CN110317900A

CN110317900A - 一种快速检测csfv、getv、jev的多重rt-pcr引物组及检测方法

Info

Publication number: CN110317900A
Application number: CN201910473625.2A
Authority: CN
Inventors: 王川庆; 王新港; 陈陆; 常洪涛; 周峰; 王新卫; 杨霞; 李永涛; 刘红英; 王傲杰
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-06-01
Filing date: 2019-06-01
Publication date: 2019-10-11

Abstract

本发明涉及一种用于快速检测CSFV、GETV、JEV的多重RT‑PCR引物组，所述的多重RT‑PCR引物组是由用于检测CSFV的引物、用于检测GETV的引物和用于检测JEV的引物组成，该多重RT‑PCR引物组的序列如SEQ ID NO:1～6所示；所述的检测不以疾病诊断和/或治疗为目的。本发明还公开了快速检测CSFV、GETV、JEV的多重RT‑PCR方法，该方法实现在同一个反应体系中同时扩增三种病毒，减少了操作次数，极大的避免了交叉污染。该方法对动物源性食品、产品或有关样品中CSFV、GETV和JEV的检测与鉴别、公共卫生及流行病学调查等方面具有重要的应用价值。

Description

一种快速检测CSFV、GETV、JEV的多重RT-PCR引物组及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种快速检测CSFV、GETV、JEV的多重RT-PCR引物组及检测方法。

背景技术

猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是一种高度接触性、致死性的传染病，临床上发病猪表现为高热稽留、呼吸困难、便秘与腹泻交替、皮肤有点状出血，此外猪瘟病毒还可以导致妊娠母猪流产、死胎、弱仔等。日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)和盖他病毒(Getah virus，GETV)都是以蚊虫为主要传播媒介的人兽共患病病毒。乙型脑炎在我国人群和猪群中的感染较常见，在我国分布较为广泛。上述三种病原均为RNA病毒，临床均可引起妊娠母猪的繁殖障碍和流产。随着目前养殖业的不断扩张，同区域的养殖场密度增加，各猪群之间或者各养殖场之间的交流更加频繁，尤其是一些依靠蚊虫等为媒介的病原，加重了该类疾病在不同猪群间的流行可能性。因此，当发生上述病原混合感染时，会极大的增加鉴别难度，而病原的确定常需要借助实验室进行。其中RT-PCR是实验室常用检测方法之一，其具有快速、灵敏、成本低、操作简单等优点；该方法不仅能进行快速确定病毒种类，还能检测病毒的早期感染和潜伏感染。但是检测时如果使用扩增单种病毒的引物对待测样品进行鉴别，则可能需要准备多份样品扩增多次才能确定感染的病毒类型，另外还会引起交叉感染。

发明内容

本发明为解决单一RT-PCR操作繁琐、交叉污染风险高的问题，提供一种快速检测CSFV、GETV、JEV的多重RT-PCR引物组及检测方法。

本发明提供如下技术方案：

本发明首先提供一种用于快速检测CSFV、GETV、JEV的多重RT-PCR引物组，所述的多重RT-PCR引物组是由用于检测CSFV的引物、用于检测GETV的引物和用于检测JEV的引物组成，其中，

用于检测CSFV的引物的核苷酸序列为：

上游引物C-F：5’-GTCAACCAATGAGATAGG-3’，如SEQ ID NO:1所示；

下游引物C-R：5’-GGCAGACAAGGTAGAAAG-3’，如SEQ ID NO:2所示；

用于检测GETV的引物的核苷酸序列为：

上游引物G-F：5’-TTCCGATGGCATGATAAA-3’，如SEQ ID NO:3所示；

下游引物G-R：5’-GGGACAAACGAGGAGGTG-3’，如SEQ ID NO:4所示；

用于检测JEV的引物的核苷酸序列为：

上游引物J-F：5’-ACTTGGGTGGACTTG-3’，如SEQ ID NO:5所示；

下游引物J-R：5’-GGAGCATTGGGTGTT-3’，如SEQ ID NO:6所示；

所述的检测不以疾病诊断和/或治疗为目的。

上述的多重RT-PCR引物组能够用于制备检测CSFV、GETV、JEV的试剂。

本发明还提供了一种含有上述的多重RT-PCR引物组的试剂盒。该试剂盒可用于同时检测CSFV、GETV、JEV，该试剂盒的应用不以疾病诊断和/或治疗为目的。

本发明提供了一种用于同时检测CSFV、GETV、JEV的多重RT-PCR方法，包括以下步骤：

步骤1：合成用于检测CSFV、GETV、JEV的多重RT-PCR引物组；

步骤2：提取待检测样品的总RNA，然后以提取的总RNA为模板进行反转录，得到cDNA；

步骤3：以反转录得到cDNA为模板，采用步骤1合成的多重RT-PCR引物组进行PCR扩增反应；

步骤4：分析PCR扩增产物，结果判定；

所述的多重RT-PCR方法不以疾病诊断和/或治疗为目的。

优选地，步骤2中所述反转录的反应体系为：RNA模板与20μmol/L的随机引物各取2μL，RNase free dH₂O 10μL，10mmol/L dNTPs1μL，5×M-MLV buffer 4μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)和反转录酶M-MLV(200U/μL)各0.5μL；所述反转录的反应条件为：30℃10min，42℃1h，70℃15min，4℃5min。

优选地，步骤3中所述PCR扩增反应的反应体系为：上游引物G-F、下游引物G-R、上游引物J-F、下游引物J-R以及上游引物C-F、下游引物C-R各0.5μL，各引物的终浓度为0.4mmol；2×ES Taq Master Mix酶12.5μL；cDNA模板各1μL；灭菌后ddH₂O补足至25μL；所述PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec；52℃退火30sec；72℃延伸20sec；35个循环；最后72延伸10min。

优选地，步骤4中所述分析PCR扩增产物是对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中病毒的种类。当样品中有GETV时，扩增产物中会出现606bp左右的条带；当样品中有JEV时，扩增产物中会出现467bp左右的条带；当样品中有CSFV时，扩增产物会出现350bp大小的目的条带。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种能够快速检测CSFV、JEV和GETV三种病毒的多重RT-PCR方法。该方法可以对同一份样品获取的cDNA为模板，进行PCR扩增；并根据扩增产物的大小，通过琼脂糖凝胶电泳判断待检样品感染病毒种类，实现在同一个反应体系中同时扩增三种病毒。以上方法在实际操作中简便，减少了操作次数，极大的避免了交叉污染，节约检测时间和试剂消耗。由于建立的检测方法针对的病毒保守区基因扩增，其针对性强，灵敏度高。在临床检测中能够达到简便、经济、快捷和准确的检验要求。对动物源性食品或产品中CSFV、GETV和JEV的检测与鉴别、公共卫生及流行病学调查等方面具有重要的应用价值。

针对CSFV、JEV以及GETV的感染特点，通过建立的多重RT-PCR方法，实现在同一反应管中同时对三种病原体的鉴别检测，对早期检测和有效防控猪繁殖障碍性疾病的发生与蔓延具有重要的实际作用。

附图说明

图1：CSFV、JEV和GETV单一RT-PCR扩增产物；M：DL1000分子marker；5、10、15泳道为阴性对照；1～4、6～9、11～14泳道分别为CSFV、JEV和GETV不同退火温度PCR扩增产物(50.0℃，52.1℃，55.8℃，60.1℃)。

图2：CSFV、JEV和GETV多重RT-PCR扩增产物；M：DL2000分子marker；1泳道为多重RT-PCR扩增产物；2～4泳道分别为CSFV、JEV和GETV单一RT-PCR扩增产物；5泳道为阴性对照。

图3：CSFV、JEV和GETV多重RT-PCR不同引物浓度扩增产物；M：DL2000分子marker；第1～5泳道为不同引物浓度(20pmol/μL、10pmol/μL、5pmol/μL、1pmol/μL、0.5pmol/μL)RT-PCR扩增产物；第6泳道为阴性对照。

图4：CSFV、JEV和GETV多重RT-PCR特异性扩增产物；M：DL1000分子marker；1泳道为多重RT-PCR混合模板扩增产物；2～4泳道分别为GETV、JEV和CSFV单一模板扩增产物；5～10泳道分别为PPV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV、PRRSV多重RT-PCR扩增产物；11泳道为阴性对照。

图5：CSFV、JEV和GETV多重RT-PCR不同模板浓度扩增产物；M：DL2000分子marker；第1～5泳道为不同模板浓度RT-PCR扩增产物(GETV：2.32×10^-1ng～2.32×10^-5，JEV：2.61×10^-1ng～2.61×10^-5ng，CSFV：0.8×10^-1ng～0.8×10^-5ng)；第6泳道为阴性对照。

图6：CSFV、JEV和GETV多重RT-PCR 3次重复性扩增产物；M：DL2000分子marker；第1、3、5泳道分别为保存10d、20d、30d的混合cDNA模板扩增产物；2、4、6泳道为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1.1、试验用毒株及临床样品

猪繁殖与呼吸综合征病毒(HENPDS-2，KU950370.1)、盖他病毒(GETV-V1，KY399029.1)、猪细小病毒(HNZK-1，KJ201928.1)、猪圆环病毒(RUZHOU，EU418626.1)、猪传染性胃肠炎病毒(HN-NY2007，EU292747.1)、猪流行性腹泻病毒(CH/ZMDZY/11，KC196276.1)、猪伪狂犬病病毒(QXY，KF017331.1)均由河南农业大学禽病研究所分离保存。猪瘟兔化弱毒活疫苗(传代细胞源，云南生物制药有限公司，批号：20160X8)，猪乙型脑炎活疫苗(湖南中岸生物药业有限公司，批号：2013110X4)。临床流产胎儿样品均来自2016～2017年河南省不同地市猪场，共计74份。

1.2、引物设计与合成

根据GenBank上已报道的CSFV、GETV以及JEV的全基因组序列，对不同毒株基因组的比对和分析，筛选其较为保守的核酸片段，应用Primer5.0引物设计软件设计了三对针对上述三种病毒的特异性引物，并通过NCBI(https://www.ncbi.nih.gov/)对三对引物进行在线分析。最终筛选出三对引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。三对引物能够特异性的扩增出606bp(GETV)、467bp(JEV)以及350bp(CSFV)的特异性片段。

表1多重RT-PCR的引物序列信息

实施例2

待测样品RNA的提取：选取疑似发病动物的流产胎儿，无菌采集其内脏组织约5g，在超净操作台用手术剪刀将上述病料组织剪碎，用PBS按照5:1(W/V)进行稀释后，放置-70℃反复冻融三次后，使用TRlzon总RNA提取试剂盒提取样品总RNA。提取的RNA用1‰的DEPC水溶解，-70℃保存备用。

对照用病毒液的RNA提取：使用TRlzon总RNA提取试剂盒分别提取对照用病毒液的总RNA，最后将RNA溶于1‰的DEPC水中，-70℃保存备用。

反转录反应条件：30℃10min，42℃保温1h，后70℃保温15min后4℃保温5min，得到的cDNA保存于-20℃，用于PCR扩增。

表2反转录PCR体系

DNA的提取：按照常规的蛋白酶K法分别提取PRV、PPV、PCV2的DNA，-20℃保存。

实施例3单一PCR扩增及扩增序列验证

取保存的GETV、CSFV和JEV的cDNA为模板，利用实施例1中设计的3对特异性引物分别进行单一PCR扩增。单一PCR反应体系如表3。反应条件为95℃5min，95℃30s，50～60℃30s，72℃30s，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。RT-PCR产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。试验结果如图1所示，将上述PCR产物经纯化试剂盒纯化目的基因，由生工生物工程(上海)有限公司测序。测序结果显示其与对应毒株的核苷酸序列完全一致。

表3 PCR反应体系

试剂	25μL反应体系
		2x EsTaqMasterMix	12.5μL
上游引物(20pmol/μL)	0.5μL
		下游引物(20pmol/μL)	0.5μL
Template cDNA	2.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	补充至25μL

实施例4多重RT-PCR反应

4.1多重RT-PCR反应体系及反应条件优化：

在反应条件不变的条件下(95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火20s，72℃延伸30s，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min)，将相同浓度的GETV、JEV以及CSFV cDNA混合后作为多重RT-PCR模板，对多重RT-PCR反应条件，包括引物终浓度、反应体系体积进行优化。

引物浓度筛选：所用反应体系：2×ES Taq Master Mix 12.5μl，3对上、下游引物各0.5μl，cDNA模板各1μl，ddH₂O补足25μl；选取20pmol/μL、10pmol/μL、5pmol/μL、1pmol/μL、0.5pmol/μL共计5个不同的引物浓度梯度进行PCR扩增，进行引物浓度筛选，结果如图3所示。

反应体系体积的筛选：在引物浓度为10pmol/μL条件下，分别选择12.5μL、25μL和50μL的反应体系进行扩增。

考虑经济性和操作简便性，最终选择的多重RT-PCR反应体系为：2×ES TaqMaster Mix 12.5μl，3对上、下游引物各0.5μl(10pmol/μL)，cDNA模板各1μl，ddH₂O补足至25μL；引物浓度为10pmol/μL。

利用上述优化的条件对GETV、JEV以及CSFV进行多重RT-PCR扩增，电泳结果显示，多重RT-PCR可同时扩增出GETV 606bp和CSFV 350bp以及JEV 467bp特异性目的条带，与单一RT-PCR结果一致(图2)。

4.2多重RT-PCR特异性试验：

在建立的多重RT-PCR反应条件下对CSFV、GETV以及JEV的混合cDNA模板及CSFV、JEV、GETV、PRRSV、TGEV、PEDV的单一cDNA模板，PRV、PPV、PCV2的单一DNA模板及ddH₂O进行扩增，扩增结果显示(如图4)，只有CSFV、GETV以及JEV的混合cDNA模板和CSFV、GETV和JEV的单一cDNA模板扩增出与目的片段大小相符的条带。对扩增出的GETV病毒的PCR扩增产物进行基因测序，并对扩增产物序列与参考引物序列进行生物信息学软件分析，两者核苷酸同源性达到99％以上，分析结果证实PCR扩增产物为GETV病毒。

4.3多重RT-PCR敏感性试验

利用分光光度计分别测定CSFV、JEV和GETV的cDNA浓度分别为0.8ng、2.61ng和2.32ng，用灭菌双蒸水对其10倍比梯度稀释，取10^-1～10^-5稀释度进行检测，将各稀释度cDNA作为模板进行PCR扩增，检测最小检出量。

如图5，三种病毒cDNA混合物扩增结果表明，该方法对GETV、JEV以及CSFV的cDNA最小检出量分别为2.32×10^-5ng、2.61×10^-5ng以及0.8×10^-4ng。

4.4多重RT-PCR重复性试验

利用优化后的多重RT-PCR，以CSFV、JEV和GETV的混合cDNA为模板，其中CSFV、JEV和GETV的cDNA浓度均为0.8ng，选择不同时间点(病毒核酸提取后每隔10d)进行重复检测3次。如图6所示，每隔10天扩增1次，连续扩增3次，均为阳性；保存一个月后的cDNA模板其PCR仍能扩增明亮条带。多重RT-PCR具有良好的可重复性。

实施例5临床初步应用

利用本发明所述的多重RT-PCR引物组进行如下样品的RT-PCR检测，样品包括市售猪乙型脑炎活疫苗、猪瘟疫苗以及河南农业大学禽病研究所分离并保存的盖他病毒(GETV-V1株)作为阳性样品；河南农业大学禽病研究所于2016～2017年采集的74份流产胎儿样品作为临床检测样品。

将检测结果与单一PCR检测结果进行比较分析，检测结果如表4所示，本发明多重RT-PCR检测试剂盒对临床病料检测结果与单一PCR检测结果的吻合率达到100％。

表4临床样品检测结果

猪瘟病毒和乙脑病毒是临床引起母猪繁殖障碍的常见病毒，可引起母猪流产和死胎，而且后者还是重要的人畜共患病病原；盖他病毒也可感染人和多种动物，在人及多种动物(马、猪、牛、羊、鸟类以及袋鼠等)体内均能检测到抗体存在，因此有极大的公共卫生潜在威胁。及时检测鉴定这些病毒，不仅对畜牧业健康发展至关重要，而且也具有非常重要的公共卫生意义。传统的检测方法如病毒分离培养、免疫学以及动物实验等耗时长，灵敏度低。而RT-PCR作为现代检测和诊断新技术，其具有灵敏度高、特异性好和方便快捷等诸多优点；与单一PCR相比，多重PCR省工、省力、简便、经济，极大的缩短了临床样品的检测和鉴别时间。

本发明针对目前临床容易引起猪流产和人兽共患病病原为检测对象，建立多重RT-PCR检测试剂盒。检测对象涉及猪瘟病毒、乙脑病毒和盖他病毒。上述病原不仅在猪群中具有较大危害，其潜在的公共卫生意义尤为重要。对检测疫病的流行和预防具有重要的应用价值。

本发明建立的多重RT-PCR灵敏度高，最低检测量达到10^-2pg级；且可以特异性的扩增目的基因；对提取的RNA含量要求较低，反应体系简单易于操作。与单一RT-PCR方法比较，多重RT-PCR与其阳性吻合率为100％，

综上所述；本发明提供了一种可以特异、灵敏地检测猪乙脑病毒、盖他病毒和猪瘟病毒的多重RT-PCR引物组和检测方法，对动物源性食品、产品及相关材料中GETV、JEV和CSFV的检测与鉴别、混合带毒的检测、公共卫生及流行病学调查等具有重要的应用价值。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 一种快速检测CSFV、GETV、JEV的多重RT-PCR引物组及检测方法

<130> 无

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gtcaaccaat gagatagg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

ggcagacaag gtagaaag 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

ttccgatggc atgataaa 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

gggacaaacg aggaggtg 18

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

acttgggtgg acttg 15

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

ggagcattgg gtgtt 15

Claims

1.一种用于快速检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR引物组，其特征在于，所述的多重RT-PCR引物组是由用于检测CSFV的引物、用于检测GETV的引物和用于检测JEV的引物组成，其中，

用于检测CSFV的引物的核苷酸序列为：

上游引物C-F：5’-GTCAACCAATGAGATAGG-3’；

下游引物C-R：5’-GGCAGACAAGGTAGAAAG-3’；

用于检测GETV的引物的核苷酸序列为：

上游引物G-F：5’-TTCCGATGGCATGATAAA-3’；

下游引物G-R：5’-GGGACAAACGAGGAGGTG-3’；

用于检测JEV的引物的核苷酸序列为：

上游引物J-F：5’-ACTTGGGTGGACTTG-3’；

下游引物J-R：5’-GGAGCATTGGGTGTT-3’；

所述的检测不以疾病诊断和/或治疗为目的。

2.权利要求1所述的多重RT-PCR引物组在制备检测CSFV、GETV和JEV的试剂中的应用。

3.含有权利要求1所述的多重RT-PCR引物组的试剂盒，该试剂盒的应用不以疾病诊断和/或治疗为目的。

4.一种用于同时检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：合成权利要求1所述的用于检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR引物组；

步骤4：分析PCR扩增产物，结果判定；

所述的多重RT-PCR方法不以疾病诊断和/或治疗为目的。

5.根据权利要求4所述的一种用于同时检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤2中所述反转录的反应体系为：RNA模板与20μmol/L的随机引物各取2μL，RNasefree dH₂O 10μL，10mmol/L dNTPs 1μL，5×M-MLV buffer 4μL，RNA酶抑制剂（40U/μL）和反转录酶M-MLV（200 U/μL）各0.5μL；所述反转录的反应条件为：30℃10min，42℃1h，70℃15min，4℃5min。

6.根据权利要求4所述的一种用于同时检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤3中所述PCR扩增反应的反应体系为：上游引物G-F、下游引物G-R、上游引物J-F、下游引物J-R以及上游引物C-F、下游引物C-R各0.5μL，各引物的终浓度为0.4mmol；2×ESTaq Master Mix酶12.5μL；cDNA模板各1μL；灭菌后ddH₂O补足至25μL；所述PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec；52℃退火30sec；72℃延伸20sec；35个循环；最后72延伸10min。

7.根据权利要求4所述的一种用于同时检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤4中所述分析PCR扩增产物是对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中病毒的种类。