表明,机械应力控制组织、细胞的功能性,参与老化、病态形成,在以往未开发充分的治疗/改善方法的区域中,正在研究着眼于机械应力的保健材料开发和药物研发的可能性。例如,还研究了心力衰竭的病态生理中的机械应力响应的重要性、基于该重要性的治疗策略(参照非专利文献1)。而且,在药物研发的领域中,还发现了利用肌肉的机械力转导(Mechanotransduction)的机理通过口服而发挥与运动同等的效果的分子(参照非专利文献2)。而且,以血管中的参与机械应力响应的细胞外基质为靶点的血管相关疾病的新的治疗法开发也正在推进(参照非专利文献3)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:心脏,Vol.47,No.12,2015
非专利文献2:生物化学,第81卷,第6号,2009,pp.494-501
非专利文献3:PNAS May 5,2020,117(18)9896-9905
发明内容
发明所要解决的问题
本发明是在该状况下完成的,其目的在于提供一种通过新的构思来评价/筛选优异的保健材料、医药品的新的方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究,结果发现了如下事实,即,存在于皮肤的“张力的平衡状态”(张力平衡)借助特定的机械应力信号来控制皮肤的功能性。在以往的研究成果中,已知由外力引起的暂时性的张力负荷控制细胞的功能性,但本发明人等首次发现接近生物体的状态的持续性的“张力平衡”直接控制皮肤功能。基于这些见解,本发明人等开发了基于新的构思的保健材料、医药品、设备的评价/筛选方法。
发明效果
根据本发明的组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法,能够发现能够将信号传递给构成组织的细胞的保健材料、医药品材料,该信号是与通过在生物体的正常状态下受到的持续性的张力平衡引起的机械应力而得到的信号相同的信号。通过本发明的方法发现的材料能够适当地控制生物体的组织形态、组织功能,因此能够期待对机械应力降低而引起的症状起到效果。例如,对于由老化引起的皱纹、松垂、斑点、透明感降低、毛孔扩大之类的审美性的降低、伤痕、妊娠纹、瘢痕疙瘩之类的皮肤纤维症、上皮细胞癌等的治疗是有用的。
附图说明
图1表示由张力平衡刺激引起的机械应力信号分子的基因表达变化(Dunnett’s T检验*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001)。
图2表示由张力平衡刺激引起的机械应力信号分子的表达、定位变化。
图3表示由张力平衡刺激引起的MRTFA的核内转移率。
图4表示由张力平衡刺激引起的ECM合成相关基因的表达量变化(Dunnett’s T检验*:P<0.001)。
图5表示由张力平衡刺激引起的I型胶原纤维的形成变化。
图6表示由张力平衡刺激引起的KGF基因表达量变化(Dunnett’s T检验*:P<0.001)。
图7表示由张力平衡刺激引起的Ki67阳性细胞分布。
图8表示由张力平衡刺激引起的表皮角化细胞的Ki67阳性增殖细胞率变化(Dunnett’s T检验*:p<0.01,**:p<0.001)。
图9表示由张力平衡刺激引起的真皮成纤维细胞和胶原纤维的形态变化。
图10表示由张力平衡刺激引起的真皮成纤维细胞的核取向性的变化。
图11表示由张力平衡刺激引起的真皮成纤维细胞的胶原纤维的取向性的基于二维傅里叶变换的评价。
图12表示ATRA给药对张力平衡人工皮肤模型的MRTFA基因表达诱导作用(T检验*:P<0.01)。
图13表示基于机械应力信号促进材料的COL1A1、HAS3基因表达诱导作用(Tukey-Kramer检验*:P<0.01,**:P<0.001)。
图14表示基于机械应力信号促进材料的胶原纤维形成促进作用。
图15表示基于Y27632的机械应力信号分子的表达和定位的变化。
图16表示基于机械应力信号抑制材料的MRTFA的核转移率变化。
图17表示基于机械应力信号抑制材料的ECM合成相关基因表达变化(Dunnett’s T检验*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001)。
图18表示基于机械应力信号抑制材料的I型胶原纤维形成变化。
图19表示基于机械应力信号抑制材料的组织形态变化。
具体实施方式
以下,对本发明进行详细说明。需要说明的是,本说明书中使用的术语只要没有特别提及,就以该技术领域中通常使用的含义来解释。
[组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法]
本发明的组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法的特征在于,包括:工序(i),在能够表达机械应力信号分子的组织或细胞中应用受试物质;以及工序(ii),对上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位(intracellularlocalization)进行评价。优选的是,本发明的方法还包括工序(iii),该工序基于上述工序(ii)的结果,对能够用作组织形态、组织功能控制剂的受试物质进行评价/筛选。根据本发明的方法,能够发现能够将信号传递给构成组织的细胞的保健材料、医药品材料,该信号是与通过在生物体的正常状态下受到的持续性的张力平衡引起的机械应力而得到的信号相同的信号。
“机械应力”是指对组织、细胞施加的拉伸、挤压等机械刺激。机械应力是胎儿的出生、年龄增长/老化、代谢、循环器官或运动器官的维持等各种情况下的重要参数。在生物体内,强烈地受到机械应力的是骨骼肌、骨等运动器官、心脏、血管等循环系统、皮肤等。可认为在这些组织中,由于机械应力的增减,其产生、结构维持会引起大的变化。
“机械应力信号分子”是指存在于组织、细胞受到机械应力时激活的拉伸离子通道、整联蛋白等及其下游并传递来自它们的信号的分子。例如,作为在对皮肤施加了机械应力的情况下激活的机械应力信号分子,可列举出YAP/TAZ、糖萼、脂筏/小窝蛋白-1、细胞粘接结构(ITGA2、桥粒、半桥粒、钙粘着蛋白)、离子通道(CaSR/TRP/Piezo)、MRTFA、Rho/ROCK相关分子(ACTA2(αSMA))等,其中,从提高本发明的方法的效率的观点考虑,优选MRTFA、ACTA2(αSMA),特别优选MRTFA。
“组织形态、组织功能控制剂”是指控制组织形态和/或组织功能的制剂。控制组织形态和/或组织功能的制剂根据组织而不同,但例如作为皮肤的情况的控制组织形态的制剂(皮肤形态控制剂),可列举出能够控制皮肤的紧致、纹理等、能够改善/抑制皱纹、松垂等的制剂等。此外,作为皮肤的情况的控制组织功能的制剂(皮肤功能控制剂),可列举出能够促进皮肤的代谢更新(turnover)、提高保湿功能、屏障功能的制剂等。作为本发明中的组织形态、组织功能控制剂,更具体而言,可列举出皮肤形态控制剂、皮肤功能控制剂、皮肤的皱纹/松垂预防剂或改善剂、皮肤的紧致/松弛的降低预防剂或改善剂、皮肤屏障功能改善剂、真皮ECM(extracellular matrix:细胞外基质)形成控制剂、胶原纤维形成控制剂、美白剂、肤色改善剂、纹理改善剂、育发/抑发剂、痤疮治疗剂等。它们可以适合用于抗衰老、护肤用的化妆品、皮肤疾病的治疗药等。
以下,将本发明的组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法分为各工序进行说明。
(i)在能够表达机械应力信号分子的组织或细胞中应用受试物质的工序
在本工序中,准备能够表达受试物质和机械应力信号分子的组织或细胞,将受试物质用于这些组织或细胞。
作为在本工序中使用的组织或细胞,只要是能够表达上述机械应力信号分子的组织或细胞就没有特别限制,可列举出能够表达上述机械应力信号分子或其基因的、从哺乳动物分离出的组织或细胞、或其培养物。具体而言,从哺乳动物采集到的皮肤组织、表皮组织、真皮组织、表皮细胞(表皮角化细胞等)、真皮细胞(真皮成纤维细胞等)、它们的培养物(包含经株化的细胞)、由它们中的任意种构成的人工皮肤模型等。其中,从简便性的观点考虑,优选表皮角化细胞、真皮成纤维细胞。此外,从得到更接近实际的皮肤的结果的方面考虑,优选人工皮肤模型,更优选由表皮角化细胞和真皮成纤维细胞构成的人工皮肤模型。作为这样的人工皮肤,可以是以往公知的市售的人工皮肤,没有特别限定,例如,作为优选的例子,可列举出通过在将正常人真皮成纤维细胞分散接种于胶原蛋白凝胶等并使其固化而制备出的人工真皮上,接种正常人表皮角化细胞并进行气层培养而构建的人工皮肤。进而,作为人工皮肤的状态,可列举出通过将人工真皮的边缘固定在培养容器内,从而在人工皮肤上重现了细胞彼此的张力与天然皮肤同样地达到平衡的状态的张力平衡人工皮肤模型、通过使人工真皮悬浮培养而释放了张力的钟形人工皮肤等,特别优选张力平衡人工皮肤模型。
作为在本工序中使用的组织或细胞,可以使用以表达上述机械应力信号分子或其基因的方式进行了遗传修饰的哺乳动物的组织或细胞、或其培养物。该进行了遗传修饰的哺乳动物的组织或细胞、及其培养物例如可以通过如下方式来制作:在哺乳动物的任意组织或细胞中导入编码上述机械应力信号分子的基因,以该组织或细胞表达上述机械应力信号分子的方式、或者以上述机械应力信号分子的表达得到强化的方式进行转化。或者,也可以使用在上述机械应力信号分子的基因的启动子区域的下游导入了融合有荧光素酶等报告基因的结构体(construct)的细胞或其培养物。作为将这些基因、结构体导入细胞的方法,可以使用以往公知的方法,例如可列举出由电穿孔、脂质体转染等进行的载体导入。
作为在本工序中使用的组织或细胞来源的哺乳动物,例如可列举出:人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、猴子等。其中,优选人。
本工序中的受试物质没有特别限制,可以是天然存在的物质,也可以是通过化学或生物学的方法等合成而得到的物质。此外,上述受试物质也可以是来自低分子化合物、肽、蛋白质、核酸、植物提取物等天然物的萃取物、它们的混合物、包含它们的组合物。
受试物质在能够表达机械应力信号分子的组织或细胞中的应用例如可以通过如下方式进行:预先将受试物质以成为规定的浓度的方式添加到培养基中后,将上述组织或细胞接种到上述培养基中;或者将受试物质以成为规定的浓度的方式添加到接种有上述组织或细胞的培养基中。优选的是,应用受试物质后的组织或细胞在通常的条件下培养,例如在真皮成纤维细胞、表皮角化细胞、人工皮肤模型的情况下,在25℃~37℃下培养8小时~240小时左右,优选在24小时~120小时左右的条件下培养。
受试物质的添加浓度根据受试物质的种类而设定为适当的浓度即可,例如为0.00001%~10%(w/v)的范围等。
培养上述组织或细胞的培养基可以适当选择适于所使用的组织、细胞的培养基,例如可列举出:例如含有或不含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基等,但并不限定于此。
(ii)对上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位进行评价的工序
在本工序中,为了进行上述工序(i)中应用的受试物质的评价/筛选,测定上述受试物质的上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位的变化。
作为上述机械应力信号分子的表达,可以是编码机械应力信号分子的基因的表达水平,也可以是机械应力信号分子(蛋白)自身的表达水平。基因的表达水平、蛋白的表达水平的测定可以按照公知的方法进行。关于基因的表达水平,在以mRNA水平进行检测的情况下,例如从细胞中提取出总RNA后,可以使用实时RT-PCR法、RNA分解酶保护试验法、DNA阵列法、NORTHERN印迹分析法等,对从机械应力信号分子基因转录而得到的mRNA进行检测定量。蛋白的表达水平的测定例如可以通过RIA法、ELISA、生物测定法、WESTERN印迹法等通常的免疫测定法来进行。WESTERN印迹法廉价且简便,因此优选。
上述机械应力信号分子的活性的测定可以通过适当的方法对各分子进行。例如,可以通过基于RT-PCR的RNA转录量的定量化、基于WESTERN印迹的特定的分子的磷酸化的检测、基于报告基因导入的荧光/发光量检测的分子活性的检测来进行。
机械应力信号分子的细胞内定位可以进行使用了与各分子特异性结合的抗体的免疫组织染色等来确认,由受试物质带来的影响(转录因子的核内转移、细胞骨架分子的聚合水平、细胞膜上的整合素亚型的变化等)可以通过与对照进行比较而得到的图像解析等来判定。
(iii)基于上述工序(ii)的结果,对能够用作组织形态、组织功能控制剂的受试物质进行评价/筛选的工序
在本工序中,基于上述工序(ii)的、上述受试物质的上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位的变化的测定结果,评价并选定该受试物质是否为能够用作组织形态、组织功能控制剂的物质。
在本工序中,评价该受试物质是否是能够用作组织形态、组织功能控制剂的物质并选定时,将应用了受试物质的上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位与对照组进行比较。作为上述对照组,可列举出与试验组相同的上述组织或细胞且未应用受试物质的对照组、仅应用了受试物质的溶剂的对照组等。对照组中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位也可以通过与工序(ii)中说明的方法同样的方法进行测定/检测。
在试验组中的机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平比对照组高的情况下,将该受试物质选为增强机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的物质。例如,在试验组中的表达或活性水平相对于对照组中的表达或活性水平在统计学上显著增加的情况下,将受试物质选为增强机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的物质。具体而言,在将对照组中的表达或活性水平设为100%时,在试验组中的表达或活性水平为110%以上、优选为130%以上、进一步优选为150%以上的情况下,可以将受试物质选为增强机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的物质。选择后的受试物质可以被选为皮肤形态控制剂、皮肤功能控制剂、皮肤的皱纹/松垂预防剂或改善剂、皮肤的紧致/松弛的降低预防剂或改善剂、皮肤屏障功能改善剂、真皮ECM形成控制剂或胶原纤维形成控制剂、美白剂、肤色改善剂、纹理改善剂、育发/抑发剂、痤疮治疗剂等,或者选为它们的候选物质。这些物质例如适合用作以抗衰老为目的的化妆品、护肤产品等。
在试验组中的机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平比对照组低的情况下,将该受试物质选为降低机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的物质。例如,在试验组中的表达或活性水平相对于对照组中的表达或活性水平在统计学上显著降低的情况下,将受试物质选为降低机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的物质。此外,在将对照组中的表达或活性水平设为100%时,在试验组中的表达或活性水平为90%以下、优选为70%以下、进一步优选为50%以下的情况下,将受试物质选为降低机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的物质。选择后的受试物质可以被选为皮肤形态控制剂、皮肤功能控制剂、真皮ECM形成控制剂、胶原纤维形成控制剂,或者选为它们的候选物质。这些物质例如对伤痕、妊娠纹、瘢痕疙瘩之类的皮肤纤维症、上皮细胞癌的治疗等有效。
在本发明的方法中,可以根据需要对在上述步骤中选择后的物质进行进一步的筛选。获取上述工序(iii)中被选为增强或降低机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的物质、使细胞内定位变化的物质的受试物质作为本发明的制剂的候选物质。接着,将这些候选物质给药至能够表达机械应力信号分子的组织或细胞(皮肤组织、表皮组织、真皮组织、表皮角化细胞、真皮成纤维细胞、或它们的培养物、或由它们中的任意种构成的人工皮肤模型)后,对ECM合成功能、I型胶原蛋白合成功能、表皮角化细胞增殖能力促进功能和由其引起的代谢更新促进功能、表皮角化细胞的增殖促进功能、维持胶原纤维在与张力方向相同的水平方向上排列而成的取向性的功能等进行测定/确认,根据需要与对照组进行比较,由此能够选出更优异的受试物质。需要说明的是,ECM合成功能、I型胶原蛋白合成功能、表皮角化细胞增殖能力促进功能和由其引起的代谢更新促进功能、表皮角化细胞的增殖促进功能、维持胶原纤维在与张力方向相同的水平方向上排列的取向性的功能可以通过RT-PCR、微阵列、免疫测定法、WESTERN印迹法、免疫组织染色等公知的方法来测定。
[组织形态、组织功能控制用设备的评价方法]
本发明的组织形态、组织功能控制用设备的评价方法的特征在于,包括:工序(i),在能够表达机械应力信号分子的组织或细胞中应用由测试设备产生的机械应力负荷;以及工序(ii),对上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位进行评价。优选的是,本发明的方法还包括工序(iii),该工序基于上述工序(ii)的结果,对上述测试设备是否能够用作组织形态、组织功能控制用设备进行评价。根据本发明的方法,能够对能将与在生物体的正常状态下受到的持续性的张力平衡引起的机械应力所得到的信号相同的信号传递给构成组织的细胞的保健用设备、医疗用设备适当地进行评价。
“组织形态、组织功能控制用设备”是指为了控制组织形态和/或组织功能而负荷机械应力,具体而言是指施加挤压刺激、超声波刺激、对其他组织施加物理刺激的装置、机械、设备等。用于适当地控制组织形态和/或组织功能的设备根据应用的组织而不同,例如在皮肤的情况下,可列举出能够控制皮肤的紧致、纹理等、能够改善/抑制皱纹、松垂等的设备。此外,作为皮肤的情况的控制组织功能的设备,可列举出能够促进皮肤的代谢更新、提高保湿功能、屏障功能的设备。更具体而言,本发明中的组织形态、组织功能控制用设备是能够期待皮肤形态控制、皮肤功能控制、皮肤的皱纹/松垂预防或改善、皮肤的紧致/松弛的降低预防或改善、皮肤屏障功能改善、真皮ECM形成控制、胶原纤维形成控制、美白、肤色改善、纹理改善、育发/抑发、痤疮治疗等的设备。它们可以出于抗衰老、护肤、皮肤疾病的治疗等的目的而适当地使用。
以下,将本发明的组织形态、组织功能控制用设备的评价方法分为各工序进行说明。
(i)在能够表达机械应力信号分子的组织或细胞中应用由测试设备产生的机械应力负荷的工序
在本工序中,准备测试设备、以及能够表达机械应力信号分子的组织或细胞,将由测试设备产生的机械应力负荷应用于这些组织或细胞。
关于本工序中使用的组织或细胞的说明,可以直接应用上述组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法的项中的说明。
本工序中的测试设备没有特别限制,是指能够负荷挤压刺激、超声波刺激、对其他皮肤负荷物理刺激的所有设备。
由测试设备产生的机械应力负荷在能够表达机械应力信号分子的组织或细胞中的应用根据各设备的规格来进行。
(ii)对上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位进行评价的工序
在本工序中,为了进行上述工序(i)中应用的测试设备(产生的机械应力负荷)的评价,测定上述测试设备中的机械应力负荷引起的上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位的变化。需要说明的是,关于上述机械应力信号分子的表达、活性、细胞内定位的说明,可以直接应用上述组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法的项中的说明。
(iii)对上述测试设备是否能够用作组织形态、组织功能控制用设备进行评价的工序
在本工序中,基于上述工序(ii)的、上述设备中的机械应力负荷引起的上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位的变化的测定结果,对该测试设备作为组织形态、组织功能控制用设备是否有效进行评价。
在本工序中,评价该受试物质是否能够用作组织形态、组织功能控制用设备时,将应用了设备中的机械应力负荷的上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位与对照组进行比较。作为上述对照组,可列举出与试验组相同的未对上述组织或细胞应用机械应力负荷的对照组。对照组中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位也可以通过与工序(ii)中说明的方法同样的方法进行测定/检测。
在试验组中的机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平比对照组高的情况下,将该测试设备(或由其引起的机械应力负荷的条件)选为增强机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的设备(或上述条件)。例如,在试验组中的表达或活性水平相对于对照组中的表达或活性水平在统计学上显著增加的情况下,将上述测试设备(或上述条件)选为增强机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的设备(或上述条件)。具体而言,在将对照组中的表达或活性水平设为100%时,在试验组中的表达或活性水平为110%以上、优选为130%以上、进一步优选为150%以上的情况下,可以将上述测试设备(或上述条件)评价为增强机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的设备(或上述条件)。评价后的测试设备可以适当地用作皮肤形态控制、皮肤功能控制、皮肤的皱纹/松垂预防或改善、皮肤的紧致/松弛的降低预防或改善、皮肤屏障功能改善、真皮ECM形成控制或胶原纤维形成控制、美白、肤色改善、纹理改善、育发/抑发、痤疮治疗用等。这些设备(或上述条件)可以用于抗衰老、护肤等美容目的、或痤疮治疗用等医疗目的。
在试验组中的机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平比对照组低的情况下,将该测试设备(或由其引起的机械应力负荷的条件)选为降低机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的设备(或上述条件)。例如,试验组中的表达或活性水平相对于对照组中的表达或活性水平在统计学上显著降低的情况下,将上述测试设备(或上述条件)选为降低机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的设备(或上述条件)。此外,在将对照组中的表达或活性水平设为100%时,在试验组中的表达或活性水平为90%以下、优选为70%以下、进一步优选为50%以下的情况下,可以将设备(或上述条件)选为降低机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的设备(或上述条件)。评价后的设备(或上述条件)可以适当地用于皮肤形态控制、皮肤功能控制、真皮ECM形成控制、胶原纤维形成控制用等美容目的。此外,这些设备(或上述条件)也可以适当地用于例如伤痕、妊娠纹、瘢痕疙瘩之类的皮肤纤维症、上皮细胞癌的治疗等医疗目的。
在本发明的方法中,可以根据需要对在上述步骤中评价后的设备进行进一步的评价。将在上述工序(iii)中评价为增强或降低机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的设备(或上述条件)、使细胞内定位变化的设备(或上述条件)的设备(或上述条件)应用于能够表达机械应力信号分子的组织或细胞(皮肤组织、表皮组织、真皮组织、表皮角化细胞、真皮成纤维细胞、或它们的培养物、或由它们中的任意种构成的人工皮肤模型)后,对ECM合成功能、I型胶原蛋白合成功能、表皮角化细胞增殖能力促进功能和由其引起的代谢更新促进功能、表皮角化细胞的增殖促进功能、维持胶原纤维在与张力方向相同的水平方向上排列而成的取向性的功能等进行测定/确认,根据需要与对照组进行比较,由此能够评价/选出更优异的设备(或上述条件)。需要说明的是,ECM合成功能、I型胶原蛋白合成功能、表皮角化细胞增殖能力促进功能和由其引起的代谢更新促进功能、表皮角化细胞的增殖促进功能、维持胶原纤维在与张力方向相同的水平方向上排列而成的取向性的功能可以通过RT-PCR、微阵列、免疫测定法、WESTERN印迹法、免疫组织染色等公知的方法来测定。
[本发明的用途]
如上所述,通过本发明的评价/筛选方法选择出的皮肤形态控制剂、皮肤功能控制剂、皮肤的皱纹/松垂预防剂或改善剂、皮肤的紧致/松弛的降低预防剂或改善剂、皮肤屏障功能改善剂、真皮ECM形成控制剂、胶原纤维形成控制剂、美白剂、肤色改善剂、纹理改善剂、育发/抑发剂可以适当地用于抗衰老(皱纹/松垂/斑点/透明感降低/毛孔扩大等的预防/改善)、保湿、美白、促进皮肤的代谢更新等追求护肤的化妆品、准医药品、口服剂。此外,也可以适当地用于伤痕、妊娠纹、瘢痕疙瘩之类的皮肤纤维症、上皮细胞癌的治疗剂、痤疮治疗剂等医药品。
此外,如上所述,通过本发明的评价方法而评价/选择后的皮肤形态控制用设备、皮肤功能控制用设备、皮肤的皱纹/松垂预防用设备或改善用设备、皮肤的紧致/松弛的降低预防用设备或改善用设备、皮肤屏障功能改善用设备、真皮ECM形成控制用设备、胶原纤维形成控制、美白、肤色改善、纹理改善、育发/抑发用设备可以适当地用作以抗衰老(皱纹/松垂/斑点/透明感降低/毛孔扩大等预防/改善)、保湿、美白、促进皮肤的代谢更新等护肤为目的的美容设备等保健设备。此外,也可以适当地用作伤痕、妊娠纹、瘢痕疙瘩之类的皮肤纤维症、上皮细胞癌、痤疮的治疗用的医疗用设备。
通过本发明的评价/筛选方法选择出的上述制剂通过与美容治疗(treatment)设备等保健设备、按摩、放松等治疗方法组合使用,能够进一步提高效果。此外,在治疗方法的开发中也能够应用本发明的筛选方法、评价方法中的构思。即,在上述治疗方法中,也能够开发增强或降低对象细胞中的机械应力信号分子或其基因的表达或活性水平的、使细胞内定位变化为优选的方向的方法。
实施例
以下,通过实施例对本发明更详细地进行说明,但本发明不受这些实施例的任何限定。
[实施例1]由张力平衡刺激引起的机械应力信号分子的表达、定位变化
使用含有10ng/ml bFGF(Peprotech公司)、10%胎牛血清以及1%青霉素/链霉素的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific株式会社),使用经组织培养包被(coating)的培养皿对正常人真皮成纤维细胞(仓敷纺绩株式会社)进行扩大培养。使用Humedia-KG2培养基(仓敷纺绩株式会社),使用经组织培养包被的培养皿对正常人表皮角化细胞(仓敷纺绩株式会社)进行扩大培养。在将正常人真皮成纤维细胞分散接种于胶原蛋白凝胶(株式会社高研)并使其固化而成的人工真皮上接种正常人表皮角化细胞,使用含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、5μg/ml胰岛素(富士胶片和光纯药株式会社)、1mM抗坏血酸磷酸镁(富士胶片和光纯药株式会社)、10ng/ml bFGF(Peprotech公司)、1μM氢化可的松(富士胶片和光纯药株式会社)的人工皮肤维持培养基进行气层培养,由此构建人工皮肤。在构建人工皮肤时,通过以往的普通的人工皮肤的构建方法,即,将人工真皮的边缘与通过使人工真皮悬浮培养而释放了张力的钟形人工皮肤固定在培养容器内,由此构建了在人工皮肤上重现了细胞彼此的张力与天然皮肤同样地达到平衡的状态的张力平衡人工皮肤模型。进而,在气层培养5天后,将张力平衡人工皮肤模型从培养容器中切离,由此制作了释放了张力的张力释放人工皮肤模型。
对于钟形人工皮肤、张力平衡人工皮肤模型、张力释放人工皮肤模型这三者,在气层培养第7天采集组织。采集到的组织的一部分立即使用RNeasy Plus mini kit(株式会社QIAGEN),按照所附带的实验方案回收总RNA。使用SuperScript VILO(Thermo FisherScientific株式会社),按照所附带的实验方案由所得到的总RNA逆转录cDNA。机械应力信号基因即ITGA2、MRTFA、ACTA2(αSMA)的实时PCR使用SYBR Premix Ex Taq II或TaqMan(注册商标)基因表达分析系统(Thermo Fisher Scientific株式会社),利用AppliedBiosystems QuantStudio 12K Flex(Thermo Fisher Scientific株式会社)实施。测定出的各基因的表达数值设定GAPDH作为内源基因表达对照,利用ΔΔCT法进行校正。
进而,采集到的组织的一部分立即在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定,通过常规方法制作石蜡切片标本,按下述的步骤进行以下的各机械应力信号分子的免疫组织染色。
·ITGA2
使用兔抗人ITGA2抗体(Abcam.plc)和Alexa Fluor 594标记抗兔IgG抗体(ThermoFisher Scientific株式会社)进行免疫组织染色。染色组织的核使用Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行染色,使用共聚焦显微镜观察核(激发波长:350nm、观察波长470nm)、以及ITGA2表达(激发波长594nm、观察波长620nm)的总量和定位。
·MRTFA
使用兔抗人MRTFA抗体(Abcam.plc)和Alexa Fluor 594标记抗兔IgG抗体(ThermoFisher Scientific株式会社)进行免疫组织染色。染色组织的核使用Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行染色,使用共聚焦显微镜观察核(激发波长:350nm、观察波长470nm)、以及MRTFA表达(激发波长594nm、观察波长620nm)的总量和定位。进而,MRTFA的核内转移量通过使用ImageJ的图像解析,计算出Hoechst阳性的核区域中的Alexa594的荧光信号强度的平均值,由此进行定量评价。
·αSMA
使用兔抗人αSMA抗体(Abcam.plc)和Alexa Fluor 594标记抗兔IgG抗体(ThermoFisher Scientific株式会社)进行免疫组织染色。染色组织的核使用Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行染色,使用共聚焦显微镜观察核(激发波长:350nm、观察波长470nm)、以及αSMA表达(激发波长594nm、观察波长620nm)的总量和定位。
图1是绘制出各人工皮肤模型中的机械应力信号基因的表达量的图。张力平衡人工皮肤模型与没有张力平衡刺激的其他两个模型相比,显示出统计学上显著高的ITGA2、MRTFA、ACTA2(αSMA)的基因表达量。
将各人工皮肤模型中的机械应力信号分子的免疫组织染色图像示于图2。张力平衡人工皮肤模型与没有张力平衡刺激的其他两个模型相比,ITGA2、MRTFA、ACTA2(αSMA)的表达量增加。
图3是绘制出通过对免疫组织染色图像进行图像解析来对每一个细胞的MRTFA的核内转移量进行定量评价的结果的图。张力平衡人工皮肤模型与没有张力平衡刺激的其他两个模型相比,观察到统计学上显著高的ITGA2、MRTFA、ACTA2(αSMA)的核内转移。
由以上可知,在反映了实际的良好的皮肤状态的张力平衡人工皮肤模型中,与没有张力平衡刺激的其他两个模型相比,促进了机械应力信号分子(ITGA2、MRTFA、ACTA2(αSMA))的表达。
[实施例2]由张力平衡刺激的调节引起的皮肤构成细胞的功能性的控制
与实施例1同样地制作钟形人工皮肤模型、张力平衡人工皮肤模型、张力释放人工皮肤模型。
对于钟形人工皮肤、张力平衡人工皮肤模型、张力释放人工皮肤模型这三种,在气层培养第7天采集组织,通过与实施例1同样的方法从各组织回收总RNA并进行实时PCR。所解析的基因是作为真皮的功能即ECM合成功能的相关基因的COL1A1、COL1A2、FBN1、ELN、MMP1、以及作为表皮的代谢更新功能即表皮角化细胞增殖控制基因的KGF。测定出的各基因的表达数值设定GAPDH作为内源基因表达对照,利用ΔΔCT法进行校正。
进而,采集到的组织的一部分立即在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定,通过常规方法制作石蜡切片标本,按下述的步骤进行与ECM合成功能相关的I型胶原蛋白、以及作为表皮角化细胞的增殖标记物的Ki67的免疫组织染色。
·COL1
使用兔抗人I型胶原蛋白抗体(Abcam.plc)和Alexa Fluor 594标记抗兔IgG抗体(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行免疫组织染色。染色组织的核使用Hoechst33342(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行染色,使用共聚焦显微镜观察核(激发波长:350nm、观察波长470nm)、以及COL1表达(激发波长594nm、观察波长620nm)的总量和定位。
·Ki67
使用大鼠抗人ki67抗体(Abcam.plc)和Alexa Fluor 594标记抗大鼠IgG抗体(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行免疫组织染色。染色组织的核使用Hoechst33342(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行染色,使用共聚焦显微镜观察核(激发波长:350nm、观察波长470nm)、以及Ki67表达(激发波长594nm、观察波长620nm)。进而,通过目视对Ki67的阳性细胞数量进行计数。
进而,采集到的组织的一部分立即在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定,通过常规方法制作冷冻切片标本,按照Lynch,B.等的方法实施基于二次谐波产生成像进行的I型胶原纤维的立体结构拍摄。成纤维细胞的核的取向性通过使用Image J对核的荧光图像进行椭圆近似,测定其主轴的斜率来评价。此外,真皮的I型胶原蛋白的取向性通过Image J的FFT功能和使用了Oval profile plug-in的二维快速傅里叶变换分析来评价。
图4是绘制出各人工皮肤模型中的真皮的功能即ECM合成功能的相关基因的表达量的图。相对于没有张力的钟形人工皮肤,在进行了张力平衡刺激的张力平衡皮肤模型中,作为编码ECM的构成纤维性蛋白质的基因的COL1A1、COL1A2、FBN1、ELN的表达上升,作为胶原蛋白分解酶的MMP1的表达降低,因此显示出由张力平衡刺激引起的ECM合成功能的提高。此外,就张力释放模型而言,与张力平衡模型相比,作为编码ECM的构成纤维性蛋白质的基因的COL1A1、COL1A2、FBN1、ELN的表达降低,作为胶原蛋白分解酶的MMP1的表达上升,因此显示出由张力平衡的释放引起的ECM合成功能的降低。
将各人工皮肤模型中的I型胶原蛋白的免疫组织染色图像示于图5。相对于没有张力的钟形人工皮肤,在进行了张力平衡刺激的张力平衡皮肤模型中,I型胶原蛋白的表达上升,显示出由张力平衡刺激引起的I型胶原蛋白合成功能的提高。此外,就张力释放模型而言,与张力平衡模型相比,I型胶原蛋白的表达降低,因此显示出由张力平衡的释放引起的I型胶原蛋白合成功能的降低。
图6是绘制出各人工皮肤模型中的表皮的代谢更新功能即作为表皮角化细胞增殖控制基因的KGF的表达量的图。相对于没有张力的钟形人工皮肤,在进行了张力平衡刺激的张力平衡皮肤模型中,KGF的表达上升,因此表明由张力平衡刺激引起的表皮角化细胞能力增殖促进作用和其引起的代谢更新促进作用。
将各人工皮肤模型中的增殖细胞标记物Ki67的免疫组织染色图像示于图7。此外,将Ki67阳性细胞数量的计数结果标示于图8。相对于没有张力的钟形人工皮肤,在进行了张力平衡刺激的张力平衡皮肤模型中,Ki67的表达细胞数量增加,显示出由张力平衡刺激引起的表皮角化细胞的增殖促进作用。此外,就张力释放模型而言,与张力平衡模型相比,Ki67阳性细胞数量减少,因此显示出由张力平衡的释放引起的表皮角化细胞的增殖抑制作用。
将各人工皮肤模型的成纤维细胞的核、细胞膜、细胞骨架、胶原纤维的形态示于图9。进而,将对该核的取向性进行分析的结果示于图10。与没有张力的钟形人工皮肤相比,在张力平衡皮肤模型中观察到核在与张力方向相同的水平方向上排列而成的取向性。通过张力释放,该取向性丧失,变化为与钟形人工皮肤类似的结构。此外,将利用二维快速傅里叶变换对胶原纤维的取向性进行分析的结果示于图11。在没有张力的钟形人工皮肤中观察到不具有取向性的胶原纤维的凝集块,另一方面,在进行了张力平衡刺激的张力平衡皮肤模型中观察到胶原纤维在与张力方向相同的水平方向上排列而成的取向性。通过张力释放,该取向性丧失,变化为与钟形人工皮肤类似的结构。
如上所述,在张力平衡人工皮肤模型中,确认到ECM合成功能的提高、I型胶原蛋白合成功能的提高、表皮角化细胞能力增殖促进和由其引起的代谢更新促进、表皮角化细胞的增殖促进、胶原纤维在与张力方向相同的水平方向上排列而成的取向性。可认为:在反映了实际的良好的皮肤状态的张力平衡人工皮肤模型中,通过张力平衡促进了机械应力信号分子(ITGA2、MRTFA、ACTA2(αSMA))的表达,与此同时,维持了在上述那样的正常皮肤组织中观察到的ECM合成功能的提高、I型胶原蛋白合成功能的提高、表皮角化细胞能力增殖促进和其引起的代谢更新促进、表皮角化细胞的增殖促进、胶原纤维在与张力方向相同的水平方向上排列而成的取向性。
[实施例3]机械应力信号活性化材料的筛选和皮肤功能性评价
对于与实施例1同样地制作的钟形人工皮肤、张力平衡人工皮肤模型、张力释放人工皮肤模型这三者,在气层培养3天后,将培养基更换为含有1%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、5μg/ml胰岛素(富士胶片和光纯药株式会社)、1μM氢化可的松(富士胶片和光纯药株式会社)的药物评价用培养基,预培养48小时。之后,更换为含有作为机械应力激活材料的10μM的ATRA(all-trans retinoic acid)的药物评价用培养基,培养6~48小时。
培养完成后采集组织。通过与实施例1同样的方法从各组织回收总RNA并进行实时PCR。解析了表达的基因是作为机械应力信号基因的MRTFA、ACTA2、以及作为ECM合成功能的相关基因的COL1A1、HAS3。测定出的各基因的表达数值设定GAPDH作为内源基因表达对照,利用ΔΔCT法进行校正。
进而,采集到的组织的一部分立即在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定,通过常规方法制作石蜡切片标本,按下述的步骤进行I型胶原蛋白的免疫组织染色。
·I型胶原蛋白
使用兔抗人I型胶原蛋白抗体(Abcam.plc)和Alexa Fluor 594标记抗兔IgG抗体(Invitrogen)进行免疫组织染色。染色组织的核使用Hoechst33342(Thermo FisherScientific株式会社)进行染色,使用共聚焦显微镜观察核(激发波长:350nm、观察波长470nm)、以及I型胶原蛋白表达(激发波长594nm、观察波长620nm)的总量和定位。
图12是绘制出对于ATRA给药的各人工皮肤模型的MRTFA基因表达变动的图。确认到:通过ATRA给药,仅在张力平衡人工皮肤模型中显著的MRTFA基因表达量的增加。
图13是绘制出对于ATRA给药的各人工皮肤模型的COL1A1、HAS3基因表达变动的图。关于COL1A1基因,确认到:仅在张力平衡人工皮肤中与对照组相比,由ATRA给药引起的显著的基因表达的促进。关于HAS3基因,确认到:与所有对照组相比,由ATRA给药引起的基因表达的显著的促进,但其表达促进比率在张力平衡人工皮肤中显示出最高的数值。
将张力平衡皮肤模型的I型胶原蛋白的免疫组织染色图像示于图14。确认到:与对照组相比,ATRA给药组中I型胶原蛋白的表达量增加,促进了胶原纤维形成。
如上所述,通过将皮肤细胞中的机械应力信号基因的表达促进作为指标,能够发现促进接近生物体环境的条件下的胶原纤维形成的材料(在本实施例中为ATRA)。特别是能确认到:使用反映了实际的皮肤状态的张力平衡人工皮肤模型时,能够更高效地进行评价/筛选。
[实施例4]基于机械应力信号抑制材料的皮肤功能性评价
对于与实施例1同样地制作的钟形人工皮肤、张力平衡人工皮肤模型、张力释放人工皮肤模型这三者,在气层培养3天后,将培养基更换为含有1%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、5μg/ml胰岛素(富士胶片和光纯药株式会社)、1μM氢化可的松(富士胶片和光纯药株式会社)的药物评价用培养基,预培养48小时。之后,更换为含有作为机械应力抑制材料的10nM的Y-27632(R&D系统公司)的药物评价用培养基,培养6小时~48小时。
培养完成后采集组织。通过与实施例1同样的方法从各组织回收总RNA并进行实时PCR。解析了表达的基因是作为ECM合成功能的相关基因的COL1A1、COL1A2、FBN1、ELN、MMP1。测定出的各基因的表达数值设定GAPDH作为内源基因表达对照,利用ΔΔCT法进行校正。
进而,采集到的组织的一部分立即在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定,通过常规方法制作石蜡切片标本,进行机械应力信号分子(ITGA2,MRTFA,αSMA)和I型胶原蛋白的免疫组织染色。对于机械应力信号分子(ITGA2,MRTFA,αSMA),与实施例1同样地进行,对于I型胶原蛋白按下述的步骤进行。此外,肌动蛋白细胞骨架和细胞膜按照下述的步骤进行观察。
·I型胶原蛋白
使用兔抗人I型胶原蛋白抗体(Abcam.plc)和Alexa Fluor 594标记抗兔IgG抗体(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行免疫组织染色。染色组织的核使用Hoechst33342(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行染色,使用共聚焦显微镜观察核(激发波长:350nm、观察波长470nm)、以及I型胶原蛋白表达(激发波长594nm、观察波长620nm)的总量和定位。
·肌动蛋白细胞骨架和细胞膜
使用Alexa594标记鬼笔环肽(Thermo Fisher Scientific株式会社)和Alexa488标记WGA(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行荧光组织染色。染色组织的核使用Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific株式会社)进行染色,使用共聚焦显微镜观察核(激发波长:350nm、观察波长470nm)、肌动蛋白细胞骨架(激发波长594nm、观察波长620nm)、以及细胞膜(激发波长488nm、观察波长535nm)。
图15表示对于Y27632给药的各人工皮肤模型的机械应力信号分子的免疫组织染色图像。确认到通过对张力平衡模型进行Y27632给药,ITGA2、MRTFA、αSMA的表达量与张力释放模型同等程度地减少。
图16表示MRTFA的核转移率的图像解析的结果。通过Y27632给药,MRTFA的核转移率显著降低,因此确认到由Y27632引起的机械应力信号的抑制作用。
图17是绘制出对于ATRA给药的各人工皮肤模型的COL1A1、COL1A2、FBN1、ELN、MMP1的基因表达变动的图。通过对张力平衡模型进行Y27632给药,参与ECM合成的COL1A1、COL1A2、FBN1、ELN的基因表达显著得到抑制,达到与张力释放人工皮肤相同程度的水准。进而,通过Y27632给药,参与ECM分解的MMP1的基因表达显著增加,达到与张力释放人工皮肤相同程度的水准。
将I型胶原蛋白的免疫组织染色图像示于图18。确认到:通过对张力平衡人工皮肤进行Y27632给药,I型胶原蛋白的表达量与张力释放模型相同程度地降低,胶原纤维形成得到抑制。
将细胞骨架和细胞膜的荧光染色图像示于图19。确认到:通过对张力平衡人工皮肤进行Y27632给药,细胞骨架、细胞膜、核的张力方向上的取向性与张力释放模型相同程度地降低,组织的取向性混乱。
如上所述,通过将皮肤细胞中的机械应力信号基因的表达抑制作为指标,能够发现在胶原纤维形成的抑制、ECM分解的促进、组织的取向性的降低的方向发挥作用的材料(在本实施例中为Y27632)。特别是能确认到:使用反映了实际的皮肤状态的张力平衡人工皮肤模型时,能够更高效地进行评价/筛选。
产业上的可利用性
根据本发明的组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法,能够发现能够将信号传递给构成组织的细胞的保健材料、医药品材料,该信号是与通过在生物体的正常状态下受到的机械应力而得到的信号相同的信号。通过本发明的方法发现的材料能够适当地控制生物体的组织形态、组织功能,因此能够期待对机械应力降低而引起的症状起到效果。例如,对于由老化引起的皱纹、松垂、斑点、透明感降低、毛孔扩大这样的审美性的降低、伤痕、妊娠纹、瘢痕疙瘩之类的皮肤纤维症、上皮细胞癌的治疗是有用的。
Claims (2)
1.一种组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法,所述方法的特征在于,包括:
在能够表达机械应力信号分子的组织或细胞中应用受试物质的工序;以及
对上述组织或细胞中的机械应力信号分子的表达、活性、或细胞内定位进行评价的工序。
2.根据权利要求1所述的组织形态、组织功能控制剂的评价/筛选方法,其特征在于,
组织形态、组织功能控制剂为皮肤功能控制剂。
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