KR20110115039A - 피부 편평세포암 진단 또는 예후 마커인 ＧＳＴｐｉ 및 이의 용도 - Google Patents

피부 편평세포암 진단 또는 예후 마커인 ＧＳＴｐｉ 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 편평세포암 진단 또는 예후 마커인 GSTpi 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 GSTpi(glutathione S-transferease pi) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후용 키트, 편평세포암이 의심되는 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 시료로부터 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 마커 GSTpi를 검출하는 방법, 편평세포암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 편평세포암 치료제의 스크리닝 방법 및 편평세포암이 의심되는 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 시료로부터 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후 방법을 제공하는 것이다.

Description

피부 편평세포암 진단 또는 예후 마커인 ＧＳＴｐｉ 및 이의 용도{GSTpi, a marker for diagnosing or prognosing cutaneous Squamous Cell Carcinoma and uses thereof}
본 발명은 편평세포암 진단 또는 예후 마커인 GSTpi 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 편평세포암 조직에서 특이적으로 발현되는 GSTpi 유전자의 진단 및 예후적 활용을 포함하며, 본 발명에서 발굴한 마커 유전자는 편평세포암의 조기 진단 및 조직검사시 악성암 여부를 판단할 수 있는 유용한 진단법 또는 질병 예후의 예측 및 질병 중증도를 결정하거나 도출시킬 수 있는 예후방법을 제공하는 것이다.
암은 형질전환된 세포의 억제되지 않는 증식과 무질서한 성장 결과로 빚어지는 복합적인 질환으로서, 대부분의 암은 환경적 요인, 유전적 요인 등의 여러 원인에 의해 발암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자(tumor suppressor gene)에 변이가 일어나 발생한다. 암세포는 초기에는 증식하여 인접한 조직에 침투하여 이를 파괴하다가, 점점 순환계를 침범하여 암 발생부위로부터 멀리 떨어진 신체의 다른 부위로 전이되어 결국 개체를 죽게 한다.
이러한 암을 치료하기 위하여 외과적 수술, 방사능 요법, 화학 요법 등이 다양하게 사용되고 있으나, 현재까지 암에 있어서 가장 유용한 치료방법은 암의 조기진단이다.
현재 임상에서 암의 진단은 문진(history taking)과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현존 임상검사법으로는 암의 세포수가 10억개, 암의 직경이 1cm 이상이 되어야 진단이 가능하다. 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며, 실제 절반 이상에서 암이 이미 전이되어 있다. 한편, 암이 직간접으로 생산하는 물질을 혈액 내에서 찾는 종양 마커(tumor markers)가 암 선별검사(cancer screening)에 이용되는데, 이는 정확도에 한계가 있어서 암이 있을 때도 약 절반까지 정상으로 나타나며, 암이 없을 때도 종종 양성으로 나타나서 혼란을 야기한다.
상기한 바와 같이, 암의 진단이 어려운 것은 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 따라서 암을 근원적으로 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준에서 접근할 필요가 있다.
암의 확인에서 분자진단법의 중요성은 증가하고 있다.
이러한 중요성은 암의 조기진단이 항암치료 성공률과 매우 높은 상관관계를 가지는데 기인한다. 예를 들어 신장암, 췌장암, 폐암 등은 조기진단 방법이 개발되어 있지 않고 암 발달에 따른 환자의 자각증상이 없어 많은 환자들은 중기이후 및 말기에 암을 발견하고 있으며 이러한 암들의 항암치료 성공률은 매우 낮게 나타나는 특징을 갖는다.
특히 신장암의 경우 조기진단에 성공한 경우 치료 후 완치율은 약 90%에 이르는 효과적 치료를 보이나 말기에 발견하는 경우 항암치료 성공률은 불과 15% 미만으로 나타나다. 췌장암, 폐암 등에서도 이러한 치료 성공율의 관건은 진단의 시점과 높은 상관관계를 보인다.
암의 조기진단이 기존의 방법으로 어려운 이유는 조기암의 경우 암의 용적이 매우 작아 X-ray, CT scan, endoscopy 등의 방법으로 쉽게 발견되지 않는다. blood test 의 경우 분자진단법이 개발된 경우 사용이 가능하나 현재로서는 매우 제한적이다.
따라서 민감한 분자진단법의 개발이 필요하며, 이를 위해서 암 특이적 마커의 개발이 중요하다.
편평세포암은 표피의 각질형성세포에서 유래한 악성종양이다. 종양의 크기 및 깊이, 원인, 해부학적 위치, 조직학적 특성에 따른 전이 등의 생물학적 양상이 기저세포암보다 복잡한 피부암이다. 중간층을 차지하는 유극층을 구성하는 세포에서 발생하는 암으로서, 우리나라에서 기저세포암과 함께 가장 많은 피부암의 하나이다.
편평세포암의 발생빈도는 각 나라마다 혹은 환경과 관련된 직업에 따라 다양하다. 전체 피부암 중에서 과거에는 67.6%로 가장 흔한 피부암이었으나 최근에는 20.5%까지 보고되어 비율은 다소 감소되나 절대적인 환자수는 증가하는 경향을 보이고 있다. 한국인의 발생 연령도 40대 이상에서 주로 발생하고 60대에 가장 많았으며 남녀비는 1.44:1로 최근 보고된 바 있다. 편평세포암의 발생 부위는 호주나 미국의 텍사스에서는 일광노출과 관련된 얼굴, 목, 팔 등에서 많고 뉴기니아 흑인에서는 화상 또는 외상성 반흔이 잘 생기는 다리에 흔하고 태국 또는 인도네시아 같이 일광 노출과 궤양 및 반흔이 함께 중요한 원인으로 관여하는 경우에는 얼굴, 목, 하지에 골고루 발생한다. 우리나라에서는 일광 노출 부위인 얼굴에 과반수에서 발생하고 특히 입술, 뺨 등에 잘 생기며 하지에서도 1/5에서 발생하여 반흔도 중요한 유발인자로 생각되고 있다. 이는 일본의 경우와 비슷하다.
편평세포암은 피부뿐만 아니라 점막에서도 발생하며, 발생부위나 발생요인에 따라 증상은 다양하다. 일반적으로, 비교적 크고 불균일한 모양의 붉은 피부가 부어 올라 살덩어리가 부서진 것처럼 보이며, 만졌을 때 응어리가 있는 경우에는 주의해야 한다. 종양이 커지면 그 모양이 꽃양배추로 비유되기도 한다. 그 외의 자각증상은 특별히 없지만, 편평세포암에서는 종양(암)의 표면이 약해지게 되므로 일반세균에 의한 감염이 잘 일어나며 농이 나오거나 악취를 내기도 한다.
정확한 진단을 위해서는 국소마취를 하고 피부병변의 일부를 잘라내어 현미경으로 조사하는 피부생검을 해야 한다. 그 외에 종양의 침윤 (주위로 퍼지는 것) 깊이나 전이 등, 병의 확산 정도를 알아보기 위해서 흉부 X선검사와 복부의 초음파검사를 비롯해, 방사성동위원소를 사용한 검사, CT스캔이나 MRI 등의 정밀검사를 필요에 따라 실시한다. 검사를 통해 암이 어느 정도 진행되었는지를 확인하고 그에 맞추어 치료법을 선택한다.
한국특허공개 제2000-0069452호에는 구강 편평세포암에 대한 류코트리엔 길항제가 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2007-0115976호에는 편평상피세포암 관련 항원을 지표로 하는 피부 성상의 평가방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2007-0112208호에는 편평상피세포암 관련 항원 발현의 억제에 의한 건선, 편평상피세포암 및/또는 부전각화의 치료를 위한 방법 및 의약 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 편평세포암 진단 마커인 GSTpi에 대해서는 개시되어 있지 않다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 편평세포암을 진단 또는 예후하기 위한 마커를 개발하기 위해, 편평세포암 환자의 암 조직 및 쥐에 자외선으로 편평세포암을 유발시킨 후 추출한 암 조직을 대상으로 편평세포암 조직과 정상 조직 간에 phase 2 효소들의 발현 차이를 조사하였고, 이를 통하여 편평세포암의 암조직에서만 특이적으로 과발현되는 신규 편평세포암 마커를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 GSTpi(glutathione S-transferease pi) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 편평세포암이 의심되는 환자의 시료로부터 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 마커 GSTpi를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 편평세포암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 편평세포암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 편평세포암이 의심되는 환자의 시료로부터 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후 방법을 제공한다.
본 발명은 편평세포암 조직에서 특이적으로 발현되는 GSTpi 유전자의 진단적 활용을 포함하며, 본 발명에서 발굴한 마커 유전자는 편평세포암의 조기 진단 및 조직검사시 악성암 여부를 판단할 수 있는 유용한 진단법 및 질병 예후의 예측 및 질병 중증도를 결정하거나 도출시키는데 사용될 수 있다.
도 1은 인간 피부의 기저 상피층 위에서 발현되는 Phase 2 효소를 나타내는 그림이다(Phase 2 효소는 HO-1(heme oxygenase-1), NQO-1(NADP(H):quinone oxidoreductase-1), GSTpi(glutathione S-transferease pi), Prx I(peroxiredoxin I)이다).
도 2a는 KC(keratinocytes) 분화 동안 상향 조절되는 Phase 2 효소를 나타낸다. (A)는 시험관 내에서 KC 분화를 유도하기 위해, 정상의 인간 상피 케라티노사이트(NHEKs)를 세포가 컨플루언트 단계에 도달한 이후(post-confluence) 9일까지 배양시켰다. (B)는 같은 조건에서, 마지막 분화에서 NHEKs를 유도시켰을 때 HO-1, NQO-1, GSTpi 및 Prx I인 Phase 2 효소는 상향 조절되었다. 대조구로 NHEKs는 컨플루언트 이전 단계에서 수득하였다. 도 2b는 도 2a (B)의 샘플로 RT-PCR 실험을 수행한 결과이다.
도 3은 시험관 내에서 Phase 2 효소의 KCs 분화-의존적 유도를 더욱 확실하게 입증하기 위해, NHEKs에 고농도 칼슘 처리에 의한 분화를 인공적으로 유도시킨 결과로, 도 3a는 위상차 영상(Phase contrast images)으로 관찰한 결과이다. 도 3b는 NHEKs 분화 마커로써 K1 발현을 웨스턴 면역 블럿으로 확인한 결과이고, 도 3c는 NQO-1 발현을 공초점 현미경(confocal microscopic)으로 관찰한 결과이다(스케일 바: 20㎛).
도 4는 고-칼슘 처리된 KCs는 ROS를 생산하는데, 이것이 phase 2 효소를 유도하는데 중요한 기능을 수행하는지 알아본 결과이다. 도 4a는 NHEKs에 37℃에서 15분 동안 10μM의 DCF-DA를 처리하고, 40분 동안 1.2 mM Ca+2 을 처리 및 비처리 후 배양한 결과를 나타낸다. 도 4b는 ROS의 기능을 평가하기 위해, ROS 제거제로 5mM NAC를 처리 및 비처리 대조구(nil) 샘플의 웨스턴 블럿 결과이다. 도 4c는 ROS의 기능을 평가하기 위해, ROS 촉진제로 0.1 mM H2O2 를 처리 및 비처리 대조구(nil) 샘플의 웨스턴 블럿 결과이다.
도 5는 Nrf-2 경로가 KCs 분화 동안 활성화되는지 여부를 웨스턴 블럿 분석으로 알아본 결과이다. 도 5의 (A)는 Nrf-2 발현을 총 세포 추출물에서 확인한 것이다. (B)는 NHEKs에 1.2 mM Ca+2를 처리하였을 때, Nrf-2 발현을 세포질 및 핵 추출물에서 확인한 것이다.
도 6은 Nrf-2가 phase 2 효소들(phase 2 enzyme family)에서 중요한 전사인자인지 알아보기 위해, NHEKs의 Nrf-2 넉 다운(Nrf-2 knock-down)에서 siRNA(Nrf-2 small interfering RNA) 트랜스펙션(tansfection)을 수행한 결과이다. 도 6a는 NHEKs은 컨플루언트 단계 이후 9일까지 Nrf-2 siRNA로 트랜스펙션된 후 Nrf-2가 넉 다운된 것을 확인한 결과이다 ((A)의 a.웨스턴 블럿 결과, Nrf-2 단백질 레벨은 siRNA 트랜스펙션된 샘플에서 siRNA 트랜스펙션되지 않은 샘플과 비교하여 하향 조절되었다. b. RT-PCR에서, 1일에서 9일 사이 siRNA 트랜스펙션된 샘플의 Nrf-2 mRNA는 거의 소멸되었다). 도 6b는 phase 2 효소들이 Nrf-2 경로와 연관되었는지 평가하기 위해, Nrf-2 넉 다운에 의해 phase 2 효소의 발현 레벨의 변화를 조사하였다. 도 6c는 RT-PCR에서 NQO-1을 제외한 phase 2 효소의 mRNA 레벨은 대조구와 비교하여 하향 조절되었고, siRNA 트랜스펙션된(Si) 및 대조구 샘플(C) 사이에서 mRNA 레벨은 중요한 차이점을 보이지 않았다.
도 7은 Phase 2 효소가 인간의 피부 SCCs에서 상향조절되는 것을 확인한 결과이다. 도 7a는 Phase 2 효소의 발현 정도를 알아보기 위해 인간 피부 SCCs(C1-C4) 및 대조구 샘플로써 같은 환자로부터 인접한 정상의 피부 샘플로부터 추출한 단백질로 웨스턴 블럿 분석을 수행한 것이다(T는 SCC 샘플, C는 대조구 피부를 의미한다). 도 7b는 인간 피부 SCCs에서 강하게 발현되는 HO-1, NOQ-1, GSTpi 및 Prx I을 면역화학적 조직 염색법으로 관찰하였다.
도 8은 Phase 2 효소가 쥐의 피부 SCCs에서 상향조절되는 것을 확인한 결과이다. 도 8a의 (A)는 32주 동안 UVB 선을 조사한 SKH1 털없는 쥐의 등 피부에서 다발성 피부 암 덩이를 관찰하였다. (B)는 UVB 조사에 의해 잘 분화된 SCCs를 나타낸다(H&E stain, ×100). 도 8b는 UVB 유도된 SCCs 및 정상의 쥐 피부(대조구)로부터의 피부 추출물로 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과이다. SCC 샘플(n=10) 및 대조구(n=6)에서 HO-1, NOQ-1, GSTpi 및 Prx I의 발현은 상향조절되었다(t는 SCC 샘플, c는 대조구 피부).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GSTpi(glutathione S-transferease pi) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 편평세포암 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 편평세포암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 편평세포암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 편평세포암 진단 또는 예후 마커는 정상 세포 조직의 세포에 비하여, 편평세포암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 GSTpi(glutathione S-transferease pi) 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.
본 발명에서, 용어 “예후(prognosis)”란 편평세포암에 의한 피부 파괴의 진행속도, 즉, 편평세포암의 중증도의 증가 및 감소를 나타낸다.
GSTpi(glutathione S-transferease pi)의 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있으나(NC_000011), GSTpi의 기능 및 편평세포암과의 연관성은 전혀 알려지지 않았다.
본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 GSTpi가 편평세포암 진단 및 예후를 위한 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.
본 발명은 편평세포암 환자의 암 조직 및 쥐에 자외선으로 편평세포암을 유발시킨 후 추출한 암 조직을 대상으로 편평세포암 조직과 정상 조직 간에 phase 2 효소들에 대해 반 정량적 RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR) 및 웨스턴 면역 블럿을 실시한 결과, 편평세포암 환자의 암 조직과 정상 피부 조직 간의 GSTpi 발현의 차이를 확연히 구별할 수 있었고(도 7a 및 도 7b), 또한 쥐의 편평세포암 암 조직과 정상 피부 조직 간의 GSTpi 발현의 차이를 확연히 구별할 수 있었다(도 8a 및 도 8b).
본 발명에서, 용어 "GSTpi(glutathione S-transferease pi)의 발현 수준을 측정하는 제제"란 상기와 같이 편평세포암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 GSTpi의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다.
GSTpi의 발현 수준은 GSTpi 유전자의 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"이란 편평세포암을 진단 및 예후하기 위하여 생물학적 시료에서 편평세포암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, GSTpi 유전자의 핵산 서열이 (NC_000011) (NCBI) 에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 GSTpi 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 편평세포암을 진단 및 예후할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 GSTpi 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 편평세포암을 진단 및 예후할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 편평세포암 진단 또는 예후 마커 검출용 조성물은 GSTpi 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 구체적으로는, 염기서열 목록으로 표시되는 프라이머들이다.
본 발명에서 "단백질 발현 수준 측정"이란 편평세포암을 진단 및 예후 하기 위하여 생물학적 시료에서의 편평세포암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.
본 발명에서, 용어 "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 GSTpi에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 편평세포암 진단 또는 예후 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 상기 편평세포암 진단 또는 예후용 조성물을 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 편평세포암 진단 또는 예후 마커인 GSTpi의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 편평세포암 진단 또는 예후 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 GSTpi의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 또는 예후용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 GSTpi의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 편평세포암 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 편평세포암이 의심되는 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 시료로부터 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 마커 GSTpi를 검출하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 “환자의 시료”란 편평세포암 마커 유전자인 GSTpi의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 편평세포암 의심 환자 또는 편평세포암 확진 환자에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 편평세포암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단 또는 예후할 수 있다. 즉, 편평세포암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 편평세포암으로 추정되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 편평세포암으로 추정되는 세포를 편평세포암으로 예측할 수 있는 것이다.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 편평세포암 의심 환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 편평세포암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여 편평세포암 의심 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 실제 편평세포암 발병 여부를 진단 또는 예후할 수 있다.
mRNA 발현 수준 측정은 바람직하게는, 편평세포암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 편평세포암 진단 또는 예후 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 편평세포암 발생 여부를 간편하게 진단 또는 예후할 수 있다.
한편, DNA 칩은 상기 편평세포암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 편평세포암의 발병 여부를 판독할 수 있다.
단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 편평세포암 의심 환자 또는 편평세포암 확진 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 편평세포암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 편평세포암 의심 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 실제 편평세포암 발병 여부를 진단 또는 예후할 수 있다.
본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 편평세포암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-락타마제 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3 ]2+, [RU(bpy)3 ]2+, [MO(CN)8]4- 등이 포함되며 이에 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이에 제한되지 않는다.
단백질 발현 수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 편평세포암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 편평세포암 발병 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 편평세포암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 편평세포암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 편평세포암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 편평세포암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 피부 상피 조직 및 편평세포암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
또한, 바람직하게는, 상기 편평세포암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 편평세포암 발병 여부를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 편평세포암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 편평세포암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 편평세포암 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 GSTpi의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 편평세포암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. GSTpi의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 편평세포암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 편평세포암 치료 후보 물질의 부재 하에 편평세포암 세포에서의 본 발명의 마커 GSTpi의 발현 수준을 측정하고, 또한 편평세포암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 GSTpi의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 편평세포암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 편평세포암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 편평세포암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명은 편평세포암이 의심되는 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 시료로부터 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 편평세포암 진단 또는 예후 방법은 GSTpi 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 편평세포암 의심 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후 방법이다.
생물학적 시료에서 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명에서 용어 “생물학적 시료”란 편평세포암 발병에 의해 편평세포암 마커의 유전자 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 편평세포암 의심 환자 또는 편평세포암 확진 환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 편평세포암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여 편평세포암 의심 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 실제 편평세포암 발병 여부를 진단 또는 예후할 수 있다.
mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 편평세포암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
한편, DNA 칩은 상기 편평세포암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 편평세포암의 발병 여부를 판독할 수 있다.
또한, 본 발명은 GSTpi 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체를 편평세포암 의심 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후 방법을 제공한다.
생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 편평세포암 의심환자 또는 편평세포암 확진환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 편평세포암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 편평세포암 의심 환자 또는 편평세포암 확진환자에서의 실제 편평세포암 발병 여부를 진단 또는 예후할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
방법
1. SKH1 쥐 모델에서 피부 편평세포암(cutaneous SCCs)의 유도
동물 실험을 위해, 쥐를 취급하기 위한 공식적인 허가는 Chonnam National University Institutional Animal Care 및 Use Committee Animal Committee에서 획득하였다. 8주된 무모 쥐(SKH1 strain; Charles River Laboratory, Boston, MA)는 7.5 ~ 8 × 10-4 W/cm2/sec으로 발산하는 UVB 광구(FL 208.E; Toshiba Electric Co., Tokyo, Japan)가 장착된 UV 라디에이터에 의해, UVB를 조사하는 동안 자유롭게 움직일 수 있도록 자외선 우리(radiation cage)에서 키웠다(Kambayashi et al., J Dermatol Sci 27 Suppl 2001;1:S19-25). UVB 자외선량은 IL 1700 Research Light Meter (International Light, Newburyport, MA)로 측정하였다. 만성적인 UV 조사를 위해, 쥐에 8달 동안 일주일에 3회 번갈아 조사하였고, 총 자외선량은 대략 10 J/cm2으로 측정되었다. 실험구는 UVB-조사(n=10) 및 UVB-비조사 대조구(n=6)로 나뉘었다. 쥐는 정상의 음식과 수돗물을 먹였고, 실험하는 동안 Individually Ventilated Cages Rack System(Tecniplast, Casale Litta, Italy)에서 키웠다.
2. 쥐 및 암 환자로부터 피부 편평세포암의 피부조직 추출의 준비
인간 샘플을 얻기 전에, 지역 윤리 위원회 및 헬싱키 선언(The local Ethics Committee 및 the Declaration of Helsinki Principles)의 지침에 따라 수여자로부터 동의(informed consent)를 얻었다. 인간 및 쥐로부터 절단한 SCC 암 덩어리는 아이리스 가위(iris scissors)로 가능한 작은 조각으로 잘랐고, 즉시 액체 질소에서 얼렸다. 정상의 대조구 피부 샘플의 준비를 위해, 비-조사 SKH-1의 등 피부 및 SCC 환자의 암조직에 인접한 정상의 피부를 사용하였다. 냉동 샘플은 액체 질소를 포함하는 막자 사발로 분쇄하였고, 0.12g/ml RIPA 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 0.25% 디옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA [pH 8.0] 및 단백질 분해 효소 저해제 칵테일)를 넣고, 4℃에서 Teflon pestle (Omni, Kennesaw, GA)으로 모터로 작동되는 Potter-Elvehjem 균질기(motor-driven Potter-Elvehjem homogenizer)로 균질화시켰다. 균질물은 4℃, 25,000 x g로 20분 동안 윈심분리 시켰고, 결과적인 상층 분획은 면역 블럿에 사용하였다. 조직 추출물에서 단백질 총 양은 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce, Rockford, IL)으로 정량하였다. 샘플은 다음 실험까지 -70℃에서 보관하였다.
3. 시험관 내에서 KCs 분화의 유도
NHEKs은 인용문헌에 기술한 대로, 어린이의 부분적 음경(circumscribed foreskin)에서 분리하였다(Lee et al., J Invest Dermatol 2000;115:1108-1114). 세포는 5% CO2 배양기에서 인간 케라티노사이트 성장 물질 및 항생제(100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신)가 첨가된 기본적인 케라티노사이트 성장 배지(EpiLife; Cascade Biologics, Portland, OR)에서 배양하였다. NHEKs의 2번째에서 4번째 계대는 실험구 모두에 사용되었다. NHEKs은 인용문헌에 기술한대로, 세포가 컨플루언트 상태에 도달한 이후(post-confluence)에 연장된 배양을 통해 인공적으로 마지막 분화를 유도시켰다(Yun et al., Arch Dermatol Res 2005;296:555-559). 몇몇의 실험에서, NHEKs 분화는 1.2 mM CaCl2을 첨가한 배지에서 세포를 배양하여 고농도 칼슘(1.2 mM Ca+2)으로 유도시켰다.
4. NHEKs 로부터 세포질 및 핵 추출물의 제조
핵 및 세포질 추출물은 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약(Pierce)으로 수득하였다. 간단하게, 세포는 배양 플레이트로부터 긁어 내었고, 차가운(ice-cold) 세포질 추출 시약 I(CER I)으로 섞었고, 10분 동안 얼음에서 반응시켰다. 그 다음으로, 세포질 추출 시약 II (CER II)을 세포 부유물에 첨가하였고, 5초 동안 볼텍싱 하였다. 혼합물은 4℃, 18,000 ⅹ g로 5분 동안 원심분리하였다. 세포질의 단백질 분획으로 이용하고자 상층액을 모았다. 펠렛은 차가운 핵 추출 시약(NER)으로 얼음에서 한 시간 동안 진탕 배양하였다. 핵 추출물은 4℃에서 10분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하여 수득하였다.
5. 웨스턴 블럿팅
총 세포 추출물은 RIPA 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 0.25% 디옥시콜산, 1% NP-40, 1 mM EDTA [pH 8.0] 및 단백질 분해 효소 저해제 칵테일)로 초음파 분해하여 준비하였다. 원심분리(4℃, 18,000 x g, 15 분) 후, 상층액의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce)를 이용하여 측정하였다. 소듐 도세실 설페이트(SDS) 샘플 버퍼(50 mM Tris-HCl [pH 6.8], 10% 글리세롤, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루, 및 5% β-머켑토에탄올)에서 세포 추출물(30 mg)은 8%-10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리 시켰고, PVDF 멤브레인(0.45 ㎛; Millipore, Billerica, MA)으로 옮겼다. 블럭킹 용액(5% skim milk in Tris-buffered saline with 0.1% tween-20 [TBS-T])으로 상온(RT)에서 한 시간 동안 배양한 후, 단백질 밴드는 항-인간 K1 (1:10,000; Convance, Emeryvill, CA), 항-loricrin (1:2,000; Convance), 항-HO-1 (SPA-896, 1:2,000; Stressgen Bioreagents, Ann Arbor, MI), 항-NQO1 (ab28947, 1:1,000; Abcam, Cambridgeshire, UK), 항-GSTpi (ab-65977, 1;100; Abcam), 항-Nrf-2 (sc-722, 1:1,000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 항-lamin B (C-20, 1:200; Santa Cruz Biotechnology) 및 항-β-액틴 (ab-6276, 1:1,000; Abcam) 항체로 4℃에서 밤새 표지하였다. 항-Prx I 폴리클로날 항체는 인용문헌에서 기술한대로 1:2000으로 준비하여 사용하였다(Lee et al., J Invest Dermatol 2000;115:1108-1114). HRP-콘주게이티드 염소 항-토끼 IgG 항체 (1:5,000; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)는 인간-β-액틴의 예외로 이차 항체로 사용하였고, HR-콘주게이티드 항-마우스 IgG 항체(1:5,000; Jackson Immunoresearch)로 검출하였다. 면역 복합체는 ECL 키트 (Millipore)를 사용하여 관찰하였다. β-액틴 (총 또는 세포질 추출물) 및 lamin B (핵 추출물)은 각 라인에 로딩한 단백질 양을 표준화하기 위한 내부 기준을 위해 사용되었다.
6. 반 정량적 RT -PCR( Semi - quantitative RT - PCR )
총 RNA는 제조사의 지시대로 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Fremont, CA)를 이용하여 분리하였다. cDNA는 Omniscript RT 키트 (Qiagen)을 이용하여 1 mg의 총 RNA로부터 생성시켰다. 반 정량적 RT-PCR을 수행하기 위해 PCR-프리-믹스쳐 키트 (ELPIS, Taejeon, Korea)를 사용하였다. 각각의 효소의 PCR 반응은 다음의 프라이머로 수행하였다: HO-1 (정방향: caggcagagaatgctgagttc(서열번호 1), 역방향: gatgttgagcaggaacgcagt(서열번호 2)); NQO-1 (정방향: cagcgccccggactgcaccagagcc(서열번호 3), 역방향: gggaagcctggaaagatacccaga(서열번호 4)); GSTpi (정방향: gctgcgcggccctgcgcatgctg(서열번호 5), 역방향: gcaggttgtagtcagcgaaggag(서열번호 6)); Prx I (정방향: atgtcttcaggaaatgctaaaat(서열번호 7), 역방향: tcacttctgcttggagaaatattc(서열번호 8)); and GADDH (정방향: gtcttcaccaccatggagaaggc(서열번호 9), 역방향: cggaaggccatgccagtgagctt(서열번호 10)). 어닐링 온도는 다음과 같이 각각 수행하였다: HO-1는 58℃, NQO-1 및 Prx I는 60℃, GSTpi은 62℃. PCR 산물은 1.5% 아가로스 젤 전기영동을 이용하여 분석하였고, 사이버 세이프 DNA 젤 염색 버퍼(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 염색하였고, 발광성 이미지 분석기 (LAS 3000, Fujifilm, Tokyo, Japan)로 관찰하였다.
7. 면역 조직화학적 염색
면역 조직화학적 염색은 LSAB2®System-HRP (DakoCytomation, Carpenteria, CA)을 이용하여 수행하였다. 정상의 인간 피부 또는 피부 SCCs 샘플은 포르말린으로 고정시키고, 파라핀으로 블럭시켰다. 4 mm 두께의 절편은 자일렌으로 파라핀을 제거시켰고, 점진적 농도의 에탄올로 헹구었다. 내생의 퍼록시다제 활성을 차단시키기 위해, 절편은 3% 과산화 수소를 포함하는 메탄올로 5분 동안 고정시켰고, 그 다음으로 1:100으로 희석한 HO-1 (Stressgen Bioreagents), 1:150으로 희석한 NQO-1 (Abcam), 1:50으로 희석한 GSTpi (Abcam), 1:150으로 희석한 Prx I에 대한 1차 항체를 반응시키기 위해 TBS(Tris-buffered saline)로 RT에서 30분 동안 세척시켰다. 3분 동안 TBS로 두 번 세척시킨 후, 절편은 비오틴화 이차 항체(biotinylated secondary antibody)로 RT에서 15분 동안 두 번 반응시킨 후, 두 번 세척시켰다. 슬라이드는 스트렙트아비딘 호스라디쉬 퍼록시다제(streptavidin horseradish peroxidase)로 15분 동안 반응시켰고, TBS로 5분 동안 세척시켰다. 절편은 1.5분 동안 3-3' 디아미노벤지딘 기질-크로모겐 용액(3-3' diaminobenzidine substrate-chromogen solution)을 처리하였고, 5분 동안 증류수로 두 번 세척시켰다. 카운터 스테인(Counter stain)은 3분 동안 헤마토자일린(hematoxylin)으로 수행하였고, 증류수로 세척하였고, 플루오레슨트 마운팅 미디엄(fluorescent mounting medium, DakoCytomation)으로 고정시켰다. 음성 대조구 염색은 1차 항체를 제거하여 수행하였다.
8. 공초점 현미경 연구
공초점 현미경 관찰을 수행하기 위한 면역 세포 화학 염색(Immunocytochemical staining)으로 대표적인 phase 2 효소인 NQO-1 뿐만 아니라, Phase 2 효소를 위한 전형적인 전사적 인자인 Nrf2의 발현을 관찰하였다. NHEKs은 웰당 1×106 세포 농도로 슬라이드 챔버의 각각의 웰에 넣었다. NQO-1 및 Nrf2 염색에서 세포는 24시간 및 6시간 동안 각각 1.2 mM Ca+2 을 처리하였다. PBS로 세척한 후, 세포는 10분 동안 4% 파라폼알데히드(paraformaldehyde)가 첨가된 PBS로 고정시킨 후, 15분 동안 0.5% Triton X-100 (PBS-T)을 포함하는 PBS를 처리하였다. 세포는 한 시간 동안 1% BSA을 포함하는 PBS-T로 반응시켰고, 항-NQO-1 항체 (1:150; Abcam) 및 항-Nrf2 항체(Ser536, 1:100; Santa Cruz)로 4℃에서 밤새 염색시켰고, Alexa Fluor 488 염소 항-토끼 IgG (A11034, H+L, 1:100; Invitrogen)로 한 시간 동안 반응시켰다. 이미지는 레이저 스캐닝 마이크로스코프(laser scanning microscope, LSM 510; Carl Zeiss, Jena, Germany) 위에서 X20 objective로 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였고, LSM 5 브라우저 이미지 소프트웨어(LSM 5 browser imaging software)을 이용하여 분석하였다.
9. DCF - DA 에 의한 H 2 O 2 측정
세포내 ROS 생산은 인용문헌에서 기술한 대로 유세포 분석기(flow cytometer, FACScalibur, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 불소처리된 유도체(fluorinated derivative)인 DCF-DA (Invitrogen)를 이용하여 측정하였다(Heck et al., J Biol Chem 1992;267:21277-21280). 간단하게, 세포는 37℃에서, 15분 동안 10 mM DCF-DA로 반응시켰고, 40분 동안 1.2 mM Ca+2 을 첨가하거나 또는 첨가 없이 반응시켰고, PBS로 두 번 세척시켰다. 양성 형광 신호는 유세포 분석기 및 cell Quest software (여기 및 방출 파장은 각각 488 nm 및 530 nm; BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
실시예 1. Phase 2 효소는 분화-의존적 방법으로 피부 및 NHEKs 에서 조절된다.
KCs 분화와 연관된 새로운 기능을 평가하기 위해, 정상인 인간 상피에서 대표적인 Phase 2 효소의 발현 패턴을 면역 조직화학적 염색으로 관찰하였다. 해독(NQO-1 및 GSTpi) 및 항산화(HO-1 및 Prx I) Phase 2 효소 모두는 기저 상피층 위로부터 산발적으로 검출되었고, 기저 상피층 위에서 KCs는 분화되는 상태였다. 이 효소들은 상피 분화와 밀접하게 연관되었을 것으로 추측된다. 즉, 그들의 발현 패턴은 거의 동일하고, 낮은 피하에서 상층의 가장 밖의 외부층까지 발현 정도에 있어 점차적인 증가를 보였다(도 1). 우리는 시험관 내(in vitro )에서 KC 분화 동안 Phase 2 효소의 조절을 관찰하였다. 그 목적을 위해, NHEKs은 컨플루언트 상태(confluent status)에 도달한 이후(post-confluence)에 연장된 배양을 통해 인공적으로 분화를 유도하였다. 웨스턴 블럿 분석에서, K1은 컨플루언트 이후 삼일째 검출되었고, 로리크린(loricrin)은 컨플루언트 이후 5일째 검출되었는데, 이것은 KCs의 마지막 분화는 컨플루언트 이후에 인공적으로 유도 될 수 있다는 것을 의미한다(도 2a-A). 같은 조건에서, 컨플루언트 이전(미분화 NHEKs)에서 컨플루언트 이후(분화된 NHEKs)까지의 다른 시간대에서 세포를 수득하였다. 웨스턴 면역 블럿에 기초하여, HO-1, NQO-1, GSTpi 및 Prx I을 포함하는 모든 Phase 2 효소는 시간 의존적 방법에서 상향조절(up-regulated) 되었는데(도 2a-B), 이것은 Phase 2 효소는 KCs 분화의 늦은 단계에서 유도된다는 것을 의미한다. RT-PCR에서, K1 및 로리크린은 컨플루언트 이후 1 일째 및 3일째 되는 날 각각 유도되었다(도 2b). 또한, Phase 2 효소의 mRNA 레벨은 컨플루언트 이후 유도되어 분화된 NHEKs에서 상향 조절되었는데, 이것은 KCs 분화 동안 Phase 2 효소의 전사적 조절을 의미한다(도 2b). 이들 모두에서, Phase 2 효소 세트는 생체 내(in vivo) 상피에서와 시험관 내(in vitro) 상피의 KCs에서 분화-의존적 방법으로 조절된다.
실시예 2. 고농도-칼슘은 KCs 분화를 유도할 뿐만 아니라 Phase 2 효소의 상향 조절을 유도한다.
시험관 내에서 Phase 2 효소의 KCs 분화-의존적 유도를 더욱 확실하게 입증하기 위해, NHEKs에 고농도 칼슘 처리에 의한 분화를 인공적으로 유도시켰다. NHEKs이 대략 50-60% 세포 농도에 도달했을 때, 세포들에 1.2 mM Ca+2 을 처리하였고, 컨플루언트 이전 상태의 다른 시간대에서 세포를 수득하였다. NHEKs은 고농도 칼슘 처리 이후 24시간째에 세포 증식을 중단하였고, 응집을 형성하였으며, 여러 개의 초점에서 성층의 무더기(stratification mound)를 형성한 것을 위상차 영상(Phase contrast images)으로 관찰할 수 있었다(도 3a). NHEKs 분화 마커로써 K1 발현을 위한 웨스턴 면역 블럿에서, K1은 고농도 칼슘 처리 이후 24시간째에서 상향 조절되었고, K1의 현저한 유도는 처리 후 48-72시간째에 관찰되었다(도 3b). 대표적인 phase 2 효소인 NQO-1 발현을 공초점 현미경 (confocal microscopic)으로 관찰한 결과, NQO-1의 양성 형광 신호는 분화된 NHEKs의 세포질에서 현저하게 관찰되었는데, 이것은 1.2 mM Ca+2 처리 후 24시간째로 비처리 대조구 세포와는 대조적이다(도 3c).
실시예 3. ROS 는 KCs 가 분화하는 동안 Phase 2 효소 유도에서 중요한 기능을 수행한다.
ROS는 세포 신호에서 이차 전달자(secondary messenger)로서 세포 기능을 조절하는데 중요한 기능을 수행한다고 알려져 있다. 상피에서 ROS 내재적 소스로서, KC는 분화를 겪는 때 ROS를 생산하는 또 다른 근원이다(Tamiji et al., J Invest Dermatol 2005;125:647-658). 세포 간 H2O2 레벨의 정도를 비교하기 위해, 분화 및 미분화 KCs에서, NHEKs에 1.2 mM Ca+2 을 24시간 동안 처리하였고, 그 후, 세포내 H2O2 정도는 유세포 분석기(flow cytometric analysis)로 측정하였다. 2',7'-디클로로디히드로플루오레신 디아세테이트 (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCF-DA) 분석에서, H2O2 양성 형광 신호는 고농도 칼슘 처리에 의해 오른쪽으로 이동되었고, 이것은 미분화 세포와 비교하여 분화된 NHEKs은 H2O2을 만들어낸다는 것을 의미한다(도 4a). 분화-의존적 phase 2 효소 발현을 위한 ROS 기능을 평가하기 위해, NHEKs은 ROS 제거제 또는 ROS 촉진제를 전처리하였다. ROS 제거제로, NHEKs에 5 mM NAC을 전처리하였을 때, 각각의 컨플루언트 이후의 시간대로부터 HO-1, NQO-1, GSTpi 및 Prx I을 포함하는 Phase 2 효소의 상향 조절 발현은 NAC-미처리 대조구 샘플 발현의 정도와 비교하여 억제되었다(도 4b). ROS 촉진제로, NHEKs에 컨플루언트 후 9일째까지 매일 신선한 배양 배지와 0.1 mM H2O2 를 처리하였을 때, Phase 2 효소의 발현 정도는 더욱 촉진되었는데, 이것은 각각의 시간대에서 H2O2-미처리 대조구 샘플과 비교하여 좀 더 일찍 첨가할수록, 더 강한 효소들의 발현을 의미한다(도 4c).
실시예 4. Nrf -2 경로는 KCs 분화 동안 활성화된다.
Phase 2 효소는 Nrf-2 경로의 활성화에 의해 주로 매개된다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 Nrf-2 경로가 KCs 분화 동안 활성화되는지 여부를 알아보았다. 웨스턴 블럿 분석에 기초하여, Nrf-2 발현은 컨플루언트 이후 1-3일째 수확한 총 세포 추출물에서 상향 조절되었고(up-regulated), 그 후, 컨플루언트 이후 5일째 세포 추출물에서 하향 조절되었다(down-regulated)(도 5A). 동시에, NHEKs에 1.2 mM Ca+2를 처리하였을 때, Nrf-2 발현은 고농도 칼슘 처리 이후 3시간째 세포질 및 핵 추출물 모두에서 상향 조절되었다(도 5B). 핵 추출물에서, 상향 조절되는 Nrf-2 발현은 칼슘 처리 이후 12시간째에 감소되었다. Nrf-2 위치 연구를 위해, NHEKs에 1.2 mM Ca+2를 처리하였고, 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 형광 신호를 관찰하기 위해 6시간 이후에 세포를 수득하였다. Nrf-2를 위한 양성 형광 신호는 대조구 NHEKs의 세포질로부터 검출되었다. NHEKs에 1.2 mM Ca+ 2을 처리하였을 때, Nrf-2의 핵 이동 뿐만 아니라, 세포질에서 Nrf-2-양성 신호가 현저하게 증가 되었다.
실시예 5. NQO -1은 Nrf -2에 의존적이지만 다른 Phase 2 효소는 KCs 분화 동안 Nrf-2로부터 독립적이다.
Nrf-2가 phase 2 효소들(phase 2 enzyme family)에서 중요한 전사인자인지 알아보기 위해, NHEKs의 Nrf-2 넉 다운(Nrf-2 knock-down)에서 siRNA(Nrf-2 small interfering RNA) 트랜스펙션(tansfection)을 수행하였다. RT-PCR에서, Nrf-2 mRNA 발현 정도는 컨플루언트 이후의 각각의 시간대로부터 샘플과 비교하여 Nrf-2 siRNA-트랜스펙션된 NHEKs에서 거의 없어졌다(도 6a-Aa). 그러나, 웨스턴 블럿 분석에서, Nrf2 단백질 발현 정도는 하향 조절되었으나 Nrf2 넉 다운에 의해서 완전하게 없어지지는 않았다(도 6a-Ab). 같은 조건에서, NQO-1 단백질 발현은 Nrf2 넉-다운 NHEKs에서 현저하게 억제되었다. 그러나 HO-1, GSTpi 및 Prx I의 발현 정도는 트랜스펙션되지 않은 NHEKs(non-transfected NHEKs)와 비교하여 억제되지 않았다(도 6b). 같은 패턴에서, NQO-1 mRNA 발현은 Nrf2 넉-다운 NHEKs에서 현저하게 억제되었으나, HO-1, GSTpi 및 Prx I의 발현 정도는 트랜스펙션되지 않은 NHEKs(non-transfected NHEKs)와 비교하여 억제되지 않았음을 RT-PCR 실험에서 관찰할 수 있었다(도 6c).
실시예 6. Phase 2 효소는 인간 및 쥐의 피부 SCCs 에서 활성화되었다.
SCC은 KCs 분화를 연구하기 위해 생체 내(in vivo) 암 모델이란 점을 고려하여, 인간의 피부 SCCs에서 Phase 2 효소의 발현 정도는 대조구 샘플로써 같은 환자로부터 인접한 정상의 피부와 비교하였다. 웨스턴 블럿 분석에서, HO-1, NQO-1, GSTpi 및 Prx I의 발현 정도는 각각의 환자(C1-C4)로부터 피부를 조절하는 피부 SCCs에서 더 높았다(도 7a). 인간 SCCs의 면역화학적 조직 염색에서 Phase 2 효소 모두는 같은 패턴으로 검출되었다. 이것은 이 효소들이 keratinizing foci의 tumor nests 뿐만 아니라 분화된 KC에서 강하게 발현된다는 것을 의미한다(도 7b). 이러한 결과가 인간에서 관찰되는 것을 확인하기 위해, SKH-1 털 없는 쥐에 만성적인 UVB 조사에 의한 피부 SCCs의 동물 모델을 개발했다. 대략 14주 동안 쥐에 UVB 선을 조사하였을 때, 피부 암은 쥐의 등 세포에서 검출되었고, 쥐의 암 추출물을 준비하기 위해 32주에 희생시켰다. 등에서 검출된 다발성 암들(multiple tumors)에서, 본 발명자들은 피부 생체검사를 위해 한 마리의 쥐로부터 무작위로 3개의 암덩이를 선별했고, 병리 조직학적 검사를 수행하였다(도 8a-A). UVB-유도 암덩이들 중 모두는 잘 분화된 SCCs로 확인되었고, 과과립구증(hypergranulosis), 각막 비후증(hyperkeratosis), 이례적인 KCs(atypical KCs) 및 케라틴 펄(keratin pearls)로 보여졌다(도 8a-B). 암 및 대조구 피부 추출물의 웨스턴 블럿 분석에서, HO-1, NOQ-1, GSTpi 및 Prx I의 발현 정도는 비 조사 대조구 피부보다 UVB-유도 SCCs (n= 10, t1-t10)에서 더 높았다(도 8b).
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> GSTpi, a marker for diagnosing cutaneous Squamous Cell Carcinoma and uses thereof <130> PN10054 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 caggcagaga atgctgagtt c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gatgttgagc aggaacgcag t 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cagcgccccg gactgcacca gagcc 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gggaagcctg gaaagatacc caga 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gctgcgcggc cctgcgcatg ctg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcaggttgta gtcagcgaag gag 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgtcttcag gaaatgctaa aat 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcacttctgc ttggagaaat attc 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtcttcacca ccatggagaa ggc 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cggaaggcca tgccagtgag ctt 23

Claims (9)

  1. GSTpi(glutathione S-transferease pi) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 GSTpi 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 편평세포암 진단 또는 예후용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 GSTpi 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 것인 편평세포암 진단 또는 예후용 조성물.
  4. 제1항에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 GSTpi 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 편평세포암 진단 또는 예후용 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 편평세포암 진단 또는 예후용 키트.
  7. 편평세포암이 의심되는 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 시료로부터 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 마커 GSTpi를 검출하는 방법.
  8. 편평세포암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 편평세포암 치료제의 스크리닝 방법.
  9. 편평세포암이 의심되는 환자 또는 편평세포암 확진 환자의 시료로부터 GSTpi 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 편평세포암 진단 또는 예후 방법.
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