CN108660189A - 一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒。所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ。本发明的有益效果在于：提供了一种高通量，高灵敏度、高特异性的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，比现有的显色法基因芯片步骤少，检测时间明显缩短，同时比有机荧光基因芯片设备成本低，利于临床的推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒。
背景技术
尿路感染(Urinary Tract Infection，UTI)是指致病微生物侵袭泌尿系统而导致的炎症，是危害人类健康的常见病之一；根据感染部位可分上、下尿路感染。其病情反复发作，迁延不愈，可由无症状细菌尿至严重的毒血症，各种年龄及性别均可发病，以女性常见。其发病率比较高，仅次于呼吸道和消化道的感染性疾病。以尿频、尿急、尿痛等膀胱刺激征为主要临床表现，部分患者还伴有发热和耻骨上压痛等症状，如治疗不及时，还可引起菌血症、急性或慢性肾功能不全等并发症状。
引起尿路感染的病原菌主要分为三类：革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌，此外，一些病毒、衣原体和寄生虫也会引起尿路感染。其中革兰氏阴性菌主要包括：大肠杆菌、奇异变形菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌等；革兰氏阳性菌主要包括：粪肠球菌、屎肠球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌等；而真菌以白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、季也蒙假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌等为主。超过95％的尿路感染是一种致病菌引起。其中尿路感染患者中所分离的致病菌的前四位分别是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和屎肠球菌，占总致病菌的80％以上，而大肠杆菌位于第一位。大肠杆菌最常见于无症状细菌尿、非复杂性尿路感染，或首次发生的尿路感染。腐生性葡萄球菌的症状性尿路感染较常发生于性生活活跃的女性。医院内感染的尿路感染、复杂性尿路感染、复发性尿路感染和尿路器械检查后发生的尿路感染，则多为粪链球菌、变形杆菌、克雷伯杆菌和绿脓杆菌所致。金黄色葡萄球菌常见于败血症等血源性尿路感染，各种厌氧性菌则很少引起尿路感染。
量子点(Quantum dot，QD)又称半导体纳米晶，呈近似球形，其三维尺寸在2-10nm范围内，具有明显的量子效应。量子点一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等)或III-V族元素(无镉量子点，如InP、InAs等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核/壳结构(如常见的CdSe/ZnS核/壳结构量子点等)。量子点的物理、光学、电学特性远优于现有有机荧光染料，具有灵敏度高、稳定性好、货架期长等优势，是新一代荧光标记探针的最佳选择。
量子点作为标记探针尤其适用于高灵敏度、多指标同时检测等应用领域，其优势如下：
1)量子荧光效率高，摩尔消光度系数大，其荧光强度比现有最强的有机荧光材料光强强20倍以上，适用于高灵敏度检测，结合高分辨荧光显微镜可实现单量子点示踪；
2)具有很好的光稳定性，耐光漂白，适用于长时间稳定激发动态观察以及结果存档；
3)荧光寿命长，有机荧光染料或生物样本背景荧光寿命一般仅为1-10纳秒，而量子点的荧光寿命可持续10-100纳秒，通过时间分辨特性，可降低背景干扰，提高灵敏度；
4)发射波长因组成成分和粒径大小而异，易于制备经表面修饰后特性相似但发射波长不同的量子点；
5)宽泛且连续的吸收光谱，实现单一光源多色激发；
6)发射光谱窄而对称，可减少多色激发过程中不同量子点之间的干扰；
7)量子点具有较大的斯托克斯位移，易与斯托克斯位移较小的有机荧光染料和背景荧光相区分，可通过调整激发光波长或使用滤光片，消除背景，提高灵敏度。
8)表面修饰后具有更好的生物相容性，与多种生物分子偶联，无非特异吸附。
量子点材料在20世纪80年代分别由Alexey I.Ekimov在玻璃基质中，以及LouisE.Brus在胶体溶液中合成，随后量子点表面配基化学修饰技术逐步完善。由于量子点相对于传统荧光染料具有诸多优点，在1998年Alivisatos和Nie将量子点应用于生物分子标记，使用生物活性分子如抗体或抗原等连接在量子点表面修配体的活性基团上，实现了量子点生物荧光染色，开创了量子点生物标记材料的应用研究。
基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，形成微阵列，所以可以一次性对临床样品中大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(SouthernBlotting和Northern Blotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。由于基因芯片技术具有高通量、高速度、高效率的检测特征，所以为高通量的病原菌检测鉴定提供了强有力的检测工具。但是目前基因芯片主要以有机荧光染料、BCIP/NBT、DAB及有机荧光为检测方法，有机荧光染料基因芯片存在很多缺陷：制备工艺复杂，检测过程复杂繁琐，而且检测仪器需要费用高昂的激光扫描仪，不利于临床的推广。BCIP/NBT及DAB方式存在操作步骤繁琐，检测灵敏度低，重复性差等技术上的缺陷。
目前，最常用的病原菌的检测方法是细菌培养和药敏试验，即细菌经培养后进行生理生化鉴定。然而，培养法有很多不足的地方，如耗时较长，一些难培养的病原菌不易培养等会影响患者及时治疗。随着技术发展，现在更多研究偏向于分子诊断，利用分子技术可以快速准确检测到病原菌种类及耐药情况，极大提高了治疗的效率。目前国内外所涉及到技术主要包括基因芯片、多重PCR技术、荧光定量PCR技术、PCR-反向斑点杂交等。但目前的实时荧光定量PCR仪的通量受限问题而不能进行高通量的检测。
现有的相关专利如下：
申请号为CN201710153149.7的中国发明专利公开了一种检测尿液病原菌的试剂盒，主要检测微生物的ATP。
申请号为CN200910250899.1的中国发明专利公开了一种基于CE-SSCP的血液病原菌快速检测方法，针对血液感染的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌和肺炎链球菌的16SrRNA基因的保守区域，设计相应的PCR通用引物并荧光标记，然后采用PCR反应对血液样本中的病原菌进行扩增以及电泳检测。
申请号为CN201610116239.4的中国发明专利公开了一种检测尿路病原菌16SrRNA的电化学生物芯片及其技术应用，本专利主要针对6种尿路病原菌(大肠埃希菌、奇异变形菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌)进行检测。
申请号为CN201611230917.6的中国发明专利公开了一种VRE/MRSA/KPC/NDM-1检测基因芯片的制备和用途，可同时检测5种耐药基因和3种相关的病原菌，包括抗万古霉素肠球菌VRE耐药基因VanA,VanB，编码新德里金属-β-内酰胺酶NDM-1耐药基因，抗甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的耐药基因mecA，编码碳青霉烯酶KPC基因，以及粪肠球菌、屎肠球菌、金黄色葡萄球菌。
申请号为CN201110276409.2的中国发明专利公开了一种高通量的细菌耐药基因检测芯片及其应用。基因芯片含有117条基因探针,耐药基因探针选自17大类耐药基因，包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因。该芯片用于病原菌耐药基因的检测。
申请号为CN200710301364.3的中国发明专利公开了一种对奇异变形杆菌中16SrRNA-23S rRNA基因的间区特异的核苷酸，涉及对奇异变形杆菌中的ITS特异的寡核苷酸及其应用，并提供了一种用本发明的寡核苷酸对为引物的PCR检测试剂盒及检测方法。
申请号为CN201610318778.6的中国发明专利公开了一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒及其检测方法，针对16S rRNA可同时适用于尿液样品中大肠埃希菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、屎肠球菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、咽峡炎链球菌、溶血葡萄球菌、摩氏摩根菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、鲁氏不动杆菌、粘质沙雷菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌。
申请号为CN201710431556.X的中国发明专利公开了一种快速检测尿路感染细菌的分子信标探针，以细菌的16s rRNA为靶点，可以同时检测出大肠埃希菌，肠球菌，绿脓假单胞菌，奇异变形杆菌，克雷伯杆菌，葡萄球菌等六类尿路感染中最常见的细菌。
公开号为CN101407836A的中国发明专利公开了一种检测性传播疾病病原体的基因芯片及检测用试剂盒，其通过16s rRNA检测淋病奈瑟氏菌、解脲脲原体、人型支原体，通过ompA基因检测沙眼衣原体、gB基因检测HSV、L1基因检测HPV。主要检测方法为有机荧光玻璃芯片。
公开号为CN 103958988A的中国发明专利公开了用于诊断泌尿生殖感染性疾病的DNA芯片，主要检测大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、阴道毛滴虫、白色念珠菌、阴道加德纳菌、1型单纯疱疹病毒和2型单纯疱疹病毒。其使用的各个靶标的特异性基因进行荧光玻璃芯片检测。
从上述专利文献及其他现有技术中可以看出，目前还没有利用量子点材料的光学特性及基因芯片的特性配合建立一种高通量、高灵敏度、高特异性的核酸检测尿路感染的检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种高通量，高灵敏度、高特异性的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；
所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ；
所述反应液I包含以下检测引物：
引物J23F1：gagatttccgaatggggaaaccca(SEQ No.1)；
引物J23R1：TTCACCTTTCCCTCACGGTACTG(SEQ No.2)；
引物BMTL23R1：TCAGCATTCGCACTTCTGAT(SEQ No.3)；
引物CTF1：GACGGAAGTCTGACGAAGCG(SEQ No.4)；
引物CN16R1：CGCATTTCACYGCTACACGT(SEQ No.5)；
引物NGF1：CGTGTCTGAAGAAGGCCTTC(SEQ No.6)；
引物MUF1：CYATYACTGACGCTTAGGCT(SEQ No.7)；
引物MUR1：GTTGCGGGACTTAACCCAACA(SEQ No.8)；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.9)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.10)；
所述反应液II包含以下检测引物：
引物TUF1：GAATTGGTTGAAATGGAAAT(SEQ No.11)；
引物TUR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA(SEQ No.12)；
引物CNSF1:GAATTGGTTGAAATGGAAAT(SEQ No.13)；
引物CNSR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA(SEQ No.14)；
引物FKYBIF1:TGCTCACACAGATTGTCTG(SEQ No.15)；
引物YGR1:CAGGCGCTCTCCCAGCTGAG(SEQ No.16)；
引物FKR1:ATCCAGATTTTTAAAGAGCA(SEQ No.17)；
引物QYR1:CTTGTTCCAGATTGTTAAAGAGCA(SEQ No.18)；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.9)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.10)；
所述反应液III包含以下检测引物：
引物VANF1:TAGGCTGCGATATTCAAAGCTC(SEQ No.19)；
引物VANR1:AACAGCCTGCTCAATTAAGATTTT(SEQ No.20)；
引物VANR2:CCGACCTCACAGCCCGAAA(SEQ No.21)；
引物MEF1:CGTTCAATTTAATTTTGTTAAA(SEQ No.22)；
引物MER1:TTTTAGATACATTCTTTGGAAC(SEQ No.23)；
引物ECOF1:GTCTGCAATTGCCACCACTG(SEQ No.24)；
引物ECOR1:GCCGAATCGCTGCTGGAAG(SEQ No.25)；
引物ECOF2:CATATCTTCTTCCAGATTGC(SEQ No.26)；
引物ECOR2:GCTGTTTGGCTATGAGGAAG(SEQ No.27)；
引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC(SEQ No.28)；
引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC(SEQ No.29)；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.9)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.10)；
所述反应液IV为Hotstart Taq DNA聚合酶。
优选的，上述的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述捕获探针包含：
探针BPP1：CAGATGCTGGTAAATTACCWTG(SEQ No.30)；
探针FSP1：TATCCAACGCGATAACAAAGT(SEQ No.31)；
探针VAP1：CGTTCAGGCTCATCCTTCGG(SEQ No.32)；
探针VBP1：TCAGGTTCGTCCTTTGGCGTAA(SEQ No.33)；
探针MEP1：AAAGCATACATATTGAAAATTT(SEQ No.34)；
探针FSPP1：TGAAGTAGAAAAAGACGGTT(SEQ No.35)；
探针HNP1：ATTACAGGTCGTGGTACAGTC(SEQ No.36)；
探针WRP1：GAACCAGATGCTGGTAAATTAC(SEQ No.37)；
探针CAP1：TTGCGCCCTCTGGTATTCC(SEQ No.38)；
探针ECOP1：GGTCATTAGCGCCACTCACTGCA(SEQ No.39)；
探针SAP1：TAGCATATCAGAAGGCACACC(SEQ No.40)；
探针SCP1：AGCTGATTAGAGGTAGAC(SEQ No.41)；
探针FCP1：AGCACATTCGAGGTAGAC(SEQ No.42)；
探针TLP1：GTGTCACGTAAGTGACGCG(SEQ No.43)；
探针BMP1：ATGTATACTTTGTATACGTG(SEQ No.44)；
探针YGP1：CACATACWTAAGTATGCTTCGT(SEQ No.45)；
探针FKP1：AGTGCTCACACAGATTGTCT(SEQ No.46)；
探针QYP1：GTTAAAGTCCAATCAGGCCTA(SEQ No.47)；
探针CTP1：GAAAGGTAAGTTAGTTGTCAAAGA(SEQ No.48)；
探针NGP1：GACGGTACCTGAAGAATAAGC(SEQ No.49)；
探针UUP1：AAATGATGTGCCTGGGTAG(SEQ No.50)；
探针MGP1：TTAAGTATCTCGCCTGGGTAG(SEQ No.51)。
优选的，上述的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述检测膜条上还含有一条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：ICP1:TTTGCTAATCATGTTCATACC(SEQ No.52)。
优选的，上述的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述捕获探针为寡核苷酸单链DNA，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸C(n)链中n为1～12的整数，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
优选的，上述的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述检测引物中的反向引物5’端修饰有生物素标记，所述检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸C(n)链中n为1～12的整数，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
优选的，上述的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。
优选的，上述的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒中，所述量子点为CdSe/ZnS。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种高通量，高灵敏度、高特异性的用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，首次建立尿路感染病原体的量子点核酸检测方法，其具有如下优点：
1)使用本发明试剂盒比现有的显色法基因芯片检测步骤少，检测时间明显缩短，同时比有机荧光基因芯片设备成本低(光源要求低)，并且现有的荧光基因芯片的载体为玻璃，其制备工艺复杂，检测过程复杂繁琐，而且检测仪器需要费用高昂的激光扫描仪，不利于临床的推广。
2)本发明采用多重PCR方法，多达7重，在一次检测中，能同时检测并鉴定19种尿路感染病原菌及3种耐药基因检测，检测菌谱覆盖90％以上，病原菌之间不会相互干扰，探针的特异性高。利用杂交膜上固定特异性探针进行杂交鉴定结果比培养法更为快速、准确，为临床治疗提供一定的依据，并且解决一些难养菌无法培养的问题。本发明还可以指导抗生素的使用，避免由于抗生素的滥用而导致的耐药，同时对混合感染或者是早期临床表现不明显患者早期诊断提供依据。
3)本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒可直接对尿液样本进行相关检测，从收到尿液样本到检测结果的获取只需8h左右，而传统的细菌分离、培养及生化反应鉴定至少需要3～4天，大大缩短了诊断时间。
4)本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒灵敏度高，所有检测靶标均能达到0.1-0.01pg/ul基因组。
5)本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒特异性高。针对各个检测靶标的核酸信息进行生物信息学分析，目前公开的现有技术无法满足特异性要求，会出现假阳性，本发明根据不同病原菌特异性基因单独设计引物及探针，保证每种病原菌的高特异性，具体涉及的基因为16S rRNA、23SrRNA、16SrRNA-23SrRNA ITS区域、gap、tuf等，不同于现有的文献里面公开的针对唯一靶标才能达到鉴定效果。
6)本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，同时增加一个内控靶标的检测，其为样本内源性的核酸(人源基因组管家基因)，每份样本检测均能得到有效的信号，保证每份样本从核酸提取到PCR扩增及量子点核酸检测的全程监控，有效避免假阴性的出现。
7)本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒可以使用简单的紫外成像仪器进行光信号的检测，最大程度地避免人为判读导致的误差。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的本发明试剂盒对各病原菌基因组杂交检测灵敏度检测结果示意图；
图2A-D分别为本发明具体实施方式的本发明试剂盒对化脓链球菌、无乳链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌基因组DNA杂交检测特异性检测结果示意图；
图3A-G分别为本发明具体实施方式中的本发明试剂盒对7份临床样本杂交检测准确性检测结果示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：利用量子点材料的光学特性及基因芯片特性建立一种高通量、高灵敏度、高特异性的量子点核酸检测尿路感染病原体的检测试剂盒，可同时检测常见的19种尿路感染病原菌及3种耐药基因的尿路感染病原体。
本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的检测谱为：金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、化脓链球菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、白色念珠菌、大肠埃希菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、淋病奈瑟菌、生殖支原体以及3种耐药基因(VanA介导的耐万古霉素基因、VanB介导的耐万古霉素基因及mecA介导的耐甲氧西林基因)。
本发明根据不同病原菌核酸信息设计能鉴定到相应病原菌的检测引物及探针，并且根据灵敏度筛选引物及探针，将满足要求的引物进行单重到多重的组合及相关优化，确定最佳的引物组合及不同的反应体系，减少引物之间的相关影响。最后确定各个反应体系的引物组合形式，将反应体系分为3管(5-7重PCR)。
实施例1
本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的制备和使用
一、量子点核酸检测原理：
将带有生物素标记核酸扩增产物与检测膜条上的探针进行分子杂交，再通过生物素与偶联链霉亲和素的量子点进行结合，检测膜条经荧光检测仪器观察各个位点有无光信号来判断该探针是否与该核酸产物杂交，从而确定样本中是否含有相关靶标核酸。
捕获探针为寡核苷酸单链DNA3’端或5’端标记有氨基，且氨基与寡核苷酸单链DNA间有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链或oligo dT(n)或脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)组合，所述脂肪酸C(n)链n数量为1～12，所述oligodT(n)n数量为1～30。
检测膜条的材质为尼龙膜，且经活化后的尼龙膜上点有一定浓度的捕获探针(1-50uM)，以微阵列形式分布在尼龙膜上。
量子点为表面偶联有若干数量链霉亲和素的量子点(CdSe/ZnS)，具体偶联的链霉亲和素数量≥1。所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm。所述量子点的尺寸1-200nm。
所核酸扩增产物为5’端带有生物素标记，具体为核酸扩增的一条引物5’端被修饰有生物素标记，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链或oligo dT(n)或脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)组合，所述脂肪酸C(n)链n数量为1～12，所述oligo dT(n)n数量为1～30。
核酸扩增方法为聚合酶链式反应(如PCR等)、恒温扩增(如TMA/RPA/LAMP等)。
量子点核酸检测流程：
1)首先使用若干对引物进行核酸扩增，并且某一基因扩增的一对引物中其中一条引物5’端修饰有生物素，所述引物与生物素连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链或oligodT(n)或脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)组合，所述脂肪酸C(n)链n数量为1～12，所述oligodT(n)n数量为1～30。
2)核酸扩增后，将产物进行核酸变性处理，所述核酸变性方法有高温加热变性。所述高温加热变性为95度以上。
3)将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至一定温度(40-55度)的杂交液中进行杂交，杂交时间为30min-2h。所述杂交液为2*SSC与0.1％SDS。
4)杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至一定温度(40-55度)的洗涤液中进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
5)洗涤结束后，将洗涤液去除后，加入到一定温度的孵育液中进行孵育，孵育时间为5-30min，所述温度为20-37度，所述孵育液为2*SSC与0.1％SDS中加入浓度为0.01nM-5nMSA-QD量子点(激发波长为200-500nm，发射波长为400-700nm)。所述量子点的尺寸1-200nm。
6)孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
7)洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。
二、引物的设计与筛选
在生物信息学网站NCBI数据库中查询并下载各个病原菌的16SrRNA、23SrRNA、16SrRNA-23SrRNA ITS区域、gap、tuf基因，经BLAST比对找出各个靶标同源性最高的区域，设计扩增引物。通过大量的试验测试筛选(单重扩增及多重组合扩增)灵敏度满足要求的引物。具体的检测引物序列及序列编号如下：
引物J23F1：GAGATTTCCGAATGGGGAAACCCA(SEQ No.1)；
引物J23R1：TTCACCTTTCCCTCACGGTACTG(SEQ No.2)；
引物BMTL23R1：TCAGCATTCGCACTTCTGAT(SEQ No.3)；
引物CTF1：GACGGAAGTCTGACGAAGCG(SEQ No.4)；
引物CN16R1：CGCATTTCACYGCTACACGT(SEQ No.5)；
引物NGF1：CGTGTCTGAAGAAGGCCTTC(SEQ No.6)；
引物MUF1：CYATYACTGACGCTTAGGCT(SEQ No.7)；
引物MUR1：GTTGCGGGACTTAACCCAACA(SEQ No.8)；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG(SEQ No.9)；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG(SEQ No.10)；
引物TUF1：GAATTGGTTGAAATGGAAAT(SEQ No.11)；
引物TUR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA(SEQ No.12)；
引物CNSF1:GAATTGGTTGAAATGGAAAT(SEQ No.13)；
引物CNSR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA(SEQ No.14)；
引物FKYBIF1:TGCTCACACAGATTGTCTG(SEQ No.15)；
引物YGR1:CAGGCGCTCTCCCAGCTGAG(SEQ No.16)；
引物FKR1:ATCCAGATTTTTAAAGAGCA(SEQ No.17)；
引物QYR1:CTTGTTCCAGATTGTTAAAGAGCA(SEQ No.18)；
引物VANF1:TAGGCTGCGATATTCAAAGCTC(SEQ No.19)；
引物VANR1:AACAGCCTGCTCAATTAAGATTTT(SEQ No.20)；
引物VANR2:CCGACCTCACAGCCCGAAA(SEQ No.21)；
引物MEF1:CGTTCAATTTAATTTTGTTAAA(SEQ No.22)；
引物MER1:TTTTAGATACATTCTTTGGAAC(SEQ No.23)；
引物ECOF1:GTCTGCAATTGCCACCACTG(SEQ No.24)；
引物ECOR1:GCCGAATCGCTGCTGGAAG(SEQ No.25)；
引物ECOF2:CATATCTTCTTCCAGATTGC(SEQ No.26)；
引物ECOR2:GCTGTTTGGCTATGAGGAAG(SEQ No.27)；
引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC(SEQ No.28)；
引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC(SEQ No.29)；
每条反向引物均被修饰有生物素标记。
三、扩增反应液体系的确认
通过大量的多重组合测试及体系优化测试，确定各个反应液体系的组成，具体情况如下：
反应液I的反应体系(48人份)如表1；
表1
反应液II的反应体系(48人份)如表2；
表2
反应液III的反应体系(48人份)如表3；
表3
每个样本的检测需要同时进行三个反应体系进行扩增，每个反应体系21ul，提取的核酸模板为4ul，总体积为25ul。
四、PCR反应程序的确定
经过大量的试验测试，本扩增程序能有效使各个反应体系中的引物最大程度得到有效扩增，并且使各个病原体检测灵敏度达到0.1-0.01pg/ul基因组浓度。具体程序如下(采用了降落PCR程序)如表4；
表4
五、捕获探针的设计
在生物信息学网站NCBI数据库中查询并下载各个病原菌的16SrRNA、23SrRNA、16SrRNA-23SrRNA ITS区域、gap、tuf基因，经BLAST比对找出各个靶标特异性最高的区域，同时兼顾各个捕获探针能在同一杂交温度进行杂交测试设计探针，并经过大量的灵敏度试验测试及特异性测试，确定各个病原菌及耐药基因的探针序列，具体序列及编号如下：
探针BPP1：CAGATGCTGGTAAATTACCWTG(SEQ No.30)；
探针FSP1：TATCCAACGCGATAACAAAGT(SEQ No.31)；
探针VAP1：CGTTCAGGCTCATCCTTCGG(SEQ No.32)；
探针VBP1：TCAGGTTCGTCCTTTGGCGTAA(SEQ No.33)；
探针MEP1：AAAGCATACATATTGAAAATTT(SEQ No.34)；
探针FSPP1：TGAAGTAGAAAAAGACGGTT(SEQ No.35)；
探针HNP1：ATTACAGGTCGTGGTACAGTC(SEQ No.36)；
探针WRP1：GAACCAGATGCTGGTAAATTAC(SEQ No.37)；
探针CAP1：TTGCGCCCTCTGGTATTCC(SEQ No.38)；
探针ECOP1：GGTCATTAGCGCCACTCACTGCA(SEQ No.39)；
探针SAP1：TAGCATATCAGAAGGCACACC(SEQ No.40)；
探针SCP1：AGCTGATTAGAGGTAGAC(SEQ No.41)；
探针FCP1：AGCACATTCGAGGTAGAC(SEQ No.42)；
探针TLP1：GTGTCACGTAAGTGACGCG(SEQ No.43)；
探针BMP1：ATGTATACTTTGTATACGTG(SEQ No.44)；
探针YGP1：CACATACWTAAGTATGCTTCGT(SEQ No.45)；
探针FKP1：AGTGCTCACACAGATTGTCT(SEQ No.46)；
探针QYP1：GTTAAAGTCCAATCAGGCCTA(SEQ No.47)；
探针CTP1：GAAAGGTAAGTTAGTTGTCAAAGA(SEQ No.48)；
探针NGP1：GACGGTACCTGAAGAATAAGC(SEQ No.49)；
探针UUP1：AAATGATGTGCCTGGGTAG(SEQ No.50)；
探针MGP1：TTAAGTATCTCGCCTGGGTAG(SEQ No.51)；
探针ICP1:TTTGCTAATCATGTTCATACC(SEQ No.52)；
其中ICP1探针为一条内控探针，用于监控样本核酸提取及扩增反正出现假阴性。
所述各条探针的5’端标记有氨基，并且氨基与寡核苷酸链间有oligodT10。
六、检测膜条的制备
每条捕获探针由引物合成单位进行合成，然后采用稀释液稀释成所需的浓度，再通过氨基与羧基的缩合反应固定在尼龙膜上，制备成检测膜条。
检测膜条的布局图如下表5；
表5
膜条上位点对应的病原菌及耐药基因如下表6；
表6
七、杂交条件的确定
PCR扩增完成后，将三管扩增产物混合后进行95度10min变性处理，然后进行杂交、洗涤、孵育、洗涤、荧光检测。在杂交步骤中，杂交温度对结果的判读有着很大的影响，杂交温度过低，会出现非特异捕获导致假阳性，杂交温度过高，会出现目的产物与捕获探针的结合率下降，最终到时灵敏度下降而导致误判阴性。后续的洗涤温度、孵育时间的长短、孵育液中SA-QD的浓度也会有对结果同样的影响。
杂交：
将变性后的PCR产物与检测膜条加入到预先孵育至48度的1ml杂交液中，48度轻摇杂交1.5h。同时将1ml洗涤液进行预热至48度。
所述杂交液为2*SSC与0.1％SDS。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
洗涤：
取出检测膜条，转移至预先预热至48度的洗涤液中，轻摇洗涤5min。
孵育：
按照1ml杂交液加入浓度为1uM SA-QD配制孵育液。将检测膜条转移至孵育液中室温孵育轻摇30min。
洗涤：
取出检测膜条，转移至洗涤液中，室温轻摇洗涤5min。
综上，本实施例提供一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ。
本实施例用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的使用流程如下：
1、将反应液I、反应液II、反应液III与反应液IV按20.75ul：0.25ul比例混合。
2、向上述混合好的反应液中加入4ul的样本核酸，置于PCR仪中进行PCR扩增。所述扩增程序如表4；
3、PCR扩增后，将产物混合后进行变性处理，所述核酸变性方法有高温加热变性。所述高温加热变性为95度以上。
4、将变性后产物及检测膜条加入到预先预热至48度的杂交液中进行杂交，杂交时间为30min-2h。所述杂交液为2*SSC与0.1％SDS。
5、杂交结束后，将检测膜条转移至预先预热至48度的洗涤液中进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
6、洗涤结束后，将洗涤液去除后，在室温加入孵育液中进行孵育，孵育时间为5-30min，所述孵育液为2*SSC与0.1％SDS中加入浓度为0.01nM-5nMSA-QD量子点(激发波长为200-500nm，发射波长为400-700nm)。所述量子点的尺寸1-200nm。
7、孵育结束后，去掉孵育液，加入一定量的洗涤液进行洗涤，洗涤时间为5-15min。所述洗涤液为0.5*SSC与0.1％SDS。
8、洗涤结束后，将检测膜条置于荧光仪器中进行荧光检测。
实施例2
本发明用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒的效果验证分析
1、灵敏度检测
将标定浓度的各病原菌基因组DNA依次进行梯度稀释(10pg/μL、1pg/μL、0.5pg/μL、0.1pg/μL、0.05pg/μL、0.01pg/μL)，通过PCR-量子点荧光检测法对上述各浓度DNA分别进行检测，出现明显亮斑的判定为阳性结果，无斑点的判定为阴性结果。检测按照实施1中的试剂盒使用流程进行测试。检测结果参见图1。
2、特异性检测
按照上述实施例1配制反应体系，并且按21ul进行分装，向每个反应体系加入4ul基因组DNA，检测的基因组DNA分别为化脓链球菌、无乳链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌。
杂交检测按照实施例1中试剂盒使用流程进行测试。化脓链球菌、无乳链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌基因组DNA检测结果分别参见图2A、B、C、D。结果显示只有化脓链球菌、无乳链球菌有荧光信号，其他两个无信号，说明其特异性满足要求。
2、临床样本检测
选择7份临床上培养结果为尿路感染病原菌阳性的尿液标本进行临床样本检测，先进行基因组DNA提取，具体提取试剂采用杭州千基生物科技有限公司生产的1.2M山梨醇及循环游离核酸提取试剂盒(磁珠法)、天根生化生产的溶壁酶，提取流程如下：
1)取200ul血培养液至1.5ml EP管，12000r离心5min，弃上清；
2)加入600ul 1.2M山梨醇buffer，重悬沉淀后，加入5ul溶壁酶，30℃水浴30min；
3)水浴后，12000r离心5min，弃上清，再加入200ul生理盐水重悬沉淀；
4)向EP管中加入300ul裂解结合液，加入5ul mag，混匀后，常温下孵育10min；
5)EP管置于磁力分离器上，分离并弃去上清；
6)向EP管中加入1ml洗涤液，充分洗涤；
7)EP管置于磁力分离器上，分离并弃去上清，晾干2-5min；
8)向EP管中加入60ul洗脱液，重悬磁珠，56℃加热5min；
9)EP管置于磁力分离器上，分离上清并转至一个干净的EP管中，-20℃保存备用。
按照实施例1配制反应体系，再按照21ul/反应分装反应液，每个反应液中加入4ul提取的核酸，然后按照实施例1中方法进行PCR扩增，扩增后的产物按照实施例1中方法进行杂交测试。
检测结果参见图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F和图3G。检测结果一例为奇异变形杆菌、一例为阴沟肠杆菌、一例为大肠杆菌，一例为屎肠球菌、一例为表皮葡萄球菌、一例弗式柠檬酸杆菌、一例为解脲脲原体，与培养法鉴定结果一致。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 杭州千基生物科技有限公司
杭州博芯生物技术有限公司
<120> 一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagatttccg aatggggaaa ccca 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcacctttc cctcacggta ctg 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aaatgatgtg cctgggtag 19
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ttaagtatct cgcctgggta g 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tttgctaatc atgttcatac c 21
Claims (7)
1.一种用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测膜条、荧光检测液和反应液，所述检测膜条包含尼龙膜及固定在尼龙膜上的捕获探针；所述荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；所述反应液包括：反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ和反应液Ⅳ；
所述反应液I包含以下检测引物：
引物J23F1：GAGATTTCCGAATGGGGAAACCCA；
引物J23R1：TTCACCTTTCCCTCACGGTACTG；
引物BMTL23R1：TCAGCATTCGCACTTCTGAT；
引物CTF1：GACGGAAGTCTGACGAAGCG；
引物CN16R1：CGCATTTCACYGCTACACGT；
引物NGF1：CGTGTCTGAAGAAGGCCTTC；
引物MUF1：CYATYACTGACGCTTAGGCT；
引物MUR1：GTTGCGGGACTTAACCCAACA；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；
所述反应液II包含以下检测引物：
引物TUF1：GAATTGGTTGAAATGGAAAT；
引物TUR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA；
引物CNSF1:GAATTGGTTGAAATGGAAAT；
引物CNSR1:CCACGGTCGATACGTCCTGA；
引物FKYBIF1:TGCTCACACAGATTGTCTG；
引物YGR1:CAGGCGCTCTCCCAGCTGAG；
引物FKR1:ATCCAGATTTTTAAAGAGCA；
引物QYR1:CTTGTTCCAGATTGTTAAAGAGCA；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；
所述反应液III包含以下检测引物：
引物VANF1:TAGGCTGCGATATTCAAAGCTC；
引物VANR1:AACAGCCTGCTCAATTAAGATTTT；
引物VANR2:CCGACCTCACAGCCCGAAA；
引物MEF1:CGTTCAATTTAATTTTGTTAAA；
引物MER1:TTTTAGATACATTCTTTGGAAC；
引物ECOF1:GTCTGCAATTGCCACCACTG；
引物ECOR1:GCCGAATCGCTGCTGGAAG；
引物ECOF2:CATATCTTCTTCCAGATTGC；
引物ECOR2:GCTGTTTGGCTATGAGGAAG；
引物ITSF1:GGTTTCCGTAGGTGAAC；
引物ITSR1:GCATCCCACGGGCTCTCACC；
引物HBBF1:TATGGTTGGGATAAGGCTGG；
引物HBBR1:CGAGCTTAGTGATACTTGTG；
所述反应液IV为Hotstart Taq DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述捕获探针包含：
探针BPP1：CAGATGCTGGTAAATTACCWTG；
探针FSP1：TATCCAACGCGATAACAAAGT；
探针VAP1：CGTTCAGGCTCATCCTTCGG；
探针VBP1：TCAGGTTCGTCCTTTGGCGTAA；
探针MEP1：AAAGCATACATATTGAAAATTT；
探针FSPP1：TGAAGTAGAAAAAGACGGTT；
探针HNP1：ATTACAGGTCGTGGTACAGTC；
探针WRP1：GAACCAGATGCTGGTAAATTAC；
探针CAP1：TTGCGCCCTCTGGTATTCC；
探针ECOP1：GGTCATTAGCGCCACTCACTGCA；
探针SAP1：TAGCATATCAGAAGGCACACC；
探针SCP1：AGCTGATTAGAGGTAGAC；
探针FCP1：AGCACATTCGAGGTAGAC；
探针TLP1：GTGTCACGTAAGTGACGCG；
探针BMP1：ATGTATACTTTGTATACGTG；
探针YGP1：CACATACWTAAGTATGCTTCGT；
探针FKP1：AGTGCTCACACAGATTGTCT；
探针QYP1：GTTAAAGTCCAATCAGGCCTA；
探针CTP1：GAAAGGTAAGTTAGTTGTCAAAGA；
探针NGP1：GACGGTACCTGAAGAATAAGC；
探针UUP1：AAATGATGTGCCTGGGTAG；
探针MGP1：TTAAGTATCTCGCCTGGGTAG。
3.根据权利要求2所述用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述检测膜条上还含有一条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：ICP1:TTTGCTAATCATGTTCATACC。
4.根据权利要求2所述用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述捕获探针为寡核苷酸单链DNA，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸C(n)链中n为1～12的整数，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
5.根据权利要求1所述用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述检测引物中的反向引物5’端修饰有生物素标记，所述检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸C(n)链和oligo dT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸C(n)链中n为1～12的整数，所述oligo dT(n)中n为1～30的整数。
6.根据权利要求1所述用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。
7.根据权利要求1所述用于尿路感染病原体的量子点核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述量子点为CdSe/ZnS。
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