KR101889529B1 - 피부노화 특이적 후성유전자 마커 및 이를 이용한 피부노화의 검출 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PFN1 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터를 포함하는, 피부노화 특이적 바이오마커 및 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 검출용 조성물에 관한 것이다.

Description

피부노화 특이적 후성유전자 마커 및 이를 이용한 피부노화의 검출 {Skin aging-specific Epigenetic gene markers and detection of skin aging using them}

본 발명은 피부노화 관련 후성 유전자 마커 및 이를 이용한 피부 노화의 검출 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 PFN1 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터를 포함하는, 피부노화 특이적 바이오마커 및 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 검출용 조성물에 관한 것이다.

후성유전자 DNA 메틸화는 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬 (CpG island)의 시토신 (cytosine)에 메틸기가 결합하는 현상으로, 상기 유전자 DNA 메틸화로 인해서 전사 인자 (transcription factor)의 유전자 프로모터의 결합이 저해되 해당 유전자의 발현이 저해된다.

종양 억제 유전자는 많은 암세포에서 그 발현이 억제되어 있음이 알려져 있고, 또한 종양 억제 유전자의 발현 억제 기작중의 하나로서 종양 억제 유전자의 후성유전자 DNA 메틸화가 연구가 진행되고 있다.

따라서, 특정 유전자의 후성유전자 DNA 메틸화를 측정하여 암을 진단하는 방법들이 제시되어 있다.

대한민국 공개특허공보제2014-0122529호에는방광암 바이오마커 유전자의 CpG 섬 부위의 메틸화를 검출하는 방법에 대해 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공부 제10-1597812호에는 ZFP37 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하여 난소암 환자의 백금 기반의 항암제에 대한 반응성 예측 정보를 제공하는 조성물에 대해 개시되어 있다.

그러나, 피부노화와 관련된 유전자의 후성유전자 DNA 메틸화와의 상관관계 및 이를 이용한 피부노화 진단 방법에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.

상기와 같은 피부노화와 관련된 유전자의 후성유전자 DNA 메틸화를 피부 노화 진단 마커로 사용하는 기술은 특정 피부의 치료과정에서 환부 부위를 모니터링하는데 적용할 수 있으므로, 그 기술의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 PFN1 (Profilin 1) 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터를 포함하는 피부노화 관련 후성 유전자 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 PFN1 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터를 포함하는PFN1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의발현을 측정할 수 있는 제제를 포함 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터의 메틸화를 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 피부 노화 또는 피부노화 진행단계의 탐지, 검출 또는 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 PFN1 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터를 포함하는PFN1 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현을 측정할 수 있는 제제를 포함 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터의 메틸화를 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 피부노화 또는 피부 노화의 진행 상태에 필요한 정보를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 피부노화 특이적 바이오마커인 PFN1 단백질, PFN1 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터를 이용한 피부노화 억제 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 PFN1 (Profilin 1) 유전자의 메틸화 또는 PFN1 유전자 또는 PFN1 단백질의 발현을 측정하여 피부 노화 또는 피부노화 진행 단계의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 UV에 의한 피부 손상부위를 모니터링, 피부노화 진단 바이오마커 개발, 및 피부노화 방지 화장품 개발에 활용이 가능하다.

피부가 노화되었거나, 피부 노화가 진행된 경우 세포 내의 PFN1 유전자 프로모터의 CpG 섬 (Island)의 메틸화가 증가한다.

또한, 피부가 노화되었거나, 피부 노화가 진행된 경우 세포 내의 PFN1 유전자 또는 PFN1 단백질의 발현이 감소한다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일례는 PFN1 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터를 포함하는, 피부노화 특이적 바이오마커를 제공한다.

상기 PFN1 (Profilin 1)은 액틴과 결합하여 세포 골격 (cytoskeleton)의 구조에 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, PFN1의 농도가 높을 경우 액틴의 중합반응이 저해되는 것으로 알려져 있다.

상기 PFN1 단백질은 인간 (Homo sapiens) 등을 포함하는 영장류, 마우스 (Mus musculus), 래트 (Rattus norvegicus) 등을 포함하는 설치류 등의 포유류, 개구리 (Xenopus laevis) 등의 양서류 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 예컨대, PFN1은 인간 PFN1 (예컨대, NP_005013.1. (유전자:　NM_005022.3.))일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PFN1 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PFN1 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 메틸화되는 PFN1 유전자 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 메틸화되는 PFN1 유전자 프로모터는 PFN1의 시작 코돈인 ATG 서열로부터 -1319에 해당하는 뉴클레오타이드 서열로부터 시작 코돈인 ATG 서열까지 포함하며, 상기 메틸화 프로모터중에서 메틸화는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열에서 81 내지 262번에 해당되는 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG 섬 (CpG island)의 시토신 (cytosine)에서 일어난 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

서열번호 1의 시작 코돈인 ATG로부터 -1239 ~ -998 부위는 methylation specific PCR을 수행한 부분이며, ATG로부터 -1241 ~ -997 부위는 이에 상응하는 unmethylation specific PCR을 수행한 부분이다.

상기 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터는 PFN1 유전자의 발현을 조절하는 프로모터의 CpG 섬 (Island)에 메틸화가 일어날 수 있는 것을 의미할 수 있고, 상기 프로모터는 PFN1 유전자의 외부에 존재할 수 있으나, PFN1 유전자의 내부에 존재할 수도 있으며, 바람직하게는 PFN1 유전자의 외부에 존재한다.

용어, "피부노화"는 흔히 주름, 처짐 및 늘어짐의 증가와 관련된 외적 및 내적 (자연적)인 과정에 의한 것으로서, 외적 노화는 반복되는 자외선 (ultraviolet rays, UV) 노출에 의해 주로 발생하기 때문에 이를 일반적으로 '광노화'라고 한다. 자연적으로 노화된 피부는 매끄럽고 창백하며 잔주름이 있으나, 광노화된 피부는 굵은 주름이 생기며 색소침착 및 모세혈관 확장증을 야기한다. 피부의 주요 구조적 구성요소인 콜라겐의 손상은 피부 노화의 주된 요인으로 여겨지고 있으며 자연적인 노화 및 광노화 피부 모두에서 확인된다. 콜라겐 손상은 부분적으로 메트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase; MMP)의 유도와 관련된다. MMP는 매트릭스-분해 효소와 구조적으로 연관된 패밀리로서, 염증, 종양 침습 및 피부 노화와 같은 다양한 분해 과정에 중요한 역할을 수행한다. MMP의 수준은 자외선 광, 산화적 스트레스 및 사이토카인 등과 같은 다양한 자극에 의해 증가하고, 자외선 조사는 활성 단백질(activator protein-1; AP-1)의 DNA 결합을 촉진시키고, 콜라게나제(MMP-1), 스트로멜리신(MMP-3), 및 젤라티나제(MMP-9)와 같은 MMP를 유도한다. 콜라겐이 MMP-1에 의해 일단 분해되면 MMP-3 및 MMP-9에 의해 추가로 분해된다.

본 발명에 있어서, 상기 피부노화는 광피부노화 또는 UV에 의한 피부노화를 의미할 수 있고, 상기 피부노화는 주름 형성이 증가하거나 피부 상피세포의 두께가 증가하는 특징을 갖는 것일 수 있으며, 바람직하게는 광피부노화를 의미할 수 있다.

상기 피부노화 단계는 외적 및 내적인 과정에 의한 피부노화가 일어나는 단계를 말하며, 구체적으로 하기와 같은 과정을 거쳐 일어난다. 표피의 경우 각질형성 세포의 케라틴 합성이 감소되며 필라그린, 케라토히알린 및 여러 효소의 감소로 탈수형상이 심해지고 죽은 각질세포들이 떨어져 나가지 못하고 정체되어 각질 세포층이 두터워 지며, 이 후 각질층의 수분 결핍 현상이 심화되고 기저층까지 수분 이동 현상이 둔화됨을 확인할 수 있다. 다음으로 피지 생산이 감소되며 멜라닌 색소의 분포가 불규칙해져 피부가 전체적으로 얼굴덜룩해 진다. 진피의 경우 콜라겐과 탄력섬유가 경화 및 불용성이 되며, 피부 탄성 관련 인자들의 가교화 과정을 거치게 된다. 다음으로 노화의 진행에 따라 기질 (ground sugstance)의 감소로 피부의 주름이 늘어나게 되며 히알루론산의 양이 점차로 감소하게 된다. 상기 피부노화 단계는 각질 세포층의 증가 및 피부 탄력의 저하 단계를 포함하는 모든 단계를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일례는 PFN1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제 또는 PFN1 유전자 프로모터의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.

상기 PFN1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 PFN1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 압타머 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PFN1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 PFN1 단백질에 특이적으로 결합하는소분자 화학물질, 단백질, 펩타이드, 핵산 분자, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PFN1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 검출은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 칩으로 구성된 군에서 선택되는 PFN1의 mRNA 측정 수단에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PFN1 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제의 검출은 웨스턴 블랏팅, ELISA 또는 질량분석법인 PFN1의 단백질 측정 수단에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 프로모터의 메틸화를 측정하는 제제는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍일 수 있으며, 상기 서열번호 1을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍은 서열번호 8 내지 11일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PFN1 유전자 프로모터의 메틸화를 측정하는 제제의 검출은 PCR, 메틸화특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 피부노화는 광피부노화 또는 UV에 의한 피부노화를 의미할 수 있고, 상기 피부노화는 주름 형성이 증가하거나 피부 상피세포의 두께가 증가하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 광피부노화를 의미할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 PFN1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 압타머, 또는 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 포함하는, 피부노화 또는 피부노화 진행 단계의 검출용 마이크로 어레이에 관한 것이다.

본 발명의 용어, "유전자의 발현 수준을 측정하는 제제"는 대상체의 피부노화 또는 피부노화 진행단계를 예측 또는 검정하기 위하여, 대상체 시료에서 상기 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 직접 또는 간접적으로 측정하여 발현 정도를 확인하는 제제를 의미한다. 예를 들어, 상기 제제는 PFN1 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 압타머, 또는 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제제는 PFN1 단백질에 특이적으로 결합하는 소분자 화학물질, 단백질, 펩타이드, 핵산 분자, 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, PFN1 유전자의 발현 수준은 PFN1 유전자의 mRNA 의 발현수준 또는 유전자에 의해 코딩 되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 상기 mRNA 발현수준 측정은 대상의 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA 의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 말한다.

본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 피부노화 또는 피부노화진행단계를 예측 또는 검정할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 용어, "압타머 (Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)으로　"fitting"의 의미를 가지는 라틴어 "aptus"가 그 어원이고, 펩타이드, 막 단백질을 포함한 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 또한, 저분자 유기물 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특별히 "chemical antibody"라고도 불리는 만큼 대체항체로서의 가능성도 매우 높다고 알려져 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 대상의 시료에서 마커 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 키트는 PFN1 유전자의 mRNA 발현수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 피부노화 마커를 검출할 수 있다. 본 발명에서 키트는 피부노화에 따라 발현이 증가되는 PFN1 유전자의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브, 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 PFN1 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필수한 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오디트(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 마이크로 어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 유전자 검출용 키트일 수 있다. 마이크로 어레이, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 마이크로어레이에서 선택된 10개 이상의 유전자 또는 그 단편에 해당하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, DNA 마이크로 어레이일 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일례는 PFN1 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 유전자의 발현 수준은 mRNA, 또는 단백질에 의해서 측정되는 것일 수 있다.

상기 mRNA의 발현 수준 측정은 역전사효소 중합효소연쇄반응, 핵산 하이브리드화, 전기영동, 또는 노던 블럿팅에 의해서 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 시료에서 RNA를 수득하고, 상기 RNA를 역전사하여 cDNA를 수득하고, 상기 cDNA에 검출가능한 표지를 부착하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 검출가능한 표지는 효소, 방사성 동위원소, 형광물질, 화학발광성 분자, 방사선 물질, 리포좀 또는 햅텐 분자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 햅텐은， 스스로는 면역 반웅을 유도할 수 없지만 일단 캐리어 분자에 부착되면 면역 반웅을 유도하는 저분자 유기 화합물로서, 햅테에 결합하는 항체를 개발하여 레퍼런스 항체로 사용함으로써 시료의 정확한 정량 측정에 이용할 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질의 발현수준 측정은 면역학적 검정법, 웨스턴 블랏, ELISA, 또는 질량분광법에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 피부노화는 광피부노화 또는 UV에 의한 피부노화를 의미할 수 있고, 상기 피부노화는 주름 형성이 증가하거나 피부 상피세포의 두께가 증가하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 광피부노화를 의미할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일례는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터의 메틸화를 측정하는 단계를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 메틸화 프로모터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열에서 81-262번째 뉴클레오타이드에 존재하는 CpG 섬 (CpG island)의 시토신 (cytosine)에서 메틸화가 된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 메틸화의 측정은 PCR, 메틸화 특이 PCR (Methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (Real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 움 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 메틸화를 측정하는 단계는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 사용하여 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 서열분석으로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 피부노화는 광피부노화 또는 UV에 의한 피부노화를 의미할 수 있고, 상기 피부노화는 주름 형성이 증가하거나 피부 상피세포의 두께가 증가하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 광피부노화를 의미할 수 있다.

본 발명은 피부노화 관련 후성 유전자 마커 및 이를 이용한 피부 노화의 검출 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 PFN1 유전자, 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질, 또는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터를 포함하는, 피부노화 특이적 바이오마커 및 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 검출용 조성물에 관한 것이며, 상기 바이오마커를 검출하여 화장품 개발, 또는 피부노화 진단에 필요한 정보의 제공에 활용이 가능하다.

도 1은 피부 광노화 동물 모델의 제작방법을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 광노화 마우스 모델에서 UVB 조사시 피부 노화가 증가하고, 상기 광노화 마우스에 대하여 카카오 마우더 (CP) 또는 항노화 물질인 피크노제놀 (Pyc)을 조사했을 때 피부 노화가 감소함을 확인한 것을 나타낸다. 도2의 CL은 CP를 39.1 mg/kg/day로 섭취하도록 한 마우스의 조직 샘플로부터 얻은 데이터이며, CH는 156.3 mg/kg/day로 CP를 섭취시킨 샘플의 데이터를 말한다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 광노화 마우스 모델에서 UVB 조사시 상피세포 두께가 증가하고, 상기 광노화 마우스에 대하여 카카오 마우더 (CP) 또는 항노화 물질인 피크노제놀 (Pyc)을 처리했을 때 상피세포 두께가 감소함을 H&E 염색으로 확인한 것을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 광노화 마우스 모델에서 UVB 조사시, 또는 광노화 마우스 모델에 UVB를 조사하고 카카오 마우더 (CP) 또는 항노화 물질인 피크노제놀 (Pyc)을 처리했을 때 상피세포 두께를 측정한 것을 나타낸다.
도 5 A는 본 발명의 실시예에 따라 광노화 마우스 모델에서 UVB 조사시 메틸화가 증가된 유전자 17개를 선별한 것을 나타낸다. 도 5 B는 UVB 조사시 mRNA의 발현양이 변하고 CP 처리시 회복되는 유전자 군 중에서 도 5A의 조건에 만족하는 유전자 집단을 Heatmap으로 나타낸 것이다. Ct기은 UVB를 조사하지 않은 것, UV는 UVB를 조사한 것, CP는 UVB를 조사하고 CP를 처리한 것을 나타낸다.
도 6은 광노화 마우스 모델에서 PFN1 유전자의 UVB 처리 또는 UVB를 처리하고 카카오 파우더 (CP)를 처리했을 때 DNA 메틸화의 변화를 확인한 것을 나타낸다.
도 7은 광노화 마우스 모델에서 UVB 처리 및 UVB를 처리하고 CP를 처리했을 때 PFN1 mRNA의 발현 변화를 확인한 것을 나타낸다.
도 8는 광노화 마우스 모델의 면역블롯 결과로서, CTL1 및 2는 UVB를 조사하지 않은 대조군 마우스, Cacao1 및 2는 UVB를 조사하고 CP를 처리한 마우스, UV1 및 2는 UVB만을 조사한 마우스이다.
도 9은 광노화 마우스 모델에서 PFN1 유전자의 RNA sequencing 분석 결과로서, Control은 UVB와 CP를 처리하지 않은 대조군이며, UV는 UVB만 처리한 마우스 조직으로부터 취한 mRNA 분석 데이터이다. CP를 8주에 걸쳐 39.1 mg/kg/day 섭취했을 때 CL이라 명하였고, CH는 156. 25 mg/kg/day 단위로 섭취하게 한 실험군이다. 마지막으로 Pyc은 피크노제놀을 625 mg/kgday씩 섭취한 실험군이다. 유의도는 0.05이상이다.
도 10는 광노화가 유도된 인간 유래 피부세포에서 UV 처리에 의한 PFN1의 단백질 발현량 변화를 나타낸다.
도 11은 광노화가 유도된 인간 유래 피부세포에서 PFN1의 메틸화 특이 PCR 수행한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예1 . PFN1 유전자의 선택

1-1: 피부 광노화 마우스 모델의 제작

(1) 제조방법

피부 광노화를 진단하기 위한 마커를 선별하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 피부 광노화 마우스 모델을 제작하였다.

구체적으로, 도 1에 도식화한 것과 같이, 6주령의 암컷 albino hairless mice (Skh-1)에 주 5회 156.25 mg/kg/day으로 카카오 파우더 (cacao powder, baba Callebaut, Lebbeke-Wieze, Belgium) 섭취시키고, 주 3회 TL20W/12RS UV lamps (Philips, Eindhoven, The Netherlands)를 이용하여 100 ~ 200 mJ/cm2의 UV를 조사하여 광노화 마우스 모델을 만들었다. 대조군의 경우 8주에 걸쳐 동일 조건에서 마우스를 키우되, UVB조사와 CP 섭취는 하지 않았다. CP를 먹어지 않고 UVB만 조사한 마우스는 UV 마우스로서 실험군에 포함시켰다. UV는 1주차에 100 mJ/cm2, 2 ~ 3주차에 150 mJ/cm2, 4 ~ 8주차에 200 mJ/cm2로 점차 UV 의 강도를 올려 조사했다. 광노화 마우스 모델은 8주차에 생검 (Biopsy)을 통해 조직을 획득하였다.

(2) 제조된 마우스의 피부 광노화 여부 확인

제작한 피부 광노화 모델에서, 피부 광노화 여부를 측정하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 주름형성 측정하고, H&E 염색으로 조직을 관찰하였다.

구체적으로 주름형성을 측정하기 위해서, Bissett's visual wrinkle scale 방법을 이용하여 주름 형성 정도를 조사하여 광노화 마우스 모델의 피부 노화 여부를 측정하였다. Silicone rubber (Silflo Dental Impression Materials, Potters Bar, UK)로 광노화 마우스 모델 피부의 주름을 본떠 coupling charge system video camera를 이용하여 사진을 찍었다. 그리고 나서 skin-Visiometer SV 600 software (CK Electronic GmbH, Germany)로 주름 정도를 측정하였다 (0,none; 1,minimal; 2,mild; 3,moderate; 4,secere; 5, very severe).

그 결과, 도 2에 나타난 것과 같이, 광노화를 유도하지 않은 마우스에 대비하여 광노화를 유도한 마우스의 경우 2배 이상의 주름 형성 부위가 증가한 것을 볼 수 있었고, 광노화를 유도한 마우스에 카카오 파우더의 농도를 증가하여 처리함에 따라서 주름 형성 부위가 점차 감소하는 것을 볼 수 있었고, 또한 광노화를 유도한 마우스에 강력한 항산화제 (항노화 물질)인 피크노제놀 (Pycnogenol)을 광노화를 유도한 마우스에 처리했을 때 주름 형성 부위가 감소함을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해서, 제작한 광노화 유도 마우스는 UVB에 의해서 피부 광노화가 유도되었음을 확인 할 수 있었다.

또한, 일반적으로 광노화가 진행된 피부의 상피세포 두께는 대조군에 비해 두껍게 나타나므로, 제작한 피부광노화 모델에서 피부 광노화가 발생했는지 여부를 상피세포 두께를 하기와 같은 H&E 염색으로 관찰하였다.

구체적으로, H&E 염색으로 상피세포 두께를 관찰하기 위해서, 4% (v/v) 파라포름알데하이드 (PFA: paraformaldehyde, Sigma, USA)를 이용하여 마우스 조직을 고정한 뒤, 탈수하여 파라핀 블록을 만들었다. 마이크로톰 (Leica, USA)을 사용하여 상기 파라핀 블록을 5 um 크기로 잘게 잘랐다. 자일렌 (xylene) (SAMCHUN, Korea)에 슬라이드를 넣어 3~10분간 탈파라핀화 하고, 100% 에탄올 (Ethanol absolute) (Millipore, USA)을 5% 단위로 줄여 최종 75%가 될 때까지 1분간 슬라이드와 반응시켜 자일렌을 제거했다. 그 후에, 증류수에 슬라이드를 담구어 세척하고, 해리스 헤마토실린(Harris Hematoxylin) 용액에 2분간 슬라이드를 반응시켜 염색한 뒤 증류수 및 0.5% (v/v) HCl을 포함하는 메탄올로 세척했다. 그리고 나서, 증류수로 다시 한 번 세척하고, 0.5% (v/v) 암모니아수 (ammonia water) (JUNSEI, Japan)로 20회 이상 세척하여 중화했다. 에오신 (Eosin)에 2분간 염색하고 세척한 뒤 에탄올을 70%에서 100%까지 5%씩 비율을 올려가며 탈수하고 자일렌으로 투명화 하여 카나바 발삼 (Canada valsam)으로 마운팅한다. 마지막으로, 광학현미경 (Nikon, eclipse 50i, Japan)을 이용하여 사진을 찍고, I Solution x64 (image & Microscope Technology, CANADA) 프로그램을 통해 상피세포의 두께를 측정했다.

그 결과 도 3 또는 4에 나타난 것과 같이, 제작한 광노화 마우스 조직의 상피세포 두께는 광노화를 유도하지 않은 마우스에 비해 약 2배 이상 상피세포의 두께가 증가했으나, 광노화를 유도한 마우스에 피부 노화 방지 물질인 카카오파우더 (CP; cacao powder) 또는 피크노제놀 (pycnogenol) 처리시 광노화에 의해서 증가된 상피세포의 두께가 감소했다.

1-2: 피부노화 마커로서 PFN1 유전자의 선택

(1) 유전체 DNA 또는 전체 RNA의 추출

피부 노화 마커 유전자를 선별하기 위해서, 실시예 1-1과 같은 방법으로 제작한 광노화 마우스에서 조직을 채취하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실시예 1-1과 같은 방법으로 제작한 광노화 마우스에서 마우스 조직을 생검하고 액체 질소를 이용해 급속 냉각 시킨 뒤, G-spinTM Total DNA Extraction Kit (Intron, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 유전체 DNA를 추출하거나, RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Valencia, USA)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 전체 RNA는 1% (w/v) agarose gel에 전기영동하여 18S와 28S RNA 밴드를 확인하여 양질의 전체 RNA이 추출되었음을 확인했다.

(2) PFN1 유전자의 선택

추출한 유전체 DNA의 메틸화 패턴을 분석하여 피부노화 마커 유전자를 선별하기 위해서, 상기 추출한 유전체 DNA에 Bisulfite 처리하여 메틸화되지 않은 시토신 (Cytosine) 잔기를 우라실 (Uracil) 잔기로 변환하였다. 그리고 나서 MeDIP (Methylated DNA immunoprecipitation)을 통해 유전자 메틸화 분석을 수행하였으며, Heatmap을 통해 그 결과를 도 5에 나타난 그래프로 나타냈다.

구체적으로, 1-2 (1)에서 유전체 DNA에 EZ DNA Methylation-LightningTM Kit (Zymoresearch, CA, USA)를 이용하여 메틸화 되지 않은 시토신 (Cytosine) 잔기를 Bisulfite 처리하여 우라실 (Uracil) 잔기로 변환하였다. MeDIP (Methylated DNA immunoprecipitation)을 통해 메틸화 특이적 항체를 사용하여 상기 메틸화 되어 시토신 잔기가 우라실 잔기로 변환된 유전자만을 선별하였다. 초록색에서 붉은색 방향으로 갈수록 메틸화 양이 증가된 것을 나타내며, 녹색에서 색이 연해질수록 메틸화 양이 감소된 것을 나타낸다.

그 결과 도 5A에 나타난 것과 같이, UVB를 조사하고 CP를 처리한 경우에 비해서 UVB만을 조사한 경우 메틸화가 1.3배 이상 증가하고, p value가 0.05 이하인 유전자를 17개 선별하였다.

그리고 나서, 1-2 (1)에서 추출한 전체 RNA를 사용하여 RNA-sequencing (RNA-Seq) 데이터 분석 (TheragenEtex, Korea)을 수행하여 상기 메틸화 변화를 통해서 선별한 17개의 유전자의 UVB의 조사 또는 UVB의 조사후 CP 처리에 의한 mRNA의 발현양이 변하는지 확인하였다. 초록색에서 붉은색 방향으로 갈수록 RNA 양이 증가된 것을 나타내며, 녹색에서 색이 연해질수록 RNA 양이 감소된 것을 나타낸다.

그 결과 도 5 B에 나타난 것과 같이, 도 5 A에서 선별한 17개의 유전자중에서 UVB를 조사하지 않은 대조구에 비해서 UVB를 조사하였을 때 mRNA 양이 1.3배 이상 감소하고, p value가 0.05 이하이고, UVB를 조사하였을 때 mRNA 양에 비해서 UVB를 조사하고 CP를 처리했을 때의 mRNA의 양은 1.3배 이상 증가하고, p value가 0.05이하이고, UVB를 조사하지 않은 대조구에 비해서 UVB를 조사하고 CP를 처리했을 때의 mRNA의 양이 1.3배 이내로 변화하고, p value가 0.05이하인 유전자를 선별하였다.

상기 도 5 A 및 도 5 B에 의해서 선별된 유전자 중에서 종래에 피부 세포에서 그 기능이 알려진 유전자를 제외하고 남은 PFN1 (Profilin 1) 유전자를 새로운 피부노화 마커로 선별하였다.

(3) PFN1 프로모터 또는 엑손의 메틸화 패턴 분석

유전자의 생체 내 발현 조절 기작 중 하나인 유전자 메틸화는 일반적으로 UVB에 의해 조절 될 수 있음이 밝혀진 바 있고, 또한 일반적으로 유전자의 프로모터 지역의 메틸화에 의해 유전자의 발현 조절이 일어남이 알려져 있다. 따라서, 상기 피부 노화 마커로 선별한 PFN1의 메틸화가 어떤 부위에서 일어나는 지 확인하기 위해서, WashU genome browser를 사용하여 하기와 같은 방법으로 PFN1의 엑손과 프로모터 부위의 메틸화를 분석하였다.

구체적으로, Hiseq 2000 (illumina, USA)을 이용하여 유전자의 염기서열을 분석하고 bowtie2 프로그램을 이용하여 마우스 지놈 (genome) 지도 분석을 수행하였다. 다음으로 feng J의 논문을 참조하여 (geng J et al., Nat Protoc. 2012, 7, 1728-40) mode-based analysis of Chip-seq (MACS)을 통한 유전자 전체 서열 중 메틸화 서열 분석을 진행하였다. 이 후 GeneSpring 7.3 (silicon. Genetics, USA)을 이용하여 메틸화된 유전자 서열의 표준화, 통계 분석 및 군집 분석을 시행하였다. 마지막으로 WashU genome browser를 통해 분석된 유전자 메틸화 결과를 나타냈다.

그 결과 도 6에 나타난 것과 같이, 염색체 11번에 위치한 PFN1의 프로모터 부위에서 메틸화가 일어나며, 상기 메틸화는 UV 조사에 의해서 증가하지만, UV 조사후 CP를 처리함에 따라서 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. PFN1 유전자 발현 수준 분석

2-1. In vivo PFN1 유전자 발현 수준 분석

(1) RT-PCR을 이용한 PFN1 mRNA 발현 수준 분석

피부 노화 마커로 선별한 PFN1의 피부 노화에 따른 유전자 발현 (mRNA)의 변화를 분석하기 위해서 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 1-1 (1)의 방법으로 제작한 마우스에 대하여 1-2 (1)의 방법으로 추출한 전체 RNA 1.5 ug을 DEPC-처리수에 녹인후, 1 uL의 oligo(dT)12-18와 10 mM의 dNTP 1 uL을넣고, 70℃에서 5 분간 반응 시킨 후, 곧바로 얼음에서 냉각시켰다. 상기시료에 5×완충용액 (reaction buffer) 5 uL, RNase inhibitor (Invitrogen, U.S.A) 0.5 uL을 넣고 42℃에서 1 분간 반응시킨 다음, AMV reverse transcriptase (Intron, No. 27021)을 1 uL을 넣고 다시 42℃에서 60분간 배양하고, 70℃에서 10분을 반응하여 잔류 단백질을 불활성화시켜서 cDNA를 합성하였다. 상기 합성한 cDNA 1 uL, 프라이머 쌍 (10 pmole) 각각 1 uL, 증류수 171 uL를 AccuPower® PCR PreMix (Bioneer, Gyonggi-do, Korea)에 첨가한 후, 95℃에서 5 분간 반응시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 1 분간, 72 ℃에서 30초 과정을 30 주기로 수행하였다. 72 ℃에서 5분간 신장시킨 다음 2 % (w/v) 아가로오스겔에서 확인하였다. 이때 RPLPO를 로딩 콘트롤로 사용하여 PFN1유전자의 발현을 정량화하였다. RT-PCR에서 사용한 프라이머쌍은 하기 표 1에 나타나 있다.

명명	서열 (5' > 3')	서열번호	Tm (℃)	Cycle
mPFN1_F	GAT GGG CAA ACA AGG TGT C	4	55.2	30
mPFN1_R	ATG TGT GTG TAT GGA AAG AAG G	5	55.4	30
mRPLPO_F	CAA AGG AAG AGT CGG AGG A	6	55.1	30
mRPLPO_R	CAA AGA TGC CAA CAC AAA GRA A	7	54.8	30

그 결과 도 8에서 나타난 것과 같이, 마우스에 UV 조사에 의해서 UV 조사하지 않은 경우에 비해 PFN1의 mRNA 발현이 약 8.9배 감소하지만, UV를 조사하고 CP를 처리한 경우 UV 조사에 의해서 발현이 감소한 PFN1의 양이 다시 증가함을 확인 할 수 있었다.

(2) RNA sequencing을 이용한 PFN1 mRNA 발현 수준 분석

피부 노화 마커로 선별한 PFN1의 피부 노화에 따른 유전자 발현 (mRNA)의 감소를 추가적으로 확인하기 위해서 하기와 같은 RNA-sequencing (RNA-seq) 분석법을 사용하여 실험을 수행하였다.

구체적으로, 마우스 조직으로부터 mRNA를 추출하여 RNA seq 분석 (TheragenEtex, Korea)을 통해 유전자의 발현량에 대한 수치를 FPKM (expected fragments per kilobase of transcript per million fragments sequenced) 값을 통해 분석하여 PFN1 mRNA의 발현 변화에 대한 그래프를 도 10에 나타내었다.

그 결과 도 10에 나타난 것과 같이, FPKM 값을 이용하여 각 실험군에서 PFN1의 발현이 어떻게 변화하는지 확인하였다. FPKM은 RNA seq 분석을 통한 mRNA 발현양의 변화를 측정하는 단위로서 대조군 대비 UVB만 조사한 실험군 (UVB)에서 PFN1의 FPKM이 약1.4배 감소함을 확인할 수 있으며, CP (CL 또는 CH) 또는 Pyc 처리시에 감소된 mRNA의 양이 증가함을 확인하였다.

(3) PFN1 단백질 발현 수준 분석

상기의 UV에 의한 PFN1 mRNA의 발현 감소에 의해서, PFN1의 단백질 발현도 감소하는지 여부를 확인하기 위해서, 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 1-1 (1)의 방법으로 제작하여 얻은 마우스 조직 세포들은 protease inhibitor cocktail kit (P3100-005; GenDEPOT, Barker, TX), 및 phosphatase inhibitor (sc-45065; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 포함한 세포 용해 버퍼를 사용하여 분해하였다 (#9803; Cell SignalingTechnology, Danvers, MA). 25 ug의 세포 용해물을 포함하는 부분 표본은 SDS-polyacrylamide 젤 상에서 전기영동하여 분리하였고, 그리고 나서 transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% [v/v] methanol [pH 8.3])상에서 75 V와 40℃에서 180 분 동안 니트로셀루로즈 막 (Amersham, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 막은 상온에서 60분 동안 0.1% (v/v) Tween-20를 포함하는 3% (w/v) BSA의 PBS로 블락킹하고, 그리고 나서 anti-PFN1 (Abcam, ab118984) 항체와 배양하였다. 이차 항체에는 HRP-결합된염소 항-마우스 IgG (1:1000; sc 2005, SantaCruz)가 사용되었다. ECL lumi Femto solution A/B (Dogen, Seoul, Korea)를 사용하여 블롯들을 현상하였다.

그 결과 도 9에 나타난 것과 같이, 마우스에 대하여 UVB를 조사하여 광노화가 유도된 경우 PFN1 단백질의 발현량이 UVB를 조사하지 않았을 때에 비하여 약 3배 감소함을 확인 할 수 있었다. 다만, 피부 노화의 효과를 억제하는 것으로 알려진 카카오 파우더 (CP)를 상기 UVB를 조사한 마우스에 처리했을 경우 UBV만을 조사했을 경우와 대비하여 PFN1 단백질의 발현량이 다시 증가함을 확인 할 수 있었다.

2-2. In vitro PFN1 유전자 발현 수준 분석

(1) 인간 피부 광노화 세포 모델의 제작

인간유래 불멸 상피세포주 (Immortalized human keratinocyte) HaCaT 세포 (ATCC, USA) 5 x 105 cell을 DMEM (5% FBS) 배지가 들어있는 100-mm dish에 분주하여 48시간 동안 37℃ CO₂ incubator에서 배양한다. 이 후 incubator로부터 세포를 꺼내어 serum free media로 배지를 교체하여 준다. 12시간 이 후 PBS로 washing하고, 다시 dish에 4 mL의 PBS를 넣어 UV crosslinker (UVP, CA, USA)를 이용하여 100 mJ/cm2의 UV를 쪼여 준다. Dish의 PBS를 제거하고 8 mL의 DMEM (5 % FBS) 배지를 채워 24시간 동안 재배양하여 피부 광노화 세포 모델을 제작한다. 피부 광노화 회복을 위해서 UV 조사 이후에 DMEM 배지에 cacao powder (4 ug/mL) 및 cacao의 대사 산물인 DHPV [5-(3',4'-19 dihydroxyphenyl)-gamma-calerolactone] (10 ng/mL)를 포함시켜 24시간 동안 배양했다. DHPV는 카카오 파우더에 대한 양성 대조군 (positive control)으로서 카카오 파우더는 다양한 물질의 조합일 수 있으며, 카카오 파우더를 섭취 또는 처리 하였을 때 카카오 파우더는 생체 내에서 대사 작용에 의해 물성이 바뀌고 실제 생체 내에서는 바뀐 물성에 의해 카카오 파우더 효과를 나타낼 수 있게 된다. HaCaT의 경우 생체 내에서 일어나는 대사 작용을 모식할 수 없기 때문에 실제 생체 내에서 대사되어 나오는 산물인 DHPV를 처리하는 것은 좀 더 정확한 카카오 파우더의 효과를 볼 수 있는 방법일 수 있으며, 카카오 파우더의 대사산물 중 어떠한 물질이 광노화 방지 효과를 나타내는지에 대한 정확한 판단을 할 수 있도록 돕는다. 대조군 세포는 UV 조사 및 상기 DHPV를 상기 세포에 처리하지 않은 것이다.

(2) 인간 피부 광노화 세포에서 PFN1 단백질 발현 수준 분석

상기 제작한 광노화 유도 인간 피부 세포에서 PFN1 단백질의 발현의 변화를 분석하기 위해서, 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2-2 (1)에서 제작한 인간 피부 광노화 세포에 대하여 면역블롯 분석을 수행하였다. 세포들은 protease inhibitor cocktail kit (P3100-005; GenDEPOT, Barker, TX), 및 phosphatase inhibitor (sc-45065; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 포함한 세포 용해 버퍼를 사용하여 분해하였다 (#9803; Cell SignalingTechnology, Danvers, MA). 20 ug의 세포 용해물을 포함하는 부분 표본은 SDS-polyacrylamide 젤 상에서 전기영동하여 분리하였고, 그리고 나서 transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% [v/v] methanol [pH 8.3])상에서 75 V와 40℃에서 180분 동안 니트로셀루로즈 막 (Amersham, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 막은 상온에서 60분 동안 0.1% (v/v) Tween-20를 포함하는 3% (w/v) BSA의 PBS로 블락킹하고, 그리고 나서 항-PFN1 (Abcam, ab118984) 항체와 배양하였다. 이차 항체는 HRP-결합된염소 항-마우스 IgG (1:1000; sc 2005, SantaCruz)를 사용했다. ECL lumi Femto solution A/B(Dogen, Seoul, Korea)를 사용하여 블롯들을 현상하고 분석하였다.

그 결과 도 10에 나타난 것과 같이, 인간 피부 세포에 대하여 UVB를 처리하여 광노화가 유도된 경우 PFN1 단백질의 발현량이 UVB를 처리하지 않았을 때에 비해서 약 80% 감소함을 확인 할 수 있었다. 다만, 상기와 같이 UVB만을 처리했을 때 감소했던 PFN1의 단백질의 양이, UVB를 처리한 피부 세포에 대하여 피부 노화의 효과를 억제하는 것으로 알려진 카카오의 대사 산물 DHPV를 상기 피부 세포에 처리했을 경우 UVB를 처리하지 않은 대조구에서의 PFN1 단백질의 양만큼 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 결과를 통해서 UVB에 의해서 PFN1의 단백질의 발현이 선택적으로 감소함을 확인할 수 있었다.

실시예 3. PFN1 프로모터 메틸화 위치 및 수준 분석

일반적으로 유전자의 프로모터의 메틸화에 의해서 해당 유전자의 발현이 감소함이 알려져 있기 때문에, 상기 UVB의 조사에 의한 광노화에 의해서 PFN1의 발현이 감소한 결과를 바탕으로 UVB의 조사에 의해서 PFN1의 프로모터의 메틸화가 증가하는지 여부를 확인하였다. UVB의 조사에 의한 PFN1의 프로모터 메틸화의 증가여부를 확인하기 위해서 비메틸화 DNA를 기준으로 메틸화 DNA의 양을 비교하여 메틸화를 확인하는 메틸화 특이 PCR을 하기와 같은 방법으로 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2-2 (1)에서 제작한 인간 광노화 피부세포를 harvest하고, NucleoSin® Tissue Kit (Macherey-Nagel, Germany)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 Nano Drop을 이용하여 정량하고 및 그 질 (Quality)을 확인하였다. 추출된 DNA는 메틸화 분석을 위해 EZ DNA Methylation-LightningTM Kit (Zymoresearch, CA, USA)를 이용하여 메틸화 되지 않은 시토신 (Cytosine) 잔기를 Bisulfite 처리하여 우라실 (Uracil) 잔기로 변환하였다.

상기 Bisulfited DNA 100 ng, 프라이머 쌍 (20 pmole) 각각 1 uL, TaKaRa EpiTaq HS (5U/㎕) 0.25 uL, 10X EpiTaq PCR Buffer (Mg2+ free) 5 uL, 25 mM MgCl2 5 uL, dNTP Mixture (2.5 mM each) 6 uL 및 최종 볼륨이 50 uL가 되도록 증류수를 첨가한 후, 98℃에서 3분간 반응시킨 후, 40 주기로 98℃에서 10초, 55℃에서 1 분, 72 ℃에서 30초 과정 반복하여 반응시켯다. 그리고 나서, 72℃에서 5분간 신장시킨 다음 2 % (w/v) 아가로오스 겔에서 결과를 분석하였다.

일반적으로 메틸화 특이 PCR의 프라이머를 제작함에 있어 프라이머 내에 최소한 2~3개의 CpG 서열이 오도록 하며, Tm 값을 메틸화와 비메틸화 프라이머가 유사하게 제작하여야 한다. Bisulfite conversion 과정에 있어 비메틸화된 시토신은 우라실로 변형 됨으로 이를 고려하며 프라이머를 제작하여야 하며 이러한 조건하에 메틸화와 비메틸화 프라이머간의 염기서열이 1~3 bp 정도 차이가 날 수 있다. 또한 상기 유전자의 메틸화는 전체 유전자 풀의 0~100% 일 수 있으며, 이에 발현될 수 있는 동일 유전자 서열 전체에서 비메틸화 대비 메틸화 유전자의 양을 파악하는 것이 DNA 메틸화를 정확히 파악하는 방법일 것이다.

상기 사항을 고려하여 메틸화 특이 PCR을 수행하기 위한 프라머를 제작하였고, 그 서열정보는 표 2에 나타나 있다. 서열번호 1의 시작 코돈인 ATG로부터 -1239 ~ -998 부위는 methylation specific PCR을 수행한 부분이며, ATG로부터 -1241 ~ -997 부위는 이에 상응하는 unmethylation specific PCR을 수행한 부분이다.

서열번호 1의 프로모터중에서 81 내지 262에 해당하는 서열에 대하여 하기 표 2에 나타난 프라이머 8 및 9를 사용하여 methylation specific PCR을 수행하여 PFN1의 프로모터에서 메틸화가 된 부위가 서열번호 1의 프로모터중에서 81 내지 262에 해당함를 확인하였다.

또한, UVB를 처리하고, CP 및 DHPV를 처리하여 피부 노화를 회복시킨 세포에서 하기 표 2에 나타난 프라이머 10 및 11를 사용하여 unmethylation specific PCR을 수행하여 상기 프로모터에서 발생한 메틸화의 정도를 확인하였다. DNA 메틸화 특이 PCR에 사용한 프라이머 서열 및 PCR 조건은 하기 표 2에 나타나 있다.

명명	서열 (5' > 3')	서열번호	Tm (℃)	Cycle
MF1	TGC GAA GAA ATT TAA AGG GTT C	8	54.6	40
MR1	ACA ATA TCT AAA TCA CCG ACC GTA	9	56.6	40
UF1	GAT TGT GAA GAA ATT TAA AGG GTT T	10	54	40
UR1	AAC AAT ATC TAA ATC ACC AAC CAT A	11	53.5	40

그 결과 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, UVB를 조사하여 광노화가 유도된 피부 세포에서 서열번호 8, 9에 해당하는 프라이머를 사용하였을 때 (Promoter 1) 서열번호 10, 11에 해당하는 프라이머를 사용했을 때에 비해서, UVB에 의해 PFN1 promoter1에서 메틸화 (M)가 약 3배 증가하고, 이러한 메틸화는 DHPV 처리에 의해 급격히 감소됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 결과는 UVB 조사에 의한 노화 모델에서 서열번호 1의 81-262 에 해당하는 PFN1 프로모터 서열의 메틸화 수준이 증가하며, 상기 PFN1 프로모터의 메틸화는 피부 노화 특이적 마커로 사용이 가능함을 나타낸다.

<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Skin aging-specific Epigenetic gene markers and detection of skin aging using them <130> DPP20164868KR <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1270 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaggcggtt tcaccgcggc cgccgcacgg ccgtcccgcc cgtcccgccc tccccaggtg 60 gctgtgagcg cacatctgac tgcgaagaaa cccaaagggc ccgaagtggg actttcccct 120 tcttgaaaaa gttgccactc ttgcaacttg agtattcttc cgcctcgaaa aatagccccg 180 cctgttaagc cccgcgggtg tccgcgctct gtgacctctg cagacacagg ccaaggggca 240 cggccggtga tccagacatt gcctgcctgg ggcgggcggg gctgggatgt ggggtgaggc 300 cctgggctag agccgatcca gagaagggac aatcctctag actgagaatg ggccctggtg 360 aacccaacct gcacgacccg agaagacgct ggggacagaa gtggccccgg tgggtgcctt 420 cagctatgag agcgactaga ggatttggcc aaactcttct ttgctttctt attacttgaa 480 taagtaaaat caagggtggt gaggcggcag cgcgcacggc ttcgcccccg ccccttccgc 540 caggcgggag acacgtcccc agcccgcctt cctttcccgc agggtccaca cgggtcgggc 600 cgggcgcgct cccgtgcagc cggctccggc cccgaccgcc ccatgcactc ccggccccgg 660 cgcaggcgca ggcgcgggca cacgcgccgc cgcccgccgg tccttccctt cggcggaggt 720 gggggaagga ggagtcatcc cgtttaaccc tgggctcccc gaactctcct taatttgcta 780 aatttgcagc ttgctaattc ctcctgcttt ctccttcctt ccttcttctg gctcactccc 840 tgccccgata ccaaagtctg gtttatattc agtgcaaatt ggagcaaacc ctacccttca 900 cctctctccc gccacccccc atccttctgc attgctttcc atcgaactct gcaaattttg 960 caataggggg agggattttt aaaattgcat ttgcaaagtt cggtgtctgg gctggcgagt 1020 gggggaggga gggaatgggg agtaggcccc gcccctaccg tcctttgcaa ataaaaatct 1080 agcggggcgg ggggggggag gagcaggaag tggcggtgcg agggctgctg cacagcgagc 1140 ggagccgcgg tccggacggc agcgcgtgcc ccgagctctc cgcctccccc cgcccgccag 1200 ccgaggcagc tcgagcccag tccgcggccc cagcagcagc gccgagagca gccccagtag 1260 cagcgccatg 1270 <210> 2 <211> 4610 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggaggcggtt tcaccgcggc cgccgcacgg ccgtcccgcc cgtcccgccc tccccaggtg 60 gctgtgagcg cacatctgac tgcgaagaaa cccaaagggc ccgaagtggg actttcccct 120 tcttgaaaaa gttgccactc ttgcaacttg agtattcttc cgcctcgaaa aatagccccg 180 cctgttaagc cccgcgggtg tccgcgctct gtgacctctg cagacacagg ccaaggggca 240 cggccggtga tccagacatt gcctgcctgg ggcgggcggg gctgggatgt ggggtgaggc 300 cctgggctag agccgatcca gagaagggac aatcctctag actgagaatg ggccctggtg 360 aacccaacct gcacgacccg agaagacgct ggggacagaa gtggccccgg tgggtgcctt 420 cagctatgag agcgactaga ggatttggcc aaactcttct ttgctttctt attacttgaa 480 taagtaaaat caagggtggt gaggcggcag cgcgcacggc ttcgcccccg ccccttccgc 540 caggcgggag acacgtcccc agcccgcctt cctttcccgc agggtccaca cgggtcgggc 600 cgggcgcgct cccgtgcagc cggctccggc cccgaccgcc ccatgcactc ccggccccgg 660 cgcaggcgca ggcgcgggca cacgcgccgc cgcccgccgg tccttccctt cggcggaggt 720 gggggaagga ggagtcatcc cgtttaaccc tgggctcccc gaactctcct taatttgcta 780 aatttgcagc ttgctaattc ctcctgcttt ctccttcctt ccttcttctg gctcactccc 840 tgccccgata ccaaagtctg gtttatattc agtgcaaatt ggagcaaacc ctacccttca 900 cctctctccc gccacccccc atccttctgc attgctttcc atcgaactct gcaaattttg 960 caataggggg agggattttt aaaattgcat ttgcaaagtt cggtgtctgg gctggcgagt 1020 gggggaggga gggaatgggg agtaggcccc gcccctaccg tcctttgcaa ataaaaatct 1080 agcggggcgg ggggggggag gagcaggaag tggcggtgcg agggctgctg cacagcgagc 1140 ggagccgcgg tccggacggc agcgcgtgcc ccgagctctc cgcctccccc cgcccgccag 1200 ccgaggcagc tcgagcccag tccgcggccc cagcagcagc gccgagagca gccccagtag 1260 cagcgccatg gccgggtgga acgcctacat cgacaacctc atggcggacg ggacctgtca 1320 ggacgcggcc atcgtgggct acaaggactc gccctccgtc tgggccgccg tccccgggaa 1380 aacgttcgtc aacatcacgg tactgcgagg cctgcgcggt ccggggcact gctccggttt 1440 ggaccctgag ggagggactt gggtgggggc gggcgcggtc tagggcgcgc agcgagaggc 1500 cctgactggg tgcttgccct ggaagcggcg cgaatggcgg ctgcacgtga gtgggtccct 1560 cagttgcccg taggtcctat gccccaggcg gcggcgccca tcccgcccgc taccccgctt 1620 tccgcgacgg ggcgttacat ccggggcaca gggcggggag gggcgcggcg cccggtgcgg 1680 cggcccactt ccgcctctcc cagggcgggg cggggacgcg cctcagtttt tactggggat 1740 tgggattgag aggggacccg gggatccttg gacccccagc tccccgtccg gctgccagcc 1800 cgcgtccctc taccattgtt tctcctggtg cggaagggag ccccaggcgc gtggtcttgg 1860 tcccttgccc accctctgtg ggcttctggc ccctcctaac tccgttagag agggcgaggc 1920 caccacacgc ccccccagct cagcacgttg gattcaacat tcctgcgagg ccaatcccgg 1980 aagtcccctc gccctccctt cccgccatcc ggcggggcct ggagcagggg aactttgtga 2040 gaagttctga gacagcataa gcgaaagtat attggtttac taccgctgct cccaccacca 2100 tctccctgtc cacactgccc ggaagtgggg agggggagcg gaagttcaaa agggggggga 2160 agggggtttc cgggcgggag gggaccggat gtgggggctt ggggtgaaag ggggaggggg 2220 gaaaggttcc cggggtacct agacccgaga gctggcctgc cgggtctggc ccctgtccac 2280 cttcaaaagt tttccaactt tcccggaaag cccccagggg tctgcttcct catctcagag 2340 cagagatacc tggagctaaa ctctaggtta cttggagacc caggcgtccg ggccctaaca 2400 gctcctgcag aacctttgac caaataaggg caaagttgct tctcttgcct cgcccgcccc 2460 cctcccttcc cctctccgct tctgcttttc ctgaaggaga gttctgagca tccaaaggct 2520 cctcacttac ctcactgact ccctttattt cctgggttta ctttccccat taacactgac 2580 atctaaatct ctagaggagt atgtcatccc ttcctccctg gttccatatt ctaagtttca 2640 gaatcatgat ctttttctgc actaacgtcc cacagtcctc agagtttctc acagttcatt 2700 gatgtgtact gagtatataa tttatactta gcccccacgg cggggtggtt ctcagaagtg 2760 gaagacaggt gggtctttgg agaacacggt gggaatcttg gtgcactgac taacttgatg 2820 ggcgcttggt tcctcttcca gccagctgag gtgggtgtcc tggttggcaa agaccggtca 2880 agtttttacg tgaatgggct gacacttggg ggccagaaat gttcggtgat ccgggactca 2940 ctgctgcagg atggggaatt tagcatggat cttcgtacca agagcaccgg tggggccccc 3000 accttcaatg tcactgtcac caagactgac aagagtgagt tcctgagtct tacccttcct 3060 ttagctccaa gatctctaat gtaccgcctt ctggtaatct tgagggtgct tttttgtgtg 3120 attccccaac atgaagggag tcagaccagt attgtgttcc ttgtctgctg gatgctggaa 3180 cacgggatag tccctccatt ctgtctcagt tcctcatctt gtaattcgaa gttgctgaac 3240 tgcattacct cttaaattac ttactgcctt gagctcggat tagaaactgt tttctaggag 3300 tataggtaga ttgttggggt cttgaatcat cgagttcatc gtttgagttc ttttgttaga 3360 acctggaggt ggcatgcaca tccacagccc tttctagcct gaacacatga atcaacagtc 3420 tatgagcctt tgacccctaa gtttttagtc tgttcctctc cagcgtttaa gcttgatttt 3480 cctcttttga aaagccttat tgtttcaggg tgactgacag cctgcctgtg tgtggtgggg 3540 gggcgggttg ggagagatga ggttgggtta cagcccccag ggctggacag ctgctgaaca 3600 gctggcaggg ggtggaattg tgacacctgg atcctagcct cctttctctt tcctcctcct 3660 ccagcgctag tcctgctgat gggcaaagaa ggtgtccacg gtggtttgat caacaagaaa 3720 tgttatgaaa tggcctccca ccttcggcgt tcccagtact gacctcgtct gtcccttccc 3780 cttcaccgct ccccacagct ttgcacccct ttcctcccca tacacacaca aaccatttta 3840 ttttttgggc cattacccca taccccttat tgctgccaaa accacatggg ctgggggcca 3900 gggctggatg gacagacacc tccccctacc catatccctc ccgtgtgtgg ttggaaaact 3960 tttgtttttt ggggtttttt ttttctgaat aaaaaagatt ctactaacaa ggtgctgtgt 4020 gatttgagct tgggtgtcag aatgggggat aggcactgtg acttgcctcc tttatcgtgg 4080 cttgggagca gggaggttga ggtactacaa ggtgcaggaa tttgagcttc tggccaggtg 4140 gccctgcccc tccacagtgg catttccagg cctaagtcct cagtgtgctg gtcaaattgg 4200 tggatgatgg aatagagcca tctggaccag agaatgggtg caggcctgca ggcaaggcag 4260 ggctagttga gtcatccttg tgggtggggc tcccccttct gagtcatagc aaatgccggc 4320 tggggctgtc cccatgacta taggttagtg tctctcagca ttcccttgct ccttatggct 4380 aaaggggtga ttccaccaaa gggttaagtt cacctgtgtg agaatgatct tacccttcct 4440 tagtccacaa agaaacaatt ttattagccc aagaagtgaa gacccagtcc ctctgcttgc 4500 cccagctcca ccccaaagcc cctcaaaagg ataggtgtgg gtaagggaga agcttgggat 4560 ggaatgtccc ctatccctca gaagactgga gggaagacga cggtctgtgc 4610 <210> 3 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Gly Trp Asn Ala Tyr Ile Asp Asn Leu Met Ala Asp Gly Thr 1 5 10 15 Cys Gln Asp Ala Ala Ile Val Gly Tyr Lys Asp Ser Pro Ser Val Trp 20 25 30 Ala Ala Val Pro Gly Lys Thr Phe Val Asn Ile Thr Pro Ala Glu Val 35 40 45 Gly Val Leu Val Gly Lys Asp Arg Ser Ser Phe Tyr Val Asn Gly Leu 50 55 60 Thr Leu Gly Gly Gln Lys Cys Ser Val Ile Arg Asp Ser Leu Leu Gln 65 70 75 80 Asp Gly Glu Phe Ser Met Asp Leu Arg Thr Lys Ser Thr Gly Gly Ala 85 90 95 Pro Thr Phe Asn Val Thr Val Thr Lys Thr Asp Lys Thr Leu Val Leu 100 105 110 Leu Met Gly Lys Glu Gly Val His Gly Gly Leu Ile Asn Lys Lys Cys 115 120 125 Tyr Glu Met Ala Ser His Leu Arg Arg Ser Gln Tyr 130 135 140 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPFN1_F <400> 4 gatgggcaaa caaggtgtc 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPFN1_R <400> 5 atgtgtgtgt atggaaagaa gg 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRPLPO_F <400> 6 caaaggaaga gtcggagga 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRPLPO_R <400> 7 caaagatgcc aacacaaagr aa 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MF1 <400> 8 tgcgaagaaa tttaaagggt tc 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MR1 <400> 9 acaatatcta aatcaccgac cgta 24 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UF1 <400> 10 gattgtgaag aaatttaaag ggttt 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UR1 <400> 11 aacaatatct aaatcaccaa ccata 25

Claims (23)

1. 삭제
2. 삭제
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5. 프로필린-1(Profilin 1, PFN1) 유전자 프로모터의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 검출용 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 피부노화는 광피부노화 또는 UV에 의한 피부노화인 것인, 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 메틸화는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열에서 81 내지 262번에 해당되는 뉴클레오타이드 서열에 존재하는 CpG 섬(CpG island)의 시토신(cytosine)에서 일어나는 것인, 조성물.
8. 제5항에 있어서, 상기 메틸화를 측정하는 제제는, PFN1 유전자의 메틸화 프로모터의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍인, 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 PCR 프라이머쌍은 서열번호 8 내지 11에서 선택되는 것인, 조성물.
10. 제5항에 있어서, 상기 PFN1 유전자 프로모터의 메틸화를 측정하는 제제의 검출은 PCR, 메틸화특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인, 조성물.
11. 제5항에 있어서, 상기 메틸화를 측정하는 것은 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 사용하여 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 서열분석으로 수행되는 것인, 조성물.
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20. PFN1 유전자의 메틸화 프로모터의 메틸화를 측정하는 단계를 포함하는 피부노화 또는 피부노화 진행단계의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 메틸화 프로모터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열에서 81 내지 262번에 해당하는 프로모터 서열의 뉴클레오타이드에서 메틸화가 된 것인, 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 메틸화의 측정은 PCR, 메틸화 특이 PCR (Methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (Real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것인, 방법.
23. 제20항에 있어서, 상기 메틸화를 측정하는 단계는 PFN1 유전자의 메틸화 프로모터의 메틸화된 CpG 섬을 포함하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 사용하여 증폭한 결과물의 생성 유무 또는 서열분석으로 수행하는 것인, 방법.

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