CN115772535A - Tt2-sct1/sct2-wr2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种TT2‑SCT1/SCT2‑WR2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用。本发明首次揭示了一种新的参与植物耐热性的信号通路：TT2‑SCT1/SCT2‑WR2信号通路；其中，TT2为调控植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的负调控因子，SCT1/SCT2也为调控植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的负调控因子，而WR2则为发挥作用的正调控因子，其在植物中维持稳态是有利的。本发明对于植物性状的遗传改良具有重要的理论意义。

Description

TT2-SCT1/SCT2-WR2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用

技术领域

本发明属于植物学和农业学领域，更具体地，本发明涉及TT2-SCT1/SCT2-WR2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用。

背景技术

在自然界条件下，由于不同的地理位置、气候条件以及人类活动等多方面原因，造成了各种不良环境，超出了植物正常生长、发育所能忍受的范围，致使植物受到伤害，甚至死亡。这些对植物产生伤害的环境称为逆境，或胁迫。逆境包括但不限于：冻、低温、高温、干旱、盐渍、土壤过湿和病害等各种逆境。植物虽经受逆境影响，但它通过生理反应而抵抗逆境，如果超过植物可忍受的范围，超出植物自身修复能力，损伤将变成不可逆的，植物将受害甚至死亡。

近些年来，随着人口的不断增长以及人类活动的不断加剧，全球气候变暖成为世界一大主要问题，众所周知农作物对于气候具有敏感性。气候变化会引起农作物的大规模减产，潜在地造成严重的粮食安全问题。随着全球平均气温的逐渐升高，将会对禾本科植物小麦、水稻等主要粮食作物造成不同程度的减产。

一直以来，提高植物的耐热能力是本领域的重要课题。本领域亟待探索更多的提高植物的耐热能力的有效途径。禾本科植物水稻是世界上最重要的粮食作物之一，养育着全世界半数以上的人口，同时它也是科学研究中最重要的单子叶模式植物之一。理解水稻是如何适应不断增加的高温环境，并且应用遗传工程的手段培育对环境温度变化适应性好的水稻优良品种有助于为本领域中水稻生产应用上提供新策略，对促进水稻产量持续、稳步提升具有深远意义。同时，对水稻环境温度适应性基因资源的挖掘及分子机理研究，也会为其他农作物的育种提供新的思路及借鉴。

发明内容

本发明的目的在于提供TT2-SCT1/SCT2-WR2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的方法，包括：调节植物中TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路；较佳地所述调节包括：(a)下调TT2的表达或活性；(b)下调SCT1/SCT2的表达或活性；和/或(c)阻断SCT1/SCT2对WR2的调控，维持WR2稳态。

在一个或多个实施方式中，所述维持WR2稳态是指WR2为正常表达量/活性。

在一个或多个实施方式中，所述维持WR2稳态是指WR2不受到热环境(热诱导/热刺激)导致的钙离子流的变化的影响。

在一个或多个实施方式中，所述维持WR2稳态是指WR2不受到SCT1和/或SCT2的调控(钙调素与SCT1/SCT2相互作用，进而负调节WR2)。

在一个或多个实施方式中，(a)中，下调TT2的表达或活性，从而减少TT2对热诱导的响应、减少热刺激下胞内钙浓度，调节钙调素与SCT1的相互作用。

在一个或多个实施方式中，(b)中，下调SCT1/SCT2的表达或活性，从而下调SCT1/SCT2对于WR2的调控，维持WR2稳态(正常表达量/活性)。

在一个或多个实施方式中，(c)中，对于受热诱导WR2低表达或不表达的植物，通过回补WR2至正常量来维持WR2稳态，或通过改变WR2启动子区的SCT1/SCT2结合区、使其不与SCT1/SCT2发生相互作用。

在一个或多个实施方式中，(a)中，下调TT2的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默TT2的编码基因，或抑制TT2的活性；较佳地，包括：以特异性干扰TT2的编码基因表达的干扰分子来沉默TT2，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除TT2的编码基因，以同源重组的方法敲除TT2编码基因，或在含有TT2的植物中将TT2进行功能丧失性突变。

在一个或多个实施方式中，(b)中，下调SCT1/SCT2的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默SCT1/SCT2的编码基因，或抑制SCT1/SCT2的活性；较佳地，包括：以特异性干扰SCT1/SCT2的编码基因表达的干扰分子来沉默SCT1/SCT2，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除SCT1/SCT2的编码基因，以同源重组的方法敲除SCT1/SCT2编码基因，或在含有SCT1/SCT2的植物中将SCT1/SCT2进行功能丧失性突变。

在一个或多个实施方式中，(c)中，所述回补WR2包括：将WR2的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；对WR2自身启动子进行突变，消除SCT1/SCT2的结合位点；以组成型启动子或组织特异性启动子促进WR2表达；或，以增强子促进WR2表达。

在一个或多个实施方式中，(a)中，所述下调TT2的表达或活性包括：敲除TT2的编码基因，从而表达无活性的蛋白或不表达蛋白；较佳地，将TT2编码基因的第165位的核苷酸C突变成A，进而形成TGA而提前终止TT2蛋白表达，或将TT2编码基因的第1位到第40位进行敲除、第85位到第90位进行敲除；第19位插入一个核苷酸、第87位到第90位进行敲除；第20位核苷酸进行敲除、第91位的核苷酸A突变成T，进而导致TT2编码区发生移码，进而形成终止密码子而提前终止TT2的表达(TT2^KO)。

在一个或多个实施方式中，(b)中，所述下调SCT1/SCT2的表达或活性包括：将SCT1编码基因的第267位到第268位敲除；第219位到第253位敲除；第222位插入1个核苷酸，进而导致SCT1的编码区域移码而产生提前终止；将SCT2编码基因的第218-248位核苷酸进行敲除；第231位插入一个核苷酸；第229-231位核苷酸进行敲除，进而导致SCT2的编码区域受到破坏或移码。(SCT1/SCT2-knockout)。

在本发明的另一方面，提供一种TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路或其的调节剂的用途，用于增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量；其中，所述的调节剂包括：(a)下调TT2的表达或活性的下调剂；(b)下调SCT1/SCT2的表达或活性的下调剂；和/或(c)阻断SCT1/SCT2对WR2的调控，维持WR2稳态(正常表达量/活性)的试剂。

在一个或多个实施方式中，所述下调TT2的表达或活性的下调剂包括：敲除或沉默TT2的试剂，抑制TT2活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰TT2的编码基因表达的干扰分子，针对TT2的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将TT2进行功能丧失性突变。

在一个或多个实施方式中，所述下调SCT1/SCT2的表达或活性的下调剂包括：敲除或沉默SCT1/SCT2的试剂，抑制SCT1/SCT2活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰SCT1/SCT2的编码基因表达的干扰分子，针对SCT1/SCT2的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将SCT1/SCT2进行功能丧失性突变。

在一个或多个实施方式中，所述维持WR2稳态的试剂包括回补WR2的试剂；较佳地，包括WR2的编码基因或含有该编码基因的表达构建物；对WR2进行功能获得性突变的试剂。

在一个或多个实施方式中，所述的禾本科植物包括禾谷类作物，或所述的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路或其中的通路基因来自于禾谷类作物；较佳地，所述禾本科植物包括(但不限于)：水稻(Oryza sativa)，玉米(Zea mays)，小米(Setaria italica)，大麦(Hordeum vulgare)，小麦(Triticum aestivum)，黍(Panicum miliaceum)，高粱(Sorghumbicolor)，黑麦(Secale cereale)，燕麦(Avena sativaL)，二穗短柄草(Brachypodiumdistachyum)。

在一个或多个实施方式中，所述的TT2、SCT1、SCT2或WR2包括cDNA序列、基因组序列(gDNA)，或在它们基础上人工优化或改造的序列。

在一个或多个实施方式中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻。

在一个或多个实施方式中，所述TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路中的蛋白或基因包括它们的同源物。

在一个或多个实施方式中，所述的TT2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQID NO:5所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQID NO:5所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在一个或多个实施方式中，所述的SCT1的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQID NO:10所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在一个或多个实施方式中，所述的SCT1的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQID NO:10所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在一个或多个实施方式中，所述的SCT2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQID NO:14所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在一个或多个实施方式中，所述的WR2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQID NO:18所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路及其中的通路基因的用途，用于：作为鉴定禾本科植物耐热能力或禾本科植物高温下产量的分子标记。

在本发明的另一方面，提供一种TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路及其中的通路基因的用途，用作定向筛选具有耐热能力或在高温下保持产量的禾本科植物的分子标记。

在本发明的另一方面，提供一种TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路及其中的通路基因的用途，用于筛选提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质。

在本发明的另一方面，提供一种定向选择禾本科植物的方法，包括：鉴定测试植物中的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路及其中的通路基因的表达或序列特征或相互作用；若具有选自下组的一或多个特征，则该测试植物为具有耐热能力或在高温下保持产量的禾本科植物：该测试植物的TT2低表达或不表达；该测试植物的SCT1/SCT2低表达或不表达；该测试植物的WR2维持稳态。

在一个或多个实施方式中，该选择植物的方法可在高温下或常温下进行。

在一个或多个实施方式中，所述低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低。

在一个或多个实施方式中，所述高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高。

在本发明的另一方面，提供一种筛选提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路的体系中；(2)检测所述体系，观测其中TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路蛋白的表达或活性：若TT2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；若SCT1和/或SCT2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；若添加候选物质后促进WR2维持稳态，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质。

在一个或多个实施方式中，还包括设置对照组，从而明确分辨测试组中目标基因/蛋白的表达或活性与对照组的差异。

在一个或多个实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对TT2、SCT1、SCT2蛋白或其编码基因或它们的上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。

在本发明的另一方面，提供一种用于提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路基因的下调剂，其为CRISPR基因编辑试剂(如构建体/表达载体)，其下调TT2、SCT1和/或SCT2的表达。

在一个或多个实施方式中，所述CRISPR基因编辑试剂靶向于TT2编码基因的第165位，使核苷酸C突变成A，进而形成TGA而提前终止TT2蛋白表达；或将TT2编码基因的第1位到第40进行敲除、第85位到第90位进行敲除；第19位插入一个核苷酸、第87位到第90位进行敲除；第20位核苷酸进行敲除、第91位的核苷酸A突变成T，进而导致TT2编码区发生移码，进而形成终止密码子而提前终止TT2的表达(TT2^KO)；或靶向于SCT1/SCT2的表达或活性包括：将SCT1编码基因的第267位到第268位敲除；第219位到第253位敲除；第222位插入1个核苷酸，进而导致SCT1的编码区域移码而产生提前终止；将SCT2编码基因的第218-248位核苷酸进行敲除；第231位插入一个核苷酸；第229-231位核苷酸进行敲除，进而导致SCT2的编码区域受到破坏或移码(SCT1/SCT2-knockout)。

在本发明的另一方面，提供一种构建体(表达载体)或植物细胞、组织或器官，其中含有有外源的所述的用于提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路基因的下调剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、TT2的图位克隆及转基因验证。

(A)HPS32替换系与轮回亲本HJX的抗热表型(42℃，RH>90％，24hr)，比例尺4cm。(B)4个局部段片段的重组个体的抗热表型(42℃，RH>90％，24hr)。(C)TT2的位点被定为在25.22Kb的范围内，黑色的箭头表示ORF，右侧的柱状图表示相应的重组个体的成活率，n＝3样品。(D)在华粳籼的背景下敲除TT2使其在热胁迫耐受方面优于对照HJX，比例尺4cm。(E)在NIL-TT2^HPS32的背景下过表达TT2使其热胁迫耐受能力消失，比例尺4cm。(F)在NIL-TT2^HPS32的背景下互补TT2全长的gDNA使其热胁迫耐受能力消失，比例尺4cm。(G)NIL-TT2^HJX和NIL-TT2^HPS32成熟期表型鉴定(13hr，38℃，白天/11hr，35℃，黑夜；12天，恢复7天)，比例尺10cm。(H)不同转基因株系的粒长对比图。(I)TT2^KO/HJX、pUbi:TT2^HJX/NIL-TT2^HPS32、pTT2:TT2^HJX/NIL-TT2^HPS32在热处理后并恢复7天后的成活率统，n＝6样品。每个样品中有24株独立的植株数据为Mean±SD，使用Student’s t-test差异显著性检验，*表示P<0.05，差异显著，**表示P<0.01，差异极显著；或使用one-way ANOVA差异显著性检验，相同字母表示P>0.05。图中，常规(Normal)条件为28℃的温度(后同)。

图2、TT2^HPS32替换片段来自热带粳稻。

(A)替换系HPS32替换片段来源确定，基于chr3:16662761–17212811，550kb。数据通过水稻3000基因组获得，本发明人通过不同背景下，每一个SNP位点的碱基差异频率来指示HPS32的片段来源。(B)在水稻的不同亚种中，关键SNP位点中两个碱基出现的频率差异呈现为柱状图。(C)10种热带粳稻抗热表型鉴定(GP5，7，55，86，112，536，629，640，641，and642)，比例尺，4cm。(D)6种温带粳稻抗热表型鉴定(WYJ:Wuyunjing 7；KY131:Kongyu131；ZH11:Zhonghua11；Jiahua1；NIP:Nipponpare；and Xiushui09).，比例尺，4cm。

图3、TT2^HPS32在热胁迫下保护水稻产量。

(A)NILs的穗部表型(13hr，38℃，白天/11hr，35℃，黑夜；12天)，比例尺3cm。(B)NIL-TT2^HJX和NIL-TT2^HPS32在正常条件和热胁迫下的单株产量。(C、D)NIL-TT2^HJX和NIL-TT2^HPS32在正常条件和热胁迫下的结实率、千粒重。(E)热处理后NIL-TT2^HJX和NIL-TT2^HPS32的I₂-KI染色，比例尺0.1mm。(F)在正常条件下NILs的农艺性状考察，株高(n＝48)、粒长(n＝15)、粒宽(n＝15)、穗粒数(n＝～26)、每株穗数(n＝～26)数据为Mean±SD，以NIL-TT2^HJX为对照，使用one-way ANOVA差异显著性检验，相同字母表示P>0.05。

图4、TT2参与蜡质合成相关调控途径。

(A)基于KEGG注释的基因集富集分析(罗列了以NES评分的前十位)，ES，富集分数；NES，通过基因集大小均一化后的富集分数。对于角质，软木酯和蜡质合成通路的基因集富集分析，绿色表示这个基因集运行的富集分数；黑色的线表示在这个基因集中的每一个基因以及他们所对应的排序位置，红色的线表示在热胁迫下与NIL-TT2^HPS32呈现正相关；蓝色的线表示在热胁迫下与NIL-TT2^HJX呈现正相关。(B)在不同处理条件下以及不同的NIL背景下的聚类分析。FKPM值被换算为log2(fpkm+1)的形式呈现在纵坐标上，每一个基因的FPKM值在不同样品不同处理方式下的变化情况由灰色的线呈现，蓝色的线表示的为FPKM的平均值情况。(C)针对于subcluster 2和subcluster 3的KEGG注释分析。(D)转录组分析不同时间的热处理下，近等基因系之间蜡质相关基因的差异表达情况，这个图中共涵盖了49个蜡质相关的基因。(E)热图呈现的是在热处理后近等基因系之间蜡质相关的DEG表达情况，3个生物学重复，每个生物学重复中含有24株独立水稻幼苗。(F)蜡质组分在不同处理条件即不同近等基因系之间的差异，样品被提取蜡质组分并用GC-MS进行分析，热图呈现的是有显著性差异的蜡质代谢物。(G)扫描电镜观察在0、12、20、24小时处理时间下不同近等基因系中叶片表面的蜡质晶体状态，比例尺，1μm。右图是对应的在不同时间处理条件下并且恢复7天后的抗热表型，比例尺，5cm。(H)qPCR鉴定热诱导的OsWR2表达量的变化。

图5、OsWR2作用于TT2调控的抗热通路下游。

(A)在NIL-TT2^HPS32的背景下敲除OsWR2，与野生型的比对后的敲除情况。(B)在NIL-TT2^HPS32的背景下的OsWR2敲除转基因植株(wr2/NIL-TT2^HPS32)与NIL-TT2^HPS32的抗热表型；比例尺，5cm。(C)在热胁迫下，转基因植株及其野生型的成活率统计。(D)甲苯胺蓝染色，表征植物表皮层透水性，12天的幼苗叶片在热条件下在TB的溶液中染色1小时后清洗掉多余着色，颜色越深，表明表皮层透水性越强。比例尺，2cm。

图6、SCT1作为一个转录了因子结合OsWR2的启动子。

(A)SCT1在作物(水稻、小麦、玉米、大豆)及拟南芥中同源基因进化分析。(B)体外的chip-qPCR实验证明Halo-SCT1-NT蛋白可以结合到OsWR2的启动子区域，这个CG1-like元件位于OsWR2转录起始位点上游293bp左右，黑色的线表示通过qPCR扩增的区域，富集倍数通过input来作为内参，Halo的空载蛋白作为对照。(C)凝胶迁移实验证明SCT1/SCT2可以结合到CG1-like的顺式元件，正常探针和突变探针的序列在图的顶端呈现，每一条探针都是在5’端标记上cy5；检测结合的特异性，结合竞争实验通过加未标记的冷探针(5x，25x，50x)来实现。(D)在烟草中瞬时表达SCT1-YFP、SCT2-YFP、CaM-mCherry，比例尺20μm。

图7、SCT1负向调控蜡质合成和水稻耐热。

(A)sct1/sct2突变体和野生型ZH11热处理后恢复7天的耐热表型，比例尺，5cm。(B)sct1/sct2突变体与ZH11在灌浆期的抗热表型，37℃/33℃处理7天后恢复5天。比例尺，10cm。(C)在ZH11的背景下敲除SCT1/SCT2，敲除后的基因组DNA与野生型的对比结果。(D)基因植株与对应的野生型在热处理后的成活率统计，3个样品，每个样品包含24棵独立的水稻幼苗。数据为Mean±SD，one-way ANOVA分析，相同字母表示P>0.05。(E)qPCR检测OsWR2在sct1/sct2突变体和野生型ZH11，在正常条件和热胁迫下的表达模式，3个生物学重复。每个样品包含24棵独立的水稻幼苗。数据为Mean±SD，Student’s t-test分析，分析后的P值标注在图上。(F)转录组测序数据基于KEGG的分析显示蜡质相关调控途径在未处理的条件下在突变体和野生型的差异基因中富集，3个生物学重复。每个生物学重复包含24棵独立的水稻幼苗。(G)热处理条件下，GC-MS呈现蜡质的含量和组分在sct1/sct2突变体和野生型ZH11之间的变化，4个生物学重复。

图8、TT2参与调控热刺激下的胞内钙信号。

(A)SIET检测水稻根部分生区(n＝6)、地上部叶肉细胞(n＝6)在热刺激下的钙流变化情况。数据为Mean±SEM，以NIL-TT2^HJX为对照。(B)SIET检测的热刺激条件下NILs的钙流速度变化曲线与时间的积分(曲线净面积)定量统计。数据为Mean±SD，以NIL-TT2^HJX为对照。(C)SIET检测水稻在热刺激下的最大钙内流定量统计。数据为Mean±SD，以NIL-TT2^HJX为对照。(D)在根、中热诱导的胞内钙动态变化曲线，基于NES-YC3.6的转基因材料。胞内的钙是通过标准化的荧光强度比例(cpVenus/ECFP)来评估的，数据为Mean±SEM，以NIL-TT2^HJX为对照。(E)峰面积(以Y＝1作为基线)。(F)最高峰值(cpVenus/ECFP)。n＝6，数据为Mean±SD，以NIL-TT2^HJX为对照。(G)在整株幼苗内，热诱导的胞内钙浓度动态变化曲线，基于UBQ10-aequorin的转基因材料。n＝21～22，数据为Mean±SEM，以NIL-TT2^HJX为对照。(H)钙浓度曲线积分，以处理前的静息钙浓度作为基线计算曲线下的净峰面积，数据为Mean±SD。n＝21～22。(I)△[Ca²⁺]_cyt ^peak-rest([Ca²⁺]_cyt ^peak-[Ca²⁺]_cyt ^rest)的定量结果显著性分析。数据为Mean±SD，n＝21～22。

图9、CaM/SCT1响应于钙信号负向调控下游OsWR2的表达。

(A)酵母双杂实验，空载AD、截短的SCT1(△CaMBD)(1-670aa)、全长的SCT1与CaM-BD共同转入Y2HGold的酵母菌株中，空载AD作为阴性对照。(B)SFLC实验验证烟草体内SCT1与CaM的互作，空载作为阴性对照。(C)Pull down实验来检测SCT1-CaMBD与GST-CaM或GST-Hal3的互作，GST-Hal3作为阴性对照，GST和MBP的抗体用于Western blot的检测。(D)SPR实验，在有无钙或者EGTA的条件下检测SCT1-CaMBD的互作。基线上的信号值代表互作两个蛋白互作的强度，KD值是基于三个梯度浓度下的CaM的信号曲线计算出来的。(E)SCT1中CaMBD核心区域蛋白多肽的凝胶迁移实验，选用了SCT1中第897-917位的氨基酸合成的肽段，设置梯度的肽段与CaM的摩尔比，并且0.1mM的CaCl₂以及2mM的EGTA电泳液中进行实验。样本在非变性的PAGE中进行分离，并通过考马斯亮蓝染色。在突变的肽段区域，第900位的缬氨酸和第907位的色氨酸被突变为精氨酸。(F)SCT1对于OsWR2的转录调控，5个拷贝的16bp的OsWR2启动子区域(含ACGCGC元件)作为报告载体，CaM抑制SCT1的转录活性，并且是CaM浓度依赖的，将转入空载effector时的LUC/REN的比值标准化为1。(G)突变的CaM₁₂₃₄缺少了结合钙的能力，同时也无法抑制SCT1的转录激活活性。(H)在水稻原生质体中通过镧离子处理抑制Ca²⁺条件下的双荧光检测实验。报告系统为5个拷贝的UAS，effector为Gal4-SCT1。(I)OsWR2在正常条件和热处理下，同时在水、氯化镁、氯化镧的处理下的表达模式。100μMMgCl₂作为阴性对照，两个不同浓度的LaCl₃被用来抑制钙通道。

具体实施方式

本发明首次研究及揭示了一种新的参与植物耐热性的信号通路：TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路；其中，TT2为调控植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的负调控因子，SCT1/SCT2也为调控植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的负调控因子，而WR2则为发挥作用的正调控因子，其在植物中维持稳态是有利的。本发明对于植物性状的遗传改良具有重要的理论意义。

术语

如本文所用，所述的“耐热能力/耐热性”、“热胁迫耐受(性)”与“抗热能力/抗热性”可互换使用。

如本文所用，所述的“信号通路”与“调控通路”可互换使用。

如本文所用，所述的“植物”为基因组中包含有本发明的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路或参与该信号通路的基因/蛋白的同源物(同源基因/同源多肽(蛋白))的植物，所述的植物可包括单子叶植物或多子叶植物；如：禾本科植物、十字花科植物、豆科植物等。优选地包括禾本科植物。在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物。较佳地，所述禾本科植物如禾本科稻属植物水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米等。例如包括：水稻、高粱、玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦。本领域技术人员应理解，适用于本发明的技术方案的植物不仅限于上述列举的，可通过鉴定其中TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路的存在情况来确定适当的植物。

如本文所用，所述的“在高温下保持产量”、“保护禾本科植物高温下产量”或“维持禾本科植物高温下产量”是指植物在高温(高于其常规培养条件的温度)环境下，保持存活、保持正常生长，并具有相对正常或基本正常的产量。在一些方式中，所述“在高温下保持产量”是指特定植物在高温环境下被培育后，其产量与“非高温环境(正常/适宜温度环境)”的产量相比，维持在后者的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上等；较佳地维持在后者的70％以上、80％以上、90％以上。

如本文所用，所述的“高温”或“热(环境)”是指显著高于植物生长适宜温度(如对于水稻而言26～30℃、较佳地28～30℃为适宜温度)的温度；例如所述的“高温”或“热(环境)”是指35℃或更高、38℃或更高、40℃或更高、42℃或更高。

如本文所用，术语“TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路”中，“SCT1/SCT2”表示“SCT1和SCT2”或“SCT1或SCT2”。SCT1与或SCT2高度同源，两者在功能上具有一定的冗余。

如本文所用，所述的“上调”包括：促进、过表达、提高、增强等，其是统计学意义的或显著性的上调、促进、提高或增强，如上调、促进、提高或增强20％、40％、60％、80％、90％或更高。

如本文所用，所述的“下调”包括：弱化、减弱、降低、抑制；表示显著性的下调、减弱、降低、抑制，如下调、减弱、降低、抑制或下调20％、40％、60％、80％、90％或更低。

如本文所用，所述的“耐热能力”是指植物耐受热环境的能力。通常，通过将测试植物与对照植物进行同一温度环境下的比较，来判断测试植物的耐热能力。当测试植物在高的温度下存活率更高、维持存活的时间更长，则通常认为其具有更好的耐热能力。

如本文所用，所述的“耐热能力高”是指某一植物(例如经改造的植物)与同类或同种植物的耐热能力相比，有统计学意义的耐热能力的增强，如存活率提高5％、10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。

如本文所用，所述的“高表达或高活性”，是针对某一目标基因/蛋白，其在某特定植物(例如经改造的植物)中的表达或活性，与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。

如本文所用，所述的“低表达或低活性”，是针对某一目标基因/蛋白，其在某特定植物(例如经改造的植物)中的表达或活性，与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。

如本文所用，所述的“功能丧失性突变”包括：使得目标蛋白的功能丧失，例如其蛋白链的关键区域发生突变、缺失或插入导致功能丧失。在一些方式中，通过基因编辑，在目标蛋白编码基因中进行碱基的插入、缺失或突变，使得目标蛋白的翻译提前终止。

如本文所用，所述的“功能获得性突变”包括：使得原本表达受限或不表达的目标蛋白正常表达；在一些方式中，通过基因编辑，在目标蛋白编码基因中进行碱基的回复(如回复到与野生型相同或简并的序列)，使得目标蛋白回复表达。

如本文所用且本领域人员能够理解，选择合适的“对照植物”是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。

TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路

本发明中，所述的“(信号)通路”是指由一系列蛋白或基因发生相互制约或相互作用而形成的信号系统，其一般会导致一些细胞事件的发生。所述的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路包括(但不限于)：TT2(THERMOTOLERANCE 2)基因(和/或其编码的蛋白)、SCT1/SCT2(Ca²⁺sensing transcription factor 1/2)(和/或其编码的蛋白)、WR2基因(和/或其编码的蛋白)。

所述的TT2的基因全长序列例如如SEQ ID NO:1所示，其编码区序列例如如SEQ IDNO:3所示，其蛋白序列例如如SEQ ID NO:6所示。

所述的SCT1基因全长序列例如如SEQ ID NO:7所示；其编码区序列例如如SEQ IDNO:9所示；其蛋白氨基酸序列例如如SEQ ID NO:10所示。

所述的SCT2基因基因全长序列如SEQ ID NO:11所示；其编码区序列例如如SEQ IDNO:13所示；其蛋白氨基酸序列例如如SEQ ID NO:14所示。

所述的WR2基因全长序列例如如SEQ ID NO:15所示；其编码区序列例如如SEQ IDNO:17所示；其蛋白氨基酸序列例如如SEQ ID NO:18所示。

当用于作为人工调控的靶标时或人为建立筛选系统时，以上的蛋白或编码基因可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物；也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的蛋白。此外，任何不影响这些蛋白的生物活性的变化形式都是可用的，如它们的功能未发生改变的衍生物或变异体。

以上所述的信号通路蛋白的变异形式也被包含在本发明中，它们包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的多肽同源性高(比如与SEQ ID NO:4所示的多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。来源于水稻以外其它物种的与所述多肽序列的同源性较高、或在同样或相近的调控通路中发挥同样或相近作用的多肽也包括在本发明中。

以上所述的信号通路基因/蛋白的同源物也被包含在本发明中。应理解，虽然本发明中优选研究了获自特定物种水稻的相应信号通路基因/蛋白，但是获自其它物种的与所述信号通路基因/蛋白同源(如具有60％以上，如70％，80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。

本发明还包括一种突变形式的TT2多肽截短体，编码其的基因序列在相应于SEQID NO:3的第165位发生突变，形成如SEQ ID NO:4的序列，从而该TT2多肽突变体发生显著性截短。所述截短体不具有野生型TT2多肽的功能，存在该突变的植物，耐热性能发生显著性变化，转变为耐热型的植物。

编码所述多肽的多核苷酸(基因)可以是来自植物的天然基因，也可以是它们的简并的序列或经密码子优化的序列。

包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含合适的表达载体。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

植物改造

本发明中，所述的“植物”包括表达TT2或包含TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路的植物。根据本领域的知识，存在TT2或包含TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制，可以实现如本发明所主张的技术效果。

在本发明的具体实施例中，以耐热的水稻品种为供体亲本，以产量优异的华粳籼74(HJX)作为轮回亲本构建了一套染色体片段替换系(CSSL)，通过对CSSL的抗热表型鉴定、筛选，筛选到了一个抗热株系HPS32。本发明人将HPS32与HJX杂交以构建F2定位群体，发现有一个显著影响水稻耐热能力的QTL位点，将其命名为TT2。通过图位克隆的方法，成功定位到了控制水稻耐热表型的TT2基因。通过测序，发现来自HPS32亲本的TT2^HPS32基因的第165位的核苷酸C突变成A，进而形成TGA而提前终止，从而编码了一个截短形式的蛋白。通过转基因鉴定，证实TT2确实是控制水稻高温耐受的功能基因。通过序列比对分析，本发明人证实TT2^HPS32位点来源于热带粳稻品种。TT2编码一个G蛋白γ亚基。本发明人构建选育了携带来自HPS32的TT2基因位点的近等基因系NIL-TT2^HPS32和其对应的对照NIL-TT2^HJX。本发明人对NILs的成熟期表型进行抗热鉴定，发现TT2^HPS32在高温下可以保护水稻产量，尤其是对于结实率的保护，并最终使得其在高温下的产量比对照提高了54.6％。TT2^HPS32会削弱热诱导的转录水平上的响应，并且差异基因富集到蜡质合成的相关通路。通过对蜡质代谢层面的研究，发现热会在NIL-TT2^HJX中诱导蜡质降低，但是在NIL-TT2^HPS32中热却不会诱导蜡质降低、因此耐热能力增强。通过对一个重要的响应于热的蜡质正向调控基因WR2的转基因分析，发现在耐热的NIL-TT2^HPS32敲除WR2会使得其耐热表型消失。通过对WR2启动子元件的分析，本发明人筛选到了一个转录因子SCT1。进一步研究发现，SCT1可以作为一个钙的感受器，其转录调控活性受到钙调素的影响，并且钙调素与SCT1的互作是受到胞内钙浓度的影响，TT2参与热刺激下胞内钙流的增加，功能缺失的TT2^HPS32会减弱该过程，SCT1可以感知在不同NILs的背景下，热刺激诱导的胞内钙浓度的差异，并最终将其反映到对于WR2转录水平的调控。

SCT1/SCT2可以作为一个钙离子的感受器，胞内钙离子浓度的变化，会被CaM识别结合并将信号记录下来，形成Ca²⁺-CaM的形式，从而促进了CaM与SCT1的互作，并抑制SCT1的转录活性，从而导致下游基因如OsWR2的表达量的下降，从而调控蜡质的含量和耐热性。

因此，本发明人解析了一条从胞外热刺激到胞内钙信号，以及钙信号被解码转导为转录水平的响应，并且最终影响到蜡质代谢层面的调控通路，进而调控抗热性。

基于本发明人的新发现，本发明提供了一种改良植物的方法，所述方法包括：调控植物体内TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路，进而调控植物耐热能力或高温下产量。

一方面，提供一种增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的方法，包括下调TT2的表达或活性。

另一方面，提供一种增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的方法，包括下调SCT1/SCT2的表达或活性。

再一方面，提供一种增强禾本科植物耐热能力或保护(维持)禾本科植物高温下产量的方法，包括阻断SCT1/SCT2对WR2的调控，维持WR2稳态。

应理解，在得知了所述TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路(可选地，也包括其上下游基因)的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低TT2表达或使之缺失表达。

本发明中，所述的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路蛋白或其编码基因的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”，且它们为具有统计学意义的“上调”、“促进”。任何可提高所述信号通路蛋白的活性、提高所述信号通路蛋白的稳定性、上调所述信号通路基因的表达、增加所述信号通路蛋白有效作用时间的物质、增加各个蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于上调TT2或信号通路有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

本发明中，所述的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路蛋白的活性、降低信号通路蛋白或其编码基因的稳定性、下调它信号通路蛋白的表达、减少信号通路蛋白有效作用时间、抑制信号通路基因的转录和翻译的物质、或降低各个蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调TT2有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰所述信号通路基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑TT2的基因编辑试剂，等等。

本发明还提供了一种下调植物中TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路中TT2或SCT1/SCT2的方法，包括对其进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。对于TT2而言，作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使TT2转变为其截短体，从而改变植物的性状。作为一种更为具体的实施例方式，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除或下调靶基因。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

作为本发明的另一种实施方式，提供了一种下调植物中TT2的表达的方法，包括：(1)将干扰TT2基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。较佳地，所述方法还包括：(3)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

本发明中发现，所述信号通路中，WR2发挥正调控的作用，其启动子区与SCT1/SCT2发生相互作用，从而受到后者的转录调控。为了维持WR2稳定地发挥作用，可以阻断SCT1/SCT2对WR2的调控；或者，可以通过改变WR2启动子区的SCT1/SCT2结合区、使其不与SCT1/SCT2发生相互作用。如此操作，在热环境刺激下，胞内钙流的变化导致的变化将不再影响到WR2的正常功能的发挥，不影响蜡质的合成。

植物定向筛选或靶向性筛选

在得知了TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路及其通路基因/蛋白的功能以后，可以以其为分子标记物，来进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节这一机制，从而定向调控植物耐热能力或在高温下产量的物质或潜在物质。

因此，本发明提供了一种定向选择或鉴定植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路及其中的通路基因的表达或序列特征或相互作用；若具有选自下组的一或多个特征，则该测试植物为具有耐热能力或在高温下保持产量的禾本科植物：该测试植物的TT2低表达或不表达；该测试植物的SCT1/SCT2低表达或不表达；该测试植物的WR2维持稳态。

本发明提供了一种筛选提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路的体系中；(2)检测所述体系，观测其中TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路蛋白的表达或活性：若TT2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；若SCT1和/或SCT2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；若添加候选物质后促进WR2维持稳态，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质。

以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。

经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路或其中的通路基因/蛋白，对植物耐热性状、产量性状有调控作用的潜在物质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、实验材料和定位克隆

本发明人利用耐热水稻品种作为供体亲本，以产量优异的感热品种华粳籼74作为轮回亲本构建了一套染色体片段替换系(CSSL)，然后筛选获得了一个具有优秀抗热能力的株系HPS32，再将其与华粳籼74回交纯化背景产生F₁代，自交得到F₂分离群体用于后续定位。首先通过观察F2代分离情况，通过图位克隆的方法将TT2基因初定位到水稻3号染色体短臂端，分子标记Caps-0到InDel8956之间。然后本发明人利用7820株F₂水稻将其精细定位在分子标记Caps-3和Caps-4之间。这段基因候选区约25.22kb。通过比对网上日本晴参考序列发现该区域含有3个候选基因LOC_Os03g29370，Os03g0407400，LOC_Os03g29389。通过设计引物扩增这三个基因全长基因组序列，比较野生型及突变体序列的差异，发现候选基因Os03g0407400编码区的第165位碱基由C突变成A，进而导致第55位氨基酸突变为提前终止。因此，本发明人猜测候选基因Os03g0407400就是TT2。同时利用BC₅F₂代植株构建了目标区段包含很小一段HPS32染色体片段(携带有TT2^HPS32)、其他大部分遗传背景为HJX的近等基因系NIL-TT2^HPS32及其对照NIL-TT2^HJX。所用的引物序列如下表1。

表1、构建所用引物

2、转基因互补验证、过表达及互补验证和CRISPR/Cas9基因编辑

为了进一步确认Os03g0407400就是造成TT2^HPS32表型的基因，本发明人将来源于野生型HJX74的Os03g0407400启动子2.5kb、全长cds、500bp 3’UTR构建到pCAMBIA1300互补载体上，通过根癌农杆菌EHA105介导的水稻种子诱导愈伤组织转化方法进行遗传转化，筛选转基因阳性株系。另外，本发明人通过构建了将野生型来源的TT2基因全长cds、玉米泛素启动子驱动下过表达TT2基因的载体。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对目的基因(TT2、SCT1/SCT2、OsWR2)分别设计基因敲除载体，用于目的基因的敲除。以上遗传性实验都是通过根癌农杆菌EHA105介导的水稻种子诱导愈伤转化法进行遗传转化，通过遗传筛选转基因阳性株系，获得稳定T₂代转基因植株并考察表型。载体构建所用的引物序列如下表2。

表2、构建所用引物

构建方法：

pCAMBIA1300互补载体：以水稻华粳籼基因组为模板，以表2相应引物扩增，获得的扩增产物克隆入pCAMBIA1300中。

pCAMBIA1301过表达载体：以水稻华粳籼cDNA为模板，以表2相应引物扩增，获得的扩增产物克隆入pCAMBIA1300中。

CRISPR/Cas9敲除TT2载体：该载体引入细胞后，将TT2编码基因的第1位到第40敲除、第85位到第90位敲除；第19位插入一个核苷酸，第87位到第90位敲除；第20位核苷酸进行敲除，第91位的核苷酸A突变成T，进而导致TT2编码区发生移码，进而形成终止密码子而提前终止TT2的表达。

CRISPR/Cas9敲除SCT1/SCT2载体：该载体引入细胞后，将SCT1编码基因的第267位到第268位敲除；第219位到第253位敲除；第222位插入1个核苷酸，进而导致SCT1的编码区域移码而产生提前终止；将SCT2编码基因的第218-248位核苷酸进行敲除；第231位插入一个核苷酸；第229-231位核苷酸进行敲除，进而导致SCT2的编码区域受到破坏或移码。

CRISPR/Cas9敲除OsWR2载体：该载体引入细胞后，OsWR2编码基因中第148～169位核苷酸和第526位核苷酸被敲除；第166位被插入一个核苷酸，第526位核苷酸被敲除；第165位核苷酸和第522～526位核苷酸被敲除，导致OsWR2蛋白编码区域移码，进而提前形成终止密码子而提前终止OsWR2的表达。

3、热刺激下的钙检测实验

TT2编码的是一个G蛋白γ亚基，根据已有的研究，本发明人猜测TT2可能参与热刺激下的钙信号的调控。因此利用三种不同原理的实验来检测热刺激下胞外钙流、胞内钙信号和胞内钙浓度的变化(图8)。Scanning Ion-selective Electrode Technique(SIET)技术广泛用于非损伤检测植物胞外离子在不同处理条件下的流速变化，负值表示内流，正值表示外排，通过监测胞外的离子流速及方向的变化，来确定热刺激下钙信号的变化情况。通过将流速曲线与时间的积分获得单位面积上的流量以及最大钙流来评估热刺激下NILs之间钙流的差异。借助NES-YC3.6(钙离子的传感器)的稳定转基因水稻材料，来检测热刺激下胞内钙水平的变化，其原理是借助荧光共振能量转移，当胞内钙水平升高时，供体CFP与受体YFP的距离被拉近，因此被CFP激活的YFP(FRET)信号增强，最终以YFP/CFP的比值来直接表示胞内钙离子的水平。借助在不同NIL背景下稳定转入UBQ10-Aequorin的转基因植株用于监测热刺激下胞内钙浓度的变化情况，其原理是借助生物发光来探测胞内的钙浓度，并最终通过相应的计算公式得到相对钙浓度。

4、蛋白互作检测

为了证明SCT1和CaM的互作，利用酵母双杂交技术进行体外的蛋白互作验证。将CaM和SCT1这2个基因都构建到pGBKT7及pGADT7载体上，然后分别共转酵母Y2HGOLD感受态菌株。让其在二缺、三缺及四缺的SD培养基上生长3天后根据菌斑的大小及颜色判断这三个基因是否两两互作。基于酵母双杂交的结果，本发明人发现SCT1和CaM可以互作。为了确认该结果的可靠性，利用荧光素酶互补技术(Split Firefly Luciferase Complementationassay)进一步在烟草体内进行验证。分别将SCT1、CaM这两个基因的编码区构建在fireflyluciferase的N端及C端，分别转化根癌农杆菌GV3101后，再混合两两共转化烟草，暗下培养48小时后，均匀luciferase的底物到叶片表面，然后用带有制冷模块的CCD成像仪拍摄。结果显示，SCT1与CaM之间确实能发生互作。本发明人又利用烟草做共定位判断发生互作的具体亚细胞场所。本发明人将SCT1基因的编码区连接在Venus载体上，将CaM连接在mCherry的载体上。结果显示SCT1和CaM共定位在细胞核中。本发明人分别将TT2和SCT1的N端构建到原核表达载体，pmal-c5x(MBP-SCT1-CaMBD)以及pGEX4T-2(GST-CaM)的载体上，转入到大肠杆菌表达感受态中，加入IPTG在10-16℃的环境下诱导表达24小时左右，然后通过亲和MBP蛋白的beads纯化蛋白，并检测是否能将GST融合蛋白拉下来。实验结果表明，GST-CaM可以被MBP-SCT1-CaMBD拉下来，因此证明SCT1与CaM互作。载体构建所用的引物序列如下表3。

表3、构建所用引物(扩增模板：水稻cDNA)

5、EMSA及体外Chip-qPCR

SCT1编码一个与钙调素蛋白结合的转录因子。因此，本发明人在体外用pMal原核表达载体转化大肠杆菌，纯化了MBP-SCT1-NT融合蛋白，公司体外合成50bp左右带Cy5化学发光基团的DNA链(来自OsWR2的启动子区域)与对应蛋白及冷探针结合，之后用TBE-PAGE及非变性胶电泳，用拍胶仪拍照。本发明人发现SCT1-NT是可以与OsWR2的启动子区域结合的。本发明人也进行了体外Chip-qPCR的实验，分别表达了Halo的空载蛋白和Halo-SCT1-NT蛋白，然后将其与HJX背景下的片段化的DNA孵育，然后通过Halo的磁珠纯化蛋白，并对纯化下来的样品进行qPCR检测，以确定SCT1与OsWR2启动子区域的结合，实验结果表明，OsWR2启动子区域内含CG1 motif的一段区域会明显的被SCT1蛋白富集下来，因此证明SCT1可以与OsWR2的启动子区域发生互作(图6)。构建所用的引物/探针序列如下表4。

表4、构建所用引物(模板：水稻基因组)/探针

6、表面等离子共振(SPR)和凝胶迁移检验在不同钙环境下的蛋白互作强度

将SCT1-CaMBD蛋白固定在羧基传感器芯片(Nicoya，SCA0815)上制备蛋白质传感器芯片。将分析蛋白(CaM)以20mL/min的流速注入不同的HBS缓冲液(10mM HEPES，150mM，NaCl，0.01％Tween)中，加入Ca²⁺或EGTA，然后记录响应曲线。当在同一芯片上测试多个蛋白质时，除非另有说明，否则在注射下一个蛋白质之前，通道被清洗。至少采用3种梯度分析物浓度(1.05、2.10、4.20μmol/L CaM)得到准确的动力学数据。分析通过OpenSPR生成的数据的，TraceDrawer^TM会选择合适的数学模型，并最终计算亲和力结合常数(KD值)，KD值越小表示两个蛋白的互作强度越强。实验结果表明，EGTA会抑制CaM和SCT1-CaMBD的互作，钙会增强CaM和SCT1-CaMBD的互作。凝胶迁移实验，人工体外合成一段位于长21个氨基酸的肽段，将其与钙调素孵育，并通过非变性胶进行分离，分别设置钙环境和EGTA环境的电泳液，通过凝胶迁移的改变来确定两者之间的互作情况。实验结果表明，钙对于SCT1与CaM之间的互作是十分重要的(图9)。

7、细胞学检测

NIL-TT2^HJX和NIL-TT2^HPS32在热处理后蜡质含量有很大的变化，因此本发明人通过扫描电镜观察热处理前后表层蜡质晶体的状体，将处理前后的近等基因系的叶片速冻到液氮中，并通过冷冻干燥对样品进行固定，然后在场发射的扫描电镜下进行观察，在处理前，NIL-TT2^HJX和NIL-TT2^HPS32表层片状蜡质晶体的排布及分布密度并没有差异，但是在处理20小时后，明显地感觉到NIL-TT2^HJX中的片状晶体排布变得稀疏，在处理24小时候，NIL-TT2^HJX的表皮受到严重损害，并且蜡质乳突皱缩，因此断定TT2可以参与热胁迫下，蜡质组分的调控(图4)。甲苯胺蓝(TB)染色，TB是一种水溶性的染料，被用来快速观察植物表层蜡质的含量情况，当表层蜡质含量降低时，TB溶液会快速的进入植物内，使得植物着色增强。实验结果表明，在OsWR2敲除的背景下，TBO染色程度是要深于其对应的野生型的，因此证明OsWR2敲除使得表层蜡质组分降低(图5)。

8、双荧光转录活性检测

为了更精确了解Ca²⁺/CaM是如何调控SCT1的转录活性的。本发明人首先将SCT1和CaM的编码区域分别构建到pGreen-62sk的载体上，以OsWR2启动子上包含CGL元件在内的16个bp的区段串联重复5次，构建到0800的载体上作为报告载体(Pro：5xCGL：LUC)，将水稻的叶鞘细胞制备成原生质体，通过PEG将上述载体共转到水稻原生质体中，室温孵育16h后，进行检测。SCT1是一个正向调控转录水平的激活因子，本发明人在原生质体中转入SCT1的同时还共转入了不同浓度CaM，然后对SCT1的转录活性进行检测，结果表明，随着CaM的加入，SCT1的转录活性被抑制了，并且该过程是CaM浓度依赖的(图9)。通过对CaM的钙结合区域进行突变，从而获得丧失钙结合能力CaM₁₂₃₄，CaM₁₂₃₄无法发挥对SCT1转录活性的抑制作用，钙在CaM-SCT1的转录调控中发挥着重要的作用。用氯化镧(钙离子通道的抑制剂)处理原生质体，结果表明减少胞内钙离子可以一定程度上解除CaM对于SCT1转录活性的抑制作用。

将SCT1的启动子区域构建到DBD-GAL4的载体上作为effector载体，将CaM构建到pGreen-62sk的载体上作为plus载体，报告系统选择7x UAS驱动的luciferase的载体，用35S驱动的renilla作为内参。将上述不同组合的载体分别转入水稻原生质体，来观察在不同La处理的条件下，CaM对于SCT1转录活性的影响。实验结果显示，CaM对于SCT1的转录活性有明显的抑制作用，但是在La处理的条件下，CaM对于SCT1的抑制作用受到了一定程度的解除。载体构建所用的引物序列如下表5。

表5、构建所用引物

9、非生物胁迫处理

对于温度处理，先把各个样种，催芽，待正常温度28℃生长12天后，对应进行温度(42℃)处理，处理后恢复20-24小时，恢复7天后观察表型。并对其成活率进行统计。

10、序列信息

TT2基因全长序列如SEQ ID NO:1(来源：HJX)：

>GATCATCTCCATTATCGGAACTTCGGAGTGACATGGCAATGGCGGcggcgccccggcccaagtcgccgccggcgccgcccgacccatgcggccgccaccgcctccagctcgccgtcgacgcgctccaCCGCGAGATCGGATTCCTCGAGGTACAATCTATCTCTATCTGTCTATATCACTACCATTCATACTCCTTCGATCTTGCTTCAAAACAAAAAAATATATATTTCCTACTTCATATTCATATACACACGTACGGCTTGCTATCTGTCGAATTGTTTGCTTCTGCATGCATGCATCACTCTCATTGTAAGTTTTTCCCAGCTTAAAACCACTCCTTTTATCTTCGTTCTTCTTCCTTCTTGTTTTTTTTTAAAAAAACAACAACTCATTTAATCTTCATATAGTGTATCATGCATCATTTGCTTCTTTGATCAGTTCCCCAAAAACTGCTCCTCTCTTCCCAGCCAAATAATTAAACTTAAGCAAACAAGCAAGTTGAACTGATGATCCAATAAAACAAAACAAAACCGATCGAATAGGAAGTCAATGGCATATACCAGCTGCTATAGCTGAAGCCACGAATGCTTAGCTTAGCTCTAGTCGATCCCTGTTGACTGTTCAACACACTGCACTAACACACCAGTTAATGAGCTGATTAATTAAACCATTAAATGAGCTTAACGGGCGGCTAGCTTCTTCCTCTGGGCCCGTGCCGATCGTACCATCGGTTTGCGCGTCCCTCCACCTAAACTCTCTGCCTTGTTATTCCCTTTGCCTAGTACTACATGCATTTGCATCATCATCCCATCACCAATAGTACTACGTTTCAACTGGATTTTGGTGGTGTCCAACCATATCATATTTGGTTTTGTTCTCTAGTTTACTCCTACATTAGTCTCTAGCGGTTTTGTGGAGTACTAAAGAAAACAACTAATCAGCCAGGGTTTAACGTTTAATCGGTTGGTGGTTTTGTTAATTAATTTCATCTACTATTTTAGACTTCACAGGTCTTCGAGCTATAAGCATCGATTGCCATGCATCAATCGATGCTGGTCCACGCTAGTTTCTGAGTTCTGACTAGCTCTCTTAATTGTGCTTTGACCTACTTTAATTAATTAACCAGTGGCTGCGTCACTCATTGACCAACATTGTCATGTTACCCGGACTGATTTTTTTTTTCTTTAAAAAAACACCGGATATATTATTAGTTAGTGTATATATATGTCTGCTCAAGAAGCGCATGCATATAGTTTCTCGTCAAACAAAAAATGTACTGTATGCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTGTCATATTCGCCTTTATAATTAAAATAATTAAAATGGTGATGCCCAGCTTTTTTTTTCCTCCAATAATTTATTTATTGGCTTGATTTCCTGTGCTATTAGGAGTAAAACTACTCCGTTTTAATTAGCACCATTTTTAAAGCTTCTAAAATTAACCTAAGTAAAGTACGACAGTACTTGCTGTCTAGCTTTAAATGTTTTGGGTGTTAAAATATCCCTCAGACATCACCTGAAAAGTTGACAGGCTAAACACATGCCCATCTCCCTCGTTTACTTAAATTAATTCGAACAAACAACTGTATATATATTTCTTGCAGGGTGAAATAAATTCAATCGAAGGGATCCACGCTGCCTCCAGATGCTGCAGAGAGTAAGCCAGCCTGCTGTTTCTTTTTGTACTACTTCCATTTCTTCTCGTCTTTACTCTTACCATGCATTCACAAAATATACTTACTTACCCCAGTTTTTGATCATGAACTTTGACCGTTATCTTTTTAAGCAACTTCAATAAAATAGGTTTAAATGCAAATGTTATGTACACCATTGATTATAAAACCTTGGCAAATGAAAGTAAAAAACCAGCACATTTAATTTCTGAACGTTGGGAGTATTATTATTTTTATATCTTTTACTATCATTTAATCATAGTATCGTGCAAGCTTTTTGAGTGTAATTAGGTTGCTTAAGGTAAAAAAATGTAACTAGGTTACATTTAGTACTAAACTGAACATTTAATTAGTAATGTTTCGTTAAGTAACTGTAATTTCAATGCATGCATGTCCTCCCGtaagagcaagtttaatagtatagccaactactagctccaatttatttatagacaatctaatagctcattcatacaataattacatactacactattaatatctgatcccacctgtcatacacatactgcattttggagtccgtgctatagctgactacaaatctatagtccgctgctcttctctctctttatttatctccttaaaatatgtttgcagctggcttatagcctgctattgtacctgctctgaAAATAGTGCAGAGACTGTTCAAAAAGTCATTGCACAATAACTATTCACATGGAACTGTGAAAAGTATATATTGGAACTTACTAGCTAGATCCTTTTGGGAACATGGGAAAAGCCAAGTCACGTGTGGAATCCCTATTCCCTGTGTTCTTCAGCTAGAAGAGTGAAAATAATGTACTACTACTATACGGAGATGAAATTACAGCAGGAGCAGAAAGCGGGAAAAAAACTTTAAATCAATTAAACAAACCTCTCTCTGCAAAATTCAACACCAGCAACGAACAACTCATCAAGTTCTTGTGTTATGTACCGGCCGGTAACTAATTGttgtttgcataagcgaaacggtatatttgcaaacaaaaaataatttatgaataaaacttttatatacatgttcttaattatctcaaaacaaaggttgaaaaataaacttcgatgaaaaaatctcaaaatcaattccaaatttatggtgaaaattttaaattttgtctgataaacataagtataagcaaaaaAAAAAGTAAAGCAATGTCACTATGTTAATGGTATTGGTATATATACCTTTGAGTTTCTGTCTGTACTTTAGGAGTACATGCTACGAACATGTTTTCTTGGCTTCTATTTCGTTGGAATTACTTGCGTATTGTGGGCCAGACGCCTGGTGAACTTCGTCGATTGTGTGGACTAATTAAGCTCACCTGAAATAAGTGGTTGAAAACAAGGCTAAAGATGATTTTAATCATGGATTTTGGCTTGGAAATTTTTTTGTAGGGTTGACGAATTCATCGGAAGAACTCCTGATCCATTCATAACGATGTATGGATTTTCAGGTCGAGAATTTGTCTTTAACTTCGCACGACTGTTATTTTTTTTCTTATTAATTCTCTGTTTACAAGCAGTTCATCGGAGAAGCGAAGTCATGATCATTCTCACCACTTCTTGAAGAAGTTTCGGTACTCACTTCATTCCCGGATCTTAATGTATATATGCATATCTGCACTGTGCTAATTGGTGTACACATTATGTGATCATCAGTCCAAGTTAATTATTACTTACAAAACTGAACTAATAAACACTAGAAAATATGTAACTTGCAAAGTACATATTGAATCAGGGATTCATATATAGAACTCCACCTGCAGATTTCTTCCAATATATATATGCTGTCACCATGTTTTCACTTGTCACCTAGTACACCTTTGACTGGGAGACTTTCCTTGATGATCGACGTGGTCATATTCTTCAGATTGATTTAATTTCAGATAGAAAAAAATATTGTTTACTTAGTTTCTCTCCTTCAGTAAGAGAGATGTGCAAGACCAGCGATCAAACTATATGAACTGTTCGTTTCATGATAAAAAAAACATGATATGGAATAACTAGGTGATTCAACATATAATGGCTGATAATCCCTCGTTTCAGGAGATACCATCAGTTTTCTACTTTTCTACTTTTCTCCATGTTCTCTTTTTCATGTTTGAGGTGGATCGGAGCTTGTATTAGATGTTTGCTCAGCTCAATTATTGCTGCAGATTTCCCTATATAGCCTCCACTGTATATAtactccctccgattccataatttaatgatattttgaacaatgacgctgtctccaaaatatatctttcactttgttttcctattataatatatacaataaaaaaaatacatatttacttttcttataaatagtttcaaagacaaatctatatatgttgttatataactcttttaaactaaatatttttaaagttatagtcaaagttacaaaagttggacctcaaacatgtataaaacgtcgagaattGTATATCTGATCAACCAATAATTTGTAGTGCATTGTCTTAAAAAAATTGCATTTCTAGCTATGTATCTAGATAATTACAAGAACCAGGTGAAATCACATTTTATTTTTACTGGACCACGAACTCATTGTTTAATTACTTCCAGCCTTGCACTAAATAACAATAATTGAACCTGGCATCACCTGCACAATTAATTTGGACACAAAGTAAACATGAATGCAACATACTTCGTTTCATATTGTTTGTTGGTGTAGGATTTAAATTTTGTGTCAAAATACTTGCCGTTCTTACTACATTCTTAAGCACTTTGAGAACTAACCTTCTCTTCCTACCCTTCATCAATACAGTCATACTAACTAATTGGCTCTTATGCCTTGAAAAACTAATTAGGATGTATTTAATGAGGGTAACCATGTAATCTGCCACCAGTGAATGCAATTTTGGTTCAAAATTTCGGGCCCCCGCCCTAAAAAGTCATTATCTCGATAGAATTTTTTTGAATTTAGTCAAAATTTATTCAAATTTAGCCAAATTGTGTTAAATTTCAAATAATTTCAGTCTAAAAAGTGCTGAAAATCCCGAAATTTAGGTTCTACCGAAATGGCCGGAAATTTTCAGCGAAAATCAAACATGAAAACCTTGTCTGCCACATTTGTTAGTTTGTGTAAAGATTTGCTAGAACGATAAGTAATTTGAAGCGGATGTATATTATATATCCCACAAAACCATCAACTTGTTAATTACATGTATATTTGTGCATGATGCTTTCACCACTTTGTGGTTGTTAACGATTAAATCACACGTTTTATTTTCTCACAGCTGTTTGTGCAGAGCAAGTGCGTGCTGCCTCAGC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TT2启动子序列如SEQ ID NO:2(来源：水稻HJX)：

>actttttaaccaacgtttgaccactcgtattattcaaaaattttatgtaaatataaaaatacttatgtcatgcttaaagaacatttgatgataaatcaagtcacaataaaataaattataattacaaattttttttgaataagacgaaaggtcaaacgtttgtaaaaaagtcaacggcgtcatacattaaaatacggagggagtacataatactccatccatttttttagtacgacattatttagttaaaatgtggaaaaaacttagagaaagtagactataaaaaggttgaatggtgcaaagtaagcatagctaaactggttttttatgttacttgttgtggaccctatctacttggattcaaggtttaaacttggtatgggtgcacgtatttacggctaattatttttaaatggtaggtgatgtactgttgacagcgagacgctctcatgatgactttatcaatctaaacatatatatgttggtgcaactttttcaaaggtacttaattcaaaggataggatatttatgtatgagtttgttcataagaacgaatatgccttgataggttgtgcatgggtatctataagagtgagtgtgtgtataatatgatagggtgtgtgtgtgtttttataagaacgactacgcgcatctctatatttcggtacatcccgggtatgccttctctaaaaatgtcttgtgctaaagttgaagacaacttctaaggaaggtatctctcatcttccttgtgtgtccctactagaaaatatttttacaggcggccaaaatatttttttttgcaggcgtccataacctccgcctacacccaaagtcatgcaaaaatcaataatttttgtaggtggctaaatccacccgtttgcgaaaatattttcagcgtaaagaaaattcgccgccctcagccctacccaccgccgccctccccttcggccggatctagggttatggttttgggaggaagagggaggggaggggagctgcgtcaccatcactgaatctggtaggtgagagcgccgccatgagctcaccggtgctgccgccgacctcctgcctacgtgccgccttctccgctgcaagtcgccgctgctgccctccccacgacacagctggatccgggaggggagggcagggaaggttcgctgtcgccgccgccaccctccctacgacgtagccagatatgggtggagaggtaagcgccgccgccgctgcacaacccacgatgccgccgctgcacaacccgcgatgccgtcggccggatttgggaggtggagcgtcgccgccctccgccccgcgccatgtctgaggaaagagagcgatgggagcgccgccggccaccaccgtccccccttccccctccaaccagatctgggaggaagggagggagggaggggagccatcacgtcgttgggagtagatgccgccaccgccctccccctccctgcggccaccacactggggtgcaccgccaccgctaggtagccgcctctggctggatccacgccgaggagaggaaggagagggagagggagagggaggggaggggagatgtggaagttgacttagaaaattttgacgcccggtggtttttaagatactttacctttttgcaggcggatttattaaagaggtccgtctgcaaaaataatgatattttcacggtcggacctcttaagatatctacatgtagaaatctatatttttttacttaaattactgccagggctttgcctcgtagtataattttcataaaaactcaaaatatttacaaattacaaaagaggaaggaaggagaaaaacttataaagattacaatgtttgtaaccaatcaaaaactatctgctttaaaggatctttcattctacacatatgaagaagaacttcttttctaaacgatattcttcatgaaccaaaggagggaagctcattccgaaaatttttcccatttctctgctcgtaggcggataactatctcatctcacggttgttatttttgtaggtggctatttggcttccagagacctactcgtccgggaaaaagaaatgccagcatctagaaaaatagtttttctagtagagtgttgtgagcgtctgcgatcgtggtaaagaaagcaaaaaaggtgaaggacgagtggcatgatacatatgggaaagctgtagactttgacccttgactactcgttggaagtgtgcgtctgcatgcattattgaacggctctgatccccgcggcgcagcggatcggggtcatgtccggatgggcatatcgacgagaaggatccgtccccgacaatctttcaaggcccgtgcccccgtccctcctctcctctgcgcctttccatcatcatttacgcccaaccccaacacatgtacatttcccttggcttgcttccggagaagaaaagagcggccatccactccactctccactctctcccttccatcattacttgcccaaaaacggcaatcccctcccctccatctccatgtgctcttccacctagctccgccattcaaagcaaagcaccaagcttttgcctctccctctaccatgcctgccccctatacatagctgctgcaccgtctctcttcataaatatactagtaggagtagcagagctcatcacttc

TT2^HJX编码区序列如SEQ ID NO:3(来源：水稻HJX)：

>ATGGCAATGGCGGcggcgccccggcccaagtcgccgccggcgccgcccgacccatgcggccgccaccgcctccagctcgccgtcgacgcgctccaCCGCGAGATCGGATTCCTCGAGGGTGAAATAAATTCAATCGAAGGGATCCACGCTGCCTCCAGATGCTGCAGAGAGGTTGACGAATTCATCGGAAGAACTCCTGATCCATTCATAACGATTTCATCGGAGAAGCGAAGTCATGATCATTCTCACCACTTCTTGAAGAAGTTTCGCTGTTTGTGCAGAGCAAGTGCGTGCTGCCTCAGCTACCTCTCCTGGATctgctgctgcagcagcgccgccggcggctgctcatcctcctcctcctccttcaacctcaagaggccgagctgctgctgcaactgcaactgcaactgctgctgctcctcctcctcctcATGTGGGGCGGCGTTAACGAAGAGTCCGTGTCGCTGCCGCCGCCGCAGCTGCTGCTGCCGTCGCTGCTGCTGCGGCGGCGTCGGCGTCCGCGCGTGCGCGAGCTGCAGCTGCTCCCCGCCGTGCGCGTGCTGCGCGCCGCCGTGCGCGGGATGCTCGTGCCGCTGCACCTGCCCGTGCCCGTGCCCCGGCGGCTGCTCCTGCGCGTGCCCGGCGTGCAGGTGCTGCTGCGGCGTCCCTCGTTGCTGCCCCCCCTGCTTGTGA

TT2^HPS32编码区序列如SEQ ID NO:4(来源：水稻HPS32)：下划线标记为第165位核苷酸C→A突变，造成提前终止：

>ATGGCAATGGCGGcggcgccccggcccaagtcgccgccggcgccgcccgacccatgcggccgccaccgcctccagctcgccgtcgacgcgctccaCCGCGAGATCGGATTCCTCGAGGGTGAAATAAATTCAATCGAAGGGATCCACGCTGCCTCCAGATGCTGAAGAGAGGTTGACGAATTCATCGGAAGAACTCCTGATCCATTCATAACGATTTCATCGGAGAAGCGAAGTCATGATCATTCTCACCACTTCTTGAAGAAGTTTCGCTGTTTGTGCAGAGCAAGTGCGTGCTGCCTCAGCTACCTCTCCTGGATctgctgctgcagcagcgccgccggcggctgctcatcctcctcctcctcctccttcaacctcaagaggccgagctgctgctgcaactgcaactgcaactgctgctcctcctcctcctcctcATGTGGGGCGGCGTTAACGAAGAGTCCGTGTCGCTGCCGCCGCCGCAGCTGCTGCTGCCGTCGCTGCTGCTGCGGCGGCGTCGGCGTCCGCGCGTGCGCGAGCTGCAGCTGCTCCCCGCCGTGCGCGTGCTGCGCGCCGCCGTGCGCGGGATGCTCGTGCCGCTGCACCTGCCCGTGCCCGTGCCCCGGCGGCTGCTCCTGCGCGTGCCCGGCGTGCAGGTGCTGCTGCGGCGTCCCTCGTTGCTGCCCCCCCTGCTTGTGA

TT2^HJX的蛋白序列如SEQ ID NO:5(来源：水稻HJX)：

>MAMAAAPRPKSPPAPPDPCGRHRLQLAVDALHREIGFLEGEINSIEGIHAASRCCREVDEFIGRTPDPFITISSEKRSHDHSHHFLKKFRCLCRASACCLSYLSWICCCSSAAGGCSSSSSSFNLKRPSCCCNCNCNCCCSSSSSCGAALTKSPCRCRRRSCCCRRCCCGGVGVRACASCSCSPPCACCAPPCAGCSCRCTCPCPCPGGCSCACPACRCCCGVPRCCPPCL

TT2^HPS32的蛋白序列如SEQ ID NO:6(来源：水稻HPS32)：第55位氨基酸变成了终止：

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SCT1^Nipponbare基因全长序列如SEQ ID NO:7(来源：水稻日本晴(NIP))：

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SCT1^Nipponbare启动子序列如SEQ ID NO:8(来源：水稻日本晴)：

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SCT1^Nipponbare编码区序列如SEQ ID NO:9(来源：水稻日本晴)：

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SCT1^Nipponbare的蛋白序列如SEQ ID NO:10(来源：水稻日本晴)：

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SCT2^Nipponbare基因全长序列如SEQ ID NO:11(来源：水稻日本晴)：

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SCT2^Nipponbare启动子序列如SEQ ID NO:12(来源：水稻日本晴)：

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SCT2^Nipponbare编码区序列如SEQ ID NO:13(来源：水稻日本晴)：

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SCT2^Nipponbare的蛋白序列如SEQ ID NO:14(来源：水稻日本晴)：

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OsWR2^HJX基因全长序列如SEQ ID NO:15(来源：水稻HJX)：

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OsWR2^HJX启动子序列如SEQ ID NO:16(来源：水稻HJX)：

>agtcatcaacaaataataataactagcatgatggcccgcgcagattgcgcggctagcatcattatattttctctcatataatagcatatatgttttctcattatattattcaaatatattaaaatgacaacataattttaaattttgcaataactttacaaaactactaatgtgtaatattcatattgcattttatatacgtgttagttattaattatttttaagataaaattttagttatttgtaaattatatatattcatatatggactctagactcgtcttttaatatttcttttttctgtaaattgtatttctatatagactatatgttcttcttctaatattatttatttttatttctgaaattttattatttctaattgtatttctatgtggactctaaactcatctttcaatattatttaatttttaatttcgaattttagttacttctaaattgtattcctatattagcattaaactcttcttcccattttttcttaatttcgaattttaactatttgtaaattgtatttttatacggactctaaactctacttttaattttattatgtttattccaaattttagttagttttaagtttctatatggactctatactctacttctaatattccttatttttaattccgaatttcagttatttcctaattgtatttctacatggactctatactctacttctaatattccttatttttaattccgaatttcagttatttcctaattgtatttctatatggactccggtctcctcttctaatattccttattttttaattccgaatttcagctatttcctaattgtatttctatatggactccggtctcctcttctaatattccttattttttaattccgaatttaagctatttctaaattgtatttctatatggactctgctttttctttttctccgattaatgtgagaatttctaggccatgagagcgaacgtggaggctcctttttctattcctttaattatataatagataataataatttagatctccatcctattcttgaagtgtggcagtagatgatgaggttgttgattataactagtaattatcatacctgtcacataattgtgaaggtttgagctagagggacccttaagattttcttccttgaatcgctagtcctagcatttgtactgacaatgtatatatgatcagtgtggtgtactagcgtttatagtgctcacctgtcaacggtttttactggacgacaggtcctgacagtccttggcaaccaccacaaacctgcctgcacttttccatgtaaaaaaaggagtgcgtgcatgtgtacgacgagcagcagcagaagaagcttccatccctgcaggaactcactgacacacgtatctgtgtggagccgatggaactgtaaaagcacccggacggaagccccattcaattcgatcggccggacaaacaatggcaacgaactcactccgccattaactccgtttcacctttttacggagagaagagcaagttcttctgctgctgcaatgctgtgtgcgccttccttgccgatgcgccatggatggatggatgattggctgcttgattggggcagttattgcaggccaactgctctgtcgaaagagtgtccctcggaaagtggctttagaagttggagtaaaccttgcagtgcatggcatacatacagcatggagtggtattaccttggttacgaacgcccatcaagtccatttctggagtagtacacactgtccaagcttcagtgtttgtacctggaaagaaatgcacattagccatatgcgcaaggcaaggcaaggcattgagcaaagttagattcatcagttactagtttagctagttagcacatacacactactggacaatgactagcgagtgagcttagctagctgatcggcgacaagtgacaaccagctagttagcaataagagctggtgatggttagctcatctcagttcatccttaggttttcctccagtgaaggccataaatgaggtcgccaagggcgtaggtgggggagtttattaccggcgtactggcagagaaggtggttatgccgctcgccacagttcaccgacagcccaccccagcagcccatgagggccccccatcctctttccatctatctctctcttccactaatctcaccaaagagtcttcttcacttccttctctaggcttattaacagcttatttctgatctctcacatgttcagttttatctcatccctcctgctagatattactgttgctggccccaaccaccctgcatggattacaacacaagtttatcagtaccactgtggttcaaagtagtgtatgtactggactcgtggagttatgaccacaaggaaattgaccagaaagttaattacaatgactgaaggtgtgtactcacttggtcctggcagagtagaaggagagtacaccaactagatctgaaccctggtgtgctactgtaccaaaaggctaaggccactgacagaggagatacgtgacagacaagtcccagttgagttactgtccaacccccaaatctaaccctcttctaccaccacccccactcgtgcgccacagcgctctcacacgcgcgccacactcatgccatgtatgtctatatatatgtgcatctatat

OsWR2^HJX的编码区序列如SEQ ID NO:17(来7源：水稻HJX)：

>atgggacagtcgaagaagaagttccgcggagtcaggcagcgccactggggctcctgggtctccgagatcaggcaccctctccttaagaggagggtgtggctgggtacctttgagacggcggaggaggcggcgcgggcgtacgacgaggccgccatcctgatgagcggccgcaacgccaagaccaacttcccggtcgcgaggaacgccacgggggagctcacaccggcggctgcggtggcagggcgggatggccgtgtcggcggcggcagcggcagctcgtcctcaatgacggccaacggcggcgggaacagcctgtctcagatcctcagcgccaagctccgcaagtgctgcaagacgccgtcgccgtcgctcacctgcctccgcctcgacccggagaagtcccacattggcgtctggcagaagcgcgccggcgcacgcgctgactccagctgggtcatgaccgtcgagctcaacaaggacacggccgtgtcgtcggctgcgaaggtggcagcagcaacagcagcgtcgtccagcgaccagccgactccgagtgacagcacagtcacaacgacgtccacgtccaccacgggctcgccgtcgccaccacctccggcaatggacgacgaggagaggatcgcgctgcagatgatcgaggagctgctgggcaggagcggcccgggctcgccgtcacatgggctgctgcacggtggtgaaggtagcctcgtcatctga

OsWR2^HJX的蛋白序列SEQ ID NO:18(来源：水稻HJX)：

>MGQSKKKFRGVRQRHWGSWVSEIRHPLLKRRVWLGTFETAEEAARAYDEAAILMSGRNAKTNFPVARNATGELTPAAAVAGRDGRVGGGSGSSSSMTANGGGNSLSQILSAKLRKCCKTPSPSLTCLRLDPEKSHIGVWQKRAGARADSSWVMTVELNKDTAVSSAAKVAAATAASSSDQPTPSDSTVTTTSTSTTGSPSPPPPAMDDEERIALQMIEELLGRSGPGSPSHGLLHGGEGSLVI

实施例1、对高温有较高耐受能力的自然位点TT2^HPS32的获得及克隆控制其表型的基因

为了挖掘更多水稻耐热的优异种质资源，研究抗逆性状形成的分子调控机制，本发明人以耐热的栽培稻品种为供体亲本，以推广的高产品种华粳籼74(HJX)为轮回亲本，构建一套覆盖水稻全染色体片段的替换系。并从中鉴定到了一个具有稳定抗热能力的替换系HPS32(图1A)。将HPS32与轮回亲本HJX杂交，构建BC5F2定位群体，通过对7820株个体的多代定位以及对若干个局部段片段替换的重组个体的抗热表型鉴定(图1B)，本发明人将TT2(THERMOTOLERANCE 2)最终定位在25.22kb的范围内，发现其中有一个基因在HPS32和HJX中存在一个SNP，并且在HPS32中造成了蛋白的翻译提前终止(图1C)。为了明确TT2的候选基因，在HJX背景下敲除TT2(TT2^KO/HJX)，热胁迫不耐受的HJX呈现出明显的抗热能力增强的表型，并且其成活率高达90％左右(图1D，图1I)。

在NIL-TT2^HPS32背景下过表达来自HJX背景的TT2(pUbi:TT2^HJX/NIL-TT2^HPS32)，可以恢复NIL-TT2^HPS32的表型(使其由抗热表型变为感热表型)(图1E，图1I)。在NIL-TT2^HPS32背景下转入由TT2自身启动子驱动的TT2^HJX的全长基因组DNA(pTT2:TT2^HJX/NIL-TT2^HPS32)，同样可以互补NIL-TT2^HPS32的抗热表型，并且使得其成活率较对照呈现极显著的下降(图1F，图1I)。

通过序列比对分析，本发明人证实TT2^HPS32位点来源于热带粳稻品种，含有该位点的热带粳稻呈现出较强的抗热能力，在温带粳稻中该位点的存在比例较低，因此呈现出较弱的抗热能力(图2A-D)。

因此，本发明人成功定位克隆到了调控水稻热胁迫耐受能力QTL，TT2是一个水稻热胁迫耐受的负向调控子，当TT2功能缺失时，会赋予水稻较强的热胁迫耐受能力。

实施例2、TT2^HPS32位点在热胁迫下保护水稻产量

本发明人对近等基因系的成熟期植株进行抗热能力的鉴定，发现在高温处理下NIL-TT2^HPS32表现出较强的热胁迫耐受能力，并且在处理后仍然能观察到绿色的叶片组织并且保持着挺立的株型，相反NIL-TT2^HJX则表现为整个植株的枯萎，叶片卷曲失绿等一系列热敏感表型(图1G-H)。

本发明人对穗部进行观察发现，相较于NIL-TT2^HPS32，NIL-TT2^HJX中出现了明显的穗部发育异常的表型(图3A、E)，并且结实率明显降低。在未遭受热胁迫的情况下(正常条件下)，NILs之间在单株产量、结实率、每株穗数等方面均没有差异；当给予水稻横跨整个灌浆期的高温处理时，很明显地看到高温造成了NIL-TT2^HJX的严重减产，主要是结实率的显著性下降，然而在NIL-TT2^HPS32中，由于TT2的功能缺失减少了水稻产量的下降，主要是对结实率的保护，热处理后，NIL-TT2^HJX的结实率仅有40％左右，然而NIL-TT2^HPS32则维持在75％左右(图3C)。在正常条件下，NIL-TT2^HJX和NIL-TT2^HPS32在单株产量上并没有明显差异，但是在热处理后，NIL-TT2^HPS32比NIL-TT2^HJX在产量上提升55.6％左右(图3B)，减少了因热处理导致的产量损失(图3D)。在正常条件下对各株进行农艺性状考察如图3F。

上述结果证明，TT2^HPS32在热胁迫下对水稻产量起着重要的保护作用。

实施例3、TT2编码G蛋白γ亚基，通过OsWR2参与调控热胁迫下蜡质含量的变化

转录组数据证明，无论是热诱导的基因上调还是热诱导的基因下调，NIL-TT2^HPS32的变化趋势总是要弱于NIL-TT2^HJX(图4B-C)，因此本发明人发现TT2的功能缺失，使得水稻中热诱导的转录水平响应受到了一定程度的抑制。借助KEGG的富集分析，本发明人发现近等基因系在热处理后的差异基因富集于蜡质合成通路(图4A)。通过不同时间下的转录组测序，本发明人发现在NIL-TT2^HJX中大多数蜡质基因在热处理1h后就呈现出下调的趋势，并且随着热处理时间的增长，其下调趋势更为明显，但是在NIL-TT2^HPS32中，这些基因在整个处理时间内基本维持不变，或者表现为与NIL-TT2^HJX相比减弱的下调趋势(图4D-E)。这些结果显示热胁迫会诱导水稻中蜡质相关基因的下调，但是功能缺失的TT2会阻止这部分基因的下调。代谢组的数据证明，在正常条件下在NIL-TT2^HJX和NIL-TT2^HPS32之间并没有明显差异，当施加热处理后，本发明人可以观察到在NIL-TT2^HJX中蜡质组分呈现出明显的下降，但是在NIL-TT2^HPS32中蜡质组分受热诱导下降的现象被抑制了(图4F)。水稻表层蜡质晶体的电镜观察，同样支持了上述结论，TT2^HPS32在热胁迫下，减少热诱导的蜡质含量的降低，且TT2在热胁迫下水稻蜡质的调控中起着重要的作用(图4G)。本发明人在NIL之间受热改变的蜡质相关基因中找到了一个重要的正向调控蜡质合成的转录因子OsWR2(图4H)。

在NIL-TT2^HPS32的背景下构建了OsWR2-knockout的植株(wr2/NIL-TT2^HPS32)，本发明人发现OsWR2的敲除会互补NIL-TT2^HPS32的表型，并且使得其成活率显著性地下降(图5A-D)。因此，OsWR2作用于TT2抗热调控通路的下游。

实施例4、SCT1直接结合OsWR2的启动子

本发明人通过对OsWR2启动子的结合元件分析，发现了一个CG1类似的结合元件，本发明人将其命名为SCT1(Sensing Ca²⁺Transcription Factor 1)和SCT2(图6A)。SCT1作为一个转录因子，具有结合启动子并调控靶基因转录水平的功能，本发明人通过EMSA(凝胶迁移实验)和体外的Chip-qPCR实验证明了SCT1是能结合到OsWR2的启动子区域上的(图6B-D)。SCT2也能结合(EMSA实验验证，图6C)，SCT1和SCT2在功能上冗余，因此本发明人将两个基因都进行突变。

该结果提示，SCT1可以直接结合OsWR2的启动子并调控OsWR2的表达。

实施例5、SCT1在热胁迫下负向调控水稻蜡质合成及热胁迫耐受能力

在中花11背景下构建了SCT1/SCT2-knockout转基因系(sct1/sct2)，抗热鉴定显示sct1/sct2的植株呈现出相较于中花11要强的热胁迫耐受能力，并且其成活率也是显著性地高于野生型中花11，sct1/sct2的突变同样使得水稻在成熟期获得抵御高温的能力(图7A-D)。qPCR实验显示，野生型中花11中的OsWR2的表达水平受热而呈现明显的下调，但是在sct1/sct2突变体中这种受热下调的表达被抑制了，呈现出与NIL-TT2^HPS32在热胁迫下一致的表达模式(图7E)。KEGG分析以及GC-MS检测结果显示，在热处理后野生型中花11的各类蜡质代谢物的含量是显著低于sct1/sct2突变体(图7F-G)。

因此，上述实验从转录水平及代谢水平上证明了SCT1/SCT2是一个在热胁迫下负向调控蜡质含量的转录因子，并最终负向调控水稻耐热能力。

实施例6、TT2参与热胁迫下胞内钙信号的调控

G蛋白在之前的研究中被证明参与胁迫下的钙信号，本发明人通过SIET非损伤电生理技术来检测、基于FRET的NES-YC3.6钙的报告系统和基于水母荧光蛋白生物发光的钙浓度检测系统来检测热刺激下近等基因系之间钙信号的差异，本发明人分别对植物的根部不同区域、叶片不同区域或者整株幼苗做了热刺激下的钙的检测。

结果发现，NIL-TT2^HJX受热胁迫后胞内钙浓度的升高都显著高于NIL-TT2^HPS32(图8A-I)，表明功能正常的TT2^HJX对于热胁迫下胞内钙信号诱发必不可少，而功能缺失的TT2^HPS32抑制了热胁迫下胞内钙信号。

实施例7、SCT1可以感知钙信号，通过CaM以钙依赖的方式负调控热诱导的OsWR2的转录响应

蛋白互作实验证明SCT1可以与钙调素CaM发生互作，并且CaM与SCT1的互作是依赖于钙离子的(图9A-G)。双荧光转录活性实验证明SCT1是一个转录激活因子，但随着CaM的加入，SCT1从一个转录激活因子转变为转录抑制子，并且该过程是CaM浓度依赖的，当共转入无法结合钙离子的突变形式的CaM₁₂₃₄时，CaM₁₂₃₄无法发挥对SCT1转录活性的抑制作用，通过氯化处理阻滞钙离子通道可以一定程度上解除CaM对于SCT1转录活性的抑制作用(图9H)。

本发明人通过体内实验验证该过程，qPCR检测热处理和氯化镧交互处理水稻植株，在NIL-TT2^HJX中热诱导的OsWR2下调被减弱，并且该减弱过程是镧离子浓度依赖的(图9I)。

因此，SCT1/SCT2(根据分析SCT2也起作用)可以作为一个钙离子的感受器，胞内钙离子浓度的变化，会被CaM识别结合并将信号记录下来，形成Ca²⁺-CaM的形式，从而促进了CaM与SCT1的互作，并使SCT1/SCT2转录抑制的活性，进而导致下游基因如OsWR2的表达量的下降，从而调控蜡质的含量和耐热性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> TT2-SCT1/SCT2-WR2调控通路在植物热胁迫耐受中的应用

<130> 215420

<160> 70

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5609

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

gatcatctcc attatcggaa cttcggagtg acatggcaat ggcggcggcg ccccggccca 60

agtcgccgcc ggcgccgccc gacccatgcg gccgccaccg cctccagctc gccgtcgacg 120

cgctccaccg cgagatcgga ttcctcgagg tacaatctat ctctatctgt ctatatcact 180

accattcata ctccttcgat cttgcttcaa aacaaaaaaa tatatatttc ctacttcata 240

ttcatataca cacgtacggc ttgctatctg tcgaattgtt tgcttctgca tgcatgcatc 300

actctcattg taagtttttc ccagcttaaa accactcctt ttatcttcgt tcttcttcct 360

tcttgttttt ttttaaaaaa acaacaactc atttaatctt catatagtgt atcatgcatc 420

atttgcttct ttgatcagtt ccccaaaaac tgctcctctc ttcccagcca aataattaaa 480

cttaagcaaa caagcaagtt gaactgatga tccaataaaa caaaacaaaa ccgatcgaat 540

aggaagtcaa tggcatatac cagctgctat agctgaagcc acgaatgctt agcttagctc 600

tagtcgatcc ctgttgactg ttcaacacac tgcactaaca caccagttaa tgagctgatt 660

aattaaacca ttaaatgagc ttaacgggcg gctagcttct tcctctgggc ccgtgccgat 720

cgtaccatcg gtttgcgcgt ccctccacct aaactctctg ccttgttatt ccctttgcct 780

agtactacat gcatttgcat catcatccca tcaccaatag tactacgttt caactggatt 840

ttggtggtgt ccaaccatat catatttggt tttgttctct agtttactcc tacattagtc 900

tctagcggtt ttgtggagta ctaaagaaaa caactaatca gccagggttt aacgtttaat 960

cggttggtgg ttttgttaat taatttcatc tactatttta gacttcacag gtcttcgagc 1020

tataagcatc gattgccatg catcaatcga tgctggtcca cgctagtttc tgagttctga 1080

ctagctctct taattgtgct ttgacctact ttaattaatt aaccagtggc tgcgtcactc 1140

attgaccaac attgtcatgt tacccggact gatttttttt ttctttaaaa aaacaccgga 1200

tatattatta gttagtgtat atatatgtct gctcaagaag cgcatgcata tagtttctcg 1260

tcaaacaaaa aatgtactgt atgctcaaag catctgtttt ggaattgtca tattcgcctt 1320

tataattaaa ataattaaaa tggtgatgcc cagctttttt tttcctccaa taatttattt 1380

attggcttga tttcctgtgc tattaggagt aaaactactc cgttttaatt agcaccattt 1440

ttaaagcttc taaaattaac ctaagtaaag tacgacagta cttgctgtct agctttaaat 1500

gttttgggtg ttaaaatatc cctcagacat cacctgaaaa gttgacaggc taaacacatg 1560

cccatctccc tcgtttactt aaattaattc gaacaaacaa ctgtatatat atttcttgca 1620

gggtgaaata aattcaatcg aagggatcca cgctgcctcc agatgctgca gagagtaagc 1680

cagcctgctg tttctttttg tactacttcc atttcttctc gtctttactc ttaccatgca 1740

ttcacaaaat atacttactt accccagttt ttgatcatga actttgaccg ttatcttttt 1800

aagcaacttc aataaaatag gtttaaatgc aaatgttatg tacaccattg attataaaac 1860

cttggcaaat gaaagtaaaa aaccagcaca tttaatttct gaacgttggg agtattatta 1920

tttttatatc ttttactatc atttaatcat agtatcgtgc aagctttttg agtgtaatta 1980

ggttgcttaa ggtaaaaaaa tgtaactagg ttacatttag tactaaactg aacatttaat 2040

tagtaatgtt tcgttaagta actgtaattt caatgcatgc atgtcctccc gtaagagcaa 2100

gtttaatagt atagccaact actagctcca atttatttat agacaatcta atagctcatt 2160

catacaataa ttacatacta cactattaat atctgatccc acctgtcata cacatactgc 2220

attttggagt ccgtgctata gctgactaca aatctatagt ccgctgctct tctctctctt 2280

tatttatctc cttaaaatat gtttgcagct ggcttatagc ctgctattgt acctgctctg 2340

aaaatagtgc agagactgtt caaaaagtca ttgcacaata actattcaca tggaactgtg 2400

aaaagtatat attggaactt actagctaga tccttttggg aacatgggaa aagccaagtc 2460

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actatacgga gatgaaatta cagcaggagc agaaagcggg aaaaaaactt taaatcaatt 2580

aaacaaacct ctctctgcaa aattcaacac cagcaacgaa caactcatca agttcttgtg 2640

ttatgtaccg gccggtaact aattgttgtt tgcataagcg aaacggtata tttgcaaaca 2700

aaaaataatt tatgaataaa acttttatat acatgttctt aattatctca aaacaaaggt 2760

tgaaaaataa acttcgatga aaaaatctca aaatcaattc caaatttatg gtgaaaattt 2820

taaattttgt ctgataaaca taagtataag caaaaaaaaa agtaaagcaa tgtcactatg 2880

ttaatggtat tggtatatat acctttgagt ttctgtctgt actttaggag tacatgctac 2940

gaacatgttt tcttggcttc tatttcgttg gaattacttg cgtattgtgg gccagacgcc 3000

tggtgaactt cgtcgattgt gtggactaat taagctcacc tgaaataagt ggttgaaaac 3060

aaggctaaag atgattttaa tcatggattt tggcttggaa atttttttgt agggttgacg 3120

aattcatcgg aagaactcct gatccattca taacgatgta tggattttca ggtcgagaat 3180

ttgtctttaa cttcgcacga ctgttatttt ttttcttatt aattctctgt ttacaagcag 3240

ttcatcggag aagcgaagtc atgatcattc tcaccacttc ttgaagaagt ttcggtactc 3300

acttcattcc cggatcttaa tgtatatatg catatctgca ctgtgctaat tggtgtacac 3360

attatgtgat catcagtcca agttaattat tacttacaaa actgaactaa taaacactag 3420

aaaatatgta acttgcaaag tacatattga atcagggatt catatataga actccacctg 3480

cagatttctt ccaatatata tatgctgtca ccatgttttc acttgtcacc tagtacacct 3540

ttgactggga gactttcctt gatgatcgac gtggtcatat tcttcagatt gatttaattt 3600

cagatagaaa aaaatattgt ttacttagtt tctctccttc agtaagagag atgtgcaaga 3660

ccagcgatca aactatatga actgttcgtt tcatgataaa aaaaacatga tatggaataa 3720

ctaggtgatt caacatataa tggctgataa tccctcgttt caggagatac catcagtttt 3780

ctacttttct acttttctcc atgttctctt tttcatgttt gaggtggatc ggagcttgta 3840

ttagatgttt gctcagctca attattgctg cagatttccc tatatagcct ccactgtata 3900

tatactccct ccgattccat aatttaatga tattttgaac aatgacgctg tctccaaaat 3960

atatctttca ctttgttttc ctattataat atatacaata aaaaaaatac atatttactt 4020

ttcttataaa tagtttcaaa gacaaatcta tatatgttgt tatataactc ttttaaacta 4080

aatattttta aagttatagt caaagttaca aaagttggac ctcaaacatg tataaaacgt 4140

cgagaattgt atatctgatc aaccaataat ttgtagtgca ttgtcttaaa aaaattgcat 4200

ttctagctat gtatctagat aattacaaga accaggtgaa atcacatttt atttttactg 4260

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ggcatcacct gcacaattaa tttggacaca aagtaaacat gaatgcaaca tacttcgttt 4380

catattgttt gttggtgtag gatttaaatt ttgtgtcaaa atacttgccg ttcttactac 4440

attcttaagc actttgagaa ctaaccttct cttcctaccc ttcatcaata cagtcatact 4500

aactaattgg ctcttatgcc ttgaaaaact aattaggatg tatttaatga gggtaaccat 4560

gtaatctgcc accagtgaat gcaattttgg ttcaaaattt cgggcccccg ccctaaaaag 4620

tcattatctc gatagaattt ttttgaattt agtcaaaatt tattcaaatt tagccaaatt 4680

gtgttaaatt tcaaataatt tcagtctaaa aagtgctgaa aatcccgaaa tttaggttct 4740

accgaaatgg ccggaaattt tcagcgaaaa tcaaacatga aaaccttgtc tgccacattt 4800

gttagtttgt gtaaagattt gctagaacga taagtaattt gaagcggatg tatattatat 4860

atcccacaaa accatcaact tgttaattac atgtatattt gtgcatgatg ctttcaccac 4920

tttgtggttg ttaacgatta aatcacacgt tttattttct cacagctgtt tgtgcagagc 4980

aagtgcgtgc tgcctcagct acctctcctg gatctgctgc tgcagcagcg ccgccggcgg 5040

ctgctcatcc tcctcctcct cctccttcaa cctcaagagg ccgagctgct gctgcaactg 5100

caactgcaac tgctgctcct cctcctcctc ctcatgtggg gcggcgttaa cgaagagtcc 5160

gtgtcgctgc cgccgccgca gctgctgctg ccgtcgctgc tgctgcggcg gcgtcggcgt 5220

ccgcgcgtgc gcgagctgca gctgctcccc gccgtgcgcg tgctgcgcgc cgccgtgcgc 5280

gggatgctcg tgccgctgca cctgcccgtg cccgtgcccc ggcggctgct cctgcgcgtg 5340

cccggcgtgc aggtgctgct gcggcgtccc tcgttgctgc cccccctgct tgtgatcgat 5400

cgatcgattg agcgaagctg cactgattgg ttaattaatt agttctcgat gatgatcgat 5460

cgagctgcgc gcgtacttaa ttagctagct aggttctggt gttaattagt tcctcatcga 5520

tgcatatgtt gattgccttg ctctgcttgc ggttatctgt aatttggctt tgctgccatg 5580

atgagtacgt gattgctgat ttattttac 5609

<210> 2

<211> 2643

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

actttttaac caacgtttga ccactcgtat tattcaaaaa ttttatgtaa atataaaaat 60

acttatgtca tgcttaaaga acatttgatg ataaatcaag tcacaataaa ataaattata 120

attacaaatt ttttttgaat aagacgaaag gtcaaacgtt tgtaaaaaag tcaacggcgt 180

catacattaa aatacggagg gagtacataa tactccatcc atttttttag tacgacatta 240

tttagttaaa atgtggaaaa aacttagaga aagtagacta taaaaaggtt gaatggtgca 300

aagtaagcat agctaaactg gttttttatg ttacttgttg tggaccctat ctacttggat 360

tcaaggttta aacttggtat gggtgcacgt atttacggct aattattttt aaatggtagg 420

tgatgtactg ttgacagcga gacgctctca tgatgacttt atcaatctaa acatatatat 480

gttggtgcaa ctttttcaaa ggtacttaat tcaaaggata ggatatttat gtatgagttt 540

gttcataaga acgaatatgc cttgataggt tgtgcatggg tatctataag agtgagtgtg 600

tgtataatat gatagggtgt gtgtgtgttt ttataagaac gactacgcgc atctctatat 660

ttcggtacat cccgggtatg ccttctctaa aaatgtcttg tgctaaagtt gaagacaact 720

tctaaggaag gtatctctca tcttccttgt gtgtccctac tagaaaatat ttttacaggc 780

ggccaaaata tttttttttg caggcgtcca taacctccgc ctacacccaa agtcatgcaa 840

aaatcaataa tttttgtagg tggctaaatc cacccgtttg cgaaaatatt ttcagcgtaa 900

agaaaattcg ccgccctcag ccctacccac cgccgccctc cccttcggcc ggatctaggg 960

ttatggtttt gggaggaaga gggaggggag gggagctgcg tcaccatcac tgaatctggt 1020

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atgccgtcgg ccggatttgg gaggtggagc gtcgccgccc tccgccccgc gccatgtctg 1320

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gatctgggag gaagggaggg agggagggga gccatcacgt cgttgggagt agatgccgcc 1440

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cctctggctg gatccacgcc gaggagagga aggagaggga gagggagagg gaggggaggg 1560

gagatgtgga agttgactta gaaaattttg acgcccggtg gtttttaaga tactttacct 1620

ttttgcaggc ggatttatta aagaggtccg tctgcaaaaa taatgatatt ttcacggtcg 1680

gacctcttaa gatatctaca tgtagaaatc tatatttttt tacttaaatt actgccaggg 1740

ctttgcctcg tagtataatt ttcataaaaa ctcaaaatat ttacaaatta caaaagagga 1800

aggaaggaga aaaacttata aagattacaa tgtttgtaac caatcaaaaa ctatctgctt 1860

taaaggatct ttcattctac acatatgaag aagaacttct tttctaaacg atattcttca 1920

tgaaccaaag gagggaagct cattccgaaa atttttccca tttctctgct cgtaggcgga 1980

taactatctc atctcacggt tgttattttt gtaggtggct atttggcttc cagagaccta 2040

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ttc 2643

<210> 3

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<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

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agctgctgct gccgtcgctg ctgctgcggc ggcgtcggcg tccgcgcgtg cgcgagctgc 540

agctgctccc cgccgtgcgc gtgctgcgcg ccgccgtgcg cgggatgctc gtgccgctgc 600

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tgcggcgtcc ctcgttgctg ccccccctgc ttgtga 696

<210> 4

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<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

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cgccaccgcc tccagctcgc cgtcgacgcg ctccaccgcg agatcggatt cctcgagggt 120

gaaataaatt caatcgaagg gatccacgct gcctccagat gctgaagaga ggttgacgaa 180

ttcatcggaa gaactcctga tccattcata acgatttcat cggagaagcg aagtcatgat 240

cattctcacc acttcttgaa gaagtttcgc tgtttgtgca gagcaagtgc gtgctgcctc 300

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<210> 5

<211> 231

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

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Met Ala Met Ala Ala Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Ala Pro Pro

1 5 10 15

Asp Pro Cys Gly Arg His Arg Leu Gln Leu Ala Val Asp Ala Leu His

20 25 30

Arg Glu Ile Gly Phe Leu Glu Gly Glu Ile Asn Ser Ile Glu Gly Ile

35 40 45

His Ala Ala Ser Arg Cys Cys Arg Glu Val Asp Glu Phe Ile Gly Arg

50 55 60

Thr Pro Asp Pro Phe Ile Thr Ile Ser Ser Glu Lys Arg Ser His Asp

65 70 75 80

His Ser His His Phe Leu Lys Lys Phe Arg Cys Leu Cys Arg Ala Ser

85 90 95

Ala Cys Cys Leu Ser Tyr Leu Ser Trp Ile Cys Cys Cys Ser Ser Ala

100 105 110

Ala Gly Gly Cys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Asn Leu Lys Arg Pro

115 120 125

Ser Cys Cys Cys Asn Cys Asn Cys Asn Cys Cys Cys Ser Ser Ser Ser

130 135 140

Ser Cys Gly Ala Ala Leu Thr Lys Ser Pro Cys Arg Cys Arg Arg Arg

145 150 155 160

Ser Cys Cys Cys Arg Arg Cys Cys Cys Gly Gly Val Gly Val Arg Ala

165 170 175

Cys Ala Ser Cys Ser Cys Ser Pro Pro Cys Ala Cys Cys Ala Pro Pro

180 185 190

Cys Ala Gly Cys Ser Cys Arg Cys Thr Cys Pro Cys Pro Cys Pro Gly

195 200 205

Gly Cys Ser Cys Ala Cys Pro Ala Cys Arg Cys Cys Cys Gly Val Pro

210 215 220

Arg Cys Cys Pro Pro Cys Leu

225 230

<210> 6

<211> 54

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 6

Met Ala Met Ala Ala Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Ala Pro Pro

1 5 10 15

Asp Pro Cys Gly Arg His Arg Leu Gln Leu Ala Val Asp Ala Leu His

20 25 30

Arg Glu Ile Gly Phe Leu Glu Gly Glu Ile Asn Ser Ile Glu Gly Ile

35 40 45

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50

<210> 7

<211> 7873

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

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ctgttcgttc ggcgcgggat ttggaatttg ggtttggagt ctactgattg cgtgggtggt 540

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atatataatc attttttttg tttttcaggg attacatgca cattgtactt gtacattatc 2040

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cttatatttg aatttaaatc ttatatacat ctcttatagg agtggaaagc ttcatataaa 2160

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ctttagcacc atgatatgtt aagttagtcc tagatgttcc cttctgatat tattaatagt 2400

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taactaaaat gcaggaatcc caggtactat catgctttca gttttggaat attagagtga 7380

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taggctatgc aagaaaagat gctcgaggag tcgacagaga tggatgaagg ccttttgatg 7500

agcgaattca aagaactgtg ggatgacgac atgccaacgc ctggatattt ctaggatcta 7560

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gataacctgt agttgcattg ctaaattttt gtatgttttg aagtttggtt ggtacaataa 7680

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<210> 8

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<212> DNA

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gtgacttgtt tttttaattt tttttcataa tttttcaaat aagacggacg gtcaaacgtt 120

agacacggaa acctgggttt gtcttttttt ttaaacggaa atagtacgtg agattgtgag 180

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aagctggact gctggatgct gcttaattag tggttgcaaa ttgcaatctg ccgaaccacg 420

aactcaaaac gacatgtaga ttactactag tccccggatg agatgatcac atcccccatc 480

ttaactactc catccgcaag caactgcttt ctcctctcca actttcacgg actgaaagat 540

cctttagaaa ggcgaaaata ataggcaaaa caaagcacat attattatat aattaattaa 600

gtatttgcta atttttttat aaaatagatt aatatgtttt taagcaactt tctaatatat 660

ttttttaaca aacgtattgt ttaacaattt aaaaaacgtg cacgcgaaaa atatgagagg 720

aaggttggga aagggaggaa acgaaaggag cctaagcgat aaggagctgg tggtggtgag 780

aatagaatat tagcctccct aacatgatgg atcgatggtt ggtggggact aatcacaggt 840

gtggccacga aagttaaagg tgtgtctggt cttttttttt taagttttta agtatacaaa 900

cacacatttg aagtattaaa tagagactaa tgataaaaaa aattacagat tctgcctgta 960

aactgcaaga cgaatttatt aaacataatt aatccatcac tagtaaatgt ttactgtata 1020

tcacattgtc aaatcatgac gtaattagat tcaacagatt cgtctcgtaa tttacatgta 1080

aactgtgtaa ttggtttttt tttctatatt taatgtttca tatatatgta caaatatttg 1140

atgtaatgtt tttggccaaa atattctgga tctaagaaag gcctaaagtt ggcagcaggg 1200

gtggtcaggt ggtcaggtgg tcagatattc atattagcga tgtgccgatg aggccattgg 1260

gggcggagca agcgtaaagt gagacggtga ggccggcgtg cggcaggcgc ccaccgggtg 1320

aggcgaggcg tgggcgagac cgcgaccgga cggcgacagc ggcgaaggac cgaggaatag 1380

catggatatg tactatgtgc gcccgcacga agcgctatcg ttgtgggatc tggaccatct 1440

gaagattctg gggaattatg ccttcttggg ccatgctaat ctttcttttt aacgaattga 1500

tagtctattt tgcattgaat aagcaaatag tctcaatcca agggcttgtt taattggcaa 1560

aaaattttgc ccatacatat cacatcagat atatggacac acatttgaat tattaaatgt 1620

agtctaataa caaaacaaat tacagattct gccagaaaac cgcgagacga atttattaag 1680

ctaattaatc tgtcattagc aaatatttaa tgtagcacca cattatcaaa tcctgacata 1740

attaggctta aaagattcgt ctcgcaattt tctggcgaac tatgtgattg ttttttttct 1800

acatttaata tctcatatat gtgttcaaac attcggtgcg acagcgtgga aaattttgtt 1860

tgggaactaa acatgtccta aatttgaaca agtccggttt tctcccccag cgctttagat 1920

aattactgat tgtgtgtttg gccaggaact agggctgatg cgccgtcaaa ataagggttt 1980

ctaaatttga aagcagaaaa gatctaggat actatccaaa tgcagaaaat gcaaaactag 2040

gcattgtgtg gaacgcataa atttcataag atttactgtg cctttttgta agaaagtttc 2100

ataagatcca accggaatat tatttttcca taataatgga agtggtttac gtcgcttctg 2160

tcaataaaca cactttgtga tggttgattt ggtgttagac ttttcctcat tagcttgtgt 2220

ttgtgtagtt agcacaaaca catgagaaag tatatcatgt gaaagcaatt atctggcacg 2280

gtttcggaat agacaggaga gcttaactgg cagagctcgc cgttgaaacc cttttggcgc 2340

ctccatcaac cgtccacgtc gtcttcggcc tcactcacca accgaaacgg acggcccaga 2400

tcgtcccatt tctcgcgggg ggcgaaaccg ccatttcgcc caaactctcc ctcttccttc 2460

cttctagtag ccgctttgcc cgccgatgat gcgtgcg 2497

<210> 9

<211> 3090

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 9

atggcggagg ggcggcgcta cgcgatcgcg ccgcagctag atattgagca gatactgaag 60

gaggctcaac gccgatggtt acgtccgact gaaatttgtg aaatacttaa gaattacagg 120

agtttccgta ttgctcctga acctccaaat aggcctccaa gtggttcact tttcttgttt 180

gatcggaagg tcctgagata tttcaggaag gacggtcata attggaggaa gaaaagagat 240

ggaaagacag tcaaagaagc ccatgaaagg ttaaagtctg gaagcattga tgtgcttcat 300

tgctactatg ctcatgggga ggagaatata aatttccaaa ggaggagtta ttggatgttg 360

gaggaggatt acatgcacat tgtacttgta cattatctgg aagtcaaggc tggaaaatta 420

agctctcgta gtacgggaca tgatgatgta ctgcaagcat ctcatgcgga tagcccttta 480

agtcaattgc cttcacaaac taccgaagga gaaagctcag ttagcggaca ggcctctgaa 540

tatgatgaaa cagaatcaga tatttattcg ggaggagcca gatacaactc tttctctcgg 600

atgcggcagc atgaaaatgg aggtggatct gtgattgatg attctatatt cagctcttat 660

gttcctgcgt catctgtagg cagttatcaa ggattacagg ctacagcacc taatacaggc 720

ttctattctc atggtcaaga taacttaccc gtggttctta acgagtcaga ccttgggact 780

gcatttaatg gccctaatag tcagtttgat ctatcattat ggattgaagc aatgaaacct 840

gacaaaggga cccatcaaat tcctctttac caagctcctg ttccctccga acagtctcct 900

tttacaggag gcccaggaat tgaatctttc acatttgatg aagtatacaa caatggactg 960

agtatcaagg atgtagatgg tgatgataca gatggagaaa ctccatggca gattccaaat 1020

gcaagtggta catttgctac agcggacagc tttcaacaaa atgataaaac tttggaggaa 1080

gccattaatt accctctctt gaaaactcaa tcatctagtc tttctgatat cataaaggac 1140

agttttaaga aaaatgacag tttcactaga tggatgagca aagagcttgc tgaagtagat 1200

gattctcaaa tcacatctag ttctggagtg tactggaaca gtgaagaagc tgacaatatc 1260

attgaagcat caagcagtga tcagtatact ctgggaccag tgcttgcaca agatcagctg 1320

tttactatag ttgatttttc tccaacctgg acatatgcag gttcaaagac tagggtattt 1380

attaaaggta atttcttaag ttctgatgaa gttaagagat taaaatggtc atgcatgttt 1440

ggagaatttg aagtcccagc tgagattata gcagatgata ctcttgtatg tcattctccc 1500

tcacacaagc ctggcagggt ccctttctat gtgacttgct ccaatagatt ggcctgcagt 1560

gaagtacggg agtttgattt ccgacctcag tacatggatg ctccaagtcc acttggttct 1620

acaaacaaaa tatatctcca gaagcgtctt gataaactat tgtctgtgga gcaggatgag 1680

atccagacaa ctctgtctaa ccccacgaag gagattattg atttgagcaa gaagataagt 1740

tcattgatga tgaacaatga tgattggtct gagttgctaa agttggctga tgataatgag 1800

cctgccacag atgataagca agatcagttc cttcaaaacc gcattaagga aaaattgcat 1860

atctggcttc tccataaagt aggggatgga ggcaaaggtc ccagtatgtt agatgaggag 1920

gggcagggtg tgcttcattt ggcagctgcc ctagggtacg attgggcaat aagaccaaca 1980

atagctgctg gtgtgaatat aaacttcaga gatgctcatg gatggactgc actccactgg 2040

gctgcatttt gtggaagaga gcggacagtc gttgcactta tagcactagg tgcagctcct 2100

ggagctgtaa cagacccaac accaagtttc ccttcaggaa gcacaccagc tgatcttgca 2160

tcagccaacg gacacaaggg aatctctggt ttcctagcag agtcttcttt aacaagtcat 2220

ctgcagactc tcaatctaaa ggaagccatg cgtagcagtg caggagaaat atctggtcta 2280

cctggcattg taaatgttgc tgatagaagc gcctcgcctt tggcagttga aggccatcag 2340

actggatcta tgggagattc actaggtgct gttcgtaatg ccgcccaagc tgctgcccgg 2400

atataccaag tttttaggat gcaatccttc cagagaaaac aagcagttca gtatgaggat 2460

gaaaatggtg cgatatcaga tgagcgtgcc atgtcactct tgtctgctaa accatccaaa 2520

cctgcacagc ttgatcctct gcatgctgct gcgactcgaa tacaaaacaa gttccgtgga 2580

tggaagggaa gaaaagaatt tctgcttatt agacagcgaa tcgtcaagat ccaggcgcat 2640

gtgcgaggtc accaagtgag aaagcattat cgcaaaataa tttggtctgt tgggatagtg 2700

gagaaggtta tattgcgctg gaggcgacga ggtgctgggt tgcgtgggtt tcgacccaca 2760

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gccgagaatg actatgattt cttacaagaa ggacggaagc agactgaaga aaggctacag 2880

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aggattttga cggtggtaac taaaatgcag gaatcccagg ctatgcaaga aaagatgctc 3000

gaggagtcga cagagatgga tgaaggcctt ttgatgagcg aattcaaaga actgtgggat 3060

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<210> 10

<211> 1029

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 10

Met Ala Glu Gly Arg Arg Tyr Ala Ile Ala Pro Gln Leu Asp Ile Glu

1 5 10 15

Gln Ile Leu Lys Glu Ala Gln Arg Arg Trp Leu Arg Pro Thr Glu Ile

20 25 30

Cys Glu Ile Leu Lys Asn Tyr Arg Ser Phe Arg Ile Ala Pro Glu Pro

35 40 45

Pro Asn Arg Pro Pro Ser Gly Ser Leu Phe Leu Phe Asp Arg Lys Val

50 55 60

Leu Arg Tyr Phe Arg Lys Asp Gly His Asn Trp Arg Lys Lys Arg Asp

65 70 75 80

Gly Lys Thr Val Lys Glu Ala His Glu Arg Leu Lys Ser Gly Ser Ile

85 90 95

Asp Val Leu His Cys Tyr Tyr Ala His Gly Glu Glu Asn Ile Asn Phe

100 105 110

Gln Arg Arg Ser Tyr Trp Met Leu Glu Glu Asp Tyr Met His Ile Val

115 120 125

Leu Val His Tyr Leu Glu Val Lys Ala Gly Lys Leu Ser Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Gly His Asp Asp Val Leu Gln Ala Ser His Ala Asp Ser Pro Leu

145 150 155 160

Ser Gln Leu Pro Ser Gln Thr Thr Glu Gly Glu Ser Ser Val Ser Gly

165 170 175

Gln Ala Ser Glu Tyr Asp Glu Thr Glu Ser Asp Ile Tyr Ser Gly Gly

180 185 190

Ala Arg Tyr Asn Ser Phe Ser Arg Met Arg Gln His Glu Asn Gly Gly

195 200 205

Gly Ser Val Ile Asp Asp Ser Ile Phe Ser Ser Tyr Val Pro Ala Ser

210 215 220

Ser Val Gly Ser Tyr Gln Gly Leu Gln Ala Thr Ala Pro Asn Thr Gly

225 230 235 240

Phe Tyr Ser His Gly Gln Asp Asn Leu Pro Val Val Leu Asn Glu Ser

245 250 255

Asp Leu Gly Thr Ala Phe Asn Gly Pro Asn Ser Gln Phe Asp Leu Ser

260 265 270

Leu Trp Ile Glu Ala Met Lys Pro Asp Lys Gly Thr His Gln Ile Pro

275 280 285

Leu Tyr Gln Ala Pro Val Pro Ser Glu Gln Ser Pro Phe Thr Gly Gly

290 295 300

Pro Gly Ile Glu Ser Phe Thr Phe Asp Glu Val Tyr Asn Asn Gly Leu

305 310 315 320

Ser Ile Lys Asp Val Asp Gly Asp Asp Thr Asp Gly Glu Thr Pro Trp

325 330 335

Gln Ile Pro Asn Ala Ser Gly Thr Phe Ala Thr Ala Asp Ser Phe Gln

340 345 350

Gln Asn Asp Lys Thr Leu Glu Glu Ala Ile Asn Tyr Pro Leu Leu Lys

355 360 365

Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Asp Ile Ile Lys Asp Ser Phe Lys Lys

370 375 380

Asn Asp Ser Phe Thr Arg Trp Met Ser Lys Glu Leu Ala Glu Val Asp

385 390 395 400

Asp Ser Gln Ile Thr Ser Ser Ser Gly Val Tyr Trp Asn Ser Glu Glu

405 410 415

Ala Asp Asn Ile Ile Glu Ala Ser Ser Ser Asp Gln Tyr Thr Leu Gly

420 425 430

Pro Val Leu Ala Gln Asp Gln Leu Phe Thr Ile Val Asp Phe Ser Pro

435 440 445

Thr Trp Thr Tyr Ala Gly Ser Lys Thr Arg Val Phe Ile Lys Gly Asn

450 455 460

Phe Leu Ser Ser Asp Glu Val Lys Arg Leu Lys Trp Ser Cys Met Phe

465 470 475 480

Gly Glu Phe Glu Val Pro Ala Glu Ile Ile Ala Asp Asp Thr Leu Val

485 490 495

Cys His Ser Pro Ser His Lys Pro Gly Arg Val Pro Phe Tyr Val Thr

500 505 510

Cys Ser Asn Arg Leu Ala Cys Ser Glu Val Arg Glu Phe Asp Phe Arg

515 520 525

Pro Gln Tyr Met Asp Ala Pro Ser Pro Leu Gly Ser Thr Asn Lys Ile

530 535 540

Tyr Leu Gln Lys Arg Leu Asp Lys Leu Leu Ser Val Glu Gln Asp Glu

545 550 555 560

Ile Gln Thr Thr Leu Ser Asn Pro Thr Lys Glu Ile Ile Asp Leu Ser

565 570 575

Lys Lys Ile Ser Ser Leu Met Met Asn Asn Asp Asp Trp Ser Glu Leu

580 585 590

Leu Lys Leu Ala Asp Asp Asn Glu Pro Ala Thr Asp Asp Lys Gln Asp

595 600 605

Gln Phe Leu Gln Asn Arg Ile Lys Glu Lys Leu His Ile Trp Leu Leu

610 615 620

His Lys Val Gly Asp Gly Gly Lys Gly Pro Ser Met Leu Asp Glu Glu

625 630 635 640

Gly Gln Gly Val Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Asp Trp Ala

645 650 655

Ile Arg Pro Thr Ile Ala Ala Gly Val Asn Ile Asn Phe Arg Asp Ala

660 665 670

His Gly Trp Thr Ala Leu His Trp Ala Ala Phe Cys Gly Arg Glu Arg

675 680 685

Thr Val Val Ala Leu Ile Ala Leu Gly Ala Ala Pro Gly Ala Val Thr

690 695 700

Asp Pro Thr Pro Ser Phe Pro Ser Gly Ser Thr Pro Ala Asp Leu Ala

705 710 715 720

Ser Ala Asn Gly His Lys Gly Ile Ser Gly Phe Leu Ala Glu Ser Ser

725 730 735

Leu Thr Ser His Leu Gln Thr Leu Asn Leu Lys Glu Ala Met Arg Ser

740 745 750

Ser Ala Gly Glu Ile Ser Gly Leu Pro Gly Ile Val Asn Val Ala Asp

755 760 765

Arg Ser Ala Ser Pro Leu Ala Val Glu Gly His Gln Thr Gly Ser Met

770 775 780

Gly Asp Ser Leu Gly Ala Val Arg Asn Ala Ala Gln Ala Ala Ala Arg

785 790 795 800

Ile Tyr Gln Val Phe Arg Met Gln Ser Phe Gln Arg Lys Gln Ala Val

805 810 815

Gln Tyr Glu Asp Glu Asn Gly Ala Ile Ser Asp Glu Arg Ala Met Ser

820 825 830

Leu Leu Ser Ala Lys Pro Ser Lys Pro Ala Gln Leu Asp Pro Leu His

835 840 845

Ala Ala Ala Thr Arg Ile Gln Asn Lys Phe Arg Gly Trp Lys Gly Arg

850 855 860

Lys Glu Phe Leu Leu Ile Arg Gln Arg Ile Val Lys Ile Gln Ala His

865 870 875 880

Val Arg Gly His Gln Val Arg Lys His Tyr Arg Lys Ile Ile Trp Ser

885 890 895

Val Gly Ile Val Glu Lys Val Ile Leu Arg Trp Arg Arg Arg Gly Ala

900 905 910

Gly Leu Arg Gly Phe Arg Pro Thr Glu Asn Ala Val Thr Glu Ser Thr

915 920 925

Ser Ser Ser Ser Gly Asn Val Thr Gln Asn Arg Pro Ala Glu Asn Asp

930 935 940

Tyr Asp Phe Leu Gln Glu Gly Arg Lys Gln Thr Glu Glu Arg Leu Gln

945 950 955 960

Lys Ala Leu Ala Arg Val Lys Ser Met Val Gln Tyr Pro Asp Ala Arg

965 970 975

Asp Gln Tyr Gln Arg Ile Leu Thr Val Val Thr Lys Met Gln Glu Ser

980 985 990

Gln Ala Met Gln Glu Lys Met Leu Glu Glu Ser Thr Glu Met Asp Glu

995 1000 1005

Gly Leu Leu Met Ser Glu Phe Lys Glu Leu Trp Asp Asp Asp Met Pro

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Thr Pro Gly Tyr Phe

1025

<210> 11

<211> 7283

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 11

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atgggggcac gccgcgcgtg tcgcgcgggg gtgctttgtc ggctcgttcc gatctggtgt 360

ggtggatgga tcatggatgg acaggggagg gggggtcgtc gttggtcgcg gtcaacgcgc 420

cggtcgtggt tacctcgcgg ctattgcttg gggggggggg ggggtggggg tagcggaggg 480

attggtagag ctgtagtgga tttttttttt gttttgtttg gcgttgtgga agatttttcg 540

ttcgattctg ctgcttcgag tgttggtgta gatcgggctc ctacggattg gtttcatttc 600

tcggtgatag tctctctgtt tttttagtcc attgctccag tgattattac tgttctagta 660

aatgaaatgc ggtgtcgttg catttagcgt tgaatggagt aagtattggg ctggattttg 720

gagcttggac tgcagcgcgc acaatttagt ttcgtgcgta gagcagttgg ttgtactact 780

ttttttggtt cagtcatgct tttgttcccc tttcgaaacg aggggatcat gttggccggc 840

ctgcagttct ccacttgtgt ggacaagagt gttagtagta tcggttggtt ctgaaagaga 900

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ttaactgtcg ctgactctgt gatctataaa cagatattgc gcagatactg aaggaggctc 1020

aacaacgatg gttgcgtcct gctgaaattt gcgaaatact taaaaactac aaaagtttcc 1080

gtattgcacc agaaccacca aacaggcctc aaagtaggat acttgtctcc ttaattaaat 1140

gttgctctaa tttgttgtgc ttttgtattg aggttatttt tatcggtgaa tcatcataat 1200

taaaaataat catttgaaaa aaatactagg agaaacatga aatttgattg catgctaatt 1260

tgtgaaaata tctttaacct taataatatg aagttctgaa cttctatctt atagctgcct 1320

gcatgtatta tggtagtttt agcttgttat ttaccttttg tgccacgttg tattcctgtt 1380

taatttctgt gtgcatcata agtaaataaa acatactacc tccgtttttt ttatgtatga 1440

cgccgttgac ttttcacata atgtttgacc attcatcatt ttcaaaaatt tagtataaat 1500

atgtagaagt ataagttaag attatagttt ctttgatggt aaaacaagtc acaacaaaat 1560

aaatgacatt tatatatata tatttttgaa taagacaaag gatcaaacgt cacgtcaaaa 1620

gccaacaaca tcatagatca aacattaaaa aacggaggta gtaatattta ttactgggct 1680

ccttatgact gttacaatgg aacacttgtc aggctgcatt agtgaggtat caatatgcat 1740

ttcttttacc atcaaagagt tattctattc tcttgacttt gatgcctttc cttcatgaaa 1800

aaaaatactg tattgcacat aaaacaagat gtactggtat gtgaatttaa aaatctactt 1860

tttattgacc tgatcgttta gttgcaacac tagtaaacag ttcacttttc ttacattacc 1920

aattaccatt gcatgcatgt aattgaagtt gataaagtgc ctataccatc ctcaagttca 1980

atatttctga tcattcttgc cctgcctagg tggctcgctt ttcctatttg atcggaaagt 2040

attgagatac tttaggaagg acggccataa ttggaggaag aaaaaggatg gaaagactgt 2100

caaagaagca catgaaaggc tgaaagtaag tcactttgcg ttatgtagtg attatttatc 2160

aatgtgaata agactcactg ttgtttgcca atccagtctg gaagtattga tgtgcttcac 2220

tgctactatg cacatggaga agagaatgag aacttccaaa ggaggactta ctggatgttg 2280

gaagagtaag ccgaattctt ccaaaaatat tacatgttcg tttatgttat tagcaatgct 2340

ataattgttc tgagcctatg aggctatgaa cacaaattct ttatcagagg cgcataaatg 2400

aacacacttg catgtagagt ttgcatacag aattttagtt atttgcattt ggataacctt 2460

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gaccaaggta ttactgaact ctcctatctt tcacttaatg attagcttat atctacctta 2580

atctacattc catctttcgg tatccaaaag ttacatgcat tgtttagcgc cataatgttt 2640

gattcctttt tctggcgctt tcattttttt tattgtggac tttatttatt ttaatttttt 2700

attgaccaaa tactagtact atattgcacc actgtgctac gaaattgtag tactatgatt 2760

atttagtttt gatgattgat attcacataa tttgggatat cacttatgta tgctttcgtg 2820

cttgctagca atctttacat gcatttttca gaaatacaca tttttccttt gtatttgtac 2880

ttaaggtggt gcttgttacg tgtaatgatt tttgaattaa ttatatgtca gctaccaatt 2940

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ttgtagtatc attatataat gataatgaat atgtcttaaa aattagacgg aacagtgtgt 3120

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ttcttatttc acattgtgaa tagaattcct cattgcctgt tgaagagagc tttttcctct 3300

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atctataatg ataatgaaaa tactacacag aaaaaaatag tttcactgat acatattcca 3600

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atgtgtacca agctactata actaacccca gtaaggagat gatcgacttg agcaagaaga 5220

ttagttcact gttggcaaac aatgatgagt ggtccaagtt acttaaattg gctgatgata 5280

atgagcctct tagccatgat cagcaggatc agtatgctga aaacttaatt aaggaaaaat 5340

tgcatgtctg gcttctccat aaagtaggcg atggtggcaa aggacccagt gtgttagatg 5400

atgaggggct gggtgttctt catcttgcag ctgcccttgg ttatgattgg gccataaggc 5460

caactgttac tgctggtgtg aacataaatt tcagagattt tcatggatgg actgcattac 5520

attgggctgc attttgtggc aggtaagtga ctaaaatggt gaattaggct aagagtatgt 5580

tttttcttta atttttgaat attggacagt aaatactctt tgatctatgt tgcagagaac 5640

ggactgtagt agcacttatt gcactgggag cagctcctgg agctttgaca gatccacatc 5700

ctaattaccc tgctgaaagc acaccagcag accttgcatc tgctaacgga cataagggca 5760

tctctggttt cctggcagag tcctctctga caagtcatct tcaagccctc aatctgaagg 5820

aagccaatat gtctgaaata tctggtctac ctggtattgg agatgtaact gagagaaatg 5880

catctcagcc tgcaattgga gattccttag gtgctgttcg aaatgccgct caagctgctg 5940

ctcgaatata tcaagttttc agggtgcaat ccttccagag gaaacaagcg gtccaatatg 6000

agggtgacaa aggtggcata tcggacgaac acgcactttc actcctgtct atgaagccat 6060

ccaagtcagg ccagcttgat cccctgcatg ctgcagcatc tcgtatacaa aataaatata 6120

ggggatggaa ggggagaaag gaatttcttc tcttcagaca acgaattgtg aagatccagg 6180

tactgtatat tatatatatt gaaatccaac agataattta gtttcccata tttctcaata 6240

gttgcattgc tcttatcaaa attttgtttg tctgccactg ggaatattaa tgaacacctg 6300

gatggatatt aagatcaaga gtactatagt gggataatct ttgttttacc gtctaatccg 6360

tcattggcta atgctgatat atatgtatat atatcttttt gctggctagg ctcatgtgcg 6420

aggccaccag gtgaggaagc attatcggaa aatagtttgg tctgttggga tagtggagaa 6480

agttatattg cgctggaggc gaagaagggc tgggttacgt ggttttaggc ctacagaagg 6540

tgcaatagag agcagcagtg gtggcacaag tagcaatttg gtcaaagata aacctgctgg 6600

agatgattat gatttcttgc aagaaggacg gaagcaaact gaagaaaggc tgcagaaagc 6660

tcttgccaga gtgaagtcca tggttcaata cccagaagca agggatcagt accaaaggat 6720

tttgaatgtt gtttcgaaaa tgcaagagtc tcaggtaatg tcctggttcc ctataaacaa 6780

gtagcattaa gcgttgctgt tatgtcttac tctgcaactt ttatccaaat ggaacactta 6840

cgccgtttgt ccctgctgat atgacgacag accgtgcaag aaaagatttt agacgaatca 6900

accgagatgg atgaaggtga tttcatgagt gaattcaagg agctgtggga tgatgataca 6960

ccactccctg gttatttcta gtgttctaga ctaactggtg gtgtctctgt aaatctcttc 7020

tcttcagttc tgctgaattg acacctgccg ataacccaaa ctctcaacat agcatgaata 7080

gcatgatctt aaaatcttga atgcttggat ttggattcag ttgtggtatt cttgctttta 7140

tgttatagcg ttatgtacag tagaatctta ttttatcatt gaaggagcca tgtatatgca 7200

gtatgaaact aatgcagaaa gttggtggtt gtatcatttg aattcaaagc tgcatgtgtg 7260

ctaagcaatt tcttgcatta gag 7283

<210> 12

<211> 2446

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 12

ccgacacagt gtcagccggt cagaccgcgg gctggccggt ccgaccgctc gatcaccgcc 60

ggtctgaccg gcaacccctg cccggtctga ccggaccaca taaaatcaca gcagtatcct 120

gtaaattcac ctgtaaatcc aatcatctcc aaaattactt tgtgaataaa ttccaaatac 180

aaaaccaata atctccaatg cccaattgtt catcacagaa taataatcaa aaacaccttt 240

gattttacat acaatcttcg taggattgtc catccactgt gaattttaaa ggaaaggata 300

agattcaatc atttatttta aaaggctttt ataaaaataa ttctcataaa attgaaatcc 360

tcaaattatc ctatgggaag attccatcca taccagaccg aaaccataaa ataccacaag 420

agtttactat agcaacatca aaacttccaa tctatcccac aaaatttccc ttttccttat 480

gaaaaaaatt tgctaattct acaattaccc ttatcgtctt cccttgtcta caccgaacaa 540

agaagtccct agacaggttt ctcgaggtcg aaggttggtc cgcaccgccg ttgaaggatg 600

agctcaagcg ccatcgaaga tgctacccaa gaggagcttg atccacaccg tagacactag 660

gataggcttg aacgttgcca ccgctgccaa gatgtggtcg aaccacacca ttactgccta 720

gaatgaggtt gatccacact gcaattaccc acaataagtt caagcgccac ctttgttgca 780

tggagtgatc ctgaccgatg acaatgacat tgcttgggac aagcttgatc tatggcgacg 840

ccgctgggag gcttgcctga gtccatgtcg ctggccattg ctcttggatg agctttgacc 900

aacggtagca gggaggagaa gggcaagagt gtcattgcac tttgttcagt tgtactataa 960

attagaaccc tccaaaaatg tgatatttta tgttttttga acaaatcttc gtggtatgga 1020

tgaaaatttc atatcgtata tattacatac ggatatcaac agacttaaag tgagtactct 1080

ttgattgcta tttttccatt taatttgagc acgttttcca aacggctaag cactacgttc 1140

ccttaaagag ccttttatgt agaagttttt aaaaaataat ataatttttc aagtttataa 1200

tagttaatgt ttaattaata atatgctaat aacctctctt attttgcaca cccttaataa 1260

gctcagctaa taaactagat cgaactcagg cacttatgtg taggctatag cactgctatt 1320

ttcatactcc tttcgtccca aaataagagg cctcatcttt tttttatact tatgcttatc 1380

agtcaaattt tgaattttca accttaaata tggagttgat tttggggttt ttcattgtag 1440

tttattttgt agtctttgct tttagatcgt taagaacacg catataaaag tattatttac 1500

aaattatttt tcatttgcaa atatgccaat aagccaaacg atggggatga agttcatttt 1560

tcatctatac cacacatacc aataccaaac agaaaagact ataatagtcc cactttgtca 1620

aatccaaatg caaatatttt tctttttata tattcccatg catttatttt atattttcac 1680

atactcccga tgaaacgatt gtttgaaaat aaatgtattt gggacaaacg gaaaggaaaa 1740

aaaaatctaa ttatggaacg gagggattag tgatggtttc acgcgcaggt gcggtgttgg 1800

agtgcggctt cttgtcggct gccccaccaa caaagaaaga agcttcccag ttcccacgtc 1860

ctgcctgcag gacatgtccg gagcgatcac actgcactta gctagtgtct tattttcctt 1920

ttttattttt ttcaactcac atatctcttt atccacacgc atatttttca gacggctaaa 1980

caatacgttt tttttaaagt tttctataga aaagctattt taaaaaatca tattaatcta 2040

ttttcaaact ttttagttaa tactaaatta ttcacgcgtt aatgagtaac atttttttac 2100

gagctccacc tcctggactc agactaaagg gctcattgtt tgcttatgct tataaatcaa 2160

agtttaaatt ttaaaactta attttaaatt taaatttttg gtttttccat cgcagtttat 2220

tttaaagtat tctctgtaaa atcattaaaa acacgtacat gaaagtttta ctcgtaggaa 2280

atatgaataa gctaaacaat gacacgtaaa actcaggggc aaaaccgtct ttctcctcat 2340

ccagctacag tcatccagag acagcctgcc tcagctccac ccgttcccat cgatccatcc 2400

ccgaaaccag cgagtgaaaa catccctcct ccctcctttt catttc 2446

<210> 13

<211> 3072

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 13

atggcggcgg cggcggacgc gcggcgcttc gcggtcgtgc cgcagctaga tattgcgcag 60

atactgaagg aggctcaaca acgatggttg cgtcctgctg aaatttgcga aatacttaaa 120

aactacaaaa gtttccgtat tgcaccagaa ccaccaaaca ggcctcaaag tggctcgctt 180

ttcctatttg atcggaaagt attgagatac tttaggaagg acggccataa ttggaggaag 240

aaaaaggatg gaaagactgt caaagaagca catgaaaggc tgaaatctgg aagtattgat 300

gtgcttcact gctactatgc acatggagaa gagaatgaga acttccaaag gaggacttac 360

tggatgttgg aagaggattt tatgcacatt gttcttgtac attatcttga gaccaagggt 420

gggaaatctc gtactagggg caacaatgac atgcatcaag cagctgttat ggatagtcca 480

ttaagtcaat taccttcaca aactatagat ggtgaaagct cacttagtgg acagttctct 540

gaatatgaag aggcagaatc agatgtttat tcaggaggaa ccggatacca ctctttcact 600

cagatgcagc agcagcaaaa tggaattgga cctgtgactg atgcttctat gttcagttct 660

cgtgtttctg cttcatccat aggtaattat cagggacaac atgctatggg acatacaaca 720

aacttctatt ctagtagtca acatgattca cctcttgttc tcagtgatcc aaaccttgaa 780

cttgcaaata atggacatga gtcattgtgg aatggggtta tgaaacctga tgaagggact 840

gttcaaatga ctcatctaca acctcctgtt catcctgagc aaggcatgtt caccacagaa 900

ggccaagggg ttgaatattt gacattcgat gaagtatatt ctgatggact cagtctgaag 960

gatataggtg ctgcaggtgc tgatgtagaa ccattctggc agctctctag tgctactgct 1020

gatatatctg caacagagaa cagcgtccaa caaaatgatg gatctctagg ggcagctatt 1080

ggcttcccat ttttgaaaac tcagtcatcc aatctatctg acatcctgaa agacagcttt 1140

aagaaatctg acagttttac aagatggatg agcaaagagc ttcttgatgt tgaggattcg 1200

caaattcagt ctagctcagg ggcatactgg aacactgaag aggcagatag tatcatcgaa 1260

gcatcaagcc gtgagccact ggatcagttc accgtggccc ctatggtttt gcaagaccag 1320

ctattcagta tagttgattt ttcgccaagc tggacatatg caggctcgaa gaccaaggtt 1380

ttagttactg gtagattctt acatgctaat gaagtcacgg agagatgcaa gtggtcatgc 1440

atgtttggag aagttgaaat tcaagcggag atttcagcag atgggactct tcgatgttat 1500

tctcccccgc ataaaccagg cagagtccct ttctatgtca cctgttccaa caggttagcc 1560

tgtagtgaag tacgtgagtt tgaatttcga ccaagtgact ctcaatacat ggatgctcct 1620

agcccgcttg gtgcaaccaa caaagtttat ttccagatac gtcttgacaa cctattgtcc 1680

ctggggccag atgtgtacca agctactata actaacccca gtaaggagat gatcgacttg 1740

agcaagaaga ttagttcact gttggcaaac aatgatgagt ggtccaagtt acttaaattg 1800

gctgatgata atgagcctct tagccatgat cagcaggatc agtatgctga aaacttaatt 1860

aaggaaaaat tgcatgtctg gcttctccat aaagtaggcg atggtggcaa aggacccagt 1920

gtgttagatg atgaggggct gggtgttctt catcttgcag ctgcccttgg ttatgattgg 1980

gccataaggc caactgttac tgctggtgtg aacataaatt tcagagattt tcatggatgg 2040

actgcattac attgggctgc attttgtggc agagaacgga ctgtagtagc acttattgca 2100

ctgggagcag ctcctggagc tttgacagat ccacatccta attaccctgc tgaaagcaca 2160

ccagcagacc ttgcatctgc taacggacat aagggcatct ctggtttcct ggcagagtcc 2220

tctctgacaa gtcatcttca agccctcaat ctgaaggaag ccaatatgtc tgaaatatct 2280

ggtctacctg gtattggaga tgtaactgag agaaatgcat ctcagcctgc aattggagat 2340

tccttaggtg ctgttcgaaa tgccgctcaa gctgctgctc gaatatatca agttttcagg 2400

gtgcaatcct tccagaggaa acaagcggtc caatatgagg gtgacaaagg tggcatatcg 2460

gacgaacacg cactttcact cctgtctatg aagccatcca agtcaggcca gcttgatccc 2520

ctgcatgctg cagcatctcg tatacaaaat aaatataggg gatggaaggg gagaaaggaa 2580

tttcttctct tcagacaacg aattgtgaag atccaggctc atgtgcgagg ccaccaggtg 2640

aggaagcatt atcggaaaat agtttggtct gttgggatag tggagaaagt tatattgcgc 2700

tggaggcgaa gaagggctgg gttacgtggt tttaggccta cagaaggtgc aatagagagc 2760

agcagtggtg gcacaagtag caatttggtc aaagataaac ctgctggaga tgattatgat 2820

ttcttgcaag aaggacggaa gcaaactgaa gaaaggctgc agaaagctct tgccagagtg 2880

aagtccatgg ttcaataccc agaagcaagg gatcagtacc aaaggatttt gaatgttgtt 2940

tcgaaaatgc aagagtctca gaccgtgcaa gaaaagattt tagacgaatc aaccgagatg 3000

gatgaaggtg atttcatgag tgaattcaag gagctgtggg atgatgatac accactccct 3060

ggttatttct ag 3072

<210> 14

<211> 1023

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 14

Met Ala Ala Ala Ala Asp Ala Arg Arg Phe Ala Val Val Pro Gln Leu

1 5 10 15

Asp Ile Ala Gln Ile Leu Lys Glu Ala Gln Gln Arg Trp Leu Arg Pro

20 25 30

Ala Glu Ile Cys Glu Ile Leu Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Arg Ile Ala

35 40 45

Pro Glu Pro Pro Asn Arg Pro Gln Ser Gly Ser Leu Phe Leu Phe Asp

50 55 60

Arg Lys Val Leu Arg Tyr Phe Arg Lys Asp Gly His Asn Trp Arg Lys

65 70 75 80

Lys Lys Asp Gly Lys Thr Val Lys Glu Ala His Glu Arg Leu Lys Ser

85 90 95

Gly Ser Ile Asp Val Leu His Cys Tyr Tyr Ala His Gly Glu Glu Asn

100 105 110

Glu Asn Phe Gln Arg Arg Thr Tyr Trp Met Leu Glu Glu Asp Phe Met

115 120 125

His Ile Val Leu Val His Tyr Leu Glu Thr Lys Gly Gly Lys Ser Arg

130 135 140

Thr Arg Gly Asn Asn Asp Met His Gln Ala Ala Val Met Asp Ser Pro

145 150 155 160

Leu Ser Gln Leu Pro Ser Gln Thr Ile Asp Gly Glu Ser Ser Leu Ser

165 170 175

Gly Gln Phe Ser Glu Tyr Glu Glu Ala Glu Ser Asp Val Tyr Ser Gly

180 185 190

Gly Thr Gly Tyr His Ser Phe Thr Gln Met Gln Gln Gln Gln Asn Gly

195 200 205

Ile Gly Pro Val Thr Asp Ala Ser Met Phe Ser Ser Arg Val Ser Ala

210 215 220

Ser Ser Ile Gly Asn Tyr Gln Gly Gln His Ala Met Gly His Thr Thr

225 230 235 240

Asn Phe Tyr Ser Ser Ser Gln His Asp Ser Pro Leu Val Leu Ser Asp

245 250 255

Pro Asn Leu Glu Leu Ala Asn Asn Gly His Glu Ser Leu Trp Asn Gly

260 265 270

Val Met Lys Pro Asp Glu Gly Thr Val Gln Met Thr His Leu Gln Pro

275 280 285

Pro Val His Pro Glu Gln Gly Met Phe Thr Thr Glu Gly Gln Gly Val

290 295 300

Glu Tyr Leu Thr Phe Asp Glu Val Tyr Ser Asp Gly Leu Ser Leu Lys

305 310 315 320

Asp Ile Gly Ala Ala Gly Ala Asp Val Glu Pro Phe Trp Gln Leu Ser

325 330 335

Ser Ala Thr Ala Asp Ile Ser Ala Thr Glu Asn Ser Val Gln Gln Asn

340 345 350

Asp Gly Ser Leu Gly Ala Ala Ile Gly Phe Pro Phe Leu Lys Thr Gln

355 360 365

Ser Ser Asn Leu Ser Asp Ile Leu Lys Asp Ser Phe Lys Lys Ser Asp

370 375 380

Ser Phe Thr Arg Trp Met Ser Lys Glu Leu Leu Asp Val Glu Asp Ser

385 390 395 400

Gln Ile Gln Ser Ser Ser Gly Ala Tyr Trp Asn Thr Glu Glu Ala Asp

405 410 415

Ser Ile Ile Glu Ala Ser Ser Arg Glu Pro Leu Asp Gln Phe Thr Val

420 425 430

Ala Pro Met Val Leu Gln Asp Gln Leu Phe Ser Ile Val Asp Phe Ser

435 440 445

Pro Ser Trp Thr Tyr Ala Gly Ser Lys Thr Lys Val Leu Val Thr Gly

450 455 460

Arg Phe Leu His Ala Asn Glu Val Thr Glu Arg Cys Lys Trp Ser Cys

465 470 475 480

Met Phe Gly Glu Val Glu Ile Gln Ala Glu Ile Ser Ala Asp Gly Thr

485 490 495

Leu Arg Cys Tyr Ser Pro Pro His Lys Pro Gly Arg Val Pro Phe Tyr

500 505 510

Val Thr Cys Ser Asn Arg Leu Ala Cys Ser Glu Val Arg Glu Phe Glu

515 520 525

Phe Arg Pro Ser Asp Ser Gln Tyr Met Asp Ala Pro Ser Pro Leu Gly

530 535 540

Ala Thr Asn Lys Val Tyr Phe Gln Ile Arg Leu Asp Asn Leu Leu Ser

545 550 555 560

Leu Gly Pro Asp Val Tyr Gln Ala Thr Ile Thr Asn Pro Ser Lys Glu

565 570 575

Met Ile Asp Leu Ser Lys Lys Ile Ser Ser Leu Leu Ala Asn Asn Asp

580 585 590

Glu Trp Ser Lys Leu Leu Lys Leu Ala Asp Asp Asn Glu Pro Leu Ser

595 600 605

His Asp Gln Gln Asp Gln Tyr Ala Glu Asn Leu Ile Lys Glu Lys Leu

610 615 620

His Val Trp Leu Leu His Lys Val Gly Asp Gly Gly Lys Gly Pro Ser

625 630 635 640

Val Leu Asp Asp Glu Gly Leu Gly Val Leu His Leu Ala Ala Ala Leu

645 650 655

Gly Tyr Asp Trp Ala Ile Arg Pro Thr Val Thr Ala Gly Val Asn Ile

660 665 670

Asn Phe Arg Asp Phe His Gly Trp Thr Ala Leu His Trp Ala Ala Phe

675 680 685

Cys Gly Arg Glu Arg Thr Val Val Ala Leu Ile Ala Leu Gly Ala Ala

690 695 700

Pro Gly Ala Leu Thr Asp Pro His Pro Asn Tyr Pro Ala Glu Ser Thr

705 710 715 720

Pro Ala Asp Leu Ala Ser Ala Asn Gly His Lys Gly Ile Ser Gly Phe

725 730 735

Leu Ala Glu Ser Ser Leu Thr Ser His Leu Gln Ala Leu Asn Leu Lys

740 745 750

Glu Ala Asn Met Ser Glu Ile Ser Gly Leu Pro Gly Ile Gly Asp Val

755 760 765

Thr Glu Arg Asn Ala Ser Gln Pro Ala Ile Gly Asp Ser Leu Gly Ala

770 775 780

Val Arg Asn Ala Ala Gln Ala Ala Ala Arg Ile Tyr Gln Val Phe Arg

785 790 795 800

Val Gln Ser Phe Gln Arg Lys Gln Ala Val Gln Tyr Glu Gly Asp Lys

805 810 815

Gly Gly Ile Ser Asp Glu His Ala Leu Ser Leu Leu Ser Met Lys Pro

820 825 830

Ser Lys Ser Gly Gln Leu Asp Pro Leu His Ala Ala Ala Ser Arg Ile

835 840 845

Gln Asn Lys Tyr Arg Gly Trp Lys Gly Arg Lys Glu Phe Leu Leu Phe

850 855 860

Arg Gln Arg Ile Val Lys Ile Gln Ala His Val Arg Gly His Gln Val

865 870 875 880

Arg Lys His Tyr Arg Lys Ile Val Trp Ser Val Gly Ile Val Glu Lys

885 890 895

Val Ile Leu Arg Trp Arg Arg Arg Arg Ala Gly Leu Arg Gly Phe Arg

900 905 910

Pro Thr Glu Gly Ala Ile Glu Ser Ser Ser Gly Gly Thr Ser Ser Asn

915 920 925

Leu Val Lys Asp Lys Pro Ala Gly Asp Asp Tyr Asp Phe Leu Gln Glu

930 935 940

Gly Arg Lys Gln Thr Glu Glu Arg Leu Gln Lys Ala Leu Ala Arg Val

945 950 955 960

Lys Ser Met Val Gln Tyr Pro Glu Ala Arg Asp Gln Tyr Gln Arg Ile

965 970 975

Leu Asn Val Val Ser Lys Met Gln Glu Ser Gln Thr Val Gln Glu Lys

980 985 990

Ile Leu Asp Glu Ser Thr Glu Met Asp Glu Gly Asp Phe Met Ser Glu

995 1000 1005

Phe Lys Glu Leu Trp Asp Asp Asp Thr Pro Leu Pro Gly Tyr Phe

1010 1015 1020

<210> 15

<211> 1575

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 15

atcttagcca cattgaacgc acgctacact gcaagaaagg caagtatagg ggtggcaggt 60

agtttatatt cactggaaac cgagaacttc actcctccca gcactccaca ctaggaggat 120

gctcactgtc tgactgactg actggctgct gctgctgctc attccttctc ctactctgcc 180

tgcctcctct gctgtgtcct tgggagaatt cttcagggac agtatccctg cagaggtgag 240

atcatgggac agtcgaagaa gaagttccgc ggagtcaggc agcgccactg gggctcctgg 300

gtctccgaga tcaggcaccc tctcctgtaa gtctctatct cactagtgat gatcactagc 360

tagctatgtt gctctgatgt gttatgccac tgtcgtgata gatacatttt gatggatagc 420

tagtggttct ggtttgttgt tgctttcttt ctttttttct ttctctttca tggtatgtta 480

gtagctaact caaggtgctt gggtgcgtgc atgcatgaat gatggatgat gttttttttg 540

ctacgtgcgt tgtggcagta agaggagggt gtggctgggt acctttgaga cggcggagga 600

ggcggcgcgg gcgtacgacg aggccgccat cctgatgagc ggccgcaacg ccaagaccaa 660

cttcccagtc gcgaggaacg ccacggggga gctcacaccg gcggctgcgg tggcagggcg 720

ggatggccgt gtcggcggcg gcagcggcag ctcgtcctca atgacggcca acggcggcgg 780

gaacagcctg tctcagatcc tcagcgccaa gctccgcaag tgctgcaaga cgccgtcgcc 840

gtcgctcacc tgcctccgcc ttgacccgga gaagtcccac attggcgtct ggcagaagcg 900

cgccggcgca cgcgctgact ccagctgggt catgaccgtc gagctcaaca aggacacggc 960

cgtgtcgtcg gctgcgacgg tggcagcagc aacagcagtg tcgtccagcg accagccgac 1020

tccgagtgac agcacagtca caacgacgtc cacgtccacc acgggctcgc cgtcgccacc 1080

acctccggca atggacgacg aggagaggat cgcgctgcag atgatcgagg agctgctggg 1140

caggagcggc ccgggctcgc cgtcacatgg gctgctgcac ggtggtgaag gtagcctcgt 1200

catctgaatt ccggaagaac aggaaagaaa ttgaaaatgc aaggttaaaa cagcatgatc 1260

aggtcaccat ctaagatcaa ggatctggta gggtggttgg tgcacaggca gttaagattg 1320

ctacatatga taggtatatc tctattacta ctacatatcc agcttaatta ggaaacaatt 1380

ataagatcga ttactactgt gtgaagtgaa gctgtgtatt tattaaagac ttacttgtat 1440

gtacaagacg tccccgtcat tatagtcata ctggtgaaag ctctgctatg tatcaacgtc 1500

atcagagatc agactacata tatataagtg gtgtcaactt ctaataaaag taaataaaaa 1560

cattgtaatt gtgta 1575

<210> 16

<211> 2670

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 16

agtcatcaac aaataataat aactagcatg atggcccgcg cagattgcgc ggctagcatc 60

attatatttt ctctcatata atagcatata tgttttctca ttatattatt caaatatatt 120

aaaatgacaa cataatttta aattttgcaa taactttaca aaactactaa tgtgtaatat 180

tcatattgca ttttatatac gtgttagtta ttaattattt ttaagataaa attttagtta 240

tttgtaaatt atatatattc atatatggac tctagactcg tcttttaata tttctttttt 300

ctgtaaattg tatttctata tagactatat gttcttcttc taatattatt tatttttatt 360

tctgaaattt tattatttct aattgtattt ctatgtggac tctaaactca tctttcaata 420

ttatttaatt tttaatttcg aattttagtt acttctaaat tgtattccta tattagcatt 480

aaactcttct tcccattttt tcttaatttc gaattttaac tatttgtaaa ttgtattttt 540

atacggactc taaactctac ttttaatttt attatgttta ttccaaattt tagttagttt 600

taagtttcta tatggactct atactctact tctaatattc cttattttta attccgaatt 660

tcagttattt cctaattgta tttctacatg gactctatac tctacttcta atattcctta 720

tttttaattc cgaatttcag ttatttccta attgtatttc tatatggact ccggtctcct 780

cttctaatat tccttatttt ttaattccga atttcagcta tttcctaatt gtatttctat 840

atggactccg gtctcctctt ctaatattcc ttatttttta attccgaatt taagctattt 900

ctaaattgta tttctatatg gactctgctt tttctttttc tccgattaat gtgagaattt 960

ctaggccatg agagcgaacg tggaggctcc tttttctatt cctttaatta tataatagat 1020

aataataatt tagatctcca tcctattctt gaagtgtggc agtagatgat gaggttgttg 1080

attataacta gtaattatca tacctgtcac ataattgtga aggtttgagc tagagggacc 1140

cttaagattt tcttccttga atcgctagtc ctagcatttg tactgacaat gtatatatga 1200

tcagtgtggt gtactagcgt ttatagtgct cacctgtcaa cggtttttac tggacgacag 1260

gtcctgacag tccttggcaa ccaccacaaa cctgcctgca cttttccatg taaaaaaagg 1320

agtgcgtgca tgtgtacgac gagcagcagc agaagaagct tccatccctg caggaactca 1380

ctgacacacg tatctgtgtg gagccgatgg aactgtaaaa gcacccggac ggaagcccca 1440

ttcaattcga tcggccggac aaacaatggc aacgaactca ctccgccatt aactccgttt 1500

caccttttta cggagagaag agcaagttct tctgctgctg caatgctgtg tgcgccttcc 1560

ttgccgatgc gccatggatg gatggatgat tggctgcttg attggggcag ttattgcagg 1620

ccaactgctc tgtcgaaaga gtgtccctcg gaaagtggct ttagaagttg gagtaaacct 1680

tgcagtgcat ggcatacata cagcatggag tggtattacc ttggttacga acgcccatca 1740

agtccatttc tggagtagta cacactgtcc aagcttcagt gtttgtacct ggaaagaaat 1800

gcacattagc catatgcgca aggcaaggca aggcattgag caaagttaga ttcatcagtt 1860

actagtttag ctagttagca catacacact actggacaat gactagcgag tgagcttagc 1920

tagctgatcg gcgacaagtg acaaccagct agttagcaat aagagctggt gatggttagc 1980

tcatctcagt tcatccttag gttttcctcc agtgaaggcc ataaatgagg tcgccaaggg 2040

cgtaggtggg ggagtttatt accggcgtac tggcagagaa ggtggttatg ccgctcgcca 2100

cagttcaccg acagcccacc ccagcagccc atgagggccc cccatcctct ttccatctat 2160

ctctctcttc cactaatctc accaaagagt cttcttcact tccttctcta ggcttattaa 2220

cagcttattt ctgatctctc acatgttcag ttttatctca tccctcctgc tagatattac 2280

tgttgctggc cccaaccacc ctgcatggat tacaacacaa gtttatcagt accactgtgg 2340

ttcaaagtag tgtatgtact ggactcgtgg agttatgacc acaaggaaat tgaccagaaa 2400

gttaattaca atgactgaag gtgtgtactc acttggtcct ggcagagtag aaggagagta 2460

caccaactag atctgaaccc tggtgtgcta ctgtaccaaa aggctaaggc cactgacaga 2520

ggagatacgt gacagacaag tcccagttga gttactgtcc aacccccaaa tctaaccctc 2580

ttctaccacc acccccactc gtgcgccaca gcgctctcac acgcgcgcca cactcatgcc 2640

atgtatgtct atatatatgt gcatctatat 2670

<210> 17

<211> 732

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 17

atgggacagt cgaagaagaa gttccgcgga gtcaggcagc gccactgggg ctcctgggtc 60

tccgagatca ggcaccctct ccttaagagg agggtgtggc tgggtacctt tgagacggcg 120

gaggaggcgg cgcgggcgta cgacgaggcc gccatcctga tgagcggccg caacgccaag 180

accaacttcc cggtcgcgag gaacgccacg ggggagctca caccggcggc tgcggtggca 240

gggcgggatg gccgtgtcgg cggcggcagc ggcagctcgt cctcaatgac ggccaacggc 300

ggcgggaaca gcctgtctca gatcctcagc gccaagctcc gcaagtgctg caagacgccg 360

tcgccgtcgc tcacctgcct ccgcctcgac ccggagaagt cccacattgg cgtctggcag 420

aagcgcgccg gcgcacgcgc tgactccagc tgggtcatga ccgtcgagct caacaaggac 480

acggccgtgt cgtcggctgc gaaggtggca gcagcaacag cagcgtcgtc cagcgaccag 540

ccgactccga gtgacagcac agtcacaacg acgtccacgt ccaccacggg ctcgccgtcg 600

ccaccacctc cggcaatgga cgacgaggag aggatcgcgc tgcagatgat cgaggagctg 660

ctgggcagga gcggcccggg ctcgccgtca catgggctgc tgcacggtgg tgaaggtagc 720

ctcgtcatct ga 732

<210> 18

<211> 243

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 18

Met Gly Gln Ser Lys Lys Lys Phe Arg Gly Val Arg Gln Arg His Trp

1 5 10 15

Gly Ser Trp Val Ser Glu Ile Arg His Pro Leu Leu Lys Arg Arg Val

20 25 30

Trp Leu Gly Thr Phe Glu Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp

35 40 45

Glu Ala Ala Ile Leu Met Ser Gly Arg Asn Ala Lys Thr Asn Phe Pro

50 55 60

Val Ala Arg Asn Ala Thr Gly Glu Leu Thr Pro Ala Ala Ala Val Ala

65 70 75 80

Gly Arg Asp Gly Arg Val Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Met

85 90 95

Thr Ala Asn Gly Gly Gly Asn Ser Leu Ser Gln Ile Leu Ser Ala Lys

100 105 110

Leu Arg Lys Cys Cys Lys Thr Pro Ser Pro Ser Leu Thr Cys Leu Arg

115 120 125

Leu Asp Pro Glu Lys Ser His Ile Gly Val Trp Gln Lys Arg Ala Gly

130 135 140

Ala Arg Ala Asp Ser Ser Trp Val Met Thr Val Glu Leu Asn Lys Asp

145 150 155 160

Thr Ala Val Ser Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ser

165 170 175

Ser Ser Asp Gln Pro Thr Pro Ser Asp Ser Thr Val Thr Thr Thr Ser

180 185 190

Thr Ser Thr Thr Gly Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Ala Met Asp Asp

195 200 205

Glu Glu Arg Ile Ala Leu Gln Met Ile Glu Glu Leu Leu Gly Arg Ser

210 215 220

Gly Pro Gly Ser Pro Ser His Gly Leu Leu His Gly Gly Glu Gly Ser

225 230 235 240

Leu Val Ile

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgttcatcgc agaagaagaa 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccagtttatc ctccactgtt 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctcccatccc aataatcctc a 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgcttgaca acaggatacc a 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aggatgcggt cttaaaaagt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gttggacaag ggtaaagtca 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttctatccgt cgtcttttgg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

attacggagt gtgtacagtg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgcagggtga aataaattca 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tgcttaaaaa gataacggtc a 21

<210> 29

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aattcgagct cggtacccgg ggatccttac aaattttttt tgaataaga 49

<210> 30

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

caagcttgca tgcctgcagg tcgacccaaa ggcaaccaag tcatttg 47

<210> 31

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tgcagcccgg gatccatggc aatggcggcg gcgcc 35

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tccacccatc aattgcaagc agggggggca gcaacg 36

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ggcatggcaa tggcggcggc gccc 24

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

aaacgggcgc cgccgccatt gcca 24

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gccgacgcgc tccaccgcga gat 23

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aaacatctcg cggtggagcg cgt 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gccggaagga cggtcataat tgg 23

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

aaacccaatt atgaccgtcc ttc 23

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ggcagaccaa cttcccggtc gcg 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

aaaccgcgac cgggaagttg gtc 23

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gccgctcctg ggtctccgag atc 23

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

aaacgatctc ggagacccag gag 23

<210> 43

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

atggccatgg aggccgaatt catggcggac cagctcaccg acgagca 47

<210> 44

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tgcggccgct gcaggtcgtc acttggccat catgacctta acg 43

<210> 45

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

atggccatgg aggccagtga attcatggcg gaggggcggc gctacgcg 48

<210> 46

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tgcagctcga gctcgatgga tctagaaata tccaggcgtt ggc 43

<210> 47

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

atggccatgg aggccagtga attcatggcg gaggggcggc gctacgcg 48

<210> 48

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

tgcagctcga gctcgatgga tctatctgaa gtttatattc aca 43

<210> 49

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

acgcgtcccg gggcggtacc atggcggacc agctcaccga cgagca 46

<210> 50

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cgaaagctct gcaggtcgac tcacttggcc atcatgacct taacg 45

<210> 51

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

acgggggacg agctcggtac catggcggag gggcggcgct 40

<210> 52

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gcgtacgaga tctggtcgac gaaatatcca ggcgttggca 40

<210> 53

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

tttcatttgg agagaacacg gagctcatgg cggaggggcg gcgct 45

<210> 54

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tcctcctcct cctcctccgg atccgaaata tccaggcgtt ggca 44

<210> 55

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

aacacggggg actgagctcg gtaccatggc ggaccagctc accgacgagc a 51

<210> 56

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gtcgacagat cctccaccac cactacctcc acctcccttg gccatcatga ccttaacg 58

<210> 57

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cgggatcgag ggaaggattt cacatatgat gatataccaa gtttttagga tgc 53

<210> 58

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

agcttattta attacctgca gggaattcct agaaatatcc aggcgttg 48

<210> 59

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

ctggttccgc gtggatccat ggcggaccag ctcaccgacg agca 44

<210> 60

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

cgatgcggcc gctcgagtcg actcacttgg ccatcatgac cttaacg 47

<210> 61

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

cgggatcgag ggaaggattt cacatatgat ggcggagggg cggcgctacg cga 53

<210> 62

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

agcttattta attacctgca gggaattcct aataagagct gaatatagaa tcatc 55

<210> 63

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

cgtgcgccac agcgctctca cacgcgcgcc acactcatgc catgtatgtc 50

<210> 64

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

cgtgcgccac agcgctctca ccacactcat gccatgtatg tc 42

<210> 65

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

gccgctctag aactagtgga tccatggcgg aggggcggcg ctacgcg 47

<210> 66

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

tcgataagct tgatatcgaa ttcctagaaa tatccaggcg ttggc 45

<210> 67

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

gccgctctag aactagtgga tccatggcgg accagctcac cgacgagca 49

<210> 68

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

tcgataagct tgatatcgaa ttctcacttg gccatcatga ccttaacg 48

<210> 69

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

attgacgagt acggtgggat ccatggcgga ggggcggcgc tacgcg 46

<210> 70

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

tcgataagct tgatatcgaa ttcctagaaa tatccaggcg ttggc 45

Claims (13)

1.一种增强禾本科植物耐热能力或保护禾本科植物高温下产量的方法，包括：调节植物中TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路；较佳地所述调节包括：

(a)下调TT2的表达或活性；

(b)下调SCT1/SCT2的表达或活性；和/或

(c)阻断SCT1/SCT2对WR2的调控，维持WR2稳态。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，下调TT2的表达或活性，从而减少TT2对热诱导的响应、减少热刺激下胞内钙浓度，调节钙调素与SCT1的相互作用；

(b)中，下调SCT1/SCT2的表达或活性，从而下调SCT1/SCT2对于WR2的调控，维持WR2稳态；

(c)中，对于受热诱导WR2低表达或不表达的植物，通过回补WR2至正常量来维持WR2稳态，或通过改变WR2启动子区的SCT1/SCT2结合区、使其不与SCT1/SCT2发生相互作用。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，下调TT2的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默TT2的编码基因，或抑制TT2的活性；较佳地，包括：以特异性干扰TT2的编码基因表达的干扰分子来沉默TT2，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除TT2的编码基因，以同源重组的方法敲除TT2编码基因，或在含有TT2的植物中将TT2进行功能丧失性突变；和/或

(b)中，下调SCT1/SCT2的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默SCT1/SCT2的编码基因，或抑制SCT1/SCT2的活性；较佳地，包括：以特异性干扰SCT1/SCT2的编码基因表达的干扰分子来沉默SCT1/SCT2，以CRISPR系统进行基因编辑从而敲除SCT1/SCT2的编码基因，以同源重组的方法敲除SCT1/SCT2编码基因，或在含有SCT1/SCT2的植物中将SCT1/SCT2进行功能丧失性突变；和/或

(c)中，所述回补WR2包括：将WR2的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；对WR2自身启动子进行突变，消除SCT1/SCT2的结合位点；以组成型启动子或组织特异性启动子促进WR2表达；或，以增强子促进WR2表达。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，所述下调TT2的表达或活性包括：敲除TT2的编码基因，从而表达无活性的蛋白或不表达蛋白；较佳地，将TT2编码基因的第165位的核苷酸C突变成A，进而形成TGA而提前终止TT2蛋白表达，或将TT2编码基因的第1位到第40位进行敲除、第85位到第90位进行敲除；第19位插入一个核苷酸、第87位到第90位进行敲除；第20位核苷酸进行敲除、第91位的核苷酸A突变成T，进而导致TT2编码区发生移码，进而形成终止密码子而提前终止TT2的表达；和/或

(b)中，所述下调SCT1/SCT2的表达或活性包括：将SCT1编码基因的第267位到第268位敲除；第219位到第253位敲除；第222位插入1个核苷酸，进而导致SCT1的编码区域移码而产生提前终止；将SCT2编码基因的第218-244位核苷酸进行敲除；第231位插入一个核苷酸；第229-231位核苷酸进行敲除，进而导致SCT2的编码区域受到破坏或移码。

5.一种TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路或其的调节剂的用途，用于增强禾本科植物耐热能力或保护禾本科植物高温下产量；其中，所述的调节剂包括：

(a)下调TT2的表达或活性的下调剂；

(b)下调SCT1/SCT2的表达或活性的下调剂；和/或

(c)阻断SCT1/SCT2对WR2的调控，维持WR2稳态的试剂。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述下调TT2的表达或活性的下调剂包括：敲除或沉默TT2的试剂，抑制TT2活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰TT2的编码基因表达的干扰分子，针对TT2的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将TT2进行功能丧失性突变；和/或

所述下调SCT1/SCT2的表达或活性的下调剂包括：敲除或沉默SCT1/SCT2的试剂，抑制SCT1/SCT2活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰SCT1/SCT2的编码基因表达的干扰分子，针对SCT1/SCT2的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将SCT1/SCT2进行功能丧失性突变；和/或

所述维持WR2稳态的试剂包括回补WR2的试剂；较佳地，包括WR2的编码基因或含有该编码基因的表达构建物；对WR2进行功能获得性突变的试剂。

7.如权利要求1-4任一所述的方法或权利要求5-6任一所述的用途，其特征在于，所述的禾本科植物包括禾谷类作物，或所述的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路或其中的通路基因来自于禾谷类作物；较佳地，所述禾本科植物包括：水稻(Oryza sativa)，玉米(Zea mays)，小米(Setaria italica)，大麦(Hordeum vulgare)，小麦(Triticum aestivum)，黍(Panicum miliaceum)，高粱(Sorghum bicolor)，黑麦(Secale cereale)，燕麦(AvenasativaL)，二穗短柄草(Brachypodium distachyum)。

8.如权利要求1-4任一所述的方法或权利要求5-6任一所述的用途，其特征在于，所述的TT2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的同源性≥80％，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；和/或

所述的SCT1的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ IDNO:10所示氨基酸序列的同源性≥80％，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；和/或

所述的SCT1的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ IDNO:10所示氨基酸序列的同源性≥80％，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；和/或

所述的SCT2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ IDNO:14所示氨基酸序列的同源性≥80％，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽；和/或

所述的WR2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)如SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与SEQ IDNO:18所示氨基酸序列的同源性≥80％，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或，(v)在SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

9.一种TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路及其中的通路基因的用途，用于：

作为鉴定禾本科植物耐热能力或禾本科植物高温下产量的分子标记；或

用作定向筛选具有耐热能力或在高温下保持产量的禾本科植物的分子标记；或

用于筛选提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质。

10.一种定向选择禾本科植物的方法，其特征在于，所述方法包括：鉴定测试植物中的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路及其中的通路基因的表达或序列特征或相互作用；若具有选自下组的一或多个特征，则该测试植物为具有耐热能力或在高温下保持产量的禾本科植物：

该测试植物的TT2低表达或不表达；

该测试植物的SCT1/SCT2低表达或不表达；

该测试植物的WR2维持稳态。

11.一种筛选提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质的方法，包括：

(1)将候选物质加入到表达TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路的体系中；

(2)检测所述体系，观测其中TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路蛋白的表达或活性：

若TT2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；

若SCT1和/或SCT2表达或活性降低，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质；

若添加候选物质后促进WR2维持稳态，则该候选物质为提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的物质。

12.一种用于提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路基因的下调剂，其为CRISPR基因编辑试剂，其下调TT2、SCT1和/或SCT2的表达；较佳地，

所述CRISPR基因编辑试剂靶向于TT2编码基因的第165位，使核苷酸C突变成A，进而形成TGA而提前终止TT2蛋白表达；或将TT2编码基因的第1位到第40进行敲除、第85位到第90位进行敲除；第19位插入一个核苷酸、第87位到第90位进行敲除；第20位核苷酸进行敲除、第91位的核苷酸A突变成T，进而导致TT2编码区发生移码，进而形成终止密码子而提前终止TT2的表达；或靶向于SCT1/SCT2的表达或活性包括：将SCT1编码基因的第267位到第268位敲除；第219位到第253位敲除；第222位插入1个核苷酸，进而导致SCT1的编码区域移码而产生提前终止；将SCT2编码基因的第218-244位核苷酸进行敲除；第231位插入一个核苷酸；第229-231位核苷酸进行敲除，进而导致SCT2的编码区域受到破坏或移码。

13.一种构建体或植物细胞、组织或器官，其中含有有外源的权利要求12所述的用于提高禾本科植物耐热能力或在高温下保持产量的TT2-SCT1/SCT2-WR2信号通路基因的下调剂。

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