CN110894506B - 调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用。首次研究及揭示了油菜素甾醇信号通路对植物体内类黄酮合成以及植物对紫外线的抗性的影响及其分子机制。油菜素甾醇信号通路，特别是其中的转录因子BES1，其能够负调控MYB转录因子，在此基础上调控植物体内类黄酮合成，并进而调控植物对紫外线的抗性。

Description

调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用
技术领域
本发明属于植物学和分子生物学领域，更具体地，本发明涉及调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用。
背景技术
植物光合作用中，能够利用的主要光谱区是波长640～660nm的红光部分和波长400～500nm的蓝光部分。而紫外线对植物光合作用没有什么作用，现有技术中，也有认为过多的紫外线照射会影响植物的光合作用效率。植物进化过程中，体内也获得了一些抵抗紫外胁迫的机制。
紫外线UV-B(280-315nm)是太阳光的一部分，可以部分到达地表，对植物生长发育具有重要影响。UV-B既可以作为光信号调节植物生长发育，例如抑制下胚轴伸长、促进类黄酮和花青素积累、抑制避荫性和高温响应等；也可能对植物造成胁迫，比如损伤叶绿体光合复合体进而抑制光合作用、DNA吸收UV-B进而造成DNA损伤等。
植物作为固生生长的生物，既要抵抗紫外胁迫，同时也要兼顾生长发育。关于这方面的研究比较少，可供分子设计育种的基因也很少。MYB转录因子已被证实在植物抗逆胁迫中起作用。MYB转录因子可以直接控制黄酮醇合成基因的表达，从而促进类黄酮的积累。植物体内的类黄酮可以吸收UV-B，作为“防晒霜”保护植物细胞，增强植物对紫外胁迫的抵抗能力。类黄酮除了保护植物，抵抗紫外胁迫，同时在人类健康和工业生产中有重要作用，它具有抗炎、抗氧化、抗癌功效，也可以作为天然产物应用于食品加工。
但是，关于UV-B诱导类黄酮积累和抵抗紫外胁迫的研究还不是很清楚，至少有以下问题有待解决：1.在没有UV-B时，MYB基因表达量低，类黄酮积累少，那么植物在正常生长状态下是如何抑制MYB表达呢？已发现存在正调控因子促进MYB基因表达，是否存在其他因子调控MYB基因表达？2.植物是如何平衡正常的生长发育和抵抗紫外胁迫呢？因此，本领域亟待研究这些问题，发现更多的调控MYB的基因有利于精细定向地调控类黄酮的积累；阐明植物平衡生长发育和抵抗紫外胁迫的分子机理，有助于培育出既抗紫外胁迫又兼顾产量的优质品种。
发明内容
本发明的目的在于提供调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的方法，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇(BR)信号通路的转录因子BES1，从而调控(负调控)植物体内类黄酮的合成或植物对紫外线的抗性；其中，所述的BES1包括其同源物。所述的同源物包括在多个物种中的同源多肽或基因，例如拟南芥或玉米中BES1，水稻中OsBZR1homolog。
在一个优选例中，所述方法选自：(a)下调BES1，从而促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；或(b)上调BES1，从而抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性。
在另一优选例中，(a)中，BES1被下调，使得MYB转录因子表达增加，进而促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；或(b)中，BES1被上调，使得MYB转录因子表达降低，进而抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性；较佳地，所述的MYB转录因子包括MYB11，MYB12，MYB111。
在另一优选例中，所述的BES1通过与MYB基因启动子G-box结合而调控MYB转录因子表达。
在另一优选例中，(a)中，下调BES1包括：在植物中敲除或沉默BES1的编码基因，或抑制BES1的活性；较佳地，包括(但不限于)：以特异性干扰BES1的编码基因表达的干扰分子来沉默BES1，以紫外胁迫抑制BES1表达，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除BES1的编码基因，或以同源重组的方法敲除BES1编码基因。
在另一优选例中，所述的以紫外胁迫抑制BES1表达是以BUV中波长为280-300nm的紫外线进行紫外胁迫。
在另一优选例中，所述的干扰分子是以BES1的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；较佳地，所述的干扰分子是以BES1 cDNA序列构建的dsRNA。
在另一优选例中，(b)中，上调BES1包括(但不限于)：将BES1的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；或对BES1进行功能获得性点突变，较佳地，将其编码区第698个核苷酸由C突变为T。
在本发明的另一方面，提供一种调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的方法，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1对于MYB转录因子的抑制作用，从而调控(负调控)植物体内类黄酮的合成或植物对紫外线的抗性。
在一个优选例中，所述方法选自：(1)降低BES1对MYB转录因子的抑制作用，从而促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；或(2)提高BES1对MYB转录因子的抑制作用，从而抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性。
在一个优选例中，所述的植物包括(但不限于)：禾本科植物、十字花科植物。
在本发明的另一方面，提供一种油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1或其调节剂的用途，用于调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性。
在一个优选例中，所述的BES1或其上调剂抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性；所述的BES1的下调剂促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性。
在本发明的另一方面，提供一种油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1的用途，用于作为鉴定植物体内类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性的分子标记。
在本发明的另一方面，提供一种定向选择类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性增强或减弱的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物体内油菜素甾醇信号通路，特别是其中的转录因子BES1的表达，若是该测试植物的BES1表达低于该类(或该种)植物的BES1平均表达值，则其为(潜在地为)类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性强的植物；若是该测试植物的BES1表达高于该类(或该种)植物的BES1平均表达值，则其为(潜在地为)类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性弱的植物。
在本发明的另一方面，提供一种定向选择类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性增强或减弱的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1对于MYB转录因子的抑制作用，若是该测试植物中BES1对于MYB转录因子的抑制作用低于该类(或该种)植物的平均水平，则其为类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性强的植物；若是该测试植物中BES1对于MYB转录因子的抑制作用高于该类(或该种)植物的平均水平，则其为类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性弱的植物。
在本发明的另一方面，提供一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的调节剂的方法，所述方法包括：(1)将候选物质加入到含有植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1的体系中；较佳地，该体系含有油菜素甾醇信号通路；(2)检测所述体系中，观测(1)的体系中转录因子BES1的表达或活性；若所述候选物质抑制(较佳地是统计学上抑制；如降低20％以上，较佳地抑制50％以上，更佳地抑制80％以上)BES1的表达或活性，则表明该候选物质是促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性的调节剂；若所述候选物质提高(较佳地是统计学上提高；如促进20％以上，较佳地提高50％以上，更佳地提高80％以上)BES1的表达或活性，则表明该候选物质是抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性的调节剂。
在本发明的另一方面，提供一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的调节剂的方法，所述方法包括：(a)将候选物质加入到含有植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1，以及MYB转录因子的体系中；较佳地，该体系含有油菜素甾醇信号通路；(b)观测所述体系中BES1对MYB转录因子的抑制作用；其中，若所述候选物质降低(较佳地是统计学上降低；如降低20％以上，较佳地降低50％以上，更佳地降低80％以上)BES1对MYB转录因子的抑制作用，则表明该候选物质是促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性的调节剂；若所述候选物质提高(较佳地是统计学上提高；如促进20％以上，较佳地提高50％以上，更佳地提高80％以上)BES1对MYB转录因子的抑制作用，则表明该候选物质是抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性的调节剂。
在一个优选例中，所述的MYB转录因子包括MYB11，MYB12，MYB111；和/或(b)中，所述观测所述体系中BES1对MYB转录因子的抑制作用包括：观测BES1与MYB基因启动子G-box的相互作用(结合作用)。
在另一优选例中，所述的方法还包括设置对照组与测试组，以观测候选物质在测试组与对照组中的区别。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针油菜素甾醇信号通路，特别是转录因子BES1，或它们上游或下游蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物(如激素)等。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、植物组织体系、植物器官体系。
在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或转基因试验，以从候选物质中进一步确定调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性效果优异的物质。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1a，c，e、拟南芥紫外胁迫表型观察：图中相应基因型的拟南芥种在长日照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管，光强为2W/m2)处理8小时，然后放回白光下恢复生长3天，观察表型。
图1b，d，f、拟南芥最大光合转化效率Fv/Fm测定：将拟南芥种子播撒在土中，放长日照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管，光强为2W/m2)处理5小时，然后第二天用拍摄型荧光计测量最大光合转化效率Fv/Fm。
图2a、Quantitative RT-PCR：将Col和BES1-RNAi种于土中，持续白光下生长7天，每天喷一次1μM BR，移到broad band UV-B下3小时，按图中标注的时间点采集样品，分析PFG MYB基因表达情况。ACT7为内参，图中标注为三个生物学重复的标准误。
图2b、Quantitative RT-PCR：将Col和bes1-D-OX种于含有1μM BRZ的1/2MS培养基，持续白光下生长7天，移到broad band UV-B下3小时，按图中标注的时间点采集样品，分析PFG MYB基因表达情况。ACT7为内参，图中标注为三个生物学重复的标准误。
图2c、HPLC测定植物类黄酮含量：将相应基因型的拟南芥种于1/2MS培养基，持续白光条件下生长6天，移至broad band UV-B下处理两天后各采集0.1g样品，研碎溶解在80％的乙腈溶液中，涡旋后4℃静置过夜。12 000g离心之后，上清用HPLC/DAD(Agilent1260)对黄酮醇进行定量。HPLC分析用的是C18柱(2.7×100mm Agilent)，流速为0.8mlmin-1，洗脱梯度为溶液A[水]，溶液B[甲醇]和溶液D[0.5％甲酸]按照以下的操作(0到10分钟，溶液B和D分别由20到40％和80到60％，10到15分钟，溶液B和D分别由40到70％和60到30，15到20分钟，溶液B和D分别由70到90％和30到10％).DAD用来检测320nm处的紫外吸收。
图2d、DPBA染色反映植物黄酮醇含量：植物生长在持续白光下6天，移至broadband UV-B下处理1天。将处理后的植物浸泡在含有0.01％Triton X-100，2.52mg/mL DPBA的乙醇溶液中，摇床上转动1.5小时，后用去离子水洗净。用荧光显微镜观察激发光为458nm时的荧光强度。用ImageJ对荧光强度定量。
图3a、EMSA实验：原核表达的BES1蛋白能够在体外结合PFG MYB启动子。
图3b-d、ChIP实验：植物体内BES1蛋白能够结合PFG MYB启动子。上部为分析PFGMYB启动子，红色圆球表示G-box，蓝色圆球表示BRRE元件。下部为ChIP-Q-PCR结果。利用野生型和BES1过表达BES1-Flag为材料，交联之前用1μM BR处理2小时。用Flag抗体做免疫共沉淀，用覆盖PFG MYB启动子的引物去做Q-PCR。
图3e、ChIP-Q-PCR：利用野生型和BES1-RNAi为材料，BES1抗体做免疫共沉淀，用PFG MYB启动子代表性的引物去做Q-PCR。
图3f、ChIP-Q-PCR：利用野生型和BES1过表达BES1-Flag为材料，BES1-Flag分别用BR和BRZ处理，用PFG MYB启动子代表性的引物去做Q-PCR。
图3g-i、瞬时转录激活实验：g，报告载体和效应载体构建方式。h-i，将转入报告载体的农杆菌分别与转入效应载体的农杆菌混合，转化烟草，三天后检测。h图为测量LUC/REN比值，i图为CCD拍摄LUC荧光。
图4a、DPBA染色测定黄酮醇含量：植物生长在持续白光下6天，移至broad bandUV-B下处理1天。将处理后的植物浸泡在含有0.01％ Triton X-100，2.52mg/mL DPBA的乙醇溶液中，摇床上转动1.5小时，后用去离子水洗净。用荧光显微镜观察激发光为458nm时的荧光强度。用ImageJ对荧光强度定量。
图4b、拟南芥紫外胁迫表型观察：图中相应基因型的拟南芥种在长日照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管，光强为2W/m2)处理8小时，然后放回白光下恢复生长3天，观察表型。
图4c、拟南芥最大光合转化效率Fv/Fm测定：将拟南芥种子播撒在土中，放长日照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管，光强为2W/m2)处理5小时，然后第二天用拍摄型荧光计测量最大光合转化效率Fv/Fm。
图5a、Western blot：将野生型拟南芥Col种在持续白光下生长7天，然后移到broad band UV-B下，按图中时间点采集样品，用BES1抗体或Actin抗体检测。
图5b、Quantitative RT-PCR：将Col种于土中，持续白光下生长7天，移到broadband UV-B下8小时，按图中标注的时间点采集样品，分析BES1基因表达情况。ACT7为内参，图中标注为三个生物学重复的标准误。
图5c-e、荧光素酶拍摄实验：利用BES1启动子驱动表达荧光素酶转基因材料pBES1:LUC，分别做四种条件光处理：narrow band UV-B(NUV)，broad band UV-B(BUV)，broad band UV-B加ZJB300滤光片，用来截止小于300nm以下的光线(BUV+ZJB300)，broadband UV-B加ZJB340滤光片，用来截止小于340nm以下的光线(BUV+ZJB340)。图c为拍摄pBES1:LUC在四种光照处理下的LUC信号，图d为四种光照条件对应的光谱，图e为图c中LUC定量值。
图6a、玉米紫外胁迫表型观察：玉米中BR合成突变体na1和相应野生型在28℃长日照白光下生长8天，用broad band UV-B处理3天，每天处理2小时，然后放回白光下恢复生长3天，观察表型。
图6b、玉米最大光合转化效率Fv/Fm测定：玉米中BR合成突变体na1和相应野生型在28℃长日照白光下生长8天，用broad band UV-B处理12小时，然后第二天用拍摄型荧光计测量最大光合转化效率Fv/Fm。
图6c、水稻紫外胁迫表型观察：水稻中BR受体突变体d61和相应野生型在28℃长日照白光下生长25天，用broad band UV-B处理12小时，然后放回白光下恢复生长3天，观察表型。
图6d、水稻最大光合转化效率Fv/Fm测定：水稻中BR受体突变体d61和相应野生型在28℃长日照白光下生长25天，用broad band UV-B处理12小时，然后第二天用拍摄型荧光计测量最大光合转化效率Fv/Fm。
具体实施方式
本发明首次研究及揭示了油菜素甾醇(BR)信号通路对植物体内类黄酮合成以及植物对紫外线的抗性的影响及其分子机制。油菜素甾醇信号通路，特别是其中的转录因子BES1(BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1)，其能够负调控MYB转录因子，在此基础上调控植物体内类黄酮合成，并进而调控植物对紫外线的抗性。
基因、多肽、信号通路及植物
如本文所用，所述的“植物”是适用于进行转基因操作的植物，可以是双子叶植物、单子叶植物或裸子植物；可以包括农作物、花卉植物或林业植物等。较佳地，所述的“植物”包括(但不仅限于)：十字花科鼠耳芥属如拟南芥；禾本科稻属植物如水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米等；十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；锦葵科棉属作物等。
如本文所用，所述的“油菜素甾醇(BR)信号通路”又称为“油菜素甾醇细胞信号转导途径”，当细胞膜表面受体激酶BRI1感知到油菜素甾醇(Brassinosteroid，BR)后磷酸化BKI1，磷酸化的BKI1与BRI1解离，BRI1与BAK1相互作用，相互磷酸化，功能增强。BRI1磷酸化BSKs和CDG，使其激活。BSKs进而磷酸化并激活BSU1，BSU1使BIN2去磷酸化。去磷酸化的BIN2功能被抑制，从而使BES1/BZR1去磷酸化。去磷酸化的BES1是激活形式的，可以向细胞核内富集并结合DNA，激活BR响应基因表达。进而发生一系列下游事件。其中，BR是一种已知的植物激素。
在本发明中，除非特别说明，所述的油菜素甾醇信号通路的相关多肽或其编码基因(包括BES1)，MYB转录因子(包括MYB11，MYB12，MYB111)或其编码基因，与它们相关的上下游多肽或基因，包括：本发明实施例中所列举的来自特定物种的信号通路、多肽或基因，以及来自其它物种的相应信号通路、同源多肽或同源基因。例如，所述的BES1指具有SEQ IDNO:1序列(CDS序列，Gene ID:838518；AT1G19350.1)编码的多肽，还包括具有与BES1多肽相同功能的序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的BES1多肽同源性高(比如与SEQ ID NO:1所示CDS序列编码的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有BES1多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。来源于拟南芥以外其它物种的与SEQ ID NO:1所示CDS序列编码的多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。
应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种的油菜素甾醇信号通路(包括BES1)以及MYB转录因子，但是获自其它物种的与所述油菜素甾醇信号通路或所述MYB转录因子高度同源(如具有60％以上，如70％，80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。
改良植物的方法
本发明揭示了油菜素甾醇信号通路对植物体内类黄酮合成以及植物对紫外线的抗性的影响及其分子机制在理论研究和植物改良中具有重要的应用价值。因此，基于本发明人的新发现，本发明提供了一种改良植物的方法，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇(BR)信号通路的转录因子BES1，进而调控(负调控)植物体内类黄酮的合成或植物对紫外线的抗性。或者，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1对于MYB转录因子的抑制作用(结合)，进而调控(负调控)植物体内类黄酮的合成或植物对紫外线的抗性。
一方面，本发明提供了一种促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性的方法，包括：降低所述植物中油菜素甾醇信号通路转录因子BES1的表达(包括使BES1不表达或低表达)或活性；或降低BES1对于MYB转录因子的抑制作用。
应理解，在得知了所述油菜素甾醇信号通路，特别是转录因子BES1的用途后，及其与MYB转录因子的相互作用机制后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的BES1的表达或调节相互作用的强弱。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低BES1的表达或使之缺失表达，比如将携带反义BES1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达BES1。
作为本发明的一种实施方式，提供了一种降低植物中BES1的表达的方法，所述的方法包括：(1)将干扰BES1表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。例如，在本发明的优选实施例中，提供了一种BES1-RNAi的试剂方法，可以有效地获得BES1表达被降低的植物。此外，也可以通过敲除、沉默或基因编辑(如基于CRISPR体系)的方法来将BES1的表达或活性进行下调。
另一方面，本发明提供了一种降低植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性的方法，包括：提高所述植物中油菜素甾醇信号通路转录因子BES1的表达(包括使BES1过表达)或活性；或，促进BES1与MYB转录因子的相互作用。
在得知了所述油菜素甾醇信号通路，特别是转录因子BES1的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的BES1的表达，或者筛选促进BES1与MYB转录因子相互作用的物质。
应用
本发明中，首次揭示了BR信号通路通过BES1抑制MYB转录因子的表达，抑制类黄酮的合成，从而负调控紫外胁迫的抗性。并且，首次揭示了高能量的、低波段的紫外线可以抑制BES1转录，从而解除对类黄酮合成的抑制，进而增强植物抵抗紫外胁迫。本发明的技术方案有助于分子设计育种，为培育出既抗紫外胁迫又兼顾产量的优质品种提供理论基础，也可以应用在药用植物中，改良类黄酮的积累。
根据本发明的揭示，结合本发明人之前的研究以及现有技术，呈现出了植物的一种新的、兼顾紫外胁迫抗逆以及营养生长的机制：BES1在没有紫外胁迫时抑制类黄酮积累，促进营养生长；在有紫外胁迫时，BES1转录被抑制，从而解除对类黄酮合成的抑制，促进植物抵抗紫外胁迫。已知BES1突变体表现为下胚轴或者株高降低，紫外胁迫抗性增强。已知BES1作为平衡营养生长和紫外胁迫抗性的连接点，可以用来分子设计育种。
根据本发明的揭示，首先，BES1抑制MYB基因表达，调节类黄酮合成，这可以应用于药用植物或功能性作物，改良类黄酮的代谢，培育类黄酮含量富集的品种。其次，抑制BR信号通路能增强植物抵抗紫外胁迫，基于此可以分子设计育种，培育抗紫外胁迫的品种。第三，低波段、高能量的紫外线可以特异的抑制BES1的转录，基于此可以设计分子开关，用低波段、高能量的紫外线启动基因表达。
筛选方法
在得知了油菜素甾醇信号通路，对植物体内类黄酮合成以及植物对紫外线的抗性的影响及其分子机制以后，可基于该新发现来筛选通过调节该信号通路，特别是BES1，从而定向调控植物体内类黄酮合成以及植物对紫外线的抗性的物质或潜在物质。
因此，本发明提供了一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的调节剂的方法，所述方法包括：以植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1作为筛选的靶点，选出特异性下调(抑制)植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1的物质，所述的物质是促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性的调节剂；或者，选出特异性上调(提高)植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1的物质，所述的物质是抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性的调节剂。
本发明提供了一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的调节剂的方法，所述方法包括：以植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1对于MYB转录因子的抑制作用(结合)作为筛选的靶点，选出特异性下调(抑制)它们这种抑制作用的物质，所述的物质是促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性的调节剂；或者，选出特异性上调这种抑制作用的物质，所述的物质是抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性的调节剂。
以蛋白或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术(GST-Pull Down)、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术等。
经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于油菜素甾醇信号通路，特别是BES1，或作用于BES1与MYB转录因子相互作用复合体的、对类黄酮的合成或代谢有调控作用的潜在物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验材料
1.BES1敲低的BES1-RNAi植株：扩增包含BES1编码区的cDNA，用酶切连接的方法将BES1 cDNA以相反方向连接至pHANNIBAL载体的两个多克隆位点，再将该载体的启动子及下游表达序列，连接至植物表达载体，转化野生型拟南芥Col，选取BES1-RNAi转基因材料；
2.BES1功能获得性点突变bes1-D和bes1-D-OX：已知BES1功能获得性点突变是其编码区第698个核苷酸由C突变为T。用包含该点突变的引物扩增BES1，克隆bes1-D，然后用BES1内源启动子驱动表达bes1-D，获得bes1-D转基因植株。用35S启动子驱动表达bes1-D，获得bes1-D-OX转基因植株。
3.转基因植株BES1-Flag：克隆BES1编码区CDS序列，用35S启动子驱动表达BES1，并融合Flag标签，转化拟南芥野生型Col，获得35S-BES1-Flag转基因植株。
4.转基因植株pBES1:LUC：克隆BES1启动子，驱动表达萤火虫荧光素酶LUC编码基因，转化拟南芥野生型Col，获得pBES1:LUC转基因植株。
5.拟南芥BR合成突变体det2：拟南芥野生型种子Col经过EMS诱变后，筛选在黑暗下持续光形态建成突变体，命名为det2，然后图位克隆，确定基因。其det2基因发生突变，进一步可以CRISPR方法再现该突变体。
6.拟南芥BR受体突变体bri1：拟南芥野生型种子Col经过EMS诱变后，筛选对BR不敏感突变体，命名为bri1，然后图位克隆，确定基因。其BR受体发生突变，进一步可以CRISPR方法再现该突变体。
7.拟南芥PFG MYB三突变体myb11 myb12 myb111：分别将插入PFG MYB的三个T-DNA突变体SALK_077068，myb12-1f，GABI-Kat291D01(该三个材料购于拟南芥生物资源中心ABRC)杂交聚合，鉴定纯和三突变。
8.玉米BR合成突变体na1购自Maize COOP。
9.水稻BR受体突变体d61：水稻用N-methyl-N-nitrosourea诱变，筛选矮化突变体，命名为d61，表型分析暗示其为BR信号突变体，进一步分析发现BR受体基因突变，经过互补验证，证明d61为BR受体突变体。进一步可以CRISPR方法再现该突变体。
10.uvr8：购自拟南芥生物资源中心ABRC。
实验方法
1.紫外胁迫表型观察
将拟南芥种子播撒在土中，放长日照白光下生长10天，用Broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管，光强为2W/m2)处理8小时，然后放回白光下恢复生长3天，观察表型。
2.测量植物最大光合转化效率Fv/Fm
将拟南芥种子播撒在土中，放长日照白光下生长10天，用broad band UV-B(Philips TL 40W/12紫外灯管，光强为2W/m2)处理5小时，然后第二天用拍摄型荧光计测量植物光合参数。
3.HPLC分析
将相应基因型的拟南芥种于1/2MS培养基，持续白光条件下生长6天，移至broadband UV-B下处理两天后各采集0.1g样品，研碎溶解在80％的乙腈溶液中，涡旋后4℃静置过夜。12 000g离心之后，上清用HPLC/DAD(Agilent 1260)对黄酮醇进行定量。HPLC分析用的是C18柱(2.7×100mm Agilent)，流速为0.8ml min-1，洗脱梯度为溶液A[水]，溶液B[甲醇]和溶液D[0.5％甲酸]按照以下的操作(0到10分钟，溶液B和D分别由20到40％和80到60％，10到15分钟，溶液B和D分别由40到70％和60到30，15到20分钟，溶液B和D分别由70到90％和30到10％).DAD用来检测320nm处的紫外吸收。
4.DPBA染色
植物生长在持续白光下6天，移至broad band UV-B下处理1天。将处理后的植物浸泡在含有0.01％ Triton X-100，2.52mg/mL DPBA的乙醇溶液中，摇床上转动1.5小时，后用去离子水洗净。用荧光显微镜观察激发光为458nm时的荧光强度。
5.实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative RT-PCR)
以cDNA作为模板，运用Takara的SYBR Green qPCR mix进行反应，在MX3000(Stratagene)系统中运行，运行程序为：95℃，30sec；95℃，5sec；60℃，30sec；过程中进行荧光信号采集，40个循环。Quantitative RT-PCR结果运用Actin7基因引物为内参，均有两次技术重复及2次以上生物学重复。
6.染色质免疫共沉淀ChIP
将Pro35S:BES1-Flag以及Col-0野生型种植在长日照的人工气候室，收集12天左右苗龄的拟南芥幼苗，质量为2g；然后用甲醛固定及交联；提取细胞核并超声破碎；用结合了Flag抗体的protein A/G agarose beads去免疫共沉淀蛋白-DNA复合物，旋转孵育过夜；洗脱及解交联；消化蛋白以及DNA的纯化；定量PCR分析。
7.凝胶阻滞实验(EMSA)
1)利用原核系统表达并纯化BES1蛋白；
2)制备探针：选择PFG MYB启动子包含有G-box的序列，合成互补的两条寡核苷酸，然后复性形成双链寡核苷酸，连接至T载体(pEASY-blunt，CB111，Transgene)。测序验证目的序列连接正确后，以该质粒为模板，用Cy5标记的M13正反向引物PCR扩增目的序列，酒精沉淀回收PCR产物即为标记的探针。用未标记的M13正反向引物PCR扩增目的序列，酒精沉淀回收后即为冷探针。
3)反应：配制20μL结合缓冲液[25mM HEPES(pH 7.5)，40mM KCl，3mM DTT，10％甘油，0.1mM EDTA，0.5mg/mL BSA，0.5mg/mL poly-Glutamate]，加入15ng探针和200ng蛋白，于冰上反应30min。
4)检测：取10μL反应产物，直接上样到6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在4℃条件下电泳，100v恒压1-2h。凝胶中的Cy5标记的探针直接用Starion FLA-9000(FujiFilm，Japan)检测。
8.瞬时转录激活实验(Dual-LUC实验)
扩增PFG MYB启动子(MYB11基因的Gene ID:825435，其启动子采用其起始密码子上游2Kb区域；MYB12基因的Gene ID:819359，其启动子采用其起始密码子上游2Kb区域；MYB111基因的Gene ID:834993，其启动子采用其起始密码子上游2Kb区域)，通过酶切连接方法连接到pGreenⅡ0800-LUC报告基因载体中，该载体有35S驱动RENILLA及目的基因启动子驱动LUC表达。将含有报告载体与效应载体(BES1-Flag或bes1-D-Flag)的农杆菌混合，共转烟草，三天后检测报告基因的表达情况。使用Promega公司的双荧光报告系统检测试剂盒，通过化学发光检测系统luminometer(GloMax 20/20，Promega)进行荧光信号的定量，计算LUC/REN的比值。或者使用冷CCD直接采集LUC信号。
9.荧光素酶LUC拍照
将转基因植物pBES1:LUC种在1/2MS培养基中，放持续白光下生长7天，然后移到相应的紫外光下处理8小时，分别收集0小时、2小时、4小时、8小时的样品，加入2.5mM荧光素底物，用冷CCD采集LUC信号。
实施例1、植物激素油菜素甾醇(BR)负调控紫外胁迫抗性
本实施例中，主要研究BR是否调节植物对紫外胁迫的抗性。本发明人观察BR合成突变体或者信号转导突变体在紫外胁迫条件下的生理表型。从图1a中可见BR合成突变体det2、BR受体突变体bri1、BR通路中关键转录因子BES1突变体BES1-RNAi相比于野生型Col对紫外胁迫抗性增强。紫外胁迫被报道会损伤光合作用复合体，直接抑制光合作用效率，所以本发明人测量光系统Ⅱ最大光化学量子产量(Fv/Fm)作为反映植物受胁迫程度的指标。Fv/Fm结果与胁迫表型一致，BR合成或信号转导突变体光合表现好于野生型Col。与之相反，BES1功能获得性点突变bes1-D在有BRZ(BR合成抑制剂)的条件下对紫外胁迫更加敏感(图2c-d)。在BR信号通路中，BRI1作为受体结合BR从而向下游传递信号，BES1位于BRI1下游，直接控制BR响应基因的表达。为了证明在调控紫外胁迫方面BES1和BRI1在同一信号通路，本发明人在bri1背景下过表达bes1-D；结果显示bri1比Col更加抵抗紫外胁迫，但是bes1-D-OX/bri1却能抑制bri1抵抗紫外胁迫的表型(图1e-f)，说明BES1在BR受体BRI1下游发挥作用，抑制植物对紫外胁迫的抵抗能力。
实施例2、BES1通过抑制MYBs基因表达从而抑制黄酮醇的合成
类黄酮的积累是植物抵抗紫外胁迫的重要机制，类黄酮合成途径涉及一系列酶促反应，包括CHS(chalcone synthase)、CHI(chalcone isomerase)等。三个MYB转录因子(MYB11，MYB12，MYB111)通过激活黄酮醇合成基因(CHS，CHI等)的表达从而控制黄酮醇的合成。本发明人用实时定量PCR(q-RT-PCR)来检测BES1是否调节MYBs基因(MYB11，MYB12，MYB111)表达，结果发现MYBs在BES1-RNAi中相比于Col被上调，在bes1-D-OX中被下调(图2a-b)。本发明人进一步用高效液相色谱(HPLC)来检测植物体内的类黄酮水平，提取出苯丙烷类化合物，用HPLC分析，如图2c，野生型Col在紫外处理后有清晰的检测峰，这些峰被标记为1-6，分别对应已知的黄酮醇化合物。本发明人分析了Col，uvr8和BR相关突变体在紫外处理后的黄酮醇含量。相比于Col，uvr8表现出明显减少的黄酮醇含量，而bri1、det2、BES1-RNAi黄酮醇含量增加(图2c)。本发明人也用DPBA染色来检测黄酮醇含量。与HPLC结论一致，在紫外胁迫处理后，与Col相比，bri1和BES1-RNAi中黄酮醇含量增加(图2d)。这些结果表明，BR突变体中MYBs基因表达量上升，从而促进黄酮醇的积累和紫外胁迫抗性增强。
实施例3、BES1响应BR信号直接结合到MYBs启动子
BES1能够抑制MYBs基因表达从而控制黄酮醇合成，那么BES1能直接结合MYBs基因启动子吗？于是本发明人就分析MYBs基因启动子(MYB11启动子序列如Gene ID:825435起始密码子上游2Kb区域、MYB12启动子序列如Gene ID:819359起始密码子上游2Kb区域、MYB111启动子启动子序列如Gene ID:834993起始密码子上游2Kb区域)，发现每个MYB基因启动子都有多个G-box元件，明显多于BRRE元件，这暗示BES1可能结合到G-box上，从而抑制MYBs转录。为了证明这个假设，本发明人做了凝胶迁移实验(EMSA)。如图3a，BES1确实可以结合到MYB11、MYB12、MYB111启动子，而对于突变了G-box的MYB12启动子却无法结合。
为了进一步证明BES1结合MYBs启动子，本发明人做了染色质免疫共沉淀(ChIP)实验。本发明人先使用超表达的35S-BES1-Flag转基因植株，用Flag抗体去富集BES1-DNA复合体，然后用覆盖MYBs启动子的引物去定量检测。如图3b-d，BES1可以结合到MYBs启动子，尤其是包含G-box的区域。本发明人也用BES1内源抗体去富集野生型材料内的BES1-DNA复合体。发现内源表达的BES1确实可以结合MYBs启动子(图3e)。根据经典的BR信号通路，BES1可以响应BR信号而发生去磷酸化反应，去磷酸化的BES1是有活性的，可以结合到生长相关基因的启动子并激活它们的表达，那本发明人就猜想BR是否影响BES1结合到MYBs启动子。为了证明这个猜想，本发明人将35S-BES1-Flag种植在含有BRZ的培养基上，使BES1主要呈现磷酸化状态；同时把35S-BES1-Flag种植在一般培养基上，在做ChIP之前用BR处理，使BES1主要呈现去磷酸化状态。用这两种条件处理的植株做ChIP实验，本发明人发现相比于磷酸化的BES1，去磷酸化的BES1对MYBs有更强的DNA结合活性，与之类似的，对于BES1已知的生长相关的靶标基因SAUR-AC，去磷酸化的BES1有更强的DNA结合活性(图3f)。这些结果说明，BR信号通路的激活能够促进BES1结合到MYBs基因的启动子。
本发明人做了瞬时转录激活实验来探究BES1对MYBs基因转录的作用。本发明人构建了Dual-LUC载体：三个MYB基因启动子分别驱动萤火虫荧光素酶(LUC)表达；持续激活的35S启动子驱动海肾荧光素酶(REN)表达作为内参。效应载体是用35S启动子驱动表达BES1或bes1-D(图3g)。三种报告载体分别与效应载体：空载体表达Flag标签、BES1-Flag、bes1-D-Flag混合，共同侵染烟草叶片。通过用冷CCD直接检测LUC荧光信号(图3h)或者定量LUC/REN值(图3i)。结果显示，相比于负对照，表达BES1或bes1-D可以显著抑制MYB基因转录。
实施例4、在调节紫外胁迫过程中，MYBs在BES1下游发挥作用
由于BES1直接控制MYBs基因表达来控制黄酮醇合成途径，所以本发明人推测MYBs在BES1下游发挥作用，调节紫外胁迫的防御反应。因此myb11 myb12 myb111三突变体(简称mybt)被用来和BES1-RNAi并观察生理表型。如图4a，测量紫外条件下的黄酮醇含量，相比于Col，mybt黄酮醇几乎没有积累；BES1-RNAi黄酮醇含量高于Col；而BES1-RNAi mybt黄酮醇含量明显少于BES1-RNAi，这说明MYBs处在BES1下游控制黄酮醇合成。与黄酮醇含量一致，BES1-RNAi mybt表现出对紫外胁迫敏感的表型，抑制了BES1-RNAi抵抗紫外胁迫的表型(图4b-c)。这些结果证明，MYBs在BES1信号通路下游发挥作用，调节紫外胁迫的抗性。
实施例5、紫外胁迫抑制BES1表达
既然BES1控制MYB基因表达，从而控制类黄酮的合成和紫外胁迫的抗性，那么BES1自身是如何被紫外胁迫调控呢？本发明人发现作为紫外胁迫的broadband UV-B(280-315nm)可以使内源BES1蛋白减少(图5a)，进一步检测发现BES1的转录水平被broadbandUV-B抑制(图5b)。本发明人构建了转基因拟南芥pBES1:LUC(BES1内源启动子(Gene ID:838518，起始密码子上游2Kb序列)驱动表达LUC基因)，用不同类型的紫外光处理，分析BES1转录本变化(图5c)。本发明人做了四种紫外光处理，并用光谱仪测量相应的光谱，如图5d：NUV表示narrowband UV-B，波长为311-315nm；BUV表示broadband UV-B，实验条件下测量光谱为280-340nm；BUV+ZJB300表示在BUV灯管下添加ZJB300滤光片，用以过滤波长小于300nm的紫外光，实际测量光谱显示小于300nm的紫外光极少；BUV+ZJB340表示在BUV灯管下添加ZJB340滤光片，用以过滤波长小于340nm的紫外光，实际测量光谱显示几乎没有紫外光。用这四种光照条件处理转基因植株pBES1:LUC，并做定量分析，发现只有BUV可以明显抑制pBES1:LUC荧光信号；BUV+ZJB340去除了几乎全部紫外线，对pBES1:LUC荧光信号没有影响；而311-315nm的NUV或去除小于300nm的BUV+ZJB300对pBES1:LUC荧光信号也没有显著影响，这表明BUV中波长为280-300nm的紫外线对于抑制BES1转录发挥关键作用。
实施例6、BR负调控紫外胁迫抗性在作物中是保守的
拟南芥中的实验表明BR负调控紫外胁迫抗性，那么这个规律是否在作物中保守呢？本发明人观察了玉米中BR合成突变体na1的紫外胁迫表型。从图6a中可见，相比于野生型，na1的叶片的受胁迫程度好于野生型。检测最大光合转化效率Fv/Fm来反映胁迫程度，na1的光合表现好于野生型(图6b)，这都表明玉米中BR合成突变体对紫外胁迫抗性增强。
本发明人还观察了水稻中BR受体突变体d61，发现在紫外胁迫处理后d61的叶片胁迫程度或者最大光合转化效率好于野生型(图6c-d)，这表明水稻中BR受体突变体对紫外胁迫抗性增强。这些结果表明，BR负调控植物对紫外胁迫的抗性在拟南芥和作物中是保守的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 调节植物类黄酮合成及紫外抗性的基因及其应用
<130> 184935
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1008
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
atgacgtctg acggagcaac gtcgacgtca gctgcagctg cagcagcagc gatggcgacg 60
aggaggaaac cgtcgtggag agagagggag aacaatcgga gaagagagcg gcggagaaga 120
gctgttgcgg cgaagattta tactggtctt agagctcaag gtaactacaa tcttccaaaa 180
cattgtgaca acaatgaggt tcttaaggct ctttgttctg aagctggttg ggttgttgaa 240
gaagacggaa ctacttatcg caagggacac aagcctctac ctggtgacat ggctggatca 300
tcttctcgag caactcctta ctcttcccat aaccaaagtc ctctttcttc cacttttgat 360
agccccatct tatcttacca agtcagtcct tcctcttctt cattcccgag tccttctcga 420
gttggtgatc cacacaatat ctccacaatc ttccctttcc tcaggaatgg tggtattcct 480
tcatcgcttc ctccacttag aatctcaaac agtgctcctg tcactccacc agtgtcatcc 540
ccaacttcta gaaaccccaa accattgcct acttgggaat cttttaccaa acaatccatg 600
tccatggctg ctaaacagtc aatgacttct ttgaactacc cgttttatgc ggtgtctgca 660
cctgccagtc ctactcatca tcgccagttc catgctccgg ctactatacc tgaatgtgat 720
gagtctgact cttccactgt tgattctggt cattggataa gctttcaaaa gtttgcacaa 780
caacagccat tctctgcctc tatggtgcca acctcgccta ccttcaatct cgtgaaacct 840
gcaccacagc aattgtctcc aaacacagca gcaatccaag agattggtca aagctccgag 900
tttaagtttg agaacagcca agttaagcca tgggaagggg agaggatcca tgatgtggct 960
atggaggatc tagagctcac gcttggaaat ggtaaagctc atagttga 1008

Claims (19)

1.一种调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的方法，其特征在于，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1，从而调控植物体内类黄酮的合成或植物对紫外线的抗性；其中，所述的植物为拟南芥。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法选自：
(a)下调BES1，从而促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；或
(b)上调BES1，从而抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(a)中，BES1被下调，使得MYB转录因子表达增加，进而促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；或
(b)中，BES1被上调，使得MYB转录因子表达降低，进而抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的MYB转录因子包括MYB11，MYB12，MYB111。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，(a)中，下调BES1包括：在植物中敲除或沉默BES1的编码基因，或抑制BES1的活性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，下调BES1包括：以特异性干扰BES1的编码基因表达的干扰分子来沉默BES1，以紫外胁迫抑制BES1表达，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除BES1的编码基因，或以同源重组的方法敲除BES1编码基因。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的以紫外胁迫抑制BES1表达是以BUV中波长为280-300 nm的紫外线进行紫外胁迫。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，(b)中，上调BES1包括：将BES1的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；或对BES1进行功能获得性点突变，将其编码区第698个核苷酸由C突变为T。
9.一种调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的方法，其特征在于，所述方法包括：调控植物体内油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1对于MYB转录因子的抑制作用，从而调控植物体内类黄酮的合成或植物对紫外线的抗性；所述的植物为拟南芥。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法选自：
(1)降低BES1对MYB转录因子的抑制作用，从而促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；或
(2)提高BES1对MYB转录因子的抑制作用，从而抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性。
11.一种油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1的用途，用于调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性；所述的植物为拟南芥。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，利用BES1或其上调剂抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性；所述上调剂为含有BES1的编码基因的表达构建物或载体；
利用BES1的下调剂促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性；所述下调剂为在植物中敲除或沉默BES1的编码基因的试剂，或抑制BES1的活性的试剂。
13.一种油菜素甾醇信号通路的转录因子BES1的用途，用于作为鉴定植物体内类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性的分子标记；所述的植物为拟南芥。
14.一种定向选择类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性增强或减弱的植物的方法，其特征在于，所述方法包括：鉴定测试植物体内油菜素甾醇信号通路，特别是其中的转录因子BES1的表达，若是该测试植物的BES1表达低于该类植物的BES1平均表达值，则其为类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性强的植物；若是该测试植物的BES1表达高于该类植物的BES1平均表达值，则其为类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性弱的植物；所述的植物为拟南芥。
15.一种定向选择类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性增强或减弱的植物的方法，其特征在于，所述方法包括：鉴定测试植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1对于MYB转录因子的抑制作用，若是该测试植物中BES1对于MYB转录因子的抑制作用低于该类植物的平均水平，则其为类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性强的植物；若是该测试植物中BES1对于MYB转录因子的抑制作用高于该类植物的平均水平，则其为类黄酮合成能力或植物对紫外线的抗性弱的植物；所述的植物为拟南芥。
16.一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的调节剂的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1) 将候选物质加入到含有植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1的体系中，该体系含有油菜素甾醇信号通路；
(2) 检测所述体系中，观测(1)的体系中转录因子BES1的表达或活性；若所述候选物质抑制BES1的表达或活性，则表明该候选物质是促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性的调节剂；若所述候选物质提高BES1的表达或活性，则表明该候选物质是抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性的调节剂；所述的植物为拟南芥。
17.一种筛选调节植物体内类黄酮合成或调控植物对紫外线的抗性的调节剂的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a) 将候选物质加入到含有植物体内油菜素甾醇信号通路转录因子BES1，以及MYB转录因子的体系中，该体系含有油菜素甾醇信号通路；
(b) 观测所述体系中BES1对MYB转录因子的抑制作用；
其中，若所述候选物质降低BES1对MYB转录因子的抑制作用，则表明该候选物质是促进植物体内类黄酮的合成或提高植物对紫外线的抗性的调节剂；若所述候选物质提高BES1对MYB转录因子的抑制作用，则表明该候选物质是抑制植物体内类黄酮的合成或降低植物对紫外线的抗性的调节剂；所述的植物为拟南芥。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的MYB转录因子包括MYB11，MYB12，MYB111；和/或
(b)中，所述观测所述体系中BES1对MYB转录因子的抑制作用包括：观测BES1与MYB基因启动子G-box的相互作用。
19.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，还包括设置对照组与测试组，以观测候选物质在测试组与对照组中的区别。
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