CN101812506A - 多色量子点组合微球编码的液体芯片及其制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多色量子点组合微球编码的液体芯片及其制备方法和检测方法,该液体芯片由通用引物和至少两种核酸检测系统组成,每种核酸检测系统由多色量子点组合微球标记的探针P1和磁性微球标记的探针P2组成,探针P1和P2分别与靶核酸序列两端互补,P1和P2之间不互补;多色量子点组合微球由球体和装载在球体中的多色量子点组合物组成;不同核酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记P1;本发明液体芯片采用通用引物PCR方法,结合多色量子点组合微球标记技术与磁性分离技术,为病原微生物的快速侦检及其它核酸检测项目提供了一种操作简单、高通量、灵敏度高、重复性好的新方案。
Description
技术领域
本发明涉及一种液体芯片,特别涉及一种多色量子点组合微球编码的液体芯片,还涉及该液体芯片的制备方法和检测方法。
背景技术
微生物的种类很多,其中传染性最强、危害性最重的是细菌、衣原体和立克次体类病原微生物。病原微生物的传统检测是以病原微生物表型特征为基础,主要采用分离培养结合形态特性、生化鉴定和免疫分析等方法,存在操作复杂耗时、条件要求苛刻、阳性率低等缺点,且许多细菌的生化特征和抗生素敏感型等表型特征不稳定,易受到基因调控、质粒获失及技术操作等方面的影响。近年来,以分子生物学为基础的鉴定方法如质粒分析、核酸杂交、限制性片段多态性分析和聚合酶链式反应(PCR)等,克服了上述病原微生物传统检测方法存在的缺点和客观因素对其产生的影响,大大提高了检测的特异性和准确度,其中生物芯片技术凭借其高通量优势在病原微生物的快速侦检中发挥了重要作用。但常规生物芯片为固体芯片,由于空间位阻的影响,核酸杂交效率较低。为克服此缺点,液体芯片应运而生。
液体芯片,又称悬浮阵列,该技术的核心是将聚苯乙烯微球用荧光染色的方法进行编码,然后将每种颜色的微球(或称为荧光编码微球)共价交联上针对特定核酸的探针。应用时,将检测样本与多种连有特定核酸探针的微球同时进行杂交反应,反应完成后,仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度,从而对靶核酸进行定量检测。由于整个反应在液相中完成,反应速度快,杂交效率高,并可以在一个微量反应体系中同时检测多达上百条靶序列,尤其适合病原微生物的快速侦检。然而,近年研究结果显示,液体芯片技术尚存在灵敏度较低、重复性较差等不足,其原因主要是不同荧光标记物的发射光谱在液相中广泛重叠,导致大量假阳性结果产生,限制了液体芯片技术在病原微生物侦检中的进一步推广应用。因此,寻找一种能以不同颜色分别标记探针,且发光强度高,不易淬灭,光谱之间重叠少的荧光标记物是提高液体芯片检测灵敏度和重复性的关键。
量子点(quantum dots,QDs)的出现为克服以上问题带来了希望。量子点是一种由周期表中II-VI族或III-V族元素组成,直径在1~10nm之间,能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒。与传统的有机荧光染料相比,量子点具有许多独特的理化特性:①发射波长可调谐,可通过控制量子点的粒径大小来调节其发射荧光的颜色;②激发波长范围宽,从紫外区到近红外区,可以用同一波长的光激发不同发射波长的量子点;③发射峰狭窄且对称,半高峰宽通常为25~45nm;④荧光强度高且稳定,对光漂白有强烈的抵制作用。量子点的优越荧光性能使其作为新型荧光标记物,在肿瘤活体成像与靶向治疗、分子诊断等领域中已显示出巨大潜力。但是直接用不同粒径的量子点制备多色荧光标记探针时尚存在如下问题,即不同粒径量子点-探针复合物的最佳杂交条件是不一致的,因而难以同时实现多色荧光标记探针的检测条件优化,这对条件要求较高的核酸杂交实验结果的影响尤为明显。为克服以上问题,有研究者采用将多个量子点组装于同一粒径的微球内的方式来实现标记物质的均一化,通过控制量子点装配的种类和数量实现了超过1000种颜色的DNA标记,为多色量子点的生物标记奠定了基础。
发明内容
有鉴于此,为克服现有技术的不足,本发明的目的之一在于提供一种多色量子点组合微球编码的液体芯片,目的之二在于提供所述液体芯片的制备方法,目的之三在于提供所述液体芯片的检测方法,从而为病原微生物的快速侦检及其它核酸检测项目提供一种操作简单、高通量、灵敏度高、重复性好的新方案。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
1、多色量子点组合微球编码的液体芯片,由通用引物和至少两种核酸检测系统组成,每种核酸检测系统由多色量子点组合微球标记的探针P1和磁性微球标记的探针P2组成;所述探针P1和P2分别与靶核酸序列两端互补,P1和P2之间不互补;所述多色量子点组合微球由球体和装载在球体中的多色量子点组合物组成;所述多色量子点组合物是从n种具有不同荧光发射波长的量子点中任取m种组合而成,n和m均为正整数且m≤n;不同核酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针P1。
进一步,所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)2、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种,以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点;
进一步,所述量子点选自CdS、CdSe、CdTe、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdSe/CdS中的任一种,以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。
2、所述多色量子点组合微球编码的液体芯片的制备方法,包括以下步骤:
a、设计并合成通用引物;
b、制备至少两种核酸检测系统:按照步骤b1~b3制备每种核酸检测系统,不同核酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针P1;
b1、根据靶核酸序列设计并合成探针P1和P2,并将探针P1和P2的一端分别用X标记;
b2、制备n种具有不同荧光发射波长的量子点,从中任取m种组成多色量子点组合物,再将其装载入球体中制成多色量子点组合微球;将多色量子点组合微球用Y标记后,与步骤b1所得X标记的探针P1通过X与Y的特异性结合进行偶联,制得多色量子点组合微球标记的探针P1;
b3、将磁性微球用Y标记后,与步骤b1所得X标记的探针P2通过X与Y的特异性结合进行偶联,制得磁性微球标记的探针P2。
进一步,所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)2、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种,以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点;
进一步,所述量子点选自CdS、CdSe、CdTe、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdSe/CdS中的任一种,以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点;
进一步,所述X和Y配对地选自下述特异性结合系统:生物素-亲和素、抗原-抗体或配体-受体。
3、所述多色量子点组合微球编码的液体芯片的检测方法,包括以下步骤:以通用引物进行PCR扩增,所得PCR产物与至少两种核酸检测系统同时进行杂交反应,反应完成后进行磁性分离,收集磁性物质进行荧光检测,通过每种核酸检测系统中多色量子点组合微球的荧光发射波长和荧光强度对靶核酸进行检测。
本发明的多色量子点组合微球编码的液体芯片,具有以下特点:
(1)分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记针对特定核酸的探针,解决了传统量子点-探针复合物由于粒径不同难以同时实现检测条件优化的问题,克服了现有液体芯片灵敏度较低、重复性较差等不足;
(2)在杂交反应完成后采用磁性分离技术,可以一步从复杂的反应体系中分离得到目标分子,去除了游离的多色量子点组合微球标记探针对后续荧光检测的干扰,使荧光检测方法更简单,从而可简化检测设备,降低检测成本;
(3)采用通用引物PCR方法,只需一次扩增,即能同时获得多种靶核酸序列,操作简便、快速,检测成本低;
综上所述,本发明提供了一种操作简单、高通量、灵敏度高、重复性好的液体芯片,适用于病原微生物的快速侦检及其它核酸检测项目,应用前景广阔。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述,其中:
图1为本发明液体芯片的制备和检测示意图;
图2为采用本发明液体芯片检测四种细菌特异性基因混合样本的标准曲线;
图3为分别采用本发明液体芯片与荧光染料编码液体芯片检测四种细菌特异性基因的对比结果。
具体实施方式
本发明使用的量子点主要包括单核量子点(如CdS、CdSe、CdTe等)和核壳结构的量子点(如CdS/ZnO、CdSe/ZnS、CdTe/CdS等)。核壳结构的量子点是在一种材料(如CdSe等)的外部包覆另一种具有较大能带隙的材料(如ZnS等)所构成的量子点,其光学特性由内核决定,外壳具有明显的提高量子产率和增强光化学稳定性的作用。此外,还包括掺杂过渡金属元素的量子点(如CdS:Mn、CdS:Cu等)和二氧化硅包被的量子点等,通过掺入一定比例的Mn、Cu等过渡金属元素可有效改善量子点的光谱性质,而二氧化硅壳层的构建除了可以提高量子点的荧光稳定性,便于量子点的表面功能化外,还有利于降低因量子点光分解所导致的细胞毒性问题。
量子点的合成方法主要有两种:一种是在有机相中合成,另一种是在水相中合成。采用胶体化学方法在有机相中合成可制得粒径分布范围较小、荧光量子产率较高的量子点,但其不溶于水,在应用于蛋白质、核酸等生物分子标记时,必须先用一定的双功能团对其表面进行修饰,使其在具备水溶性的同时又能与生物分子发生偶联。与有机相合成法相比,水相合成法通过在水溶液中加入巯基乙醇、巯基羧酸、半胱胺等稳定剂,可以直接制得表面修饰有羟基、羧基或氨基的水溶性量子点,具有操作简单、成本低、毒性小、水溶液中稳定性高、生物兼容性好等优点,但量子点的粒径分布范围相对较大,荧光量子产率相对较低。
探针的多色量子点组合微球标记或磁性微球标记可通过生物素-亲和素(包括亲和素和链霉亲和素)、抗原-抗体或配体-受体等特异性结合系统进行,如将探针一端标记上生物素、抗原或配体,多色量子点组合微球或磁性微球的表面对应地标记上亲和素、抗体或受体,则利用生物素-亲和素、抗原-抗体或配体-受体的特异性结合可以实现探针与多色量子点组合微球或磁性微球的生物偶联。
本发明液体芯片的制备和检测示意图如图1所示。下面将参照附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
优选实施例的液体芯片由针对细菌16S rDNA保守序列设计的通用引物和分别针对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌特异性基因序列设计的4种核酸检测系统组成;每种核酸检测系统由多色量子点组合微球标记的探针P1和磁性微球标记的探针P2组成,探针P1和P2分别与靶核酸序列两端互补,P1和P2之间不互补;4种核酸检测系统分别用4种具有不同荧光发射波长的多色量子点组合微球标记探针P1;所述多色量子点组合微球是从3种具有不同荧光发射波长的量子点中任取1、2或3种组成多色量子点组合物,再将其装载在具有相同粒径的球体中制成。
一、多色量子点组合微球编码的液体芯片的制备
1、通用引物和特异性探针的设计与合成
利用Primer Premier和Clustal X软件针对细菌16S rDNA的保守序列设计通用引物,并分别针对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌的特异性基因序列设计分别与靶核酸序列两端互补的探针P1和P2,P1和P2之间不互补。合成P1和P2,并将P1和P2的5’端分别标记上生物素,探针的生物素标记可以采用缺口平移法、PCR法等常规方法。通用引物和特异性探针序列如下表所示:
表通用引物和特异性探针序列
2、多色量子点组合微球标记的探针P1的制备
(1)多色荧光组合的设计
根据组合原则,N种物质有2N-1种组合方式,则3种发射不同荧光的荧光物质有7种组合方式,可以产生7种荧光。本实施例运用软件模拟多色荧光组合,以光谱间重叠可能最小(即光谱间干扰最小)为标准,确定了3种荧光物质(a、b、c)的荧光发射波长(分别是560nm、620nm、650nm)及4种组合方式(分别是a、b、c、ab)。
(2)量子点的合成
根据上述确定的3种荧光物质的荧光发射波长,分别合成具有这3种荧光发射波长的量子点:将氯化镉(CdCl2·2.5H2O)溶于双蒸水中,加入巯基乙酸(MAA),搅拌均匀,在搅拌条件下滴加浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至10.2,再在氮气保护下加入新制的碲氢化钠(NaHTe)溶液(由碲粉与硼氢化钠在氮气保护下反应制得),Cd2+/Te2-/MAA的摩尔比为1∶0.5∶2.4,搅拌20分钟,再在100℃水浴中回流反应,通过控制回流时间,分别制得3种不同颜色的CdTe溶液,向该溶液中加入适量异丙醇降低CdTe的溶解度,再以10000rpm超速离心30分钟提纯CdTe,即得3种不同粒径大小且表面修饰有羧基的CdTe;运用荧光光度计和双光束紫外可见分光光度计分别检测3种CdTe的荧光发射光谱和可见吸收光谱,并运用电子衍射图判断其衍射环情况,再根据上述表征结果优化量子点的合成条件。
(3)纳米微球(即球体)的合成
以苯乙烯和甲基丙烯酸为共聚合单体,二乙烯基苯为交联剂,过硫酸钾为引发剂,采用分散聚合的方法制备纳米微球:按一定质量比取十二烷基硫酸钠和十六醇,加水溶解,在搅拌、氮气保护条件下加热至温度60℃,加入苯乙烯和二乙烯基苯的混合液以及甲基丙烯酸溶液,继续搅拌45分钟后,再加入过硫酸钾溶液,升温至温度70℃引发聚合,在恒温、氮气保护条件下反应3小时得咖啡色乳液,再经分离、洗涤、干燥后,得表面带有羧基的亲水性高分子微球;运用激光光散射仪对纳米微球的粒径和表面Zeta电荷进行测定,并用透射电镜观察其粒径分布,再根据上述表征结果优化纳米微球的合成条件。
(4)多色量子点组合微球的制备
根据上述确定的4种组合方式,从合成的3种CdTe中选择1~2种组成4种多色量子点组合物,再将其分别装载入具有相同粒径的纳米微球中,制成4种具有不同荧光发射波长的多色量子点组合微球:在氯仿与丙醇或丁醇(体积比为5∶95)的混合溶液中,加入单一粒径的纳米微球,再加入多色量子点组合物,搅拌均匀,使多色量子点组合物装载入纳米微球中,再经分离、洗涤、干燥即得,通过控制量子点与纳米微球的比例,使每个纳米微球内装载的多色量子点组合物保持一致;运用流式细胞术检测4种多色量子点组合微球的荧光发射光谱,与理论上的荧光发射光谱比较,分析其差异和成因并进行纳米微球粒径大小优化;运用荧光光度计分别检测3种CdTe和4种多色量子点组合微球的荧光发射光谱,比较其光谱变化(如半峰宽、红/蓝移以及荧光强度变化等),考察多色量子点组合微球内的量子点是否发生聚集,以及量子点之间是否发生荧光共振能量转移;运用激光光散射仪对多色量子点组合微球的表面Zeta电荷进行测定,再根据上述表征结果优化多色量子点组合微球的制备条件。
(5)探针P1的多色量子点组合微球标记
用4种具有不同荧光发射波长的多色量子点组合微球分别标记4种针对特定微生物的探针P1:在浓度为0.1mol/L、pH为8.5的磷酸缓冲液(PBS)中,加入多色量子点组合微球0.6mg和浓度为8.7g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)溶液250μL,混合均匀,加入链霉亲和素0.12mg,室温下搅拌反应3小时,即得链霉亲和素标记的多色量子点组合微球,用Sephadex G100层析柱进行分离纯化,并用牛血清白蛋白溶液封闭非特异性位点。在pH为8.0的PBS中,加入链霉亲和素标记的多色量子点组合微球和5’端生物素标记的探针P1,室温下避光反应24小时,使多色量子点组合微球和探针P1通过链霉亲和素和生物素的特异性结合进行偶联,即得多色量子点组合微球标记的探针P1,采用层析法分离纯化;分别运用荧光光度计和双光束紫外可见分光光度计检测多色量子点组合微球标记探针前后的荧光发射光谱和可见吸收光谱,观察荧光发射光谱的变化,再根据上述表征结果优化多色量子点组合微球的标记条件。
3、磁性微球标记的探针P2的制备
将4种针对特定微生物的探针P2均用磁性微球进行标记。参照探针P1的多色量子点组合微球标记方法,先将磁性微球进行链霉亲和素标记,再将链霉亲和素标记的磁性微球和5’端生物素标记的探针P2通过链霉亲和素和生物素的特异性结合进行偶联,即得磁性微球标记的探针P2。
二、多色量子点组合微球编码的液体芯片的检测
检测原理:以通用引物对待测样本进行PCR扩增,再将PCR产物同时与多种核酸检测系统进行杂交反应,如果待测样本中含有靶核酸序列,则多色量子点组合微球标记的探针P1和磁性微球标记的探针P2可以与靶核酸序列通过碱基互补发生特异性结合,所得复合物利用磁性微球可通过磁性分离从复杂的反应体系中分离出来,再利用多色量子点组合微球的荧光强度与靶核酸序列浓度成正比,对靶核酸序列进行定量检测;如果待测样本中不含有靶核酸序列,则针对该靶核酸序列的多色量子点组合微球标记的探针P1无法通过靶核酸序列与磁性微球标记的探针P2结合,不具有磁性,从而在磁性分离中去除,而针对该靶核酸序列的磁性微球标记的探针P2虽然不能通过磁性分离去除,但其不发射荧光,从而不会干扰后续的荧光检测。
检测方法:常规培养四种细菌的标准菌株(金黄色葡萄球菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌即绿脓杆菌ATCC 27853、产期荚膜梭菌ATCC 64711、破伤风梭状芽孢杆菌ATCC 64041),取四种培养菌等比例混合,裂解细菌,提取总DNA,以通用引物进行PCR,所得PCR产物置反应管中,同时加入4种核酸检测系统(分别是金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、产期荚膜梭菌、破伤风梭状芽孢杆菌特异性基因检测系统),混合均匀,温度37℃杂交反应20分钟,反应完成后,将反应管置电磁场中进行磁性分离,收集磁性物质,洗涤后用PBS重新分散,将分散液滴于玻片上,置装备有冷CCD的荧光显微镜下,用图像采集和分析软件进行图像采集与分析,根据每种核酸检测系统中多色量子点组合微球的荧光发射波长和荧光强度对靶核酸序列进行定量检测,可通过调节激发波长和图像采集时间间隔等优化检测条件。
图2为采用本发明液体芯片检测四种细菌特异性基因混合样本的标准曲线,用最小平方法求得各标准曲线的回归方程,R2均高于0.99,表明多色量子点组合微球的荧光强度与靶核酸序列浓度成正比,可以据此对靶核酸序列进行定量检测。
三、多色量子点组合微球编码的液体芯片的性能评价
按照上述优选实施例的液体芯片的制备方法,将探针P1用荧光染料Cy3进行标记,其余方法相同,构建荧光染料编码的液体芯片。分别采用优选实施例的液体芯片与荧光染料编码的液体芯片对四种细菌特异性基因进行检测,考察本发明液体芯片的性能。
图3为分别采用本发明液体芯片与荧光染料编码液体芯片检测四种细菌特异性基因的对比结果。由图可知,当细菌特异性基因的浓度极低时,Cy3的荧光强度极弱,仅为多色量子点组合微球的10%左右,故荧光染料编码的液体芯片对低浓度核酸的检出效率低下,而本发明液体芯片的检测灵敏度较高;当细菌特异性基因的浓度较高时,Cy3与多色量子点组合微球的荧光强度差距有所减小,但仍然非常显著,说明多色量子点组合微球具有良好的荧光性能。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120>多色量子点组合微球编码的液体芯片及其制备方法和检测方法
<160>11
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>通用引物Primer a
<400>1
gtaggagtct ggaccgtgtc 20
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>通用引物Primer b
<400>2
cggcgtgcct aatacatg 18
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>通用引物Primer c
<400>3
cgccccgtag gagtctggac cgtgtc 26
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>针对金黄色葡萄球菌特异性基因的探针P1
<400>4
acagcaagac cgtctttcac ttttg 25
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>针对金黄色葡萄球菌特异性基因的探针P2
<400>5
aggggcggaa accccctaac actta 25
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>针对绿脓杆菌特异性基因的探针P1
<400>6
ccactttctc cctcaggacg tatg 24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>针对绿脓杆菌特异性基因的探针P2
<400>7
atctcaagga tcccaacggc tagt 24
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>针对破伤风梭状芽孢杆菌特异性基因的探针P1
<400>8
gcccatctca aagcagatta ctc 23
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>针对破伤风梭状芽孢杆菌特异性基因的探针P2
<400>9
aggcggaata cttaatgtgt taact 25
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>针对产气荚膜梭菌特异性基因的探针P1
<400>10
atctcatagc ggattgctcc tttgg 25
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>针对产气荚膜梭菌特异性基因的探针P2
<400>11
cggcacggag gtgttgaaac cccca 25
Claims (8)
1.多色量子点组合微球编码的液体芯片,其特征在于:由通用引物和至少两种核酸检测系统组成,每种核酸检测系统由多色量子点组合微球标记的探针P1和磁性微球标记的探针P2组成;所述探针P1和P2分别与靶核酸序列两端互补,P1和P2之间不互补;所述多色量子点组合微球由球体和装载在球体中的多色量子点组合物组成;所述多色量子点组合物是从n种具有不同荧光发射波长的量子点中任取m种组合而成,n和m均为正整数且m≤n;不同核酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针P1。
2.根据权利要求1所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片,其特征在于:所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)2、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种,以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。
3.根据权利要求2所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片,其特征在于:所述量子点选自CdS、CdSe、CdTe、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdSe/CdS中的任一种,以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。
4.权利要求1所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
a、设计并合成通用引物;
b、制备至少两种核酸检测系统:按照步骤b1~b3制备每种核酸检测系统,不同核酸检测系统分别用球体粒径相同但荧光发射波长不同的多色量子点组合微球标记探针P1;
b1、根据靶核酸序列设计并合成探针P1和P2,并将探针P1和P2的一端分别用X标记;
b2、制备n种具有不同荧光发射波长的量子点,从中任取m种组成多色量子点组合物,再将其装载入球体中制成多色量子点组合微球;将多色量子点组合微球用Y标记后,与步骤b1所得X标记的探针P1通过X与Y的特异性结合进行偶联,制得多色量子点组合微球标记的探针P1;
b3、将磁性微球用Y标记后,与步骤b1所得X标记的探针P2通过X与Y的特异性结合进行偶联,制得磁性微球标记的探针P2。
5.根据权利要求4所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片的制备方法,其特征在于:所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)2、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种,以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。
6.根据权利要求5所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片的制备方法,其特征在于:所述量子点选自CdS、CdSe、CdTe、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdSe/CdS中的任一种,以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点。
7.根据权利要求4所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片的制备方法,其特征在于:所述X和Y配对地选自下述特异性结合系统:生物素-亲和素、抗原-抗体或配体-受体。
8.权利要求1所述的多色量子点组合微球编码的液体芯片的检测方法,其特征在于:包括以下步骤:以通用引物进行PCR扩增,所得PCR产物与至少两种核酸检测系统同时进行杂交反应,反应完成后进行磁性分离,收集磁性物质进行荧光检测,通过每种核酸检测系统中多色量子点组合微球的荧光发射波长和荧光强度对靶核酸进行检测。
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