CN112941215B - 泌尿系统真菌感染检测体系及其试剂盒和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种泌尿系统真菌感染检测体系及其试剂盒和应用，检测体系共有5对引物，其中包括3对检测引物和1对人DNA内参引物，1对系统质控内参引物。本发明的泌尿系统真菌感染检测体系及其试剂盒和应用不需要采用常规检测，可在同一反应体系内直接对尿液样本进行多种病原体的同步鉴定和定量分析，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、快速准确的优势，第一时间为临床提供全面、精准、低成本的病原学诊断，为个体化用药和精准医疗提供重要参考。

Description

泌尿系统真菌感染检测体系及其试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及一种多重基因检测产品以及该产品所用到的检测体系，属于生物技术领域。
背景技术
泌尿系统感染又称尿路感染（Urinary Tract Infections, UTI），是临床上最常见的感染性疾病之一。多种病原体可侵入泌尿系统并大量生长繁殖，引起尿频、尿急、尿痛、排尿困难和腰腿酸痛等临床症状，严重者可发展为脓毒血症和急慢性肾功能损害等重症疾病；而尿源性脓毒症及脓毒性休克进展极快，病死率高达28.3%～41.1%。超过50%的女性一生中至少经历一次UTI。研究发现，女性、年龄大、住院时间长、糖尿病史、外科手术侵入操作、导尿管留置时间长、使用抗菌药物种类等多种因素是诱发院内UTI的独立危险因素，这也是近年来医源性UTI不断增多的主要原因。同时，经验性用药和抗菌药物的滥用导致UTI病原菌的耐药性日益增强。此外，在相当多的UTI患者中，感染在短期内会复发多次。综上，UTI的高发生率、高耐药率和高复发率给患者带来巨大痛苦，给社会公共卫生系统带来了沉重的治疗与经济负担，甚至危及患者生命。
引起UTI的病原体种类繁多，尿样本中常分离到的病原菌依次为大肠埃希菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、奇异变形杆菌和无乳链球菌等。UTI感染以单一菌种为主，近些年两种以上细菌混合感染、以及合并厌氧菌、真菌或其他非经典微生物感染的复杂性UTI的发生日趋严重。值得注意的是，相当一部分UTI病原体如结核分枝感染、淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体等难以培养和鉴定。以泌尿系统结核（urinary tuberculosis, UTB）为例，其发病率约占全部结核病的4％，在肺外结核占比高达30％～40％，是肺外结核中最为严重的临床类型，但这些病原体漏检率极高，易造成假阴性和误诊。综上，UTB病原体的繁多与复杂导致其诊断难度加大、延误治疗、甚至引起严重的临床并发症。所以，快速、准确和全面的病原体检测是诊断和控制UTB的关键。
UTI发病率高，易反复感染，病程迁延，严重危害患者的健康及生活质量。早期快速、准确的病原学诊断对于治疗UTI至关重要。但是国内外UTI相关病原体和耐药检测的常规方法均不能满足临床精准诊疗的需求。目前常用的检测方法包括：1）培养鉴定：细菌或真菌培养是UTI相关病原体检测的金标准。该方法特异性高，可直接为临床提供明确的病原学诊断和体外药敏试验结果。但是培养鉴定存在许多不足：①耗时长：普通细菌培养孵育需要经过16～24h，对于生长缓慢且营养需求复杂的病原体甚至需要更长的时间；菌落生长后还需进行生化鉴定和药敏试验，至少需要3个工作日；②覆盖面不全，阳性检出率低：由于普通培养多针对单一病原体，而UTI中还有结核分枝杆菌、支原体等难培养但又极为重要的致病菌，常导致假阴性。2）免疫学方法：临床可采用胶体金、血清学等方法，快速检测尿样本中特定的病原体。但该方法检测谱窄，无法同步检测混合感染。3）分子生物学方法：近年来国内外部分微生物实验室采用荧光定量PCR法（RT-PCR），通过检测UTI常见病原体的特异性基因片段进行病原体的快速鉴定，可以大大提高阳性检出率。但是RT-PCR每次仅可检出一种特定的病原体或条件病原体，而无法同时检测/鉴定UTI相关的多种病原体。同时，该方法成本较高，每种病原体的PCR检测收费均在100元左右，单次20种临床最常见的UTI病原体全面检测费用至少需要1200元。 2017年3月，欧洲泌尿外科学会（European Association ofUrology, EAU）更新发布了泌尿系感染管理指南，指出“应尽早明确泌尿系统感染的病原体和药敏结果，以便临床选择最佳的抗菌药物治疗方案”。因此，目前急需一种可以快速并且同步检测多种泌尿系统感染病原体的检测技术和方法。
此外，不同的病原体引起的泌尿道感染的治疗的方法各不相同。
《国家卫计委2015年抗菌药物临床应用指导原则》明确指出：“抗菌药物的应用必须根据患者的症状、体征和实验室检查结果，明确诊断后可应用”。但是，目前的常规检测方法存在检出率低、耗时长、尤其无法同时对多种病原体进行准确鉴定等缺点，无法为临床提供及时、全面和准确的病原体诊断依据，导致临床普遍采用广谱性抗菌药物进行经验性治疗，造成疗效低下、不能及时控制尿路感染进展、诱发菌株高耐药率和增加患者医疗负担等问题。
对引起泌尿道感染的病原体进行定量检测有助于了解患者感染的病原体载量和评估病情严重程度，同时对病原体进行定性和定量检测能为临床提供更加全面的诊断信息，有助于临床医生采取更加准确的用药方案。例如，病原体在正常人体皮肤表面都有一定分布，属于定植菌。确定定植菌是否为感染的病原菌时，需要要确认该菌是否在数量上占优势。目前临床上区分感染或污染主要看病原体向活组织深部侵入程度、每克组织或样本的含病原体量是否达到一定域值。《现代泌尿外科诊疗指南》指出，中段尿定量培养病原体数＞105/mL为感染，＜103/mL则多为污染，如为103/mL～105/mL则不能排除感染的可能性，必要时需要重新采样进行复查。真菌、衣原体、淋病奈瑟菌、伤寒沙门菌、结核分枝杆菌及厌氧菌等需要做特殊培养。因此在对病原体感染类型进行定性的同时也应该进行定量，从而帮助临床医生明确尿培养病原体阳性是否是尿路感染引起，进而决定是否应采取抗生素干预治疗。病原体感染量对于临床医生评估患者的感染程度、制定合理的治疗方案具有重要意义。
此外，定量检测发现泌尿系统感染病原体含量较低时提示患者可能处于感染早期，从而警示临床医师及时采取治疗干预，避免患者病情加重。
综上所述，为了尽早明确泌尿系统感染病原体种类，同时对病原体进行定量检测，迫切需要开发新技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有快速、全面、准确、低成本优势的泌尿系统感染病原体检测体系，以及试剂盒，以及采用该检测体系在制备诊断产品方面的应用。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种泌尿系统感染病原体检测体系，包括分别针对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、人型支原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌进行检测的正反向引物，检测样本为尿液。
针对大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
针对铜绿假单胞菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对铜绿假单胞菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
针对肺炎克雷伯菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对肺炎克雷伯菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
针对阴沟肠杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对阴沟肠杆菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
针对鲍曼不动杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对鲍曼不动杆菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
针对奇异变形杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，针对奇异变形杆菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
针对无乳链球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，针对无乳链球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
针对屎肠球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，针对屎肠球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；
针对粪肠球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，针对粪肠球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
针对金黄色葡萄球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，针对金黄色葡萄球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；
针对白色念珠菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，针对白色念珠菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；
针对热带念珠菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，针对热带念珠菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；
针对光滑念珠菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，针对光滑念珠菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；
针对结核分枝杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，针对结核分枝杆菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；
针对沙眼衣原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示，针对沙眼衣原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示；
针对人型支原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示，针对人型支原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示；
针对解脲脲原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，针对解脲脲原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；
针对淋病奈瑟菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，针对淋病奈瑟菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。
上述泌尿系统感染病原体检测体系还包括针对人DNA内参进行检测的正反向引物和针对系统质控内参进行检测的正反向引物；针对人DNA内参的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示，针对人DNA内参的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示；针对系统质控内参的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示，以及针对系统质控内参的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.40所示。
系统质控内参可以是ß-globin基因。
针对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、沙眼衣原体、人型支原体、解脲脲原体淋病奈瑟菌、人DNA内参和系统质控内参的正向引物在检测体系中的终浓度均为200nM；针对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、沙眼衣原体、人型支原体、解脲脲原体淋病奈瑟菌、人DNA内参和系统质控内参的反向引物在检测体系中的终浓度均为200nM；针对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和结核分枝杆菌的正向引物在检测体系中的终浓度均为400nM；针对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和结核分枝杆菌的反向引物在检测体系中的终浓度均为400nM。
上述泌尿系统感染病原体检测体系还包括多重PCR预混液、多重PCR酶液和无核酸酶纯水；所述多重PCR预混液由10×PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs混合而成；所述多重PCR酶液由热启动DNA聚合酶和UNG酶混合而成。
所有正向引物上设有荧光标记，所述荧光标记为CY5或CY3或FAM。
上述泌尿系统感染病原体检测体系还包括阳性对照物和阴性对照物；所述阳性对照物是包括所有目的基因靶点的质粒混合物；所述阴性对照物是无核酸酶超纯水。
反应时体系中的组分用量为10×的PCR缓冲液1体积，10μM的dNTPs共0.2体积，25mmol/L的MgCl2溶液0.8体积，引物混合物1体积，5U/μL的热启动DNA聚合酶0.4体积，1U/μL的UNG酶0.5体积，DNA模板5体积，无核酸酶纯水1.1体积；所述DNA模板的使用量为5～50ng/体系。
本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种包括上述检测体系的泌尿系统感染病原体检测试剂盒。
本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述的检测体系制备泌尿系统感染病原体检测和诊断产品的应用。
本发明具有积极的效果：
（1）本发明的泌尿系统感染病原体的检测产品可以通过尿液，同时鉴别多种泌尿系统感染病原体，将所有目的基因的质粒等拷贝数混合在一起，通过调整各病原体的引物浓度，使各靶点出现的峰高相当，达到等效扩增所有靶基因的目的。可通过两种方法定量检测的病原体：标准曲线法和病原体峰面积与已知拷贝数IC的比值方法。该方法能对泌尿系统感染患者或疑似患者的尿液样本进行检测，提供关于泌尿系统感染病原体的病原学诊断信息，帮助临床医师在及时明确病原体种类并采取有效治疗方案，同时减少经验性抗生素使用，降低医疗成本。
(2) 本发明的泌尿系统感染病原体的检测产品，加入了防污染的UNG 酶，在基因扩增前有效消除基因扩增片段污染，确保结果的准确性和可靠性。
（3）本发明的泌尿系统感染病原体的检测产品，不同于传统凝胶电泳分析模式，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，因而检测结果无杂峰，确保了检测的特异性和灵敏度。经测试，本方法杂峰较少，显示高特异性；并可检测低至1000cfu/mL或10拷贝/μL的病原体，灵敏度较高。
（4）本发明的泌尿系统感染病原体的检测产品加入了人DNA内参和IC内参，确保了检测的准确性。人DNA内参可监控样品核酸提取质量，人DNA内参特征峰出现说明核酸提取成功，可有效避免核酸提取失败造成的假阴性；人DNA内参特征峰不出现说明核酸提取失败，可有效避免杂峰造成的假阳性。IC可监控PCR和毛细电泳的反应过程，IC特征峰不出现说明反应失败，可有效避免假阴性。在对样本进行核酸抽提的同时加入IC，作为系统质控内参用于监控整个检测过程的同时，可以对病原体进行相对定量。
（5）不同的病原体引起的泌尿系统感染的用药方案和治疗方法各不相同。《国家卫计委2015年抗菌药物临床应用指导原则》明确指出：“抗菌药物的应用必须根据患者的症状、体征和实验室检查结果，明确诊断后可应用”。但是，目前的常规检测方法存在检出率低、耗时长、尤其无法同时对多种病原体进行准确鉴定等缺点，导致临床普遍采用广谱性抗菌药物进行经验性治疗，造成疗效低下、不能及时控制泌尿系统感染、耐药菌株高发、浪费国家医疗资源和增加患者医疗成本等问题。本发明采用建立了一种高通量、快速、准确、低成本的泌尿系统感染病原体鉴定系统，可以同步检测18种泌尿系统感染常见的病原体，有效弥补常规检测方法检出率低、耗时长和不能同时进行多种病原体鉴定等缺点，可在2.5小时内明确病原体种类，以便临床采取正确的治疗方案和隔离措施，有效防止感染扩散和减少耐药菌株的产生。
附图说明
图1是本发明实施例1的试剂盒对混合阳性对照进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图2是本发明实施例1的试剂盒对阴性对照进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图3是本发明实施例1的试剂盒对样本1进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图4是本发明实施例1的试剂盒对样本2进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图5是本发明实施例1的试剂盒对样本3进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图6是本发明实施例1的试剂盒检测无乳链球菌的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线；
图7是本发明实施例1的试剂盒检测大肠埃希菌的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线。；
图8是本发明实施例1的试剂盒检测鲍曼不动杆菌的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线；
图9是本发明实施例1的试剂盒检测阴沟肠杆菌的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线；
图10是本发明实施例1的试剂盒检测屎肠球菌的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线；
图11是本发明实施例1的试剂盒检测金黄色葡萄球菌的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线；
图12是本发明实施例1的试剂盒检测人型支原体的梯度浓度模拟尿液的定量标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例
一、试剂盒的组成
本实施例的泌尿系统感染病原体检测试剂盒包括：多重PCR预混液、多重PCR酶液、引物混合物、阳性对照物、阴性对照物、系统质控内参（IC）和无核酸酶纯水。多重PCR预混液由10×PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs混合而成。多重PCR酶液由热启动DNA聚合酶和UNG酶混合而成。
多重PCR预混液和多重PCR酶液均来自Roche公司（货号：210212）。
阳性对照物是包括所有目的基因靶点的质粒混合物。
阴性对照物是无核酸酶超纯水。
引物混合物包括分别检测18种病原体靶基因的引物对，检测人DNA内参的引物对和检测系统质控内参（IC）的引物对，各引物序列的特征如表1所示，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
表1 引物序列特征表
二、试剂盒的使用方法
本实施例的泌尿系统感染病原体检测试剂盒的具体检测步骤如下：
（1）采集患者尿液样本：采集疑似或确诊为泌尿系统感染患者的清洁中段尿。
（2）样本核酸提取：取300μL清洁中段尿样本进行核酸提取，阳性对照和阴性对照各取80μL进行提取，每个参与提取的样本需加入3μL的IC共同提取。
（3）配制反应体系：根据说明书，按照每个反应多重PCR预混液2μL、多重PCR酶液0.9μL、引物混合物1μL、无核酸酶纯水1.1μL的比例配制反应体系，涡旋混匀后，用离心机进行离心，然后分装于PCR反应管中。
（4）加入核酸模板：将提取好的核酸加入到装有配制好的反应体系的PCR反应管中，每人份加入5μL核酸。
（5）多重PCR扩增；本试剂盒的PCR扩增反应条件见表2。
表2 多重PCR扩增条件
（6）对扩增产物进行毛细电泳分析，并根据峰型图进行结果判读。
取3500Dx遗传分析仪配套高度去离子甲酰胺（HiDi）8.75μL、SIZE-500 Plus 0.25μL，混合后加入PCR产物1μL 进行毛细电泳分离样品。根据峰型图的出峰位置大小判断病原体种类和数量。
三、试剂盒的检测结果判定
1．试剂盒有效性判定
同时满足下列条件，才可进行结果判定：
1) 阴性对照：只检测到系统质控内参特异峰。
2) 阳性对照：在各扩增片段长度处各检测到一个荧光信号，且荧光信号值高于500。
2. 样本有效性判定：
1) 若检测样本的荧光信号值至少有一个高于32000，则样本加入过量，建议对PCR产物进行适当稀释后再进行毛细管电泳检测。
2) 若检测样本的荧光信号值均低于500，则样本加入量较低，可适当增加PCR产物加入量或增加PCR反应循环数；若仍然不符合要求，需重新制备样本。
3. 结果判定标准
泌尿系统感染病原体鉴定：人DNA内参、系统质控内参和病原体基因的目的片段区域出现了相应的峰且荧光信号值均高于500，可以判断感染了相关病原体。
定量方法：通过检测相关泌尿系统感染病原体的梯度浓度（cfu/mL）模拟尿液或梯度浓度质粒，确定不同梯度浓度和相应的检测峰面积之间的相关性，制定标准曲线，进而根据检测样本的峰面积对病原体浓度进行相对定量，评估样本中所感染的病原体载量。具体的方法是以每种病原体的梯度浓度为横坐标，以各梯度浓度的检测峰面积为纵坐标，绘制定量标准曲线，确定不同浓度和相应的检测峰面积之间的相关性。所使用的数据分析软件为Origin 2018，所选函数类型为MichaeliMenten，R2值越接近1表示各病原体的梯度浓度和检测峰面积之间的相关性越强。
另外，还可以根据检测样本中的病原体与IC的峰面积比值对病原体进行相对定量。
4．结果判断实例
采用本实施例的试剂盒使用方法对对所有阳性对照的混合液进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后图谱如图1所示。基因的目标片段区域大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、人型支原体、解脲脲原体、淋病奈瑟菌、人DNA内参和系统质控内参共20个检测靶点均出现了相应的峰。该结果非常直观，基因均扩增良好。说明各引物之间没有干扰，能同时有效扩增所有目的基因。
采用本实施例的试剂盒使用方法对阴性对照进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图2所示，只出现了人DNA内参（Hum_DNA）和系统质控内参（IC）的特征峰，没有出现任何病原体的特征峰，只在小于100nt处有非特异性背景荧光信号。说明该检测体系特异性良好。
采用本实施例的试剂盒使用方法对单个泌尿系统感染病原体的阳性对照进行系列稀释，进行PCR反应后采用毛细管电泳分析，用于评估本方法检测18种病原体的灵敏度。如表3所示，本方法对13种病原体的检测最低灵敏度均为1000cfu/mL，对5种病原体的检测最低灵敏度均为10拷贝数/μL。说明该检测系统对泌尿系统感染病原体单重感染检测的灵敏度较高。
表3 泌尿系统感染病原体检测灵敏度
采用本实施例的试剂盒使用方法对样本1进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图3所示。人DNA内参和系统质控内参同时出现且信号值大于500，淋病奈瑟菌（NG）基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于500。根据结果判定标准，说明该患者感染了淋病奈瑟菌。淋病奈瑟菌（NG）基因的信号值为32167，峰面积为293179，检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒使用方法对样本2进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图4所示。人DNA内参和系统质控内参同时出现且信号值大于500，屎肠球菌（Efm）和大肠埃希菌（Eco）基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于500。根据结果判定标准，说明该患者感染了屎肠球菌和大肠埃希菌。屎肠球菌（Efm）基因的信号值为31268，峰面积为280581，大肠埃希菌（Eco）基因的信号值为31384，峰面积为179914，检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒使用方法对样本3进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图5所示。人DNA内参和系统质控内参同时出现且信号值大于500，沙眼衣原体（CT）和金黄色葡萄球菌（Sau) 基因的目标片段区域均出现了相应的峰且信号值大于500。根据结果判定标准，说明该患者同时感染了沙眼衣原体和金黄色葡萄球菌。沙眼衣原体（CT）基因的信号值为31952，峰面积为236416，金黄色葡萄球菌（Sau) 基因的信号值3462，峰面积为20089，检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒使用方法对无乳链球菌的梯度浓度模拟尿液进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图6所示。系列稀释的梯度浓度模拟尿液（103cfu/mL～106cfu/mL）的检测峰面积随着模拟尿液的浓度的增高而增高，无乳链球菌感染模拟尿液的浓度（cfu/mL）和检测峰面积（rfu）之间的相关系数R2＞0.99。
采用本实施例的试剂盒使用方法对大肠埃希菌的梯度浓度模拟尿液进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图7所示。系列稀释的梯度浓度模拟尿液（103cfu/mL～106cfu/mL）的检测峰面积随着模拟尿液的浓度的增高而增高，大肠埃希菌感染模拟尿液的浓度（cfu/mL）和检测峰面积（rfu）之间的相关系数R2＞0.99。
采用本实施例的试剂盒使用方法对鲍曼不动杆菌的梯度浓度模拟尿液进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图8所示。系列稀释的梯度浓度模拟尿液（103cfu/mL～106cfu/mL）的检测峰面积随着模拟尿液的浓度的增高而增高，鲍曼不动杆菌感染模拟尿液的浓度（cfu/mL）和检测峰面积（rfu）之间的相关系数R2＞0.99。
采用本实施例的试剂盒使用方法对阴沟肠杆菌的梯度浓度模拟尿液进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图9所示。系列稀释的梯度浓度模拟尿液（103cfu/mL～106cfu/mL）的检测峰面积随着模拟尿液的浓度的增高而增高，阴沟肠杆菌感染模拟尿液的浓度（cfu/mL）和检测峰面积（rfu）之间的相关系数R2＞0.99。
采用本实施例的试剂盒使用方法对屎肠球菌的梯度浓度模拟尿液进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图10所示。系列稀释的梯度浓度模拟尿液（103cfu/mL～106cfu/mL）的检测峰面积随着模拟尿液的浓度的增高而增高，屎肠球菌感染模拟尿液的浓度（cfu/mL）和检测峰面积（rfu）之间的相关系数R2＞0.99。
采用本实施例的试剂盒使用方法对金黄色葡萄球菌的梯度浓度模拟尿液进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图11所示。系列稀释的梯度浓度模拟尿液（103cfu/mL～106cfu/mL）的检测峰面积随着模拟尿液的浓度的增高而增高，金黄色葡萄球菌感染模拟尿液的浓度（cfu/mL）和检测峰面积（rfu）之间的相关系数R2＞0.99。
采用本实施例的试剂盒使用方法对人型支原体的梯度浓度模拟尿液进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图12所示。系列稀释的梯度浓度模拟尿液（10拷贝/微升～104拷贝/微升）的检测峰面积随着模拟尿液的浓度的增高而增高，人型支原体感染模拟尿液的浓度（拷贝/微升）和检测峰面积（rfu）之间的相关系数R2＞0.99。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 华东医院
宁波海尔施基因科技有限公司
<120> 泌尿系统真菌感染检测体系及其试剂盒和应用
<130> 无
<141> 2021-04-08
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 1
tctgtcaacg ctctacagtt ccggtaagac gc 32
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 2
gtatgcccat attgaagcgc cgtccagtaa 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 3
tctgtcaact agtgttcaac cggacctgtg g 31
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 4
gtatgcccat aatggttgcc tggtagtctt cgg 33
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 5
tctgtccaat agatttcaga atgcggagtc gttca 35
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 6
gtatgcccat atacgcgtcg atgccactcg gcc 33
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 7
tctgtcaact gcattcgcga aatgtcagat aacga 35
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 8
gtatgcccat cttactcatg ttcgttaccc atccac 36
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 9
tctgtcaaca caacgattag caactcgtct tagct 35
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 10
gtatgcccat atttaaacgt tgctgagcat acggaa 36
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 11
tctgtctgaa tattcctcac gccctgaata ttgtc 35
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 12
gtatgcccat atatctgatc ggtcaattcc caatgta 37
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 13
tctgtcaact acgacgtcac gctacatcca a 31
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 14
gtatgcccat gtaacgtccc ttgtttccct tgc 33
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 15
tctgtcaaca atgggctatg atgtaacgat gacg 34
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 16
gtatgcccat taggtagcca agctgaaacc atggc 35
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 17
tctgtcaacc tattccgatg ttaggtgtcg taact 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 18
gtatgcccat aaatcaggag gtaacgggaa gaaat 35
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 19
tgaagggtgc attatggacg ttagcgc 27
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 20
gtcgtgcttg cggatacata ttctctgc 28
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 21
tgtcaagtcc aacagaaacc caaatcg 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 22
gtaggcaaat aagcgtagat cccatag 27
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 23
tgactatatc gtcgtcgcgt ctgaatt 27
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 24
gtaggtagac gcggaactca atagaact 28
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 25
tgatctccga gatgtcatag cccttta 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 26
gtagactcgg ctcctgttta actgaat 27
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 27
tgaatgcgag ctcgagggat accagt 26
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 28
gtccagtaga ggacgccaag agggt 25
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 29
agggcttcct tacccataaa cttacgca 28
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 30
atgctgtgac ttgttgtagt gtgtgaa 27
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 31
tatcgatgcg gacacccaat acctgc 26
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 32
gtttgaaatc tccgttgccc ataccgg 27
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 33
tgccatagaa atgcacgaga ttacaa 26
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 34
gttggtgtac cattccaata ccagtt 26
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 35
cgcccataag tgccttacca agtata 26
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 36
tctgataccg caaccgctat tgtatac 27
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 37
tgtccgtgcc ccaaattcca g 21
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 38
gtctcggtca ggtctccca 19
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 39
ttgatggcac agtcgaggct g 21
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 40
gtggccgctt ttctggattc at 22

Claims (6)

1.一种泌尿系统真菌感染检测体系，其特征在于：包括分别针对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、人型支原体、解脲脲原体和淋病奈瑟菌进行检测的正反向引物，以及多重PCR预混液、多重PCR酶液和无核酸酶纯水；检测样本为尿液；
针对白色念珠菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，针对白色念珠菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；
针对热带念珠菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，针对热带念珠菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；
针对光滑念珠菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，针对光滑念珠菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；
针对大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
针对铜绿假单胞菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对铜绿假单胞菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
针对肺炎克雷伯菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对肺炎克雷伯菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
针对阴沟肠杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对阴沟肠杆菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
针对鲍曼不动杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对鲍曼不动杆菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
针对奇异变形杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，针对奇异变形杆菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
针对无乳链球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，针对无乳链球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
针对屎肠球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，针对屎肠球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；
针对粪肠球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，针对粪肠球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
针对金黄色葡萄球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，针对金黄色葡萄球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；
针对结核分枝杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，针对结核分枝杆菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；
针对沙眼衣原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示，针对沙眼衣原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示；
针对人型支原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示，针对人型支原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示；
针对解脲脲原体的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，针对解脲脲原体的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；
针对淋病奈瑟菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，针对淋病奈瑟菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；
针对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、沙眼衣原体、人型支原体、解脲脲原体、淋病奈瑟菌的正向引物在检测体系中的终浓度均为200nM；针对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、沙眼衣原体、人型支原体、解脲脲原体、淋病奈瑟菌的反向引物在检测体系中的终浓度均为200nM；针对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌的正向引物在检测体系中的终浓度均为400nM；针对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌、热带念珠菌和光滑念珠菌的反向引物在检测体系中的终浓度均为400nM；
所述多重PCR预混液由10×PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs混合而成；所述多重PCR酶液由热启动DNA聚合酶和UNG酶混合而成。
2.根据权利要求1所述的泌尿系统真菌感染检测体系，其特征在于：还包括针对人DNA内参进行检测的正反向引物和针对系统质控内参进行检测的正反向引物；针对人DNA内参的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示，针对人DNA内参的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示；针对系统质控内参的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示，以及针对系统质控内参的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.40所示。
3.根据权利要求1所述的泌尿系统真菌感染检测体系，其特征在于：所有正向引物上设有荧光标记，所述荧光标记为CY5或CY3或FAM。
4.根据权利要求1所述的泌尿系统真菌感染检测体系，其特征在于：还包括阳性对照物和阴性对照物；所述阳性对照物是包括所有目的基因靶点的质粒混合物；所述阴性对照物是无核酸酶超纯水。
5.根据权利要求1所述的泌尿系统真菌感染检测体系，其特征在于：反应时体系中的组分用量为10×的PCR缓冲液1体积，10μM的dNTPs共0.2体积，25mmol/L的MgCl2溶液0.8体积，引物混合物1体积，5U/μL的热启动DNA聚合酶0.4体积，1U/μL的UNG酶0.5体积，DNA模板5体积，无核酸酶纯水1.1体积；所述DNA模板的使用量为5～50ng/体系。
6.一种包括如权利要求1所述的检测体系的泌尿系统真菌感染检测试剂盒。
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