CN101525669B - 量子点组合微球标记核酸探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了量子点组合微球标记核酸探针及其制备方法和应用，具有不同序列的核酸探针标记有具有不同发射光谱特征的量子点组合微球，量子点组合微球包括球体和装载在球体中的量子点组合，量子点组合是从n种具有不同发射光谱特征的量子点中任取m种组合而成，n和m均为正整数且m≤n；探针制备方法包括以下步骤：制备多种具有不同序列的探针并用X进行标记；制备多种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球并用Y进行标记；将X标记探针与Y标记量子点组合微球通过X与Y的特异性结合进行偶联；该探针用于多色荧光原位杂交、光谱核型分析和染色体核型分析，可提高检测灵敏度、重复性和特异性，简化检测设备，提高检测速度，防止假阳性结果产生。

Description

量子点组合微球标记核酸探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和细胞遗传学领域，特别涉及量子点组合微球标记核酸探针及其制备方法和应用。

背景技术

不同物种的染色体都有各自特定的形态结构特征(包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等)，而且这种形态结构特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是遗传研究的重要内容，对于人类染色体病和恶性肿瘤的发生、发展、转移机制研究也具有重要的科学意义。

染色体核型分析的传统方法主要为染色体G显带法，具有操作简单、费用低廉的优点，可准确区别出各号染色体及较大片段的缺失、重复和倒位，但无法确定标记染色体的来源，无法检测微小或复杂的染色体易位。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是20世纪80年代末期在放射性原位杂交技术的基础上以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交技术。因具有经济、安全、快速、稳定等特点，目前已广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等诸多领域。其基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。近年来在FISH的基础上又建立了多色荧光原位杂交(M-FISH)和光谱核型分析(SKY)，使用5种荧光染料通过不同的组合和比例标记24种探针，杂交后24条染色体各自呈现特异的荧光，从而实现了人类全基因组染色体核型图谱的绘制，为研究人员提供了更加丰富详尽的细胞遗传学信息，包括确定标记染色体的来源、检测微小或复杂的染色体易位等，尤其为高度重排的肿瘤细胞染色体分析提供了全新、高效的方法。

本发明人运用M-FISH技术进行了多项前期研究：对宫颈脱落细胞人类染色体末端酶(hTERC)基因拷贝数的变化进行了检测以判断其与人乳头状瘤病毒(HPV)感染、分型的相关性；对膀胱移行细胞癌患者尿液脱落细胞进行了检测并证实3、7和17号染色体数目畸变与膀胱癌的临床病理分期有显著相关性。但前期研究结果发现，现有M-FISH技术存在如下问题：(1)荧光染料的荧光强度弱且背景噪音高，检测灵敏度较低；(2)荧光染料的光漂白现象明显，检测重复性较差；(3)不同荧光染料的光谱间干扰严重影响结果判断，检测特异性较弱；(4)不同荧光染料的激发需用不同滤镜组，而在滤镜组之间切换时容易产生假阳性结果。因此，如何提高检测的灵敏度、重复性和特异性、减少假阳性结果是M-FISH技术应用于临床急需解决的关键问题。

量子点(quantum dots，QDs)的出现为克服以上问题带来了希望。量子点是一种直径在1～10nm之间，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，由周期表中II-VI族或III-V族元素组成。其相对于荧光染料具有许多优点：(1)发射波长可调谐，通过控制量子点的大小和组成，可以调节其发射荧光的颜色；(2)激发波长范围宽，从紫外区到近红外区，可以用同一波长的光激发不同发射波长的量子点；(3)发射峰狭窄且对称，半高峰宽通常为25～45nm；(4)荧光强度高且稳定，对光漂白有强烈的抵制作用。由于上述优良的光谱特性，近年来量子点作为新型荧光标记物在肿瘤活体成像与靶向治疗、分子诊断等领域已显示出巨大潜力。但迄今为止，尚未见量子点组合微球标记核酸探针及其制备方法和应用的研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种量子点组合微球标记核酸探针，可以克服现有的荧光染料标记核酸探针存在的荧光强度较弱、易光漂白、不同荧光染料标记核酸探针需不同波长激发且光谱间干扰较大等缺陷。

为达到此目的，本发明提供了一种量子点组合微球标记核酸探针，具有不同序列的核酸探针标记有具有不同发射光谱特征的量子点组合微球；所述量子点组合微球包括球体和装载在球体中的量子点组合；所述量子点组合是从n种具有不同发射光谱特征的量子点中任取m种组合而成，n和m均为正整数且m≤n。

进一步，所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag₂S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)₂、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点；

进一步，所述量子点选自CdS、CdSe、CdTe、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdSe/CdS中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点；

进一步，所述球体为高分子微球。

本发明的目的之二在于提供所述量子点组合微球标记核酸探针的制备方法。

为达到此目的，本发明提供了所述量子点组合微球标记核酸探针的制备方法，包括以下步骤：

a、制备多种具有不同序列的核酸探针并用X进行标记；

b、制备n种具有不同发射光谱特征的量子点，从n种具有不同发射光谱特征的量子点中任取m种组成多种具有不同发射光谱特征的量子点组合，n和m均为正整数且m≤n；制备球体；将多种具有不同发射光谱特征的量子点组合分别装载在球体中，制得多种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球并用Y进行标记；

c、将步骤a所得的X标记核酸探针与步骤b所得的Y标记量子点组合微球通过X与Y的特异性结合进行偶联，使不同序列的核酸探针标记上具有不同发射光谱特征的量子点组合微球，即得量子点组合微球标记核酸探针。

进一步，所述量子点选自MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、SrS、SrSe、SeTe、CdS、CdSe、CdTe、BaS、BaSe、BaTe、HgS、HgSe、HgTe、PbSe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdS/Ag₂S、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、CdS/PbS、CdS/Cd(OH)₂、CdSe/CuSe、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CdS、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdSe/HgTe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/ZnSe、InAs/CdSe、InAs/InP、ZnS:Mn、ZnS:Cu、CdS:Mn和CdS:Cu中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点；

进一步，所述量子点选自CdS、CdSe、CdTe、ZnS/CdS、CdS/ZnS、CdSe/ZnS、CdSe/CdS中的任一种，以及以上述任一种为核、二氧化硅为壳的核壳型量子点；

进一步，所述球体为高分子微球；

进一步，所述X和Y配对地选自下述特异性结合系统：生物素-亲和素系统、抗原-抗体系统或配体-受体系统。

本发明的目的之三在于提供所述量子点组合微球标记核酸探针的应用。

为达到此目的，本发明提供了所述量子点组合微球标记核酸探针在多色荧光原位杂交、光谱核型分析和染色体核型分析中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明采用能装载多个量子点的微球标记核酸探针，只需制备几种具有不同发射光谱特征的量子点，通过控制装载量子点的种类和数量，即可轻松实现上百种甚至上千种颜色的核酸标记，且具有荧光强度高、荧光稳定性强、不易光漂白、不同微球可用单一波长激发且光谱间干扰小等优点；本发明探针的制备方法简便，所得探针稳定；本发明探针可用于M-FISH、SKY和染色体核型分析，不仅可以提高检测灵敏度、重复性和特异性，而且可以简化检测设备，降低检测成本，提高检测速度，还能够防止滤镜组切换时假阳性结果的产生；本发明为量子点在生命科学中的应用开辟了一个新的方向，为细胞遗传学的研究提供了一种高效、简便的方法，为人类染色体病和恶性肿瘤的发生、发展、转移机制的研究和临床诊断奠定了坚实的基础，具有良好、广阔的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为量子点组合微球标记核酸探针的制备和应用示意图；

图2为采集的M-FISH图像；

图3为用软件处理得到的24色人类全基因组染色体核型图谱。

具体实施方式

本发明使用的量子点主要包括单核量子点(如CdS、CdSe、CdTe等)和核壳结构的量子点(如CdS/ZnO、CdSe/ZnS、CdTe/CdS等)。核壳结构的量子点是在一种材料(如CdSe等)的外部包覆另一种具有较大能带隙的材料(如CdS、ZnS等)所构成的量子点，其光学特性由内核决定，外壳具有明显的提高量子产率和增强光化学稳定性的作用。此外，还包括掺杂过渡金属元素的量子点(如CdS:Mn、CdS:Cu等)和二氧化硅包被的量子点等，通过掺入一定比例的Mn、Cu等过渡金属元素可有效改善量子点的光谱性质，而二氧化硅壳层的构建除了可以提高量子点的荧光稳定性，便于量子点的表面功能化外，还有利于降低因量子点光分解所导致的细胞毒性问题。

量子点的制备方法主要有两种：一种是在有机相中制备，另一种是在水相中制备。采用胶体化学方法在有机相中制备可制得粒径分布范围较小、荧光量子产率较高的量子点，但其不溶于水，在应用于核酸标记时，必须先用一定的双功能团对其表面进行修饰，使其在具备水溶性的同时又能与核酸分子发生偶联。目前已有多种制备水溶性量子点的方法：(1)配体交换法，用亲水性的双功能化配体替代原量子点表面的三正辛基氧化膦/三正辛基膦(TOPO/TOP)配体，这种双功能化配体主要由两部分构成，一部分能固定在量子点的表面(如-SH)，另一部分为亲水性基团(如-OH、-COOH)；(2)装入法，如通过聚合的硅壳将量子点装入，聚合硅壳的内层是-SH，外层是亲水性基团；(3)新配体制备法，保留原量子点表面的TOPO/TOP配体，使用二嵌段或三嵌段聚合物的两亲分子的变体通过疏水作用插入和相互交叉来获得亲水性。与有机相制备法相比，水相制备法通过在水溶液中加入巯基乙醇、巯基羧酸、半胱胺等稳定剂，可以直接制得表面修饰有羟基、羧基或氨基的水溶性量子点，具有操作简单、成本低、毒性小、水溶液中稳定性高、生物兼容性好等优点，但量子点的粒径分布范围相对较大，荧光量子产率相对较低。

量子点组合是从n种具有不同发射光谱特征的量子点中任取m种组合而成，其中每种量子点的数量可以相同也可以不同，由此可获得多种具有不同发射光谱特征的量子点组合。

装载量子点组合的球体可以是高分子微球或其它微球，高分子微球可以通过选择聚合单体和聚合方式进行设计和制备，并且可以方便地控制其尺寸大小和均一性，使之具有所需要的特定性能与功能。

核酸探针的量子点组合微球标记可采用生物素-亲和素(主要包括亲和素和链霉亲和素)、抗原-抗体或配体-受体等特异性结合系统进行偶联，如将核酸探针标记上生物素、抗原或配体，量子点组合微球配对地标记上亲和素、抗体或受体，则利用生物素-亲和素、抗原-抗体或配体-受体的特异性结合可以使核酸探针标记上量子点组合微球。

本发明的量子点组合微球标记核酸探针可用于M-FISH、SKY和染色体核型分析。

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

一、量子点组合微球标记核酸探针的制备

图1为量子点组合微球标记核酸探针的制备和应用示意图，如图所示，本实施例的量子点组合微球标记核酸探针的制备方法，包括以下步骤：

a、制备24种全染色体涂抹探针并用生物素进行标记

根据人类全基因组染色体DNA序列设计整套共24种全染色体涂抹探针，设计的全染色体涂抹探针按照常规方法进行制备。当然，也可以直接采用商品化的未用荧光染料标记的全染色体涂抹探针。全染色体涂抹探针的生物素标记可以采用缺口平移法、PCR法等常规方法。

b、制备5种具有不同发射光谱特征的量子点，从5种具有不同发射光谱特征的量子点中任取1至3种组成24种具有不同发射光谱特征的量子点组合；制备高分子微球；将24种具有不同发射光谱特征的量子点组合分别装载在高分子微球中，制得24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球并用链霉亲和素进行标记

高分子微球的制备：以苯乙烯和甲基丙烯酸为共聚合单体，二乙烯基苯为交联剂，过硫酸钾为引发剂，用分散聚合的方法进行制备：按一定质量比取十二烷基硫酸钠和十六醇，加水溶解，在搅拌、氮气保护条件下加热至温度60℃，加入苯乙烯和二乙烯基苯的混合液以及甲基丙烯酸溶液，继续搅拌45分钟后，再加入过硫酸钾溶液，升温至温度70℃引发聚合，在恒温、氮气保护条件下反应3小时得咖啡色乳液，再经分离、洗涤、干燥后，得表面带有羧基的亲水性高分子微球。

5种具有不同发射光谱特征的量子点的制备：将氯化镉(CdCl₂·2.5H₂O)和巯基乙酸(MAA)的混合溶液用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH至10.2，通氮气30分钟后，在搅拌条件下加入新制的碲氢化钠(NaHTe)溶液(由碲粉与硼氢化钠反应制得)，Cd²⁺/Te^2-/MAA的摩尔比为1∶0.5∶2.4，继续搅拌20分钟，制得橙色的CdTe量子点前驱体溶液；将此前驱体溶液在100℃水浴中回流反应不同时间，制得5种具有不同发射光谱特征且表面修饰有羧基的CdTe量子点溶液(QD1～QD5，最大发射波长分别为525nm、550nm、565nm、605nm和620nm)；在上述CdTe量子点溶液中分别加入适量异丙醇以降低CdTe量子点的溶解度，再于10000r/min离心30分钟，弃上清，即得纯化的CdTe量子点。

在CdTe量子点制备条件的优化实验中，考察了原料配比、溶液酸碱度、回流反应时间对制备CdTe量子点的影响。结果发现：当Cd²⁺/Te^2-/MAA的摩尔比为1∶0.5∶2.4时，所得CdTe量子点溶液最稳定；当CdTe量子点前驱体溶液的pH为10.2时，纳米晶体的生长速度快且所得CdTe量子点的荧光效率高；回流反应不同时间所得CdTe量子点的荧光发射光谱均具有稳定、对称的强荧光发射信号峰，且随着回流反应时间的延长，量子点的荧光发射信号峰逐渐红移；回流反应不同时间所得CdTe量子点的可见吸收光谱显示量子点的激发波长范围很宽且粒径分布较均匀；在透射电子显微镜下可以观察到回流反应不同时间所得的CdTe量子点近似球形且粒径分布较均匀，其对应的电子衍射图为衍射环，表明生成的CdTe量子点为立方微晶结构。

24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球的制备：在含有体积百分浓度为5％的氯仿和体积百分浓度为95％的丙醇的溶液中，加入高分子微球，并按表1所示加入从5种具有不同发射光谱特征的量子点中选择1至3种(每种数量相同)组成的量子点组合，搅拌均匀，使量子点组合装载在高分子微球中，再经分离、洗涤、干燥后，即制得24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球。

表1、24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球的制备

在量子点组合微球的制备中，通过两种方式对高分子微球粒径进行优化：从5种具有不同发射光谱特征的量子点中选择1至3种组成量子点组合并装载在粒径为0.5μm的高分子微球内，制得24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球，采用流式细胞仪检测每种量子点组合微球的荧光，绘制荧光发射光谱，与理论上的荧光发射光谱进行比较，分析其差异和成因并对高分子微球的粒径进行优化；同时，将5种具有不同发射光谱特征的量子点全部装载在具有不同粒径(0.05～1.0μm)的高分子微球内(以最复杂的情况进行优化)并通过生物素-链霉亲和素系统标记全染色体涂抹探针，再与染色体标本原位杂交，通过杂交效果判断不同粒径的高分子微球进入细胞并与染色体结合的能力，进一步优化高分子微球的粒径。

量子点组合微球的链霉亲和素标记：在浓度为0.1mol/L、pH为8.5的磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入量子点组合微球0.6mg和浓度为8.7g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)250μL(EDC用量为量子点的50～100倍)，混匀，再加入链霉亲和素0.12mg，室温下搅拌反应3小时后，上SephadexG100层析柱，用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS洗脱，得纯化的链霉亲和素标记的量子点组合微球溶液；按照上述方法，对24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球分别进行链霉亲和素标记，制得24种具有不同发射光谱特征且链霉亲和素标记的量子点组合微球。

c、将生物素标记的全染色体涂抹探针与链霉亲和素标记的量子点组合微球通过生物素与链霉亲和素的特异性结合进行偶联，使不同序列的全染色体涂抹探针标记上具有不同发射光谱特征的量子点组合微球

将链霉亲和素标记的量子点组合微球先用pH为7.4的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性位点，再与生物素标记的全染色体涂抹探针在pH为8.0的PBS中室温避光反应24小时，最后用层析柱分离纯化，即得量子点组合微球标记的全染色体涂抹探针；按照上述方法，将24种具有不同发射光谱特征且链霉亲和素标记的量子点组合微球分别与24种生物素标记的全染色体涂抹探针通过生物素与链霉亲和素的特异性结合进行偶联，使不同序列的全染色体涂抹探针标记上具有不同发射光谱特征的量子点组合微球，即得24种发射不同颜色荧光的量子点组合微球标记全染色体涂抹探针，置-20℃避光保存。

二、量子点组合微球标记核酸探针的应用

图1为量子点组合微球标记核酸探针的制备和应用示意图，如图所示，应用上述制得的量子点组合微球标记全染色体涂抹探针进行染色体核型分析的方法，包括以下步骤：

a、制备中期染色体标本

取多发性骨髓瘤患者骨髓涂片，用浓度为0.4μg/mL的秋水仙胺处理1.5小时，37℃胰酶消化6分钟，加入浓度为0.075mol/L的氯化钾溶液10mL，轻轻吹打均匀，37℃水浴30分钟，加入预冷的固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)固定，再将细胞悬液滴至载玻片上，过夜干燥，即得中期染色体标本，置-20℃保存。

b、将量子点组合微球标记核酸探针和中期染色体标本进行原位杂交

杂交包括预杂交、杂交和漂洗共三步操作，其中，预杂交的目的是将待测核酸分子中的非特异性位点封闭，以避免这些位点与核酸探针的非特异性结合；漂洗的目的是洗去非特异性杂交以及未杂交的标记探针，以避免干扰特异性杂交信号的检测。

中期染色体标本的预杂交：取中期染色体标本，滴加浓度为100μg/mL的RNA酶溶液[将浓度为10mg/ml的RNA酶溶液用2×SSC缓冲液(由浓度为0.3mol/L的氯化钠和浓度为0.03mol/L的柠檬酸三钠组成)稀释制得]，盖上盖玻片，37℃孵育30分钟，用2×SSC缓冲液漂去盖玻片并洗涤5分钟，再滴加质量百分浓度为0.05％的胃蛋白酶溶液(将质量百分浓度为10％的胃蛋白酶溶液用浓度为1mol/L的HCl溶液稀释制得)，盖上盖玻片，37℃孵育10分钟，用2×SSC缓冲液漂去盖玻片并洗涤5分钟，再置体积百分浓度为1％的甲醛溶液中，37℃固定10分钟，用PBS洗涤5分钟，再立即依次置预冷的体积百分浓度为70％、90％、100％的乙醇系列溶液中脱水，每次5分钟，自然干燥。

量子点组合微球标记核酸探针和中期染色体标本的原位杂交：将经过预杂交处理的中期染色体标本置体积百分浓度为70％的甲酰胺溶液(用2×SSC缓冲液配制)中变性3分钟，再立即依次置预冷的体积百分浓度为70％、90％、100％的乙醇系列溶液中脱水，每次5分钟，自然干燥；将24种量子点组合微球标记核酸探针在75℃恒温水浴中温育5分钟，之后立即在0℃静置5～10分钟，使双链DNA探针变性；将已变性的24种量子点组合微球标记核酸探针滴加在已变性的中期染色体标本上，盖上盖玻片，用橡皮泥封片，再转移至潮湿暗盒中(控制杂交pH为6～7)，37℃杂交24小时。

中期染色体标本的漂洗：杂交完毕后，取出中期染色体标本，用刀片轻轻将盖玻片揭掉，先用预热至73℃的体积百分浓度为0.3％的乙基苯基聚乙二醇(NP-40)溶液(用0.4×SSC缓冲液配制)洗涤2分钟，再在室温下用体积百分浓度为0.3％的NP-40溶液(用0.4×SSC缓冲液配制)洗涤1分钟，PBS洗涤2分钟，再置体积百分浓度为70％、90％、100％的乙醇系列溶液中脱水，每次5分钟，自然干燥，再用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)复染，PBS洗涤多余的DAPI，自然干燥，置-20℃保存。

c、对杂交信号进行荧光检测

将杂交后的中期染色体标本置安装有冷CCD摄像头的荧光显微镜下，可见同一细胞核内24条染色体各自呈现特异的荧光，用商业化图像采集软件和自编的数据分析软件进行M-FISH的图像采集和数据处理，并绘制24色人类全基因组染色体核型图谱。为避免不同荧光间的相互作用引起错误的分类，在检测时需仔细考虑关于一个图像到另一个图像时的像素位移和摄取图像的次序。通过调节激发光源波长、采样时间、采样间隔等进行检测条件优化。采集的M-FISH图像如图2所示，用软件处理得到的24色人类全基因组染色体核型图谱如图3所示，箭头所指处为发生突变的染色体。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (1)

1.量子点组合微球标记核酸探针在制备染色体核型分析试剂中的应用，所述量子点组合微球标记核酸探针的制备方法包括以下步骤：

a、制备24种全染色体涂抹探针并用生物素进行标记；

b、制备5种具有不同发射光谱特征的量子点，从5种具有不同发射光谱特征的量子点中任取1至3种组成24种具有不同发射光谱特征的量子点组合；制备高分子微球；将24种具有不同发射光谱特征的量子点组合分别装载在高分子微球中，制得24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球并用链霉亲和素进行标记；

所述5种具有不同发射光谱特征的量子点的制备方法具体如下：将氯化镉即CdCl₂·2.5H₂O和巯基乙酸即MAA的混合溶液用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH至10.2，通氮气30分钟后，在搅拌条件下加入新制的碲氢化钠NaHTe溶液，Cd²⁺/Te^2-/MAA的摩尔比为1∶0.5∶2.4，继续搅拌20分钟，制得橙色的CdTe量子点前驱体溶液；将此前驱体溶液在100℃水浴中回流反应不同时间，制得5种具有不同发射光谱特征且表面修饰有羧基的CdTe量子点溶液QD1～QD5，最大发射波长分别为525nm、550nm、565nm、605nm和620nm；在上述CdTe量子点溶液中分别加入适量异丙醇以降低CdTe量子点的溶解度，再于10000r/min离心30分钟，弃上清，即得纯化的CdTe量子点；

所述高分子微球的制备方法具体如下：以苯乙烯和甲基丙烯酸为共聚合单体，二乙烯基苯为交联剂，过硫酸钾为引发剂，用分散聚合的方法进行制备：按一定质量比取十二烷基硫酸钠和十六醇，加水溶解，在搅拌、氮气保护条件下加热至温度60℃，加入苯乙烯和二乙烯基苯的混合液以及甲基丙烯酸溶液，继续搅拌45分钟后，再加入过硫酸钾溶液，升温至温度70℃引发聚合，在恒温、氮气保护条件下反应3小时得咖啡色乳液，再经分离、洗涤、干燥后，得表面带有羧基的亲水性高分子微球；

所述24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球的制备方法具体如下：在含有体积百分浓度为5％的氯仿和体积百分浓度为95％的丙醇的溶液中，加入高分子微球，并按下表所示加入从5种具有不同发射光谱特征的量子点中选择1至3种且每种数量相同组成的量子点组合，搅拌均匀，使量子点组合装载在高分子微球中，再经分离、洗涤、干燥后，即制得24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球；

所述量子点组合微球的链霉亲和素标记方法具体如下：在浓度为0.1mol/L、pH为8.5的磷酸盐缓冲液中，加入量子点组合微球0.6mg和浓度为8.7g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺即EDC 250μL，EDC用量为量子点的50～100倍，混匀，再加入链霉亲和素0.12mg，室温下搅拌反应3小时后，上Sephadex G100层析柱，用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS洗脱，得纯化的链霉亲和素标记的量子点组合微球溶液；按照上述方法，对24种具有不同发射光谱特征的量子点组合微球分别进行链霉亲和素标记，制得24种具有不同发射光谱特征且链霉亲和素标记的量子点组合微球；

c、将生物素标记的全染色体涂抹探针与链霉亲和素标记的量子点组合微球通过生物素与链霉亲和素的特异性结合进行偶联，使不同序列的全染色体涂抹探针标记上具有不同发射光谱特征的量子点组合微球；

具体方法如下：将链霉亲和素标记的量子点组合微球先用pH为7.4的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性位点，再与生物素标记的全染色体涂抹探针在pH为8.0的PBS中室温避光反应24小时，最后用层析柱分离纯化，即得量子点组合微球标记的全染色体涂抹探针；按照上述方法，将24种具有不同发射光谱特征且链霉亲和素标记的量子点组合微球分别与24种生物素标记的全染色体涂抹探针通过生物素与链霉亲和素的特异性结合进行偶联，使不同序列的全染色体涂抹探针标记上具有不同发射光谱特征的量子点组合微球，即得24种发射不同颜色荧光的量子点组合微球标记全染色体涂抹探针。

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