CN117867144A - 同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR试剂 - Google Patents
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Abstract
同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR试剂,属于分子医学技术领域。提供一种用于同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA引物探针组合物。提供各类标本(含人体或环境的标本)的梅毒螺旋体tp47基因和polA基因mRNA水平的试剂的制备以及在梅毒传染性和疗效判断中的用途。提供的方法可以同时检测梅毒螺旋体tp47基因和polA基因mRNA水平,从而可以更好地评估梅毒传染性和判断疗效,有较好的灵敏度和特异度,具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子医学技术领域,具体是涉及一种同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR试剂。
背景技术
梅毒(Syphilis)是一种由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)引起的性传播疾病,其病原体是梅毒螺旋体,属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液播散全身,使机体几乎所有的组织及器官受累,临床表现为全身性的,可分为不同临床阶段,包括一期、二期、三期和潜伏期。2011年以来,我国梅毒的发病数逐年增长,但显性梅毒的发生率却逐年下降,显性梅毒得到较好控制。然而,隐性梅毒大幅上升,占比高达80%以上。隐性梅毒患者无自觉症状,处于临床静止期(也称之为潜伏梅毒),但仍具有传染性,可传染给胎儿或他人,是重要的传染源。一旦机体抵抗力下降,隐性梅毒将重新发作,进展为显性梅毒。研究表明约20%隐性梅毒可进展为神经梅毒。此外,抗生素尽管已经应用于各类梅毒的治疗,并有效控制患者继发的各种并发症,但不论使用哪种规范的治疗方案,都有治疗失败的可能,其中梅毒血清固定现象高达30%。鉴于梅毒螺旋体尚难于体外常规培养,至今没有直接有效的方法可以评价治疗效果。
已有的文献和国内外指南曾认为,梅毒螺旋体非特异性抗体检测可用于评估梅毒疾病活动度或传染性,即随访滴度降低4倍以上或血清转阴表明治疗有效或治愈(Satyaputra F.,Hendry S.,Braddick M.,et al.The laboratory diagnosis ofSyphilis[J].Journal of Clinical Microbiology,2021,59(10):e0010021.10.1128/JCM.00100-21),但其敏感性和特异性受到感染的分期和免疫抑制的严重程度的影响。此外,最近的动物试验研究显示,宿主梅毒螺旋体非特异性抗体的滴度变化与抗生素治疗无关,其滴度降低4倍以上或血清转阴均可能是一种自然过程(Lin Li Rong,Zhu Xiao Zhen,Liu Dan,et al.Are nontreponemal tests suitable for monitoring syphilistreatment efficacy?Evidence from rabbit infection models[J].ClinicalMicrobiology and Infection,2020,26(2):240-6.10.1016/j.cmi.2019.06.004)。如何梅毒的活动性和传染性,如何判断是否治愈,仍然是当前梅毒防控的难点,需要找到存在活的梅毒螺旋体的直接证据。
梅毒螺旋体DNA的载量可以反映梅毒螺旋体的存在以及数量,但不能区分活的或死的梅毒螺旋体。病原体mRNA很容易降解,半衰期短,其存在表明存在活的病原体,提示具有传染性或尚未治愈。虽然有研究在梅毒患者的精液标本中检出梅毒螺旋体RNA(Godornes,Charmie,Ciccarese,et al.Treponema pallidum subsp.pallidum DNA andRNA in Semen ofa Syphilis Patient Without Genital orAnalLesions[J]),但目前被广泛研究并快速发展的PCR体系通常以梅毒螺旋体DNA片段为靶标,尚未有成熟的PCR体系被建立并用于评估检测梅毒感染者体内的梅毒螺旋体基因组DNA转录产生的mRNA。
梅毒螺旋体基因tp47(47kDa脂蛋白)为特异性47-kDa脂蛋白基因,是梅毒螺旋体最常见的表达基因,具有高度的特异性,该47-kDa蛋白为青霉素结合蛋白,与青霉素类的治疗密切相关。
梅毒螺旋体polA基因(DNApolymeraseⅠgene ofT.pallidum),是梅毒螺旋体的管家基因,序列具有高度的保守性,其特别功能区,有丰富的半胱氨酸和四个独一无二的插入区,在DNA复制与修复中起重要的作用,应用polA基因检测梅毒螺旋体,有较高的敏感性和特异性。
同时检测以上二个靶基因,可以最大限度提升灵敏度,减少由于突变或表达水平等因素造成的漏检。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA引物探针组合物。
本发明的第二目的在于提供一种同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR试剂盒。
本发明的第三目的在于提供所述同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR试剂盒制备方法。
本发明的第四目的在于提供所述所述同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR试剂盒的应用。
一种用于同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA引物探针组合物,其特征在于所述引物探针组合物包括用于检测tp47基因的引物探针组合,用于检测polA基因的引物探针组合,以及用于检测RNaseP基因的引物探针组合;具体序列如下:
其中,FAM、HEX、CY5为荧光报告基团,BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基因。
一种梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂盒,其特征在于所述试剂盒上述引物探针组合物。
本发明所述梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR试剂盒,包括PCR反应液、酶反应液、标准品、阴性对照品和阳性对照品。
其中PCR反应液的成份含有dNTP/dUTPMix、Mg2+、4对引物探针混合物和ddH2O。
其中酶反应液的成份含有HiScript II Reverse Transcriptase、RNaseinhibitor、Heat-labile UDG和TakaraTaq HSDNAPolymerase。
标准品(含梅毒螺旋体tp47基因、polA基因和人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液)包括1.0×102copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×106copies/mL和1.0×107copies/mL共6个浓度。
阴性对照品为不含梅毒螺旋体tp47基因和polA基因,只含人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液。
阳性对照品为含有梅毒螺旋体tp47基因和polA基因的目标片段的装甲RNA溶液。
所述梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR试剂的制备方法,包括以下步骤:
1)靶基因筛选与制备
从NCBI上下载梅毒螺旋体的tp47基因、polA基因和人类的RNaseP基因核酸序列,根据引物设计原则,借助NCBI-Primer BLAST、DNAMAN、PrimerPremier 5和TM Utility等软件进行辅助设计,同时对这3个靶点分别设计一条带有不同荧光基团的TaqMan探针,tp47基因的探针为FAM荧光基团、polA基因的探针为HEX荧光基团、RNaseP基因的探针为CY5荧光基团,由于这3条探针上的荧光基团具有不同的发射波长,因此可以根据不同波长的通道对这3个基因的扩增情况进行区别判断。接着,对设计好的引物用NCBI的Primer BLAST工具进行在线的基因组和转录组同源比对,以确保设计的引物特异性良好,无潜在的非特异性扩增靶标。最后合成验证后的引物和探针,将合成验证后的引物和探针进行4000rpm,30s离心,用Tris-EDTA缓冲液按照说明书进行溶解和稀释,之后用Nanodrop 2000对引物和探针进行定量,稀释至100μM放置于-20℃作为储存溶液,稀释至10μM放置于4℃作为工作溶液。
2)靶基因装甲RNA的构建
制备含靶基因装甲RNA溶液:我们采用基于单质粒双表达系统对梅毒螺旋体进行装甲RNA构建。以pET-24a(+)质粒作为载体,插入的外源基因包括梅毒螺旋体tp47基因片段、polA基因片段和人类RNaseP基因片段,并在该外源基因的前面插入了T7终止子、启动子以及Pac site共计约2700nt,使该外源基因能够独立于外壳蛋白基因而作为独立表达的序列。我们以BamHⅠ和HindⅢ为酶切位点,对外源片段进行基因合成后插入到pET-24a(+)表达载体,获得重组质粒pETMS2-Tp,并用重组质粒pETMS2-Tp对大肠杆菌BL21(DE3)进行转化。再通过对大肠杆菌进行细胞破碎,获得含靶基因的装甲RNA,然后进行双酶切实验并通过琼脂糖凝胶电泳观察产物条带,酶切后的装甲RNA溶液置于75℃干浴5min,破坏其外壳蛋白,用RT-qPCR进行扩增验证两个外源目的片段是否存在。对RT-qPCR的扩增产物进行回收,对产物进行Sanger测序验证,然后利用DNAMAN软件将测序结果与靶片段序列进行比对,判断扩增产物是否正确。SDS-聚丙酰胺凝胶电泳验证用于初步判断其外壳是否有表达。最后采用PEG沉淀法浓缩纯化含靶基因的装甲RNA,将已知浓度的质粒倍比稀释后与纯化后的含靶基因的装甲RNA同时进行RT-qPCR扩增,计算含靶基因装甲RNA的浓度,获得已知浓度的含靶基因装甲RNA溶液,用于标准品的制备。
3)PCR反应液制备
dNTP/dUTP Mix、Mg2+、3对引物探针混合物和无菌无酶的ddH2O共同组成PCR反应液。
4)酶反应液制备
VazymeHiScript II Reverse Transcriptase、VazymeRNase inhibitor、VazymeHeat-labile UDG、Takara Taq HSDNAPolymerase共同组成酶反应液。
5)对照品制备
阴性对照品制备:制备不含梅毒螺旋体tp47基因和polA基因,只含人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液。
阳性对照品制备:制备含梅毒螺旋体tp47基因、polA基因和人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液。
6)标准品制备和标准曲线的建立
用Tris-EDTA缓冲液稀释含tp47基因、polA基因和人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液,选择1.0×102copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×107copies/mL 6个浓度作标准品,分别以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应,确定线性范围。所述的标准品浓度不限于1.0×102copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×107copies/mL 6个浓度。
7)样品处理方法的建立
使用梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂的标本主要包括人体的组织、血液、生殖道分泌物和脑脊液等临床标本,或者环境标本。采用总RNA提取试剂提取样本中的RNA核酸片段。样本核酸提取后得到的RNA溶液选用Thermo Fisher Scientific的DNA-freeTMDNA去除试剂依照说明书去除样本中残留的DNA。
8)梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂的制备
PCR反应液、酶反应液、标准品和对照品共同组成梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂。
在步骤3)中,所述引物探针混合物的引物的浓度为0.2μmol/L,荧光探针的浓度为0.2μmol/L。
本发明在同一反应管中同时实现了对梅毒螺旋体tp47基因、polA基因和人类RNaseP基因的检测,同时采用一步法RT-qPCR,将逆转录和核酸扩增步骤相结合,在减少污染发生的同时节省时间,且PCR反应液内含的dUTP和酶反应液内含的UDG酶共同构成防污染体系,进一步降低环境中气溶胶污染对实验结果可能带来的不利影响,双基因实时荧光定量PCR可以同时并定量检测样本中的tp47和polA两个靶基因,大大提高了检测的灵敏度,同时避免单基因突变造成的漏检,很大程度上提高了梅毒检测的准确性和灵敏度。
附图说明
图1为样本扩增曲线图,图中的横坐标代表相对荧光强度,纵坐标代表阈值循环数。其中,1:tp47基因扩增曲线,2:polA基因扩增曲线;3:人类RNaseP基因扩增曲线
图2为标准品检测结果,图中的横坐标代表标准品浓度,纵坐标代表阈值循环数。其中,a为polA标准曲线,b为tp47标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下实施例将结合附图对本发明进行作进一步的说明。
本发明所述梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂实施例由1.0×102copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×106copies/mL和1.0×107copies/mL标准品1-6,阴性对照品7,阳性对照品8,PCR反应液9,酶反应液10共同组成。
其中标准品(含梅毒螺旋体tp47基因、polA基因和人类RNaseP基因目标片段的装甲RNA溶液)包括1.0×102copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×106copies/mL和1.0×107copies/mL共6个浓度。
其中阴性对照品为不含梅毒螺旋体tp47基因和polA基因,只含人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液。
其中阳性对照品为含有梅毒螺旋体tp47基因、polA基因和人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液。
其中PCR反应液的成份含有dNTP/dUTP Mix、Mg2+、3对引物探针混合物和无菌无酶的ddH2O。
其中酶反应液的成分含有VazymeHiScript II Reverse Transcriptase、VazymeRNase inhibitor、VazymeHeat-labile UDG和TakaraTaq HSDNAPolymerase。
所述梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR试剂的制备方法,包括以下步骤:
1)靶基因筛选与制备
从NCBI上下载梅毒螺旋体的tp47基因、polA基因和人类的RNaseP基因核酸序列,根据引物设计原则,借助NCBI-Primer BLAST、DNAMAN、PrimerPremier 5和TM Utility等软件进行辅助设计,同时对这3个靶点分别设计一条带有不同荧光基团的TaqMan探针,tp47基因的探针为FAM荧光基团、polA基因的探针为HEX荧光基团、RNaseP基因的探针为CY5荧光基团,由于这3条探针上的荧光基团具有不同的发射波长,因此可以根据不同波长的通道对这3个基因的扩增情况进行区别判断。接着,对设计好的引物用NCBI的Primer BLAST工具进行在线的基因组和转录组同源比对,以确保设计的引物特异性良好,无潜在的非特异性扩增靶标。最后合成验证后的引物和探针,将合成验证后的引物和探针进行4000rpm,30s离心,用Tris-EDTA缓冲液按照说明书进行溶解和稀释,之后用Nanodrop 2000对引物和探针进行定量,稀释至100μM放置于-20℃作为储存溶液,稀释至10μM放置于4℃作为工作溶液。图1给出样本扩增曲线图。
2)靶基因装甲RNA的构建
制备含靶基因装甲RNA溶液:我们采用基于单质粒双表达系统对梅毒螺旋体进行装甲RNA构建。以pET-24a(+)质粒作为载体,插入的外源基因包括梅毒螺旋体tp47基因片段、polA基因片段和人类RNaseP基因片段,并在该外源基因的前面插入了T7终止子、启动子以及Pac site共计约2700nt,使该外源基因能够独立于外壳蛋白基因而作为独立表达的序列。我们以BamHⅠ和HindⅢ为酶切位点,对外源片段进行基因合成后插入到pET-24a(+)表达载体,获得重组质粒pETMS2-Tp,并用重组质粒pETMS2-Tp对大肠杆菌BL21(DE3)进行转化。再通过对大肠杆菌进行细胞破碎,获得含靶基因的装甲RNA,然后进行双酶切实验并通过琼脂糖凝胶电泳观察产物条带,酶切后的装甲RNA溶液置于75℃干浴5min,破坏其外壳蛋白,用RT-qPCR进行扩增验证两个外源目的片段是否存在。对RT-qPCR的扩增产物进行回收,对产物进行Sanger测序验证,然后利用DNAMAN软件将测序结果与靶片段序列进行比对,判断扩增产物是否正确。SDS-聚丙酰胺凝胶电泳验证用于初步判断其外壳是否有表达。最后采用PEG沉淀法浓缩纯化含靶基因的装甲RNA,将已知浓度的质粒倍比稀释后与纯化后的含靶基因的装甲RNA同时进行RT-qPCR扩增,计算含靶基因装甲RNA的浓度,获得已知浓度的含靶基因装甲RNA溶液,用于标准品的制备。
3)PCR反应液制备
dNTP/dUTP Mix、Mg2+、3对引物探针混合物和无菌无酶的ddH2O共同组成PCR反应液。
4)酶反应液制备
VazymeHiScript II Reverse Transcriptase、Vazyme RNase inhibitor、VazymeHeat-labile UDG、Takara Taq HSDNAPolymerase共同组成酶反应液。
5)对照品制备
阴性对照品制备:制备不含梅毒螺旋体tp47基因和polA基因,只含人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液。
阳性对照品制备:制备含梅毒螺旋体tp47基因、polA基因和人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液。
6)标准品制备和标准曲线的建立
用Tris-EDTA缓冲液稀释含tp47基因、polA基因和人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液,选择1.0×102copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×107copies/mL 6个浓度作标准品,分别以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应,确定线性范围。所述的标准品浓度不限于1.0×102copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×106copies/mL、1.0×107copies/mL 6个浓度。
7)样品处理方法的建立
使用梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂的标本主要包括人体的组织、血液、生殖道分泌物和脑脊液等临床标本,或者环境标本。采用总RNA提取试剂提取样本中的RNA核酸片段。样本核酸提取后得到的RNA溶液选用Thermo Fisher Scientific的DNA-freeTMDNA去除试剂依照说明书去除样本中残留的DNA。
8)梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂的制备
PCR反应液、酶反应液、标准品和对照品共同组成梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂。
以下给出梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂的性能检定:
1.精密度试验:对同一标本每天进行1批次检测,每批重复检测2次,共进行20天。收集20天的有效数据,进行重复性评价。标本浓度包括3个水平:阴性标本、临界阳性标本、强阳性标本。梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂的精密度为:阴性标本未检出目的片段;临界阳性标本的阳性检出率≥95%;强阳性标本的阳性检出率为100%且Ct值的变异系数≤5%。
2.分析灵敏度:选取400copies/mL、200copies/mL、100copies/mL、50copies/mL 4个浓度样品进行检测,每个浓度至少重复20次,以95%检出阳性的最低浓度值为分析灵敏度。梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂的分析灵敏度为100copies/mL。
3.分析特异性:临床常见泌尿生殖道感染患者分泌物标本150例,其中淋病50例、支原体感染50例、尖锐湿疣50例,分别进行核酸提取,然后进行逆转录实时荧光PCR检测,评价方法的特异性。梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂用于检测以上150例临床常见泌尿生殖道感染患者分泌物标本均不出现扩增曲线,该试剂不与非梅毒感染患者的其他临床常见生殖道感染标本产生交叉反应。
4.线性范围:选取分析灵敏度以上的装甲RNA溶液进行6个浓度根据标准曲线的线性,维持相关系数在0.97以上,判断方法的线性范围。梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂线性范围是1.0×102copies/mL至1.0×107copies/mL。
5.试剂稳定性:将试剂进行分装保存于4℃和-20℃环境中,每隔一定时间取出来进行冻融试验,分别对临界阳性和强阳性两个浓度水平临床标本进行扩增,每个浓度水平标本重复测定至少6次,计算平均值。梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂存放于4℃环境下,对临界阳性浓度水平临床标本的开瓶稳定性在两周左右,对强阳性浓度水平临床标本的的开瓶稳定性在一个月左右。当试剂存放于-20℃环境时,对临界阳性和强阳性两个浓度水平临床标本的开瓶稳定性至少为十二个月。
以下给出采用梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂检测标本:
1.标本处理:
1.1分泌物(皮肤、生殖器溃疡、糜烂部分的分泌物):加入1mL灭菌生理盐水,充分震荡摇匀,挤干棉拭子;吸取全部液体转至1.5mL离心管中,12,000rpm离心5min;去上清,沉淀加灭菌生理盐水1mL混匀,12,000rpm离心5min;去上清,沉淀备用。
1.2硬下疳及皮损部位组织标本:用适量灭菌生理盐水清洗去掉送检组织沾带的血液;取约50mg组织,加1mL灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆,转移至1.5mL离心管中,12,000rpm离心5min;去上清,沉淀加灭菌生理盐水1mL混匀,12,000rpm离心5min;去上清,沉淀备用。
1.3全血:肝素抗凝静脉血1mL,加入3mL的红细胞裂解液,轻轻涡旋或颠倒混匀。冰上放置15min,其间轻轻涡旋混匀两次,待红细胞裂解后,溶液颜色清亮透明。接着在4℃条件下2000g离心10min以沉淀白细胞,小心吸弃上清液。向白细胞沉淀中加入2mL的红细胞裂解液,轻轻涡旋以重悬白细胞。4℃条件下2000g离心10min以沉淀白细胞,小心并彻底吸弃上清液。用无菌无核酸酶水重悬细胞备用。
2.核酸提取:根据所选用核酸提取试剂的说明书进行操作,以下选用TIANGEN总RNA提取试剂,依照说明书要求提取RNA。样本核酸提取后得到的RNA溶液需要进行残留DNA去除处理以防止残留DNA污染,该步骤选用Thermo Fisher Scientific的DNA-freeTMDNA去除试剂,依照说明书去除样本中残留的DNA。
3.对照品处理:取出阴性对照品和阳性对照品,8,000rpm离心15s,漩涡震荡器充分混匀后吸取所需量至1.5mL无核酸酶离心管中,将离心管中的对照品75℃加热5min,漩涡震荡器充分混匀备用。
4.标准品:取出标准品,8,000rpm离心15s,漩涡震荡器充分混匀后吸取所需量至1.5mL无核酸酶离心管中,将离心管中标准品75℃加热5min,漩涡震荡器充分混匀备用。
5.PCR扩增:在PCR反应管中加入5μL处理后的样品(包括样本、对照品、标准品)和25μL的PCR反应混合液(包括PCR反应液和酶反应液),8,000rpm离心15s,放入PCR仪器样品槽进行扩增;扩增程序为先进行55℃5min的逆转录程序段,接着95℃30s的预变性程序段,然后进行45个扩增循环,每个循环包括95℃10s变性程序段、62℃10s退火程序段和72℃30s延伸程序段,最后进行37℃10s的程序段。
6.结果判定,根据反应曲线和定性诊断标准,确定标本是否为梅毒螺旋体阳性,根据标准品检测的标准曲线(见图2),计算得到各待测标本中的靶基因的量(copies/mL)。
7.检测结果:
(1)检测结果质量控制:
阴性对照品:FAM检测通道和HEX检测通道无Ct值或无明显扩增曲线,CY5检测通道Ct值≤28;
阳性对照品:FAM、HEX和CY5检测通道Ct值≤28;
以上要求需在同一批次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。
(2)检测结果判定:
检测通道FAM和/或HEX Ct值≤36和CY5 Ct值≤28为阳性,阳性结果根据标准品的标准曲线(见图2),计算得到各待测标本中的靶基因的量(copies/mL),结果解释如下:
1)tp47和/或polA基因结果阳性,RNaseP基因为阳性,可判为梅毒螺旋体mRNA阳性;
2)tp47和polA基因结果为阴性,RNaseP基因为阳性,可判为梅毒螺旋体mRNA阴性;
3)tp47、polA基因和RNaseP基因复检结果均为阴性,需再次重新取样进行检测。
以下给出采用梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂在判断梅毒传染性或判断疗效中的应用:
1.对梅毒螺旋体活性的判断
制备浓度为1.0×101条/mL、1.0×102条/mL、1.0×103条/mL、1.0×104条/mL、1.0×105条/mL、1.0×106条/mL梅毒螺旋体悬液,每一浓度样本5份,并定义为活梅毒螺旋体组;另采用热处理灭活梅毒螺旋体,灭活后使用LIVE/DEAD BacLight Viability kit染色试剂鉴定灭活效果(所有的螺旋体均为红色,提示成功灭活螺旋体),制备浓度为1.0×102条/mL、1.0×103条/mL、1.0×104条/mL、1.0×105条/mL、1.0×106条/mL、1.0×107条/mL梅毒螺旋体悬液,每一浓度样本5份,定义为死梅毒螺旋体组。采用所构建的梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂检测,结果显示,活梅毒螺旋体组样本的tp47 mRNA和/或polA基因mRNA为阳性,且tp47mRNA和polA基因mRNA的载量与梅毒螺旋体的浓度呈正相关,而死梅毒螺旋体组的tp47mRNA和polA基因mRNA均为阴性。
2.梅毒传染性或疗效判断的诊断效能评估
收集临床诊断为传染性梅毒的患者全血100份,无传染性梅毒患者血液100份,采用所构建的梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂检测,以临床诊断为金标准,根据梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂检测结果制作诊断四格表,应用统计软件分析梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂在判断梅毒感染传染性或疗效判断中的诊断效能,结果显示梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂对梅毒感染传染性或疗效诊断的灵敏度为99.00%,特异性为99.00%(表1)。
表1采用诊断四格表分析tp47 mRNA逆转录实时荧光定量PCR检测试剂的诊断效能
本发明建立一种同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR方法,用于评估梅毒患者体内梅毒螺旋体mRNA含量并探究其与梅毒传染性和疗效的关系,其中一步法指逆转录过程和扩增过程在一个反应孔内进行,无须提前进行mRNA逆转录过程,大大减少时间成本和实验室污染风险,双基因实时荧光定量PCR可以同时并定量检测样本中的tp47和polA两个靶基因,大大提高检测的灵敏度,同时避免单基因突变造成的漏检,很大程度上提高梅毒检测的准确性和灵敏度。具有广阔的应用前景和重要的社会经济价值。
上述实施例仅为本发明的较佳实施例,不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等,均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (7)
1.一种用于同时检测梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA引物探针组合物,其特征在于所述引物探针组合物包括用于检测tp47基因的引物探针组合,用于检测polA基因的引物探针组合,以及用于检测RNaseP基因的引物探针组合;具体序列如下:
其中,FAM、HEX、CY5为荧光报告基团,BHQ1和BHQ2为荧光淬灭基因。
2.一种梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂盒,其特征在于所述试剂盒包括如权利要求1所述引物探针组合物。
3.如权利要求2所述一种梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂盒,其特征在于所述引物探针组合物中,引物的浓度为0.2μmol/L,荧光探针的浓度为0.2μmol/L。
4.如权利要求2所述一种梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂盒,其特征在于还包括定量标准品1-6,其浓度分别为1.0×102copies/mL、1.0×103copies/mL、1.0×104copies/mL、1.0×105copies/mL、1.0×106copies/mL和1.0×107copies/mL。
5.如权利要求2所述一种梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂盒,其特征在于还包括阴性对照品、阳性对照品、PCR反应液、酶反应液;阴性对照品为不含梅毒螺旋体tp47基因和polA基因,只含人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液;阳性对照品为含有梅毒螺旋体tp47基因、polA基因和人类RNaseP基因的目标片段的装甲RNA溶液;PCR反应液的成份含有dNTP/dUTP Mix、Mg2+、3对引物探针组合物和无菌无酶的ddH2O;其中酶反应液的成分含有VazymeHiScript II Reverse Transcriptase、VazymeRNase inhibitor、VazymeHeat-labile UDG和TakaraTaq HSDNAPolymerase。
6.如权利要求2所述一种梅毒螺旋体tp47和polA双基因mRNA一步法PCR检测试剂盒在判断梅毒传染性中的应用。
7.如权利要求6所述应用,其特征在于所述判断梅毒传染性,活梅毒螺旋体组样本的tp47mRNA和/或polA基因mRNA为阳性,且tp47mRNA和polA基因mRNA的载量与梅毒螺旋体的浓度呈正相关,而死梅毒螺旋体组的tp47mRNA和polA基因mRNA均为阴性。
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2023
- 2023-12-20 CN CN202311757345.7A patent/CN117867144A/zh active Pending
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