JP4387120B2 - 深播耐性に関与する遺伝子等についての新規遺伝マーカーおよびその利用法 - Google Patents
深播耐性に関与する遺伝子等についての新規遺伝マーカーおよびその利用法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規遺伝マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）、例えば、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における、深播耐性に関与する遺伝子等についての新規遺伝マーカーと、その利用法とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９８０年代後半から、植物において遺伝マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）とそれらを利用した連鎖地図作成が急速に行われてきた。このＤＮＡマーカーの検出技術の発展は、形態的形質に関与する標識遺伝子を遺伝マーカーとして用いてきた従来の連鎖解析を飛躍的に進展させた。例えば、イネでは、病虫害抵抗性等に代表される単一遺伝子が関与している形質の連鎖解析が効率化されたばかりでなく、従来の方法では解析が困難とされてきた複数の遺伝子が関与する形質（量的形質）についても、ＤＮＡマーカーによる関与遺伝子座の解析が可能となった。
【０００３】
ここで、「量的形質」について簡単に説明する。単一主働遺伝子支配の形質に対して、出穂期や稈長に代表される多くの農業上重要な形質は、雑種後代で連続的な変異を示すものが多い。このような形質は一般に複数の遺伝子の作用によって決定されている場合が多く、総称して量的形質と呼ばれている。作物の育種において改良対象とされる形質の多く、例えば収量や品質・食味等はこの量的形質に含まれる。
【０００４】
係る量的形質に関与する個々の遺伝子座は量的形質遺伝子座（Quantitative Trait Loci：ＱＴＬ）と呼ばれ、ＤＮＡマーカーの利用以前は、連鎖がみられる遺伝様式が明瞭な形態や生化学的な形質を司る遺伝子をマーカーとし、これらのマーカーとの連鎖分析によって試みられてきた。しかしながら、形態的なマーカーは多面発現といったそれ自体が目的の形質に影響する場合が多く、さらに染色体全体に分散する形態的なマーカーを用いることは事実上不可能であった。
【０００５】
そのため、新しい遺伝的なマーカーを利用した方法が開発された。核ＤＮＡを制限酵素により切断すると、個体または系統によりＤＮＡ断片の長さが異なることがある。これをＤＮＡ多型と呼ぶ。ＤＮＡ多型は、通常の形態形質を司る遺伝子と同じくメンデル遺伝をすることから、これらを遺伝的なマーカーとして利用し、相互の遺伝的連鎖の程度を推定して距離の指標とすれば、マーカー相互の染色体上の位置を示す連鎖地図が作成できる。このマーカーをRFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）マーカーと呼ぶ。１９８０年代になってRFLPマーカーに代表されるＤＮＡマーカーが開発され、量的形質遺伝子座のマッピングも現実的なものとなった。
【０００６】
上記RFLPマーカーのようなＤＮＡマーカーによる詳細な連鎖地図を利用することにより、量的形質を支配する遺伝子座（ＱＴＬ）の連鎖分析も可能となった。また、単に、連鎖群上のＤＮＡマーカーの数が増えても、該当するＤＮＡマーカーがないと連鎖地図上にギャップができる。しかし、ギャップはＤＮＡマーカーの種類を変えることにより埋まる可能性があり、ＲＦＬＰマーカーによって作成された連鎖地図上のギャップを、マイクロサテライトマーカーなどを使って補う試みも行われている。現在、図１に示すように、ＤＮＡマーカーとしては種々のマーカーが開発され利用されている。
【０００７】
さらに上記ＱＴＬ解析は、これまで解析が困難とされた環境による影響を受け易い耐病性や、培養特性などの遺伝性に関する研究にも利用されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００８】
また、オオムギの深播耐性についても、ＱＴＬを用いた遺伝解析が進められている。「深播耐性」とは、図２に示すように、乾燥地のように、地表層に種子の発芽に必要な水分が少ない地域では、土壌深くの水分で作物を育てる必要があるため、乾燥地では種子を土壌深くに播いても出芽する耐性が要求され、このような地中深くからでも出芽できる性質のことである。深播耐性は半乾燥地における畑作物の苗立ちの安定性に資するだけでなく、イネの直播栽培における苗立ちの安定性にも利用できると考えられる。
【０００９】
これまでオオムギの「Harrington」と「TR306」および「Steptoe」と「Morex」のＦ１からバルボッサム法で作出された倍加半数体（ＤＨ）系統を用いて、深播耐性に関連するＱＴＬ解析を行い、３〜４個のＱＴＬが見出されている（非特許文献３参照）。
【００１０】
また、オオムギの５Ｈ染色体長腕末端部に作用力の大きいＱＴＬが見出され、深播耐性のＱＴＬの約半数は、子葉鞘長および第１節間長のＱＴＬと同座あるいは近傍に位置すると報告した。オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部には、休眠性（ＧＡ３感受性）やストレス耐性（耐湿性、ＡＢＡ感受性など）に関与する遺伝子やＱＴＬも報告されている（例えば、非特許文献４、５参照）。
【００１１】
また、ＱＴＬ解析に用いたオオムギ品種の「Harrington」と「TR306」のＤＨ系統による連鎖地図によると、５Ｈ染色体長腕末端部のＤＮＡマーカーはABC309およびMWG632であることが報告された（非特許文献６参照）。
【００１２】
【非特許文献１】
Mano, Y., Takahashi, H., Sato, K and Takeda, K.共著、「Mapping Genes for Callus Growth and Shoot Regeneration in Barley (Hordeum vulgare L.) 」、Breeding Science、46: 137〜142、1996
【００１３】
【非特許文献２】
Graner, A., Streng, S., Kellermann, A., Schiemann, A., Bauer, E., Waugh, R., pellio, B., Ordon, F共著、「Molecular mapping and genetic fine-structure of the rym5 locus encoding resistance To different strains of the Barley Yellow Mosaic Virus Complex.」、Theor Appl Genet 98:285-290、1999
【００１４】
【非特許文献３】
Takahashi, H., Sato, K. & Takeda, K,共著、「Mapping genes for deep-seeding tolerance in barley.」、Euphytica, 122:37-43、2001.
【００１５】
【非特許文献４】
武田和義著、「オオムギにおける種子休眠性のＱＴＬ解析」 育種学雑誌、46、別１：207．1996.
【００１６】
【非特許文献５】
岩佐友彦，高橋秀和，武田和義共著、「オオムギ種子感水性のＱＴＬマッピング」、岡山大学資源生物科学研究所報告、1999.
【００１７】
【非特許文献６】
Mather, D.著、「Barley Steptoe X Morex and Harrington X TR306 basemaps.」、1995. HYPERLINK "（http://gnome.agrenv.mcgill.ca/info/basemaps.htm" （http://gnome.agrenv.mcgill.ca/info/basemaps.htm.）
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、ＱＴＬ解析が有効であるための前提条件には、順序の正確な遺伝マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）による連鎖地図が作成されていることである。一般に、マーカー間の密度が高いほど新しくマップされるＱＴＬの位置の精度が高くなり、また、インターバルマッピングによるＱＴＬマップの推定精度は、マーカー間の組換え価が小さいほど推定精度が高い傾向にある。さらに高密度な連鎖地図が利用されれば、ＱＴＬの単離も可能になる。
【００１９】
しかしながら、上述のような従来のオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部におけるＤＮＡマーカーのみでは、深播耐性、休眠性、ストレス耐性に関する遺伝子やＱＴＬを単離・同定するための、詳細な連鎖地図を作製できないという問題がある。
【００２０】
したがって、オオムギの深播耐性、休眠性、ストレス耐性に関する遺伝子やＱＴＬをＱＴＬ解析によって単離・同定するための、信頼性の高い連鎖地図を作製するために、さらなるオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における遺伝マーカーが強く求められていた。
【００２１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規遺伝マーカー、特に、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における、深播耐性等に関与する遺伝子等についての新規遺伝マーカーと、その利用法とを提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、オオムギの５Ｈ染色体長腕末端部のABC309〜MWG632近傍とみられるマーカー情報を収集し、ＰＣＲ法で利用可能なマーカーの開発、ならびにマッピング、新規に作成された連鎖地図による深播耐性の解析を行ったところ、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカーを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２３】
すなわち、本発明に係る遺伝マーカーは、以下の（ａ）または（ｂ）に示される塩基配列を有することを特徴としている。（ａ）配列番号１〜２２のいずれかに示される塩基配列。（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかに示される塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／または付加された塩基配列であって、植物の深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬと連鎖する塩基配列。
【００２４】
上記のような遺伝マーカーは、オオムギの深播耐性に関する遺伝子と連鎖するため、作物育種におけるマーカー選抜（marker assisted selection）を可能にするばかりでなく、連鎖地図作製にも利用可能であり、地図情報を利用した遺伝子単離（map-based cloning）の基盤となる。すなわち、上記遺伝マーカーによれば、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子を単離・同定するためのＱＴＬ解析等に有用な連鎖地図を作製することができる。さらに、上記遺伝マーカーを指標として、「深播耐性」の植物を選択的に育種することが可能となる。
【００２５】
また、上述したように、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における、オオムギの「深播耐性」に関するＱＴＬとほぼ同座あるいはその近傍には、ストレス耐性（耐湿性、ＡＢＡ反応性等）、休眠性に関する遺伝子やＱＴＬが存在している。このため、上記遺伝マーカーを用いることにより、オオムギのストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子やＱＴＬをも単離・同定することができると考えられる。
【００２６】
なお、上記植物は、ムギ類植物であることが好ましい。特に、本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギ由来であることが好ましい。また、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における遺伝マーカーであることが好ましい。さらに、ＳＴＳ（sequence tagged site）マーカーであることが好ましい。
【００２７】
また、本発明に係る連鎖地図は、従来から知られている遺伝マーカーに加えて、さらに、上記いずれかの遺伝マーカーを用いて作製されているオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における連鎖地図である。
【００２８】
上記の連鎖地図は、オオムギの深播耐性、ストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬについて、の正確かつ信頼性の高い連鎖地図である。このため、オオムギの深播耐性、ストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬについて、より詳細なＱＴＬ解析を行うために利用することができる。
【００２９】
また、本発明に係る遺伝子等の単離方法は、少なくとも、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを用いて、植物染色体から深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬの座乗位置を特定する工程を含むことを特徴とする深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬの単離方法である。
【００３０】
上記の方法によれば、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子と連鎖する遺伝マーカーを利用するため、オオムギの深播耐性、ストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬを、効率的に単離・同定することができる。
【００３１】
また、本発明に係るＱＴＬ解析方法は、上記いずれかの遺伝マーカー、あるいは上記連鎖地図を用いて、オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬについてのＱＴＬ解析を行う方法である。
【００３２】
上記の方法によれば、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子と連鎖する遺伝マーカーを利用するため、オオムギの深播耐性、ストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬについて、効率的なＱＴＬ解析を行うことができる。
【００３３】
また、本発明に係る植物選抜方法は、上記いずれかの遺伝マーカーを指標として、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を選抜する方法である。上記の構成によれば、上記遺伝マーカーと連鎖している深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を簡便に選抜することができる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
半乾燥地域において作物を栽培する場合、発芽時に土壌深部の水分を利用するために、当該作物の種子を土壌深くに播いて栽培する深播栽培が行われる。そのため、このような地域で栽培される作物では、深播条件での出芽力、すなわち深播耐性が必要となる。係るオオムギの深播耐性に関連するＱＴＬは、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部に位置することが知られている。また、休眠性（ＧＡ３感受性）やストレス耐性（耐湿性、ＡＢＡ感受性など）に関係する遺伝子やＱＴＬも、深播耐性に関連するＱＴＬとほぼ同座あるいは近傍に位置することが知られている。しかし、これまで知られているＤＮＡマーカーだけでは、上記遺伝子やＱＴＬの位置を詳細に検出することができない。
【００３５】
そこで、本発明では、５Ｈ染色体長腕末端部におけるＱＴＬの位置をより詳細に知るため、新規ＤＮＡマーカー、および当該ＤＮＡマーカーを用いたＱＴＬ解析方法、並びにオオムギ５Ｈ染色体の長腕末端部における詳細な連鎖地図を提供する。以下に、本発明のＤＮＡマーカーおよびその利用法に関する実施の一形態について図１〜図２４に基づいて順に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３６】
（１）本発明に係る遺伝マーカー
本発明に係る遺伝マーカーは、上述のように、以下の（ａ）または（ｂ）に示される塩基配列を有する遺伝マーカーであればよい。（ａ）配列番号１〜２２のいずれかに示される塩基配列。（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかに示される塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／または付加された塩基配列であって、植物の深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬと連鎖する塩基配列。
【００３７】
本発明でいう、「ＱＴＬ（Quantitative Trait Loci）」とは量的形質遺伝子座のことであり、「オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連するＱＴＬ」とは、オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性といった量的形質に関与する個々の遺伝子座であればよい。また、「連鎖」とは、同じ染色体上に位置する２つ以上の遺伝子あるいは遺伝形質が組になって遺伝する現象をいう。また、「休眠性」とは、種子が成熟後に一定期間芽が出なくなる性質であり，成熟時に雨の多い地域で，成熟後穂に実の付いたまま発芽する穂発芽という障害に対する耐性となる性質のことをいい、「ストレス耐性」とは、例えば、耐湿性、ＡＢＡ（abscisic acid:アブシジン酸）反応性をいい、具体的には、植物が不良な環境に対して健全に生育する能力を指している。
【００３８】
以下に「耐湿性」と「ＡＢＡ反応性（感受性）」とについて説明する。「耐湿性」とは、オオムギは中近東原産なので元来乾燥を好み、日本のように水田の裏作として湿った土壌で育てると根が呼吸できず、生育不良となり、排水不良で温度の高い場合などは枯れてしまう。耐湿性はこのような土壌が湿潤な条件でも生育できる作物のストレス耐性をいう。また、「ＡＢＡ反応性」とは、ＡＢＡはabscisic acid（アブシジン酸）の略称であり、全ての高等植物にみとめられ、休眠性を制御したり、ストレス耐性において中心的な役割を担っているとされている。オオムギにおいても、休眠性や耐塩性とＡＢＡ反応性は共通の作用機構が存在することが示唆されている。
【００３９】
また、上記植物は、イネ科植物であることが好ましい。ここでいう「イネ科植物」とは、オオムギ属（Hordeum）、コムギ属、イネ等の植物であればよく、特に限定されるものではない。また、上記遺伝マーカーは、オオムギ由来であることが好ましく、オオムギのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来であってもよい。オオムギ属は、二条、六条等の条性、裸性、皮性、並・渦性等の諸性質は特に限定されないことは、いうまでもない。さらに、上記遺伝マーカーは、オオムギの５Ｈ染色体長腕末端部における遺伝マーカーであることが好ましい。
【００４０】
また、上記遺伝マーカーは、ＳＴＳマーカーであることが好ましい。ここでいう「ＳＴＳマーカー」とは、配列認識部位マーカーのことであり、ＤＮＡ断片の染色体上の位置を知るため等に用いられる塩基配列マーカーであって、ゲノム上で唯一しか存在しないような特異的な塩基配列（例えば、ＤＮＡ配列等）を含んでいるマーカーをいう。また、ＳＴＳマーカーとは、STSプライマーで増幅される全ての塩基多型（断片長，塩基置換）とも換言できる。
【００４１】
なお、本発明の「遺伝マーカー」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい。さらに、本発明の「遺伝マーカー」は、上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列以外に、その他の塩基配列、例えば、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの塩基配列を含むものであってもよい。
【００４２】
また、本発明でいう「１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、公知の人為的な手法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加される変異を意味する。また、上記変異は、人為的に導入された変異ではなくてもよい。例えば、天然に存在する植物のゲノムから同様の変異を有するポリヌクレオチドを単離して、本発明にかかる遺伝マーカーとして用いてもよい。
【００４３】
本実施の形態では、具体的には、▲１▼配列番号１〜１８に示される塩基配列のうちいずれか１つの塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー：ABG314とその多型）、▲２▼配列番号１９〜２２に示される塩基配列のうちいずれか１つの塩基配列を有するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ（マーカー：ABC718）のほか、上記ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡ等が例示される。
【００４４】
以下、上記▲１▼、▲２▼の遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）について詳細に説明する。
【００４５】
（１−１）ＤＮＡマーカー：ABG314について
ABG314は、配列番号３３、３４の塩基配列に示されるSTSプライマーによって増幅されるDNA配列の多型であって、配列番号１〜１６のいずれか１つあるいは配列番号１７〜１８に示される塩基配列を有する多型を含み、深播耐性、ストレス耐性、または休眠性の遺伝子またはＱＴＬの近傍に位置するＤＮＡマーカーである。すなわち、ABG314は、５H染色体長腕末端部に位置すると考えられるオオムギ深播耐性に関わるＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーであると考えられる。
【００４６】
ABG314のSTSプライマーと、オオムギ品種「Harrington」および「TR306」から得たゲノムＤＮＡとを用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅断片を得た。そして、ABG314のSTSプライマーによるＰＣＲ増幅断片を制限酵素 Afa Iで処理すると、図１２に示すように、「Harrington」では約1,500 bpの断片がみられ、「TR306」では1,600 bpの断片が確認された（図１２参照）。すなわち、ABG314は、オオムギ品種「Harrington」および「TR306」の間において、１塩基の多型が見られ、この１塩基多型は制限酵素処理によって確認できることがわかった。このことから、ABG314は、STSマーカーとして利用可能であると考えられる。
【００４７】
次いで、上記STSプライマーを用いて、種々のオオムギ品種のゲノムＤＮＡを鋳型として、ABG314の多型を調べた。その結果、オオムギの１６品種から多型が得られた。なお、ABG314は４ｋｂｐ程度の配列であったため、ABG314の多型の塩基配列は、上記STSプライマーより２０〜３０塩基対から約９００塩基対程度まで特定できた。これら塩基配列を配列番号１〜１８に示す。
【００４８】
具体的には、配列番号１に示される塩基配列は、後述する実施例の図２２に示す、ＯＵ番号（岡山大学 資源生物科学研究所 大麦・野性植物資源研究センターの整理番号）がＢ６０８、品種名「Media」におけるABG314多型であり、６７８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。同様に、配列番号２に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＢ６２３、品種名「Algiers」におけるABG314多型であり、７６７塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号３に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＢ００９、品種名「Poda」におけるABG314多型であり、６７８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号４に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＢ７２０、品種名「Hatial」におけるABG314多型であり、８１１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号５に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＴ０５７、品種名「Turkey169」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号６に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＵ０４０、品種名「Bohemia Nackt」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号７に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＫ７５８、品種名「論山裸1-6」におけるABG314多型であり、９１４塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号８に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ５３３、品種名「北陸皮16号」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号９に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ１４９、品種名「坊主裸」におけるABG314多型であり、９０１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１０に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ２３９、品種名「鉱毒不知」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１１に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ４０６、品種名「ユウナギハダカ」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１２に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＫ１４４、品種名「春川ユンモボリ」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１３に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ４８１、品種名「愛知裸16号」におけるABG314多型であり、９１９塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１４に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ４１５、品種名「広島在来」におけるABG314多型であり、９０７塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１５に示される塩基配列は、図２２に示す、品種名「TR306」におけるABG314多型であり、６７８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１６に示される塩基配列は、図２２に示す、品種名「Harrington」におけるABG314多型であり、６７８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。なお、以上の塩基配列は、Ｌプライマー（配列番号３３、図３参照）から読まれた塩基配列である。
【００４９】
また、配列番号１７に示される塩基配列は、図２２に示す、品種名「TR306」におけるABG314多型であり、Ｒプライマー（配列番号３４、図３参照）から読まれた５８１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１８に示される塩基配列は、図２２に示す、品種名「Harrington」におけるABG314多型であり、Ｒプライマー（配列番号３４、図３参照）から読まれた５５８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。
【００５０】
上記ABG314の多型について図２４にまとめて示す。図２４に示す表の横の数字は、配列番号１〜１６に示される塩基配列における塩基数を示す。すなわち、上記ABG314は、図２４に示すように、１１、３４、３７４、３８８、４１８、４９３、５５０、６０６、６１７、６１９、７２３、８０７、８０８、８６４番目の塩基に多型を有することがわかった。
【００５１】
以上のことから、上記ABG314多型は、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部におけるＤＮＡマーカーとして利用できることがわかった。したがって、上記ABG314多型は、作物育種におけるマーカー選抜を可能にするばかりでなく、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における連鎖地図作製にも利用可能であり、当該地図情報を利用した遺伝子単離にも利用可能である。
【００５２】
（１−２）ＤＮＡマーカー：ABC718
ABC718は、配列番号４５、４６の塩基配列に示されるSTSプライマーによって増幅されるDNA配列の多型であって，配列番号１９〜２２のいずれか１つに示される塩基配列を含む、５H染色体長腕末端部に位置すると考えられる深播耐性、ストレス耐性、または休眠性の遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００５３】
配列番号１９〜２２は、後述する実施例に示すように、配列番号４５、４６に示される塩基配列からなるSTSプライマーを用いて、オオムギ品種「Harrington」、「TR306」、または「Steptoe」のゲノムＤＮＡを鋳型として得られたものである。
【００５４】
すなわち、配列番号１９に示される塩基配列は、オオムギ品種「TR306」におけるABC718であり、約２．２ｋｂｐからなる塩基配列である。また、配列番号２０に示される塩基配列は、オオムギ品種「Harrington」におけるABC718であり、約２．２ｋｂｐからなる塩基配列である。これらの配列は、プライマー（配列番号４５、４６）の塩基配列を含むものであり、Ｌプライマー（配列番号４５）からＲプライマー（配列番号４６）の方向で示してある。
【００５５】
また、配列番号２１に示される塩基配列は、オオムギ品種「Steptoe」におけるABC718であり、約３００ｂｐからなる塩基配列である。また、配列番号２２に示される塩基配列は、上記配列番号２１の塩基配列をもとに相同性検索により検出したＥＳＴにおけるABC718であり、約８００ｂｐからなる塩基配列である。また、上記ABC718は、深播き時の第１節間長のＱＴＬと組換え価０％を示す。
【００５６】
上記のことから、ABC718は、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部におけるＤＮＡマーカーとして利用できる。したがって、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における詳細な連鎖地図の作製に役立つとともに、深播耐性、ストレス耐性の強い系統の選抜、作出等に利用可能と考えられる。
【００５７】
また、本発明に係る遺伝マーカーの一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝マーカーの一部配列をチップやシリコン等の担体上に固定した、いわゆるＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００５８】
また、上記プローブの配列を、本発明に係る遺伝マーカーの塩基配列の中から選択し、コムギ、イネ、その他の植物のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記各遺伝マーカーと同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝マーカーを単離できる可能性が高い。
【００５９】
したがって、上記遺伝マーカーを利用すれば、オオムギだけでなく、他の植物、例えば、コムギ、イネ等の深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関する遺伝子をも、ＱＴＬ解析によって単離・同定することが可能となると考えられる。
【００６０】
なお、本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法は、上記の方法や後述する実施例で詳細に説明するように、オオムギの葉から抽出されたＤＮＡとＳＴＳプライマーとを用いたＰＣＲを行い作製している。もちろん、本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法は、これに限定されるものではなく、公知の他の方法を用いて作製してもよい。すなわち、本発明では、前述した遺伝マーカー（ＳＮＰマーカー）やこれを含む遺伝マーカー群を作製できるような方法であれば、どのような方法を採用してもよい。
【００６１】
（２）本発明に係る連鎖地図
本発明に係る連鎖地図は、従来から知られている遺伝マーカーに加えて、さらに、上記いずれかの遺伝マーカーを用いて作製されているオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における連鎖地図であればよく、その他の遺伝マーカーを含んでいてもよく、特に限定されるものではない。ここでいう「従来から知られている遺伝マーカー」とは、例えば、図１６（ａ）、図１７、図１８に示すような、ABG463、ABG057B、ABC309、またはMWG632等が挙げられる。本発明に係る連鎖地図は、これらの従来公知の遺伝マーカーを全て含んでいることが好ましいが、これに限られるわけではなく、本発明の遺伝マーカーと併せて連鎖地図を作製することによって、より正確な連鎖地図が作製できる程度の従来の遺伝マーカーが用いられていればよい。例えば、上記従来の遺伝マーカーのうち、いずれか１つの遺伝マーカーを含んでいれば、より正確な連鎖地図が作製できる場合は、従来の遺伝マーカーは１つでよい。本発明にかかる連鎖地図に含まれる従来の遺伝マーカーとしては、特にABC309、MWG632が好ましい。
【００６２】
また、後述する実施例に示すように、上記ABG314、ABC718は、いずれも５H染色体長腕末端部に位置することがわかった。この事実に基づき、オオムギ５H染色体長腕末端部における連鎖地図を作製した。図１６（ａ）は、従来知られていた５H染色体長腕末端部の連鎖地図である。図１６（ｂ）は、本発明で作製された５H染色体長腕末端部の連鎖地図である。図１６（ｂ）に示される連鎖地図には、上記ABG314、ABC718が加えられており、従来の連鎖地図と比較して、信頼性が高まり、より正確な連鎖地図となっている。
【００６３】
図１６（ｂ）に示すように、ABG314は、ABG057BとABC309との間であって、ABG057Bから４．３ｃＭ、ABC309から１．６ｃＭ離れた位置に座乗している。また、HVM6は、MWG632の下（末端部）側、８．７ｃＭの位置に座乗している。さらに、ABC718は、MWG632とHVM6との間であって、MWG632から０．７ｃＭ、HVM6から８．０ｃＭ離れた位置に座乗している。
【００６４】
上述したように、本発明に係る連鎖地図は、従来の連鎖地図に新たなＤＮＡマーカーを追加することになるため、従来の連鎖地図よりも信頼性が高まる。このため、本発明の連鎖地図を用いることにより、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部において、深播耐性、ストレス耐性、または休眠性の遺伝子またはＱＴＬについて、より精度の高いＱＴＬ解析を行うことができる。
【００６５】
なお、本発明にかかる連鎖地図の作製方法には、従来公知の方法が利用でき、特に限定されるものではない。例えば、計算ソフトを使った通常の方法が挙げられる（LANDER, E., P. GREEN, J. ABRAHAMSON, A. BARLOW, M. DALY et al., 1987 Mapmaker: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics 1: 174-181.、またはLINCOLN, S., M. DALY and E. LANDER, 1993 Constructing genetic linkage maps with Mapmaker/Exp 3.0. Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report. 3rd ed, Cambridge, MA, USA.等）。
【００６６】
また、本発明でいう「連鎖地図」とは、いわゆる遺伝子地図、遺伝地図、染色体地図とよばれるものをも含むものである。
【００６７】
（３）本発明に係る遺伝子等の単離方法、ＱＴＬ解析方法
本発明にかかる遺伝マーカーの用途としては、遺伝子のクローニングや細胞融合、交配等の実験において目的とする遺伝子の所在を追跡するためのマーカーとして広く用いることができる。特に、本発明にかかる遺伝マーカーのうち、塩基配列中にＳＮＰ（１塩基多型）を含んでいるものは、検出が容易であるという利点がある。
【００６８】
また、本発明にかかる遺伝マーカーを用いる対象となる生物は特に限定されるものではないが、これら遺伝マーカーがオオムギ由来のものであるので、特に好ましい対象としては、オオムギおよびオオムギの属するコムギ連、イネ科植物を挙げることができる。もちろん、用途によってはイネ科植物以外の植物や場合によっては動物も対象とすることができる。
【００６９】
本発明にかかる遺伝マーカーは、それぞれ単独で上述した各種用途に用いることもできるが、特に、オオムギ染色体の遺伝子地図の作成に用いるために、複数を組み合わせて遺伝マーカー群として用いることが好ましい。本発明にかかる遺伝マーカー群をマッピングして得られた遺伝子地図は、染色体から目的とする遺伝子を特定する用途に好適に用いることができるが、本発明では、特に、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬの座乗位置を特定する用途に好適に用いることができる。さらには、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬを単離・同定することも可能となる。なお、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬの座乗位置を特定するための方法、または上記遺伝子等を単離・同定するための方法として、ＱＴＬ解析を挙げることができる。
【００７０】
また、本発明に係るＱＴＬ解析方法は、上記いずれかの遺伝マーカー、あるいは上記の連鎖地図を用いて、オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬについてのＱＴＬ解析を行う方法であればよく、その他の条件、方法等は、従来公知のＱＴＬ解析方法を用いることができ、特に限定されるものではない。
【００７１】
ＱＴＬ解析の原理は、雑種集団の各個体をマーカーの遺伝子型グループに分類し、それらの平均値を比較することから始まる。マーカーと解析対象形質に関与するＱＴＬの一つとが連鎖していれば、遺伝子型グループの平均値間に偏りが生じる。連鎖していなければ、それらの間に偏りはない。これを発展させ、マーカーの存在しないマーカー間に対応させた解析が、インターバルマッピング法によるＱＴＬ解析である。解析対象の生物種の染色体全体に分散するマーカーを用いてこの解析を繰り返すと、解析対象形質に関与する染色体領域が明らかになる。
【００７２】
また、ＱＴＬ解析で重要な項目の中に、交配親として解析対象の形質について大きな差異、すなわち遺伝的に異なる品種の選抜が重要となる。それにより、形質に関与するＱＴＬ中の主要なものが検出されると期待できる。
【００７３】
すなわち、「ＱＴＬ解析」とはＱＴＬのマッピングであればよい。さらに，マップされたQTLを単離する具体的な方法として、例えば、以下の方法が挙げられる。まず、２品種の親個体を交配させ、実験材料として多数の系統群の作出を行う。次に、目的とする形質を指標にこの系統群のゲノムを解析し、目的遺伝子の近傍に存在すると考えられる遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）を統計的に解析し、見つけ出す。この遺伝マーカーを用いて連鎖地図を作製し、それぞれの遺伝マーカーを指標としながら片方の親で戻し交雑を繰り返して、目的遺伝子の周辺のみがもう片方の親由来である個体を作製する。ここで得られた個体は、準同質遺伝子系統と呼ばれ、この準同質遺伝子系統を利用して、目的遺伝子の染色体上の位置を絞り込んでいくことで、目的の遺伝子を単離する。
【００７４】
本発明に係るＱＴＬ解析方法によれば、上記遺伝マーカーまたは上記の連鎖地図を利用しているため、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子についてのＱＴＬ解析を行った結果、後述する実施例に示すように、ＱＴＬの位置の正確性と信頼性とを高めることができる。したがって、本発明のＱＴＬ解析によって、オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関する遺伝子またはＱＴＬの位置をより正確に特定することができる。
【００７５】
（４）本発明に係る植物選抜方法、植物生産方法
本発明に係る植物選抜方法は、上記いずれかの遺伝マーカーを指標として、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を選抜する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。
【００７６】
本発明に係る植物選抜方法の具体的方法としては、植物育種における従来公知の手法が利用でき、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、交配等により作出した植物のゲノムＤＮＡを抽出し、本発明に係る遺伝マーカーを有するか否かを指標として植物を選抜する方法が挙げられる。なお、上記遺伝マーカーを検出する手段としては、例えば、上記遺伝マーカーの一部の配列を固定化させたＤＮＡチップを用いる方法、または上記遺伝マーカーの一部の配列をプライマーとするＰＣＲにより上記遺伝マーカーを増幅させる方法等の従来公知の方法が利用でき、特に限定されるものではない。
【００７７】
また、本発明に係る植物生産方法は、上記いずれかの遺伝マーカーを指標として、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を生産する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は、特に限定されるものではない。
【００７８】
本発明に係る植物生産方法の具体的な方法としては、植物育種における従来公知の手法または遺伝子工学的な手法が利用でき、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、上記遺伝マーカーを有する植物を親個体として交配させて上記遺伝マーカーを有する植物個体を生産する方法、または上記遺伝マーカーを含むＤＮＡ領域をベクター等を利用した遺伝子導入等の遺伝子工学的な手法によって、上記遺伝マーカーを有する植物を生産する方法が挙げられる。なお、生産した植物個体が上記遺伝マーカーを有するか否かは、上述のＤＮＡチップやＰＣＲ法を利用して簡便に調べることができる。
【００７９】
なお、ここでいう「植物」には、オオムギ、コムギ、イネ等のイネ科植物が好ましい。
【００８０】
上記のように、本発明の植物選抜方法によれば、非常に簡便かつ高確率で、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を選抜することができる。また、本発明の植物生産方法によれば、非常に簡便かつ高確率で、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を生産することができる。
【００８１】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８２】
【実施例】
〔実施例１〕オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部の詳細地図の作製
オオムギのＤＨ系統を用いて深播耐性に関するＱＴＬ解析を行った結果、５Ｈ染色体長腕末端部に作用力の大きなＱＴＬが見出された。ＱＴＬ解析に用いたオオムギ品種「Harrington」と「TR306」のDH系統から得られた連鎖地図によると、５Ｈ染色体長腕末端部のＤＮＡマーカーはABC309およびMWG632であることが報告された（非特許文献６参照）。よって、５Ｈ染色体長腕末端部のABC309〜MWG632近傍とみられるマーカー情報を収集し、ＰＣＲ法で利用可能なマーカーへの開発ならびにマッピング、新規に作成された連鎖地図を用いて深播耐性の解析を行った。
【００８３】
〔１〕ＤＮＡマーカーの開発
〔１−１〕RFLPマーカーのSTS化
（１）材料および方法
供試材料としてオオムギ品種「Harrington」と「TR306」の葉から抽出したＤＮＡを用いた。オオムギ葉からのＤＮＡの抽出法（ＣＴＡＢ法）は以下に示す通りである。
【００８４】
成葉を1cm角程度に刻んだ後、アルミホイルに包んで液体窒素に浸漬し、急速に凍結する。凍結葉サンプルに液体窒素を加え、乳鉢と乳棒で粉砕した。粉砕によって細胞壁を破壊した葉の粉末を、予め60℃に温めておいた15mlのCTABバッファーと３０μｌの2‐メルカプトエタノールの入っているコニカルチューブに移し入れ、ウォーターバスシェーカーで60℃、30分間往復振とうし、ＤＮＡを溶解させた。
【００８５】
バッファー中に溶出したＤＮＡは、ＤＮＡ中のリン酸塩（負電荷）がナトリウムイオンに取り囲まれる形で存在している。細胞からはタンパクも抽出バッファー中に溶出するので、クロロホルム溶液（クロロホルム：イソアミルアルコール=24：1）をCTAB抽出バッファーと等量（15ml）加え、20分〜30分往復振とうした（70rpm、室温）。さらに遠心分離機に移し、4000rpmで15分間遠心分離した後、沈澱を壊さないようにして静かに、上層を新しいコニカルチューブに移し、タンパクを変性させて除去した。
【００８６】
CTAB-RNAもCTAB沈殿の際同時に析出するのでRNaseを15μｌ加え、37℃のウォーターバス中で30分往復振とうして分解した。コニカルチューブを氷水で５〜10分間十分に冷やし、上澄みの0.6倍量のイソプロパノールを加え、コニカルチューブをゆっくり振り、コニカルチューブ内のＤＮＡをパスツールピペットで巻き取りエッペンドルフチューブへ移した。エッペンドルフチューブに、70%エタノール（500〜1000μｌ）を加え、遠心分離機（14000rpm,10分）にかけた。チューブ内のエタノールを捨て、再び70%エタノール（500μｌ）でＤＮＡを洗い、ＤＮＡを乾燥させた。その後、1×TEバッファー（100〜200μｌ）を加えて、ペレットを往復振とう機上で完全に溶かした。
【００８７】
また、ＤＮＡ溶液の濃度測定は、以下の方法で行った。まず、エッペンドルフチューブに1×TE 98mlをとり、抽出したサンプルＤＮＡ原液２mlを加え、よく混ぜる（50倍希釈）。アガロースゲル電気泳動法により測定するサンプルＤＮＡ溶液と標準ＤＮＡサンプル（市販のλ-ＤＮＡ）との電気泳動を135Vで５分程度行う。サンプルをゲルにのせる際には、サンプル溶液に10×ローディングバッファー1/10量（1〜2ml）を加え、十分に混合した。エチジウムブロマイドによって核酸を蛍光染色して、UV波長を励起するトランスイルミネーター上でサイズの確認を行った。アガロースゲルの濃度は1.0 %のゲルを使用した。また、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行い、電気泳動の状態を記録した。サンプルの蛍光の強さとほぼ同じ強さのλ-ＤＮＡサンプルを見出し、その希釈率からサンプルのＤＮＡ濃度を計算した。
【００８８】
PCRプライマーは、「Harrington」と「TR306」、「Steptoe」と「Morex」、「Igri」と「Franka」および「Proctor」と「Nudinka」の交配からなる4種のDH系統において既に連鎖地図にマッピングされているRFLPマーカーからSTS（sequence tagged site）化された塩基配列情報を元に合成した。また、RFLPマーカーの塩基配列情報は公開されているがSTS化されていないものに関しては、塩基配列情報を元に新規にプライマーを設計し合成した。PCRプライマーの設計はPrimer3（http://www-genome.wi.nit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi）を用い、設計条件は▲１▼PCR増幅断片サイズを300塩基、▲２▼プライマーの塩基数を20塩基、▲３▼Tm値を60℃とした（図３参照）。図３に示すように、「Harrington」と「TR306」の連鎖地図において位置が決まっているRFLPマーカー由来のプライマーである、ABC622のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号２３、２４で示される塩基配列を有すし、ABG463のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号２５、２６で示される塩基配列を有し、ABG057のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号２７、２８で示される塩基配列を有し、ABC309のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号２９、３０で示される塩基配列を有し、MWG632のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３１、３２で示される塩基配列を有する。
【００８９】
また、「Harrington」と「TR306」の連鎖地図において位置が決まっていないRFLPマーカー由来のプライマーである、ABG314のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３３、３４で示される塩基配列を有し、CDO213のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３５、３６で示される塩基配列を有し、CDO506のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３７、３８で示される塩基配列を有し、MWG602のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３９、４０で示される塩基配列を有し、MWG851のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号４１、４２で示される塩基配列を有し、MWG891のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号４３、４４で示される塩基配列を有する。また、図３には図示しないが、「Harrington」と「TR306」の連鎖地図において位置が決まっていないRFLPマーカー由来のプライマーである、ABC718のSTS化には、配列番号４５、４６に示すプライマーを用いた。
【００９０】
PCR反応液の組成はＤＮＡポリメラーゼ（Ex Taq、タカラ）の添付プロトコールに従い、全量を20μｌに調整し、GeneAmp9700（アプライドバイオシステムズ）によって反応を行った（図４参照）。PCRチューブはサンプルブロックが80℃以上に上昇してからセットした。PCRのプログラムは、プライマーのTm値および目的のPCR増幅断片サイズを考慮していくつか試行し、プライマーごとに最適な条件を設定した（図５参照）。
【００９１】
PCR後の反応液は、アガロースゲル電気泳動法により増幅断片を分画し、エチジウムブロマイドによって核酸を蛍光染色して、UV波長を励起するトランスイルミネーター上で増幅の有無や増幅断片サイズの多型の確認を行った。アガロースゲルの濃度はPCR増幅断片に合わせて変更し、1.0〜1.5 %のゲルを使用した。また、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行い、電気泳動の状態を記録した。
【００９２】
（２）結果および考察
本実験に用いた11プライマー対によるPCRは、再現性よくPCR増幅断片が確認でき、ABG463を除く10プライマー対ではPCR増幅断片が1種（シングルバンド）とみられた。MWG602、MWG632、MWG851、MWG891、CDO213およびCDO506の増幅断片は250〜500 bpで目的の増幅断片サイズとみられたが、ABC309、ABG314、ABC622およびABG057は1 kbより大きなサイズであった。
【００９３】
「Harrington」と「TR306」の連鎖地図の５Ｈ染色体長腕端部にマッピングされているマーカーは、動原体側からABC622〜ABG463〜ABG057〜ABC309〜MWG632の順に配列しており、MWG632が末端部のマーカーとしている（Mather 1995）。他のマーカー情報は、ABG314およびMWG851が「Steptoe」と「Morex」、MWG602およびMWG891が「Igri」と「Franka」、CDO213およびCDO506が「Proctor」と「Nudinka」の連鎖地図において報告されている（Kasha, K.J., Kleinhofs, A and the North American Barley Genome Mapping Project, 1994. Mapping of the barley cross Harrington X TR306. Barley Genetics Newsletter 23:65-69.、Graner, A., Jahoor, A., Schondelmaier, J., Siedler, H., Pillen, K., Fischbeck, G., Wenzel, G and Herrmann. R.G, 1991. Construction of an RFLP map of barley. Theor. Appl. Genet. 83:250-256.、Becker, J and Heun, M, 1995. Mapping of digested and undigested random amplified microsatellite polymorphisms in barley. Genome 38:991-998.）。ちなみに、「Steptoe」と「Morex」および「Igri」と「Franka」の連鎖地図にはRFLPマーカーがそれぞれ400マーカー以上、「Harrington」と「TR306」には250マーカー以上がマッピングされている。「Proctor」と「Nudinka」の連鎖地図には118個のAFLPマーカーとオートムギのcＤＮＡ由来のマーカー（マーカー名にCDOが付く）がマッピングされている。
【００９４】
今回用いたマーカーの中に、共通のRFLPマーカーとして報告されているものはABC309のみであった。
【００９５】
オオムギの５Ｈ染色体長腕末端部のマーカー情報は十分ではないが、PCRに供試した11プライマー対の90 %（10/11）においてPCRが安定しており、次項のシーケンス解析にこれらのPCR増幅断片を用いることとした（図６参照）。
【００９６】
〔１−２〕STS化によるシーケンス多型の解析
（１）材料および方法
供試材料としてオオムギ品種「Harrington」と「TR306」の葉より抽出したＤＮＡを用いた。
【００９７】
シーケンス解析には、RFLPマーカーのSTS化されたABC622、ABG057、ABC309、MWG632、ABG314、MWG851、MWG602、MWG891、CDO213およびCDO506のプライマー対を用いた。
【００９８】
「Harrington」と「TR306」のＤＮＡを鋳型にABC622、ABG057、ABC309、MWG632、ABG314、MWG851、MWG602、MWG891、CDO213およびCDO506のプライマー対のPCRを行い、反応液中の増幅されたＤＮＡ以外の酵素および未反応のプライマーとdNTPはQIAquick PCR Purification Kit（キアゲン）によって除去し、シーケンス反応の鋳型ＤＮＡとして供試した。
【００９９】
シーケンス反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0（アプライドバイオシステムズ）を用い、添付プロトコールに従い反応液の調整、反応プログラム、精製を行った。反応液は、反応試薬希釈バッファー（5X Sequencing Buffer、アプライドバイオシステムズ）を加えて全量を10μｌとし、GeneAmp9700（アプライドバイオシステムズ）のサンプルブロックが96℃に上昇してからPCRチューブをセットした。シーケンス反応液の精製はエタノール沈殿法によって行い、エタノールなどの廃液はマイクロピペットで丁寧に吸い取り、濃縮遠心機によってエタノールの除去および反応サンプルの乾燥を行った。シーケンス用サンプルは電気泳動の直前にシーケンス用ローディングバッファで溶解し、ヒートブロックを用いて100℃で2分の熱処理をし、直ちに氷水に移し、シーケンス用サンプルを1本鎖にした。
【０１００】
シーケンス解析には373A ＤＮＡ Sequencer（アプライドバイオシステムズ）を利用した。サンプルはシーケンスゲルに3.5〜4.0μｌを分注し、電気泳動は40 W（2.8 KV）で16時間行った。
【０１０１】
電気泳動のGelFileからSequencing Analysis 3.4（アプライドバイオシステムズ）により各サンプルの波形データとして抽出し、SeqEd（アプライドバイオシステムズ）によりベースコールの修正およびテキストファイルへの変換を行った。「Harrington」と「TR306」の間の塩基配列の違いと制限酵素認識配列の検察にはGENETYX-MAC Ver.11.0を用いた。
【０１０２】
（２）結果および考察
今回用いた10プライマー対によるSTSのシーケンス多型の解析は全てのPCR増幅断片において可能であった。MWG602、MWG632、MWG851、MWG891、CDO213およびCDO506の増幅断片サイズが250〜500 bpであったことから、増幅断片のプライマー対間の全ての塩基配列を確認することができた。しかしながら、ABC309、ABG314、ABC622およびABG057は断片サイズが1 kbより大きいため、プライマーから20〜30塩基目から500塩基程度の塩基配列を確認し、多型の検索を行った。1塩基多型などの検出には正確な塩基配列情報が不可欠であり、シーケンス解析に用いるハード面とソフト面の特性を考慮して可能な限りプライマー対によるデータを用いるように配慮した。その結果、MWG851、CDO506、ABG314およびABC622において1塩基の多型がみられた。さらにMWG851、CDO506およびABG314の多型においては、Nhe I、Pmac IおよびAfa Iによる制限酵素認識部位であった。ABC622に関しては、多型配列がPCRプライマーの3'末になるよう新規にプライマーを設計し、アレルスペーシフィック（allele specific）PCR法により多型を検出することにした。
【０１０３】
既知の「Harrington」と「TR306」の連鎖地図には、ABC622とCDO506はマッピングされているが、MWG851とABG314は報告されていない。共通のRFLPマーカーであるABC309からMWG851およびABG314の位置を他の連鎖地図から予想すると、「Steptoe」と「Morex」の連鎖地図からABC309より末端部とみられた。しかしながら、ABG314は複数の連鎖地図を重ね合わせて作成したコンセンサス地図によるとABC309より動原体側に位置することが報告されていることから、三点実験によって位置を決める必要が示唆された。
【０１０４】
オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のマーカー情報から作成したSTSのシーケンス多型の解析を行ったところ、供試した10プライマー対のうち4プライマー対において1塩基の多型が確認されたことから、次項でこれら多型の確認を試みる（図７）。
【０１０５】
〔１−３〕多型の確認
（１）材料および方法
多型の確認には、ABC622、CDO506、ABG314およびMWG851のプライマー対を用いた（表2）。ABC622に関しては、ABC622のプライマー対と多型配列がPCRプライマーの3'末になるように設計した新規のプライマーを用いた（図８参照）。
【０１０６】
まずCDO506、ABG314およびMWG851は最適条件下のプログラムでPCRを行った（図５参照）。PCR反応液の組成はＤＮＡポリメラーゼ（Ex Taq、タカラ）の添付プロトコールに従い、全量を20μｌに調整し、GeneAmp9700（ABI）によって反応を行った。ＤＮＡは、オオムギ品種「Harrington」と「TR306」を用いた。PCRチューブはサンプルブロックが80℃以上に上昇してからセットした。次に、得られたPCR産物と制限酵素を加えて反応液を調整し（図９参照）、ヒートブロックを用いて1時間・37℃の条件で処理した。
【０１０７】
ABC622のアレルスペーシフィックPCR法によるPCRプログラムは、目的の対立遺伝子に対し特異的に増幅するようにタッチダウンPCRとした（図１０参照）。タッチダウンPCRとは、熱変性、アニール、および伸長を繰り返し行う反応プログラム中のアニールの温度を、繰り返しの回数毎に変更するPCRプログラムを呼び、反応液中のプライマーのTm値が異なる場合に有効とされる。しかし、繰り返し回数が多くなることから、目的以外のPCR産物の増幅も予測される。
【０１０８】
各反応後、アガロースゲル電気泳動法により断片を分画した。次に、エチジウムブロマイドによって核酸を蛍光染色して、UV波長を励起するトランスイルミネーター上で、制限酵素処理した増幅断片ＤＮＡが消化されたか否や、消化されたPCR産物のバンドサイズの多型の確認を行った。また、新規のABC622プライマーによるPCR増幅の有無や増幅断片サイズの多型の確認も行った。ゲルは1.5％ アガロースを使用した。また、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行って電気泳動の状態を記録した。
【０１０９】
マイクロサテライトマーカー（HVM6）のPCRは、プライマーのTm値および目的のPCR増幅断片サイズを考慮して設定した（図１１参照）。なお、当該Ｌ側、Ｒ側のプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号４７、４８に示す。PCR反応後に５％メタフォアゲルで電気泳動し、増幅断片サイズの多型の確認を行った。また、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行い、電気泳動の状態を記録した。
【０１１０】
（２）結果および考察
MWG851のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Nhe Iで処理すると、「Harrington」では処理前の約300 bpの断片がみられ、「TR306」では推定通りの約150 bpずつの断片となった（不図示）。すなわち、制限酵素処理により多型の確認が可能となった。
【０１１１】
また、ABG314のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Afa Iで処理すると、「Harrington」では約1,500 bpの断片がみられ、「TR306」では1,600 bpの断片が確認された（図１２、１３参照）。
【０１１２】
CDO506のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Pmac Iで処理しても、「Harrington」と「TR306」のいずれも制限酵素で消化されなかった。これは、塩基配列の解析において間違いが含まれていたためとみられる。
【０１１３】
ABG057のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Mva I, Afa Iで処理すると、「Harrington」と「TR306」のいずれも制限酵素で消化された。しかし「Harrington 」と「TR306」の断片を比較すると、多型は検出されなかった。
【０１１４】
MWG602のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Mva Iで処理すると、「Harrington」と「TR306」のいずれも制限酵素で消化され、250 bpのPCR産物が180 bpの断片になった。しかし、これも「Harrington」と「TR306」において多型の検出がされなかった。
【０１１５】
ABC309のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Mbo IIで処理すると、「Harrington」と「TR306」のいずれも制限酵素で消化され、1 kbのPCR産物が3つの断片に切断された。ABC309はPCR産物が大きいため、全ての塩基配列が解析されていない。よって、今回検出した多型部分の他に、Mbo II酵素認識部位が存在し、そのため1 kbのPCR産物が3個の断片に切断されたとみられる。ABC309においても「Harrington」と「TR306」の多型の検出がされなかった。
【０１１６】
ABG057とMWG602およびABC309は、各制限酵素で消化されているため制限酵素部位はあると考えられる。しかし、「Harrington 」と「TR306」において多型が検出されない。これらは今後、別の検出法を用いることにより多型の検出の可能性を検討する必要がある。
【０１１７】
ABC622は、3種のプライマーによってアレルスペーシッフィックPCRを行った。しかしながらABC622のアレルスペーシッフィックPCRは目的の対立遺伝子を増幅させず、非特異的なPCR増幅断片を複数増幅させた（不図示）。
【０１１８】
HVM6のSTSプライマーによるPCR増幅断片は、「Harrington」と「TR306」において多型が検出された（図１４参照）。
【０１１９】
以上STSマーカーの作成についてまとめると、HVM6は「Harrington」と「TR306」間でPCR産物に多型がみられた。また、MWG851とABG314は制限酵素処理を行う事によって多型が確認された。
【０１２０】
オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のマーカー情報から作成したSTSのシーケンス多型の解析から、4プライマー対において多型が確認された。よって、MWG851、ABG314、HVM6およびABC622はSTSマーカーとして利用が可能となった。
【０１２１】
次節で、二条型の「Harrington」と「TR306」の交配（H/T）による倍加半数体94系統を用いて、新規に開発したSTSマーカーであるMWG851およびABG314ならびにマイクロサテライトマーカーであるHVM6のマッピングを試みることにする。
【０１２２】
〔２〕ＤＮＡマーカーのマッピング
（１）材料および方法
オオムギ品種「Harrington」と「TR306」のDH94系統をマッピング集団とした。これらのＤＮＡと第１章・第１節で開発したSTSマーカー（MWG851、ABG314、ABC718およびHVM6）を用いてPCRを行い、MWG851、ABG314についてはさらに酵素処理を行った後、電気泳動を行った（各条件と方法は第１節を参照）。泳動後は増幅断片サイズの多型の確認を行い、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行って電気泳動の様子を記録した。
【０１２３】
次いでDH94系統における各STSマーカーの遺伝子型を調査し、MAPMAKERを使用して各STSマーカーの連鎖地図を作成した。
【０１２４】
（２）結果および考察
DH94系統における各STSマーカーを用いて多型を検出した結果（図１３、１４参照）それらより推定した遺伝子型を図１５に示した。その結果ABG314、ABC718、およびHVM6は、５Ｈ染色体の長腕末端部にマッピングされた。Mather(1995)（非特許文献６）の連鎖地図によると、ABC309およびMWG632が５Ｈ染色体の長腕末端部のＤＮＡマーカーであると報告されている（図１６（ａ）参照）。今回の実験でABG314は、ABG057とABC309の間に座乗し、HVM6はMWG632の下に座乗した。また、ABC718は、MWG632とHVM6との間に座乗した（図１６（ｂ）、図１８参照）。
【０１２５】
すなわち、今回の実験により作製された連鎖地図によれば、ABG463-ABG057B間の距離は２．６ｃＭ、ABG057B-ABG314間の距離は４．３ｃＭ、ABG314-ABC309間の距離は１．６ｃＭ、ABC309-MWG632間の距離は２．４ｃＭ、MWG632-ABC718間の距離は０．７ｃＭ、ABC718-HVM6間の距離は８．０ｃＭである。
【０１２６】
深播耐性のＱＴＬがこの長腕末端部（MWG632）付近にあると推測される。よって、新たにマッピングされたこのマーカーの地図を使用し、ＱＴＬ解析を行うこととする。
【０１２７】
MWG851は７Ｈ染色体の短腕末端部にマッピングされた。MWG851は目的の５Ｈ染色体には座乗しなかった。しかし７H染色体の短腕末端部には深播耐性に関連のある第１節間長のＱＴＬがある。よってMWG851のRFLPマーカーをSTS化された事によって、第１節間長の遺伝子を解明する手がかりとなるものである。
【０１２８】
〔３〕深播耐性のＱＴＬ解析
（１）材料および方法
「Harrington」と「TR306」のDH94系統の深播耐性の検定結果データ（非特許文献３）を用いた。この検定では発芽した種子だけを深さ12cmに播種し、出芽数を数えて播種粒数に対する出芽率が深播耐性の強弱であると示している。
【０１２９】
連鎖地図上に平均マーカー距離5cMの効率良く配置された127（H/T）のマーカー（非特許文献６）に新しくマッピングしたABG314とHVM6を加え、改めてＱＴＬ解析を行った。ＱＴＬ解析には、MAPMAKER/QTLを用いてインターバルマッピングを行った。LODスコア2.0以上を有意なQTLとした。
【０１３０】
あわせて、DH系統をSTSマーカー毎に得られた遺伝子型データに基づきグループ化し、グループ間の平均値の有意差検定（ｔ検定）を行った。ここでは特定の染色体（連鎖地図）領域で最も各グループの対象形質の平均値に有意差が認められたマーカーの近傍が、推定上のQTLの存在領域であるとして分析した。
【０１３１】
（２）結果および考察
HVM6が５Ｈ染色体長腕の最末端にマッピングした結果が図12である。ここで深播耐性のQTLの位置はこれまでの報告（図１７）と異なった位置が推定された（図１８参照）。これまでの報告では「Harrington」と「TR306」の連鎖地図によると、５Ｈ染色体長腕末端部のＤＮＡマーカーはABC309およびMWG632であると報告されていた（非特許文献６）。この地図を用いたＱＴＬ解析の結果、深播耐性のQTLはMWG632の位置もしくはより末端部に位置するものとみられた。本研究において、HVM6が５Ｈ染色体長腕の最末端にマッピングされた結果、深播耐性のＱＴＬ解析におけるLOD曲線に谷を作り、スコアの比較をした（図１９）。既知のABC309-MWG632間の比較では、距離が2.7cMあるうちの約8割の位置にQTLがある。つまりABC309-MWG632間の比較では、QTLがMWG632に近い場所にあると示される。しかし新規のMWG632- HVM6間の比較では距離が6.8cMあるうちの約2割の位置にQTLが見出された。つまり、QTLがMWG632とHVM6の間にあり、かつMWG632の近くに存在することを示している。また、LODスコアが13.5から14.4に、ｒ2（寄与率）が約35％から38％になった。このQTLを持つことで深播耐性を約17％高めた。逆にこのQTLがないと、17％下げると言える。新たにマーカーを追加したことで、QTLの位置の正確性と信頼性を増加させた。
【０１３２】
本実験の結果から、ＱＴＬ解析を行う上では、染色体の全域をカバーするようなＤＮＡマーカーの必要性が示唆される。特に、染色体末端のマーカーにQTLがマッピングされる時は、ピークを明らかにできるようなマーカーを作る必要がある。HVM6マーカーをベースマップに加えたことで、QTLの山と谷を作り、よって正確なマーカーがより正確なQTLの位置を導くと推察された。
【０１３３】
また、系統をＤＮＡマーカー毎に得られた遺伝子型データに基づきグループ化し、グループ間の平均値の有意差検定（ｔ検定）を行った結果（図２０）、ABG314およびHVM6は、５Ｈ染色体上にあること、MWG851が異なる染色体上にあることが示され、上記の結果とよく類似した。各マーカーにおける深播耐性について強弱系統の遺伝子型を比較した結果（図２１）、深播耐性の強いDH系統のMWG632とHVM6の遺伝子型はTR306型、弱いDH系統の遺伝子型はHarrington型であった。ABG314、ABC309、MWG632およびHVM6のマーカーのうちMWG632が最も深播耐性に関連しているマーカーとみられ、インターバルマッピングの結果と同様であった。
【０１３４】
今後、MWG632とHVM6の間で、新たなマーカーを開発することにより、深播耐性系統を育成する際の助けとなるものである。さらに５Ｈ染色体末端部には多種のストレス耐性のQTLが報告されていることから、今後ムギ類にストレス耐性を付与したり、強い品種を選抜するための良き手がかりになると思われる。
【０１３５】
〔実施例２〕深播耐性の地理的分化
（１）材料および方法
オオムギの深播耐性の極強品種と極弱品種計14品種から抽出したＤＮＡを供試した（図２２）。
【０１３６】
シーケンスには、STS化されたABG314のプライマー対を用いた。
【０１３７】
極強・極弱品種のＤＮＡを鋳型にABG314のプライマー対のPCRを行い、反応液中の増幅されたＤＮＡ以外の酵素および未反応のプライマーとdNTPはQIAquick PCR Purification Kit（キアゲン）によって除去し、シーケンス反応の鋳型ＤＮＡとして供試した（図２３）。
【０１３８】
シーケンス反応ならびに解析は、第1章 第2項の方法に従った。
【０１３９】
電気泳動のGelFileからSequencing Analysis 3.4（アプライドバイオシステムズ）により各サンプルの波形データとして抽出し、SeqEd（アプライドバイオシステムズ）によりベースコールの修正およびテキストファイルへの変換を行った。極強・極弱品種の間の塩基配列の違いの検察にはGENETYX-MAC Ver.11.0を用いた。表の作成は、Tanno(2002)（Tanno, K., Taketa, S., Takeda, K., Komatsuda, T, 2002. A ＤＮＡ marker closely linked to the vrs1 locus (row-type gene) indicates multiple origins of six-rowed cultivated barley (Hordeum vulgare L.) Theor Appl Genet 104:54-60）を参考に行った。
【０１４０】
（２）結果および考察
今回用いたABG314は断片サイズが1 kbより大きいため、プライマーより20〜30塩基目から500塩基程度の塩基配列を確認できた。各品種の塩基配列の結果を図２４に示した。
【０１４１】
５Ｈ染色体長腕末端部に座上したABG314マーカーを用いて、深播耐性が極強・極弱と評価されている計14品種の塩基配列を比較すると、12ヵ所に1塩基多型が検出され、供試品種の地域間に共通する塩基配列がいくつか認められた。
【０１４２】
深播き耐性に強い品種は、北アフリカ・ネパール・トルコ・日本が知られている。弱い品種では、ドイツ・朝鮮半島・日本が知られている。14品種の塩基配列を比較したところ、直接深播耐性との関係が示されなかったが、地域による違いがみられた。374番目塩基から、北アフリカとその他の地域に分類でき、その他の地域においては、418番目の塩基に違いのあるトルコと388番目の塩基の違うドイツとに分類された。ABG314の塩基比較の結果、北アフリカのグループ、トルコのグループ、ドイツのグループ、ネパールや日本や朝鮮半島のグループに分類でき、５Ｈ染色体末端部の遺伝子座には地理的な分化があるものと考えられる。
【０１４３】
以上の結果をまとめると、以下のようになる。すなわち、連鎖地図の作成はＤＮＡを利用した多型解析が可能となり、染色体全体をカバーする連鎖地図の作成、さらにＤＮＡマーカーの開発に伴ってその解析能力の向上がみられ、詳細な連鎖地図の作成が可能になった。
【０１４４】
本実験で用いたプライマー対によるPCRは、再現性よくPCR増幅断片が確認でき、PCR増幅断片が1種（シングルバンド）とみられた。これらのプライマー対によるSTSのシーケンス多型の解析から、1塩基の多型が確認できた。さらにMWG851、ABG314の多型においては、Nhe I、およびAfa Iによる制限酵素認識部位であった。ABC622に関しては、多型配列がPCRプライマーの3'末になるよう新規にプライマーを設計した。HVM6のSTSプライマーによるPCR増幅断片は、「Harrington」と「TR306」において多型が検出できた。MWG851、ABG314、ABC622およびHVM6は、STSマーカーとして、今後使用することが可能である。
【０１４５】
次に、大麦品種の「Harrington」と「TR306」のDH系統を使用して、新規に作成したSTSマーカーおよびマイクロサテライトマーカーのマッピングを試みた。ABG314およびHVM6は５Ｈ染色体上に、MWG851は７Ｈ染色体にマッピングされた。
【０１４６】
５Ｈ染色体の連鎖地図上に配置された新たなマーカーであるHVM6とABG314を加え、QTLを再解析した。HVM6が５Ｈ染色体長腕の最末端にマッピングされた結果、深播耐性のピークを決定することができた。QTLがMWG632とHVM6の間にあり、かつMWG632の近くに見出された。非特許文献３のTakahashiら（2001）の報告と近傍のマーカーはMWG632と同様であったが、QTLピークのLODスコアは上昇し、変異の約38％を説明した。このQTLを持つことで深播耐性を約17％高めることが示された。マーカーを追加したことで、よりQTLの位置の正確性と信頼性を増加させることができた。
【０１４７】
一方、Kleinhofsら（1994）（Kleinhofs, A., Kilian, A and the NABGMP, 1994. The NABGMP Steptoe X Morex mapping progress report. BGN 23:79-83.）の連鎖地図によると、MWG632よりも末端部にはABC718がある。ABC718は子葉由来のｃＤＮＡマーカーであることなどから、深播耐性の強い系統の選抜に利用可能とも考えられる。また、子葉鞘長および第１節間のQTLや植物ホルモンに対する反応も深播耐性のQTLとほぼ同座あるいは近傍に位置することが報告されている（非特許文献３）。よって今後、ABC718は作物にストレス耐性を付与したり、強い品種を選抜するための良き手がかりになると思われる。
【０１４８】
ABG314を用いて深播耐性の強い品種と弱い品種の塩基配列を比較したところ、地域間において共通する塩基がいくつか見られた。北アフリカのグループ、トルコのグループ、ドイツのグループ、ネパールや日本や朝鮮半島のグループの４つに分類できた。今回、ABG314座の塩基配列と深播耐性との関係は示されなかった。しかし、オオムギ品種の深播耐性の地理的変異を調べると、北アフリカ、ネパール、エチオピア、トルコおよび西南アジアの品種が強く、中国およびヨーロッパ地域に深播耐性の弱い品種が分布していると報告されている。よって、今回の分類の結果と類似が見られる。このことから、品種数を増やすことによって大麦の系統進化が推測できる可能性があると思われる。
【０１４９】
【発明の効果】
以上のように、本発明の遺伝マーカーによれば、信頼性の高い連鎖地図を作製することができるだけでなく、深播耐性、ストレス耐性、または休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬについて、より精度の高いＱＴＬ解析を行うことができるという効果を奏する。したがって、深播耐性、ストレス耐性、または休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬを単離・同定するための非常に有用な手段となるという効果を奏する。
【０１５０】
さらに、上記の遺伝マーカーを指標とすることにより、簡便かつ高効率で、深播耐性、休眠性、ストレス耐性等の諸形質を有する植物を選抜したり、または深播耐性、休眠性、ストレス耐性等の諸形質を有する植物を作出したりできるという効果を奏する。
【０１５１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】主なＤＮＡマーカーの特徴を示す図である。
【図２】オオムギの深播耐性について模式的に説明する図である。
【図３】本実施の一形態におけるオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のSTSプライマーを示す図である。
【図４】本実施の一形態におけるＰＣＲの反応液の組成を示す図である。
【図５】本実施の一形態における、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のSTSプライマーにおけるＰＣＲ条件を示す図である。
【図６】 RFLPマーカーのSTS化を調べた電気泳動の結果を示す図である。
【図７】本実施の一形態における、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のＤＮＡマーカーの多型検索結果を示す図である。
【図８】本実施の一形態における、ABC622-Rプライマーを用いた「Harrington」と「TR306」との塩基配列を比較した図である。
【図９】図９（ａ）は本実施の一形態における、制限酵素処理に使用する制限酵素名を示す図であり、図９（ｂ）は、酵素処理反応液の組成を示す図である。
【図１０】本実施の一形態におけるタッチダウンＰＣＲのプログラムを示す図である。
【図１１】本実施の一形態における、HVM6（マイクロサテライトマーカー）のPCR条件を示す図である。
【図１２】本実施の一形態の「Harrington」および「TR306」におけるABG314の多型を調べた結果を示す図である。
【図１３】（ａ）（ｂ）は、本実施の一形態の「Harrington」、「TR306」およびそのDH系統におけるABG314の多型を調べた結果を示す図である。
【図１４】本実施の一形態の「Harrington」および「TR306」のDH系統におけるHVM6の多型を調べた結果を示す図である。
【図１５】本実施の一形態の各マーカーにおけるDH94系統の遺伝子型を示す図である。
【図１６】図１６（ａ）は従来（Mather）のオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部の連鎖地図を示す図であり、図１６（ｂ）は本実施の一形態におけるオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部の連鎖地図を示す図である。
【図１７】従来（Mather）の連鎖地図を利用したＱＴＬ解析の結果を示す図である。
【図１８】本実施の形態における、新規の連鎖地図を利用したＱＴＬ解析の結果を示す図である。
【図１９】本実施の形態における、各マーカー間の深播耐性の位置とLODスコアの比較を示す図である。
【図２０】本実施の形態における、５Ｈ染色体末端部のマーカーの遺伝子型別による深播耐性（％）を示す図である。
【図２１】深播耐性の強い１０系統と弱い１０系統における各マーカーの遺伝子型を示す図である。
【図２２】供試した深播耐性の極強・極弱品種を示す図である。
【図２３】本実施の形態における、ABG314プライマー対を用いた深播耐性の極強・極弱品種のPCR増幅断片を示す図である。
【図２４】本実施の形態における、ABG314を用いた深播耐性の極強・極弱品種の塩基配列の比較を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規遺伝マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）、例えば、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における、深播耐性に関与する遺伝子等についての新規遺伝マーカーと、その利用法とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９８０年代後半から、植物において遺伝マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）とそれらを利用した連鎖地図作成が急速に行われてきた。このＤＮＡマーカーの検出技術の発展は、形態的形質に関与する標識遺伝子を遺伝マーカーとして用いてきた従来の連鎖解析を飛躍的に進展させた。例えば、イネでは、病虫害抵抗性等に代表される単一遺伝子が関与している形質の連鎖解析が効率化されたばかりでなく、従来の方法では解析が困難とされてきた複数の遺伝子が関与する形質（量的形質）についても、ＤＮＡマーカーによる関与遺伝子座の解析が可能となった。
【０００３】
ここで、「量的形質」について簡単に説明する。単一主働遺伝子支配の形質に対して、出穂期や稈長に代表される多くの農業上重要な形質は、雑種後代で連続的な変異を示すものが多い。このような形質は一般に複数の遺伝子の作用によって決定されている場合が多く、総称して量的形質と呼ばれている。作物の育種において改良対象とされる形質の多く、例えば収量や品質・食味等はこの量的形質に含まれる。
【０００４】
係る量的形質に関与する個々の遺伝子座は量的形質遺伝子座（Quantitative Trait Loci：ＱＴＬ）と呼ばれ、ＤＮＡマーカーの利用以前は、連鎖がみられる遺伝様式が明瞭な形態や生化学的な形質を司る遺伝子をマーカーとし、これらのマーカーとの連鎖分析によって試みられてきた。しかしながら、形態的なマーカーは多面発現といったそれ自体が目的の形質に影響する場合が多く、さらに染色体全体に分散する形態的なマーカーを用いることは事実上不可能であった。
【０００５】
そのため、新しい遺伝的なマーカーを利用した方法が開発された。核ＤＮＡを制限酵素により切断すると、個体または系統によりＤＮＡ断片の長さが異なることがある。これをＤＮＡ多型と呼ぶ。ＤＮＡ多型は、通常の形態形質を司る遺伝子と同じくメンデル遺伝をすることから、これらを遺伝的なマーカーとして利用し、相互の遺伝的連鎖の程度を推定して距離の指標とすれば、マーカー相互の染色体上の位置を示す連鎖地図が作成できる。このマーカーをRFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）マーカーと呼ぶ。１９８０年代になってRFLPマーカーに代表されるＤＮＡマーカーが開発され、量的形質遺伝子座のマッピングも現実的なものとなった。
【０００６】
上記RFLPマーカーのようなＤＮＡマーカーによる詳細な連鎖地図を利用することにより、量的形質を支配する遺伝子座（ＱＴＬ）の連鎖分析も可能となった。また、単に、連鎖群上のＤＮＡマーカーの数が増えても、該当するＤＮＡマーカーがないと連鎖地図上にギャップができる。しかし、ギャップはＤＮＡマーカーの種類を変えることにより埋まる可能性があり、ＲＦＬＰマーカーによって作成された連鎖地図上のギャップを、マイクロサテライトマーカーなどを使って補う試みも行われている。現在、図１に示すように、ＤＮＡマーカーとしては種々のマーカーが開発され利用されている。
【０００７】
さらに上記ＱＴＬ解析は、これまで解析が困難とされた環境による影響を受け易い耐病性や、培養特性などの遺伝性に関する研究にも利用されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００８】
また、オオムギの深播耐性についても、ＱＴＬを用いた遺伝解析が進められている。「深播耐性」とは、図２に示すように、乾燥地のように、地表層に種子の発芽に必要な水分が少ない地域では、土壌深くの水分で作物を育てる必要があるため、乾燥地では種子を土壌深くに播いても出芽する耐性が要求され、このような地中深くからでも出芽できる性質のことである。深播耐性は半乾燥地における畑作物の苗立ちの安定性に資するだけでなく、イネの直播栽培における苗立ちの安定性にも利用できると考えられる。
【０００９】
これまでオオムギの「Harrington」と「TR306」および「Steptoe」と「Morex」のＦ１からバルボッサム法で作出された倍加半数体（ＤＨ）系統を用いて、深播耐性に関連するＱＴＬ解析を行い、３〜４個のＱＴＬが見出されている（非特許文献３参照）。
【００１０】
また、オオムギの５Ｈ染色体長腕末端部に作用力の大きいＱＴＬが見出され、深播耐性のＱＴＬの約半数は、子葉鞘長および第１節間長のＱＴＬと同座あるいは近傍に位置すると報告した。オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部には、休眠性（ＧＡ３感受性）やストレス耐性（耐湿性、ＡＢＡ感受性など）に関与する遺伝子やＱＴＬも報告されている（例えば、非特許文献４、５参照）。
【００１１】
また、ＱＴＬ解析に用いたオオムギ品種の「Harrington」と「TR306」のＤＨ系統による連鎖地図によると、５Ｈ染色体長腕末端部のＤＮＡマーカーはABC309およびMWG632であることが報告された（非特許文献６参照）。
【００１２】
【非特許文献１】
Mano, Y., Takahashi, H., Sato, K and Takeda, K.共著、「Mapping Genes for Callus Growth and Shoot Regeneration in Barley (Hordeum vulgare L.) 」、Breeding Science、46: 137〜142、1996
【００１３】
【非特許文献２】
Graner, A., Streng, S., Kellermann, A., Schiemann, A., Bauer, E., Waugh, R., pellio, B., Ordon, F共著、「Molecular mapping and genetic fine-structure of the rym5 locus encoding resistance To different strains of the Barley Yellow Mosaic Virus Complex.」、Theor Appl Genet 98:285-290、1999
【００１４】
【非特許文献３】
Takahashi, H., Sato, K. & Takeda, K,共著、「Mapping genes for deep-seeding tolerance in barley.」、Euphytica, 122:37-43、2001.
【００１５】
【非特許文献４】
武田和義著、「オオムギにおける種子休眠性のＱＴＬ解析」 育種学雑誌、46、別１：207．1996.
【００１６】
【非特許文献５】
岩佐友彦，高橋秀和，武田和義共著、「オオムギ種子感水性のＱＴＬマッピング」、岡山大学資源生物科学研究所報告、1999.
【００１７】
【非特許文献６】
Mather, D.著、「Barley Steptoe X Morex and Harrington X TR306 basemaps.」、1995. HYPERLINK "（http://gnome.agrenv.mcgill.ca/info/basemaps.htm" （http://gnome.agrenv.mcgill.ca/info/basemaps.htm.）
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、ＱＴＬ解析が有効であるための前提条件には、順序の正確な遺伝マーカー（例えば、ＤＮＡマーカー）による連鎖地図が作成されていることである。一般に、マーカー間の密度が高いほど新しくマップされるＱＴＬの位置の精度が高くなり、また、インターバルマッピングによるＱＴＬマップの推定精度は、マーカー間の組換え価が小さいほど推定精度が高い傾向にある。さらに高密度な連鎖地図が利用されれば、ＱＴＬの単離も可能になる。
【００１９】
しかしながら、上述のような従来のオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部におけるＤＮＡマーカーのみでは、深播耐性、休眠性、ストレス耐性に関する遺伝子やＱＴＬを単離・同定するための、詳細な連鎖地図を作製できないという問題がある。
【００２０】
したがって、オオムギの深播耐性、休眠性、ストレス耐性に関する遺伝子やＱＴＬをＱＴＬ解析によって単離・同定するための、信頼性の高い連鎖地図を作製するために、さらなるオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における遺伝マーカーが強く求められていた。
【００２１】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規遺伝マーカー、特に、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における、深播耐性等に関与する遺伝子等についての新規遺伝マーカーと、その利用法とを提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、オオムギの５Ｈ染色体長腕末端部のABC309〜MWG632近傍とみられるマーカー情報を収集し、ＰＣＲ法で利用可能なマーカーの開発、ならびにマッピング、新規に作成された連鎖地図による深播耐性の解析を行ったところ、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子と連鎖するＤＮＡマーカーを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２３】
すなわち、本発明に係る遺伝マーカーは、以下の（ａ）または（ｂ）に示される塩基配列を有することを特徴としている。（ａ）配列番号１〜２２のいずれかに示される塩基配列。（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかに示される塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／または付加された塩基配列であって、植物の深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬと連鎖する塩基配列。
【００２４】
上記のような遺伝マーカーは、オオムギの深播耐性に関する遺伝子と連鎖するため、作物育種におけるマーカー選抜（marker assisted selection）を可能にするばかりでなく、連鎖地図作製にも利用可能であり、地図情報を利用した遺伝子単離（map-based cloning）の基盤となる。すなわち、上記遺伝マーカーによれば、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子を単離・同定するためのＱＴＬ解析等に有用な連鎖地図を作製することができる。さらに、上記遺伝マーカーを指標として、「深播耐性」の植物を選択的に育種することが可能となる。
【００２５】
また、上述したように、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における、オオムギの「深播耐性」に関するＱＴＬとほぼ同座あるいはその近傍には、ストレス耐性（耐湿性、ＡＢＡ反応性等）、休眠性に関する遺伝子やＱＴＬが存在している。このため、上記遺伝マーカーを用いることにより、オオムギのストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子やＱＴＬをも単離・同定することができると考えられる。
【００２６】
なお、上記植物は、ムギ類植物であることが好ましい。特に、本発明に係る遺伝マーカーは、オオムギ由来であることが好ましい。また、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における遺伝マーカーであることが好ましい。さらに、ＳＴＳ（sequence tagged site）マーカーであることが好ましい。
【００２７】
また、本発明に係る連鎖地図は、従来から知られている遺伝マーカーに加えて、さらに、上記いずれかの遺伝マーカーを用いて作製されているオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における連鎖地図である。
【００２８】
上記の連鎖地図は、オオムギの深播耐性、ストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬについて、の正確かつ信頼性の高い連鎖地図である。このため、オオムギの深播耐性、ストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬについて、より詳細なＱＴＬ解析を行うために利用することができる。
【００２９】
また、本発明に係る遺伝子等の単離方法は、少なくとも、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを用いて、植物染色体から深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬの座乗位置を特定する工程を含むことを特徴とする深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬの単離方法である。
【００３０】
上記の方法によれば、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子と連鎖する遺伝マーカーを利用するため、オオムギの深播耐性、ストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬを、効率的に単離・同定することができる。
【００３１】
また、本発明に係るＱＴＬ解析方法は、上記いずれかの遺伝マーカー、あるいは上記連鎖地図を用いて、オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬについてのＱＴＬ解析を行う方法である。
【００３２】
上記の方法によれば、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子と連鎖する遺伝マーカーを利用するため、オオムギの深播耐性、ストレス耐性（耐湿性、ABA反応性等）、休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬについて、効率的なＱＴＬ解析を行うことができる。
【００３３】
また、本発明に係る植物選抜方法は、上記いずれかの遺伝マーカーを指標として、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を選抜する方法である。上記の構成によれば、上記遺伝マーカーと連鎖している深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を簡便に選抜することができる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
半乾燥地域において作物を栽培する場合、発芽時に土壌深部の水分を利用するために、当該作物の種子を土壌深くに播いて栽培する深播栽培が行われる。そのため、このような地域で栽培される作物では、深播条件での出芽力、すなわち深播耐性が必要となる。係るオオムギの深播耐性に関連するＱＴＬは、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部に位置することが知られている。また、休眠性（ＧＡ３感受性）やストレス耐性（耐湿性、ＡＢＡ感受性など）に関係する遺伝子やＱＴＬも、深播耐性に関連するＱＴＬとほぼ同座あるいは近傍に位置することが知られている。しかし、これまで知られているＤＮＡマーカーだけでは、上記遺伝子やＱＴＬの位置を詳細に検出することができない。
【００３５】
そこで、本発明では、５Ｈ染色体長腕末端部におけるＱＴＬの位置をより詳細に知るため、新規ＤＮＡマーカー、および当該ＤＮＡマーカーを用いたＱＴＬ解析方法、並びにオオムギ５Ｈ染色体の長腕末端部における詳細な連鎖地図を提供する。以下に、本発明のＤＮＡマーカーおよびその利用法に関する実施の一形態について図１〜図２４に基づいて順に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３６】
（１）本発明に係る遺伝マーカー
本発明に係る遺伝マーカーは、上述のように、以下の（ａ）または（ｂ）に示される塩基配列を有する遺伝マーカーであればよい。（ａ）配列番号１〜２２のいずれかに示される塩基配列。（ｂ）配列番号１〜２２のいずれかに示される塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／または付加された塩基配列であって、植物の深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬと連鎖する塩基配列。
【００３７】
本発明でいう、「ＱＴＬ（Quantitative Trait Loci）」とは量的形質遺伝子座のことであり、「オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連するＱＴＬ」とは、オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性といった量的形質に関与する個々の遺伝子座であればよい。また、「連鎖」とは、同じ染色体上に位置する２つ以上の遺伝子あるいは遺伝形質が組になって遺伝する現象をいう。また、「休眠性」とは、種子が成熟後に一定期間芽が出なくなる性質であり，成熟時に雨の多い地域で，成熟後穂に実の付いたまま発芽する穂発芽という障害に対する耐性となる性質のことをいい、「ストレス耐性」とは、例えば、耐湿性、ＡＢＡ（abscisic acid:アブシジン酸）反応性をいい、具体的には、植物が不良な環境に対して健全に生育する能力を指している。
【００３８】
以下に「耐湿性」と「ＡＢＡ反応性（感受性）」とについて説明する。「耐湿性」とは、オオムギは中近東原産なので元来乾燥を好み、日本のように水田の裏作として湿った土壌で育てると根が呼吸できず、生育不良となり、排水不良で温度の高い場合などは枯れてしまう。耐湿性はこのような土壌が湿潤な条件でも生育できる作物のストレス耐性をいう。また、「ＡＢＡ反応性」とは、ＡＢＡはabscisic acid（アブシジン酸）の略称であり、全ての高等植物にみとめられ、休眠性を制御したり、ストレス耐性において中心的な役割を担っているとされている。オオムギにおいても、休眠性や耐塩性とＡＢＡ反応性は共通の作用機構が存在することが示唆されている。
【００３９】
また、上記植物は、イネ科植物であることが好ましい。ここでいう「イネ科植物」とは、オオムギ属（Hordeum）、コムギ属、イネ等の植物であればよく、特に限定されるものではない。また、上記遺伝マーカーは、オオムギ由来であることが好ましく、オオムギのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来であってもよい。オオムギ属は、二条、六条等の条性、裸性、皮性、並・渦性等の諸性質は特に限定されないことは、いうまでもない。さらに、上記遺伝マーカーは、オオムギの５Ｈ染色体長腕末端部における遺伝マーカーであることが好ましい。
【００４０】
また、上記遺伝マーカーは、ＳＴＳマーカーであることが好ましい。ここでいう「ＳＴＳマーカー」とは、配列認識部位マーカーのことであり、ＤＮＡ断片の染色体上の位置を知るため等に用いられる塩基配列マーカーであって、ゲノム上で唯一しか存在しないような特異的な塩基配列（例えば、ＤＮＡ配列等）を含んでいるマーカーをいう。また、ＳＴＳマーカーとは、STSプライマーで増幅される全ての塩基多型（断片長，塩基置換）とも換言できる。
【００４１】
なお、本発明の「遺伝マーカー」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい。さらに、本発明の「遺伝マーカー」は、上記（ａ）または（ｂ）の塩基配列以外に、その他の塩基配列、例えば、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの塩基配列を含むものであってもよい。
【００４２】
また、本発明でいう「１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、公知の人為的な手法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加される変異を意味する。また、上記変異は、人為的に導入された変異ではなくてもよい。例えば、天然に存在する植物のゲノムから同様の変異を有するポリヌクレオチドを単離して、本発明にかかる遺伝マーカーとして用いてもよい。
【００４３】
本実施の形態では、具体的には、▲１▼配列番号１〜１８に示される塩基配列のうちいずれか１つの塩基配列を有するゲノムＤＮＡ（マーカー：ABG314とその多型）、▲２▼配列番号１９〜２２に示される塩基配列のうちいずれか１つの塩基配列を有するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ（マーカー：ABC718）のほか、上記ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡ等が例示される。
【００４４】
以下、上記▲１▼、▲２▼の遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）について詳細に説明する。
【００４５】
（１−１）ＤＮＡマーカー：ABG314について
ABG314は、配列番号３３、３４の塩基配列に示されるSTSプライマーによって増幅されるDNA配列の多型であって、配列番号１〜１６のいずれか１つあるいは配列番号１７〜１８に示される塩基配列を有する多型を含み、深播耐性、ストレス耐性、または休眠性の遺伝子またはＱＴＬの近傍に位置するＤＮＡマーカーである。すなわち、ABG314は、５H染色体長腕末端部に位置すると考えられるオオムギ深播耐性に関わるＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーであると考えられる。
【００４６】
ABG314のSTSプライマーと、オオムギ品種「Harrington」および「TR306」から得たゲノムＤＮＡとを用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅断片を得た。そして、ABG314のSTSプライマーによるＰＣＲ増幅断片を制限酵素 Afa Iで処理すると、図１２に示すように、「Harrington」では約1,500 bpの断片がみられ、「TR306」では1,600 bpの断片が確認された（図１２参照）。すなわち、ABG314は、オオムギ品種「Harrington」および「TR306」の間において、１塩基の多型が見られ、この１塩基多型は制限酵素処理によって確認できることがわかった。このことから、ABG314は、STSマーカーとして利用可能であると考えられる。
【００４７】
次いで、上記STSプライマーを用いて、種々のオオムギ品種のゲノムＤＮＡを鋳型として、ABG314の多型を調べた。その結果、オオムギの１６品種から多型が得られた。なお、ABG314は４ｋｂｐ程度の配列であったため、ABG314の多型の塩基配列は、上記STSプライマーより２０〜３０塩基対から約９００塩基対程度まで特定できた。これら塩基配列を配列番号１〜１８に示す。
【００４８】
具体的には、配列番号１に示される塩基配列は、後述する実施例の図２２に示す、ＯＵ番号（岡山大学 資源生物科学研究所 大麦・野性植物資源研究センターの整理番号）がＢ６０８、品種名「Media」におけるABG314多型であり、６７８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。同様に、配列番号２に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＢ６２３、品種名「Algiers」におけるABG314多型であり、７６７塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号３に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＢ００９、品種名「Poda」におけるABG314多型であり、６７８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号４に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＢ７２０、品種名「Hatial」におけるABG314多型であり、８１１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号５に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＴ０５７、品種名「Turkey169」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号６に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＵ０４０、品種名「Bohemia Nackt」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号７に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＫ７５８、品種名「論山裸1-6」におけるABG314多型であり、９１４塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号８に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ５３３、品種名「北陸皮16号」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号９に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ１４９、品種名「坊主裸」におけるABG314多型であり、９０１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１０に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ２３９、品種名「鉱毒不知」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１１に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ４０６、品種名「ユウナギハダカ」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１２に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＫ１４４、品種名「春川ユンモボリ」におけるABG314多型であり、８９１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１３に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ４８１、品種名「愛知裸16号」におけるABG314多型であり、９１９塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１４に示される塩基配列は、図２２に示す、ＯＵ番号がＪ４１５、品種名「広島在来」におけるABG314多型であり、９０７塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１５に示される塩基配列は、図２２に示す、品種名「TR306」におけるABG314多型であり、６７８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１６に示される塩基配列は、図２２に示す、品種名「Harrington」におけるABG314多型であり、６７８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。なお、以上の塩基配列は、Ｌプライマー（配列番号３３、図３参照）から読まれた塩基配列である。
【００４９】
また、配列番号１７に示される塩基配列は、図２２に示す、品種名「TR306」におけるABG314多型であり、Ｒプライマー（配列番号３４、図３参照）から読まれた５８１塩基対からなるＤＮＡマーカーである。また、配列番号１８に示される塩基配列は、図２２に示す、品種名「Harrington」におけるABG314多型であり、Ｒプライマー（配列番号３４、図３参照）から読まれた５５８塩基対からなるＤＮＡマーカーである。
【００５０】
上記ABG314の多型について図２４にまとめて示す。図２４に示す表の横の数字は、配列番号１〜１６に示される塩基配列における塩基数を示す。すなわち、上記ABG314は、図２４に示すように、１１、３４、３７４、３８８、４１８、４９３、５５０、６０６、６１７、６１９、７２３、８０７、８０８、８６４番目の塩基に多型を有することがわかった。
【００５１】
以上のことから、上記ABG314多型は、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部におけるＤＮＡマーカーとして利用できることがわかった。したがって、上記ABG314多型は、作物育種におけるマーカー選抜を可能にするばかりでなく、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における連鎖地図作製にも利用可能であり、当該地図情報を利用した遺伝子単離にも利用可能である。
【００５２】
（１−２）ＤＮＡマーカー：ABC718
ABC718は、配列番号４５、４６の塩基配列に示されるSTSプライマーによって増幅されるDNA配列の多型であって，配列番号１９〜２２のいずれか１つに示される塩基配列を含む、５H染色体長腕末端部に位置すると考えられる深播耐性、ストレス耐性、または休眠性の遺伝子またはＱＴＬと連鎖するＤＮＡマーカーである。
【００５３】
配列番号１９〜２２は、後述する実施例に示すように、配列番号４５、４６に示される塩基配列からなるSTSプライマーを用いて、オオムギ品種「Harrington」、「TR306」、または「Steptoe」のゲノムＤＮＡを鋳型として得られたものである。
【００５４】
すなわち、配列番号１９に示される塩基配列は、オオムギ品種「TR306」におけるABC718であり、約２．２ｋｂｐからなる塩基配列である。また、配列番号２０に示される塩基配列は、オオムギ品種「Harrington」におけるABC718であり、約２．２ｋｂｐからなる塩基配列である。これらの配列は、プライマー（配列番号４５、４６）の塩基配列を含むものであり、Ｌプライマー（配列番号４５）からＲプライマー（配列番号４６）の方向で示してある。
【００５５】
また、配列番号２１に示される塩基配列は、オオムギ品種「Steptoe」におけるABC718であり、約３００ｂｐからなる塩基配列である。また、配列番号２２に示される塩基配列は、上記配列番号２１の塩基配列をもとに相同性検索により検出したＥＳＴにおけるABC718であり、約８００ｂｐからなる塩基配列である。また、上記ABC718は、深播き時の第１節間長のＱＴＬと組換え価０％を示す。
【００５６】
上記のことから、ABC718は、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部におけるＤＮＡマーカーとして利用できる。したがって、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における詳細な連鎖地図の作製に役立つとともに、深播耐性、ストレス耐性の強い系統の選抜、作出等に利用可能と考えられる。
【００５７】
また、本発明に係る遺伝マーカーの一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝マーカーの一部配列をチップやシリコン等の担体上に固定した、いわゆるＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００５８】
また、上記プローブの配列を、本発明に係る遺伝マーカーの塩基配列の中から選択し、コムギ、イネ、その他の植物のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記各遺伝マーカーと同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝マーカーを単離できる可能性が高い。
【００５９】
したがって、上記遺伝マーカーを利用すれば、オオムギだけでなく、他の植物、例えば、コムギ、イネ等の深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関する遺伝子をも、ＱＴＬ解析によって単離・同定することが可能となると考えられる。
【００６０】
なお、本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法は、上記の方法や後述する実施例で詳細に説明するように、オオムギの葉から抽出されたＤＮＡとＳＴＳプライマーとを用いたＰＣＲを行い作製している。もちろん、本発明にかかる遺伝マーカーの作製方法は、これに限定されるものではなく、公知の他の方法を用いて作製してもよい。すなわち、本発明では、前述した遺伝マーカー（ＳＮＰマーカー）やこれを含む遺伝マーカー群を作製できるような方法であれば、どのような方法を採用してもよい。
【００６１】
（２）本発明に係る連鎖地図
本発明に係る連鎖地図は、従来から知られている遺伝マーカーに加えて、さらに、上記いずれかの遺伝マーカーを用いて作製されているオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における連鎖地図であればよく、その他の遺伝マーカーを含んでいてもよく、特に限定されるものではない。ここでいう「従来から知られている遺伝マーカー」とは、例えば、図１６（ａ）、図１７、図１８に示すような、ABG463、ABG057B、ABC309、またはMWG632等が挙げられる。本発明に係る連鎖地図は、これらの従来公知の遺伝マーカーを全て含んでいることが好ましいが、これに限られるわけではなく、本発明の遺伝マーカーと併せて連鎖地図を作製することによって、より正確な連鎖地図が作製できる程度の従来の遺伝マーカーが用いられていればよい。例えば、上記従来の遺伝マーカーのうち、いずれか１つの遺伝マーカーを含んでいれば、より正確な連鎖地図が作製できる場合は、従来の遺伝マーカーは１つでよい。本発明にかかる連鎖地図に含まれる従来の遺伝マーカーとしては、特にABC309、MWG632が好ましい。
【００６２】
また、後述する実施例に示すように、上記ABG314、ABC718は、いずれも５H染色体長腕末端部に位置することがわかった。この事実に基づき、オオムギ５H染色体長腕末端部における連鎖地図を作製した。図１６（ａ）は、従来知られていた５H染色体長腕末端部の連鎖地図である。図１６（ｂ）は、本発明で作製された５H染色体長腕末端部の連鎖地図である。図１６（ｂ）に示される連鎖地図には、上記ABG314、ABC718が加えられており、従来の連鎖地図と比較して、信頼性が高まり、より正確な連鎖地図となっている。
【００６３】
図１６（ｂ）に示すように、ABG314は、ABG057BとABC309との間であって、ABG057Bから４．３ｃＭ、ABC309から１．６ｃＭ離れた位置に座乗している。また、HVM6は、MWG632の下（末端部）側、８．７ｃＭの位置に座乗している。さらに、ABC718は、MWG632とHVM6との間であって、MWG632から０．７ｃＭ、HVM6から８．０ｃＭ離れた位置に座乗している。
【００６４】
上述したように、本発明に係る連鎖地図は、従来の連鎖地図に新たなＤＮＡマーカーを追加することになるため、従来の連鎖地図よりも信頼性が高まる。このため、本発明の連鎖地図を用いることにより、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部において、深播耐性、ストレス耐性、または休眠性の遺伝子またはＱＴＬについて、より精度の高いＱＴＬ解析を行うことができる。
【００６５】
なお、本発明にかかる連鎖地図の作製方法には、従来公知の方法が利用でき、特に限定されるものではない。例えば、計算ソフトを使った通常の方法が挙げられる（LANDER, E., P. GREEN, J. ABRAHAMSON, A. BARLOW, M. DALY et al., 1987 Mapmaker: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics 1: 174-181.、またはLINCOLN, S., M. DALY and E. LANDER, 1993 Constructing genetic linkage maps with Mapmaker/Exp 3.0. Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report. 3rd ed, Cambridge, MA, USA.等）。
【００６６】
また、本発明でいう「連鎖地図」とは、いわゆる遺伝子地図、遺伝地図、染色体地図とよばれるものをも含むものである。
【００６７】
（３）本発明に係る遺伝子等の単離方法、ＱＴＬ解析方法
本発明にかかる遺伝マーカーの用途としては、遺伝子のクローニングや細胞融合、交配等の実験において目的とする遺伝子の所在を追跡するためのマーカーとして広く用いることができる。特に、本発明にかかる遺伝マーカーのうち、塩基配列中にＳＮＰ（１塩基多型）を含んでいるものは、検出が容易であるという利点がある。
【００６８】
また、本発明にかかる遺伝マーカーを用いる対象となる生物は特に限定されるものではないが、これら遺伝マーカーがオオムギ由来のものであるので、特に好ましい対象としては、オオムギおよびオオムギの属するコムギ連、イネ科植物を挙げることができる。もちろん、用途によってはイネ科植物以外の植物や場合によっては動物も対象とすることができる。
【００６９】
本発明にかかる遺伝マーカーは、それぞれ単独で上述した各種用途に用いることもできるが、特に、オオムギ染色体の遺伝子地図の作成に用いるために、複数を組み合わせて遺伝マーカー群として用いることが好ましい。本発明にかかる遺伝マーカー群をマッピングして得られた遺伝子地図は、染色体から目的とする遺伝子を特定する用途に好適に用いることができるが、本発明では、特に、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬの座乗位置を特定する用途に好適に用いることができる。さらには、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬを単離・同定することも可能となる。なお、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬの座乗位置を特定するための方法、または上記遺伝子等を単離・同定するための方法として、ＱＴＬ解析を挙げることができる。
【００７０】
また、本発明に係るＱＴＬ解析方法は、上記いずれかの遺伝マーカー、あるいは上記の連鎖地図を用いて、オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関連する遺伝子またはＱＴＬについてのＱＴＬ解析を行う方法であればよく、その他の条件、方法等は、従来公知のＱＴＬ解析方法を用いることができ、特に限定されるものではない。
【００７１】
ＱＴＬ解析の原理は、雑種集団の各個体をマーカーの遺伝子型グループに分類し、それらの平均値を比較することから始まる。マーカーと解析対象形質に関与するＱＴＬの一つとが連鎖していれば、遺伝子型グループの平均値間に偏りが生じる。連鎖していなければ、それらの間に偏りはない。これを発展させ、マーカーの存在しないマーカー間に対応させた解析が、インターバルマッピング法によるＱＴＬ解析である。解析対象の生物種の染色体全体に分散するマーカーを用いてこの解析を繰り返すと、解析対象形質に関与する染色体領域が明らかになる。
【００７２】
また、ＱＴＬ解析で重要な項目の中に、交配親として解析対象の形質について大きな差異、すなわち遺伝的に異なる品種の選抜が重要となる。それにより、形質に関与するＱＴＬ中の主要なものが検出されると期待できる。
【００７３】
すなわち、「ＱＴＬ解析」とはＱＴＬのマッピングであればよい。さらに，マップされたQTLを単離する具体的な方法として、例えば、以下の方法が挙げられる。まず、２品種の親個体を交配させ、実験材料として多数の系統群の作出を行う。次に、目的とする形質を指標にこの系統群のゲノムを解析し、目的遺伝子の近傍に存在すると考えられる遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）を統計的に解析し、見つけ出す。この遺伝マーカーを用いて連鎖地図を作製し、それぞれの遺伝マーカーを指標としながら片方の親で戻し交雑を繰り返して、目的遺伝子の周辺のみがもう片方の親由来である個体を作製する。ここで得られた個体は、準同質遺伝子系統と呼ばれ、この準同質遺伝子系統を利用して、目的遺伝子の染色体上の位置を絞り込んでいくことで、目的の遺伝子を単離する。
【００７４】
本発明に係るＱＴＬ解析方法によれば、上記遺伝マーカーまたは上記の連鎖地図を利用しているため、オオムギの「深播耐性」に関する遺伝子についてのＱＴＬ解析を行った結果、後述する実施例に示すように、ＱＴＬの位置の正確性と信頼性とを高めることができる。したがって、本発明のＱＴＬ解析によって、オオムギの深播耐性、休眠性、またはストレス耐性に関する遺伝子またはＱＴＬの位置をより正確に特定することができる。
【００７５】
（４）本発明に係る植物選抜方法、植物生産方法
本発明に係る植物選抜方法は、上記いずれかの遺伝マーカーを指標として、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を選抜する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。
【００７６】
本発明に係る植物選抜方法の具体的方法としては、植物育種における従来公知の手法が利用でき、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、交配等により作出した植物のゲノムＤＮＡを抽出し、本発明に係る遺伝マーカーを有するか否かを指標として植物を選抜する方法が挙げられる。なお、上記遺伝マーカーを検出する手段としては、例えば、上記遺伝マーカーの一部の配列を固定化させたＤＮＡチップを用いる方法、または上記遺伝マーカーの一部の配列をプライマーとするＰＣＲにより上記遺伝マーカーを増幅させる方法等の従来公知の方法が利用でき、特に限定されるものではない。
【００７７】
また、本発明に係る植物生産方法は、上記いずれかの遺伝マーカーを指標として、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を生産する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は、特に限定されるものではない。
【００７８】
本発明に係る植物生産方法の具体的な方法としては、植物育種における従来公知の手法または遺伝子工学的な手法が利用でき、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、上記遺伝マーカーを有する植物を親個体として交配させて上記遺伝マーカーを有する植物個体を生産する方法、または上記遺伝マーカーを含むＤＮＡ領域をベクター等を利用した遺伝子導入等の遺伝子工学的な手法によって、上記遺伝マーカーを有する植物を生産する方法が挙げられる。なお、生産した植物個体が上記遺伝マーカーを有するか否かは、上述のＤＮＡチップやＰＣＲ法を利用して簡便に調べることができる。
【００７９】
なお、ここでいう「植物」には、オオムギ、コムギ、イネ等のイネ科植物が好ましい。
【００８０】
上記のように、本発明の植物選抜方法によれば、非常に簡便かつ高確率で、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を選抜することができる。また、本発明の植物生産方法によれば、非常に簡便かつ高確率で、深播耐性、休眠性、またはストレス耐性を有する植物を生産することができる。
【００８１】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８２】
【実施例】
〔実施例１〕オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部の詳細地図の作製
オオムギのＤＨ系統を用いて深播耐性に関するＱＴＬ解析を行った結果、５Ｈ染色体長腕末端部に作用力の大きなＱＴＬが見出された。ＱＴＬ解析に用いたオオムギ品種「Harrington」と「TR306」のDH系統から得られた連鎖地図によると、５Ｈ染色体長腕末端部のＤＮＡマーカーはABC309およびMWG632であることが報告された（非特許文献６参照）。よって、５Ｈ染色体長腕末端部のABC309〜MWG632近傍とみられるマーカー情報を収集し、ＰＣＲ法で利用可能なマーカーへの開発ならびにマッピング、新規に作成された連鎖地図を用いて深播耐性の解析を行った。
【００８３】
〔１〕ＤＮＡマーカーの開発
〔１−１〕RFLPマーカーのSTS化
（１）材料および方法
供試材料としてオオムギ品種「Harrington」と「TR306」の葉から抽出したＤＮＡを用いた。オオムギ葉からのＤＮＡの抽出法（ＣＴＡＢ法）は以下に示す通りである。
【００８４】
成葉を1cm角程度に刻んだ後、アルミホイルに包んで液体窒素に浸漬し、急速に凍結する。凍結葉サンプルに液体窒素を加え、乳鉢と乳棒で粉砕した。粉砕によって細胞壁を破壊した葉の粉末を、予め60℃に温めておいた15mlのCTABバッファーと３０μｌの2‐メルカプトエタノールの入っているコニカルチューブに移し入れ、ウォーターバスシェーカーで60℃、30分間往復振とうし、ＤＮＡを溶解させた。
【００８５】
バッファー中に溶出したＤＮＡは、ＤＮＡ中のリン酸塩（負電荷）がナトリウムイオンに取り囲まれる形で存在している。細胞からはタンパクも抽出バッファー中に溶出するので、クロロホルム溶液（クロロホルム：イソアミルアルコール=24：1）をCTAB抽出バッファーと等量（15ml）加え、20分〜30分往復振とうした（70rpm、室温）。さらに遠心分離機に移し、4000rpmで15分間遠心分離した後、沈澱を壊さないようにして静かに、上層を新しいコニカルチューブに移し、タンパクを変性させて除去した。
【００８６】
CTAB-RNAもCTAB沈殿の際同時に析出するのでRNaseを15μｌ加え、37℃のウォーターバス中で30分往復振とうして分解した。コニカルチューブを氷水で５〜10分間十分に冷やし、上澄みの0.6倍量のイソプロパノールを加え、コニカルチューブをゆっくり振り、コニカルチューブ内のＤＮＡをパスツールピペットで巻き取りエッペンドルフチューブへ移した。エッペンドルフチューブに、70%エタノール（500〜1000μｌ）を加え、遠心分離機（14000rpm,10分）にかけた。チューブ内のエタノールを捨て、再び70%エタノール（500μｌ）でＤＮＡを洗い、ＤＮＡを乾燥させた。その後、1×TEバッファー（100〜200μｌ）を加えて、ペレットを往復振とう機上で完全に溶かした。
【００８７】
また、ＤＮＡ溶液の濃度測定は、以下の方法で行った。まず、エッペンドルフチューブに1×TE 98mlをとり、抽出したサンプルＤＮＡ原液２mlを加え、よく混ぜる（50倍希釈）。アガロースゲル電気泳動法により測定するサンプルＤＮＡ溶液と標準ＤＮＡサンプル（市販のλ-ＤＮＡ）との電気泳動を135Vで５分程度行う。サンプルをゲルにのせる際には、サンプル溶液に10×ローディングバッファー1/10量（1〜2ml）を加え、十分に混合した。エチジウムブロマイドによって核酸を蛍光染色して、UV波長を励起するトランスイルミネーター上でサイズの確認を行った。アガロースゲルの濃度は1.0 %のゲルを使用した。また、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行い、電気泳動の状態を記録した。サンプルの蛍光の強さとほぼ同じ強さのλ-ＤＮＡサンプルを見出し、その希釈率からサンプルのＤＮＡ濃度を計算した。
【００８８】
PCRプライマーは、「Harrington」と「TR306」、「Steptoe」と「Morex」、「Igri」と「Franka」および「Proctor」と「Nudinka」の交配からなる4種のDH系統において既に連鎖地図にマッピングされているRFLPマーカーからSTS（sequence tagged site）化された塩基配列情報を元に合成した。また、RFLPマーカーの塩基配列情報は公開されているがSTS化されていないものに関しては、塩基配列情報を元に新規にプライマーを設計し合成した。PCRプライマーの設計はPrimer3（http://www-genome.wi.nit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi）を用い、設計条件は▲１▼PCR増幅断片サイズを300塩基、▲２▼プライマーの塩基数を20塩基、▲３▼Tm値を60℃とした（図３参照）。図３に示すように、「Harrington」と「TR306」の連鎖地図において位置が決まっているRFLPマーカー由来のプライマーである、ABC622のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号２３、２４で示される塩基配列を有すし、ABG463のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号２５、２６で示される塩基配列を有し、ABG057のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号２７、２８で示される塩基配列を有し、ABC309のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号２９、３０で示される塩基配列を有し、MWG632のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３１、３２で示される塩基配列を有する。
【００８９】
また、「Harrington」と「TR306」の連鎖地図において位置が決まっていないRFLPマーカー由来のプライマーである、ABG314のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３３、３４で示される塩基配列を有し、CDO213のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３５、３６で示される塩基配列を有し、CDO506のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３７、３８で示される塩基配列を有し、MWG602のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号３９、４０で示される塩基配列を有し、MWG851のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号４１、４２で示される塩基配列を有し、MWG891のＬ側、Ｒ側のプライマーは、それぞれ配列番号４３、４４で示される塩基配列を有する。また、図３には図示しないが、「Harrington」と「TR306」の連鎖地図において位置が決まっていないRFLPマーカー由来のプライマーである、ABC718のSTS化には、配列番号４５、４６に示すプライマーを用いた。
【００９０】
PCR反応液の組成はＤＮＡポリメラーゼ（Ex Taq、タカラ）の添付プロトコールに従い、全量を20μｌに調整し、GeneAmp9700（アプライドバイオシステムズ）によって反応を行った（図４参照）。PCRチューブはサンプルブロックが80℃以上に上昇してからセットした。PCRのプログラムは、プライマーのTm値および目的のPCR増幅断片サイズを考慮していくつか試行し、プライマーごとに最適な条件を設定した（図５参照）。
【００９１】
PCR後の反応液は、アガロースゲル電気泳動法により増幅断片を分画し、エチジウムブロマイドによって核酸を蛍光染色して、UV波長を励起するトランスイルミネーター上で増幅の有無や増幅断片サイズの多型の確認を行った。アガロースゲルの濃度はPCR増幅断片に合わせて変更し、1.0〜1.5 %のゲルを使用した。また、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行い、電気泳動の状態を記録した。
【００９２】
（２）結果および考察
本実験に用いた11プライマー対によるPCRは、再現性よくPCR増幅断片が確認でき、ABG463を除く10プライマー対ではPCR増幅断片が1種（シングルバンド）とみられた。MWG602、MWG632、MWG851、MWG891、CDO213およびCDO506の増幅断片は250〜500 bpで目的の増幅断片サイズとみられたが、ABC309、ABG314、ABC622およびABG057は1 kbより大きなサイズであった。
【００９３】
「Harrington」と「TR306」の連鎖地図の５Ｈ染色体長腕端部にマッピングされているマーカーは、動原体側からABC622〜ABG463〜ABG057〜ABC309〜MWG632の順に配列しており、MWG632が末端部のマーカーとしている（Mather 1995）。他のマーカー情報は、ABG314およびMWG851が「Steptoe」と「Morex」、MWG602およびMWG891が「Igri」と「Franka」、CDO213およびCDO506が「Proctor」と「Nudinka」の連鎖地図において報告されている（Kasha, K.J., Kleinhofs, A and the North American Barley Genome Mapping Project, 1994. Mapping of the barley cross Harrington X TR306. Barley Genetics Newsletter 23:65-69.、Graner, A., Jahoor, A., Schondelmaier, J., Siedler, H., Pillen, K., Fischbeck, G., Wenzel, G and Herrmann. R.G, 1991. Construction of an RFLP map of barley. Theor. Appl. Genet. 83:250-256.、Becker, J and Heun, M, 1995. Mapping of digested and undigested random amplified microsatellite polymorphisms in barley. Genome 38:991-998.）。ちなみに、「Steptoe」と「Morex」および「Igri」と「Franka」の連鎖地図にはRFLPマーカーがそれぞれ400マーカー以上、「Harrington」と「TR306」には250マーカー以上がマッピングされている。「Proctor」と「Nudinka」の連鎖地図には118個のAFLPマーカーとオートムギのcＤＮＡ由来のマーカー（マーカー名にCDOが付く）がマッピングされている。
【００９４】
今回用いたマーカーの中に、共通のRFLPマーカーとして報告されているものはABC309のみであった。
【００９５】
オオムギの５Ｈ染色体長腕末端部のマーカー情報は十分ではないが、PCRに供試した11プライマー対の90 %（10/11）においてPCRが安定しており、次項のシーケンス解析にこれらのPCR増幅断片を用いることとした（図６参照）。
【００９６】
〔１−２〕STS化によるシーケンス多型の解析
（１）材料および方法
供試材料としてオオムギ品種「Harrington」と「TR306」の葉より抽出したＤＮＡを用いた。
【００９７】
シーケンス解析には、RFLPマーカーのSTS化されたABC622、ABG057、ABC309、MWG632、ABG314、MWG851、MWG602、MWG891、CDO213およびCDO506のプライマー対を用いた。
【００９８】
「Harrington」と「TR306」のＤＮＡを鋳型にABC622、ABG057、ABC309、MWG632、ABG314、MWG851、MWG602、MWG891、CDO213およびCDO506のプライマー対のPCRを行い、反応液中の増幅されたＤＮＡ以外の酵素および未反応のプライマーとdNTPはQIAquick PCR Purification Kit（キアゲン）によって除去し、シーケンス反応の鋳型ＤＮＡとして供試した。
【００９９】
シーケンス反応はBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0（アプライドバイオシステムズ）を用い、添付プロトコールに従い反応液の調整、反応プログラム、精製を行った。反応液は、反応試薬希釈バッファー（5X Sequencing Buffer、アプライドバイオシステムズ）を加えて全量を10μｌとし、GeneAmp9700（アプライドバイオシステムズ）のサンプルブロックが96℃に上昇してからPCRチューブをセットした。シーケンス反応液の精製はエタノール沈殿法によって行い、エタノールなどの廃液はマイクロピペットで丁寧に吸い取り、濃縮遠心機によってエタノールの除去および反応サンプルの乾燥を行った。シーケンス用サンプルは電気泳動の直前にシーケンス用ローディングバッファで溶解し、ヒートブロックを用いて100℃で2分の熱処理をし、直ちに氷水に移し、シーケンス用サンプルを1本鎖にした。
【０１００】
シーケンス解析には373A ＤＮＡ Sequencer（アプライドバイオシステムズ）を利用した。サンプルはシーケンスゲルに3.5〜4.0μｌを分注し、電気泳動は40 W（2.8 KV）で16時間行った。
【０１０１】
電気泳動のGelFileからSequencing Analysis 3.4（アプライドバイオシステムズ）により各サンプルの波形データとして抽出し、SeqEd（アプライドバイオシステムズ）によりベースコールの修正およびテキストファイルへの変換を行った。「Harrington」と「TR306」の間の塩基配列の違いと制限酵素認識配列の検察にはGENETYX-MAC Ver.11.0を用いた。
【０１０２】
（２）結果および考察
今回用いた10プライマー対によるSTSのシーケンス多型の解析は全てのPCR増幅断片において可能であった。MWG602、MWG632、MWG851、MWG891、CDO213およびCDO506の増幅断片サイズが250〜500 bpであったことから、増幅断片のプライマー対間の全ての塩基配列を確認することができた。しかしながら、ABC309、ABG314、ABC622およびABG057は断片サイズが1 kbより大きいため、プライマーから20〜30塩基目から500塩基程度の塩基配列を確認し、多型の検索を行った。1塩基多型などの検出には正確な塩基配列情報が不可欠であり、シーケンス解析に用いるハード面とソフト面の特性を考慮して可能な限りプライマー対によるデータを用いるように配慮した。その結果、MWG851、CDO506、ABG314およびABC622において1塩基の多型がみられた。さらにMWG851、CDO506およびABG314の多型においては、Nhe I、Pmac IおよびAfa Iによる制限酵素認識部位であった。ABC622に関しては、多型配列がPCRプライマーの3'末になるよう新規にプライマーを設計し、アレルスペーシフィック（allele specific）PCR法により多型を検出することにした。
【０１０３】
既知の「Harrington」と「TR306」の連鎖地図には、ABC622とCDO506はマッピングされているが、MWG851とABG314は報告されていない。共通のRFLPマーカーであるABC309からMWG851およびABG314の位置を他の連鎖地図から予想すると、「Steptoe」と「Morex」の連鎖地図からABC309より末端部とみられた。しかしながら、ABG314は複数の連鎖地図を重ね合わせて作成したコンセンサス地図によるとABC309より動原体側に位置することが報告されていることから、三点実験によって位置を決める必要が示唆された。
【０１０４】
オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のマーカー情報から作成したSTSのシーケンス多型の解析を行ったところ、供試した10プライマー対のうち4プライマー対において1塩基の多型が確認されたことから、次項でこれら多型の確認を試みる（図７）。
【０１０５】
〔１−３〕多型の確認
（１）材料および方法
多型の確認には、ABC622、CDO506、ABG314およびMWG851のプライマー対を用いた（表2）。ABC622に関しては、ABC622のプライマー対と多型配列がPCRプライマーの3'末になるように設計した新規のプライマーを用いた（図８参照）。
【０１０６】
まずCDO506、ABG314およびMWG851は最適条件下のプログラムでPCRを行った（図５参照）。PCR反応液の組成はＤＮＡポリメラーゼ（Ex Taq、タカラ）の添付プロトコールに従い、全量を20μｌに調整し、GeneAmp9700（ABI）によって反応を行った。ＤＮＡは、オオムギ品種「Harrington」と「TR306」を用いた。PCRチューブはサンプルブロックが80℃以上に上昇してからセットした。次に、得られたPCR産物と制限酵素を加えて反応液を調整し（図９参照）、ヒートブロックを用いて1時間・37℃の条件で処理した。
【０１０７】
ABC622のアレルスペーシフィックPCR法によるPCRプログラムは、目的の対立遺伝子に対し特異的に増幅するようにタッチダウンPCRとした（図１０参照）。タッチダウンPCRとは、熱変性、アニール、および伸長を繰り返し行う反応プログラム中のアニールの温度を、繰り返しの回数毎に変更するPCRプログラムを呼び、反応液中のプライマーのTm値が異なる場合に有効とされる。しかし、繰り返し回数が多くなることから、目的以外のPCR産物の増幅も予測される。
【０１０８】
各反応後、アガロースゲル電気泳動法により断片を分画した。次に、エチジウムブロマイドによって核酸を蛍光染色して、UV波長を励起するトランスイルミネーター上で、制限酵素処理した増幅断片ＤＮＡが消化されたか否や、消化されたPCR産物のバンドサイズの多型の確認を行った。また、新規のABC622プライマーによるPCR増幅の有無や増幅断片サイズの多型の確認も行った。ゲルは1.5％ アガロースを使用した。また、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行って電気泳動の状態を記録した。
【０１０９】
マイクロサテライトマーカー（HVM6）のPCRは、プライマーのTm値および目的のPCR増幅断片サイズを考慮して設定した（図１１参照）。なお、当該Ｌ側、Ｒ側のプライマーの塩基配列は、それぞれ配列番号４７、４８に示す。PCR反応後に５％メタフォアゲルで電気泳動し、増幅断片サイズの多型の確認を行った。また、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行い、電気泳動の状態を記録した。
【０１１０】
（２）結果および考察
MWG851のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Nhe Iで処理すると、「Harrington」では処理前の約300 bpの断片がみられ、「TR306」では推定通りの約150 bpずつの断片となった（不図示）。すなわち、制限酵素処理により多型の確認が可能となった。
【０１１１】
また、ABG314のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Afa Iで処理すると、「Harrington」では約1,500 bpの断片がみられ、「TR306」では1,600 bpの断片が確認された（図１２、１３参照）。
【０１１２】
CDO506のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Pmac Iで処理しても、「Harrington」と「TR306」のいずれも制限酵素で消化されなかった。これは、塩基配列の解析において間違いが含まれていたためとみられる。
【０１１３】
ABG057のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Mva I, Afa Iで処理すると、「Harrington」と「TR306」のいずれも制限酵素で消化された。しかし「Harrington 」と「TR306」の断片を比較すると、多型は検出されなかった。
【０１１４】
MWG602のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Mva Iで処理すると、「Harrington」と「TR306」のいずれも制限酵素で消化され、250 bpのPCR産物が180 bpの断片になった。しかし、これも「Harrington」と「TR306」において多型の検出がされなかった。
【０１１５】
ABC309のSTSプライマーによるPCR増幅断片を制限酵素 Mbo IIで処理すると、「Harrington」と「TR306」のいずれも制限酵素で消化され、1 kbのPCR産物が3つの断片に切断された。ABC309はPCR産物が大きいため、全ての塩基配列が解析されていない。よって、今回検出した多型部分の他に、Mbo II酵素認識部位が存在し、そのため1 kbのPCR産物が3個の断片に切断されたとみられる。ABC309においても「Harrington」と「TR306」の多型の検出がされなかった。
【０１１６】
ABG057とMWG602およびABC309は、各制限酵素で消化されているため制限酵素部位はあると考えられる。しかし、「Harrington 」と「TR306」において多型が検出されない。これらは今後、別の検出法を用いることにより多型の検出の可能性を検討する必要がある。
【０１１７】
ABC622は、3種のプライマーによってアレルスペーシッフィックPCRを行った。しかしながらABC622のアレルスペーシッフィックPCRは目的の対立遺伝子を増幅させず、非特異的なPCR増幅断片を複数増幅させた（不図示）。
【０１１８】
HVM6のSTSプライマーによるPCR増幅断片は、「Harrington」と「TR306」において多型が検出された（図１４参照）。
【０１１９】
以上STSマーカーの作成についてまとめると、HVM6は「Harrington」と「TR306」間でPCR産物に多型がみられた。また、MWG851とABG314は制限酵素処理を行う事によって多型が確認された。
【０１２０】
オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のマーカー情報から作成したSTSのシーケンス多型の解析から、4プライマー対において多型が確認された。よって、MWG851、ABG314、HVM6およびABC622はSTSマーカーとして利用が可能となった。
【０１２１】
次節で、二条型の「Harrington」と「TR306」の交配（H/T）による倍加半数体94系統を用いて、新規に開発したSTSマーカーであるMWG851およびABG314ならびにマイクロサテライトマーカーであるHVM6のマッピングを試みることにする。
【０１２２】
〔２〕ＤＮＡマーカーのマッピング
（１）材料および方法
オオムギ品種「Harrington」と「TR306」のDH94系統をマッピング集団とした。これらのＤＮＡと第１章・第１節で開発したSTSマーカー（MWG851、ABG314、ABC718およびHVM6）を用いてPCRを行い、MWG851、ABG314についてはさらに酵素処理を行った後、電気泳動を行った（各条件と方法は第１節を参照）。泳動後は増幅断片サイズの多型の確認を行い、トランスイルミネーターに付属のCCDカメラによって写真撮影を行って電気泳動の様子を記録した。
【０１２３】
次いでDH94系統における各STSマーカーの遺伝子型を調査し、MAPMAKERを使用して各STSマーカーの連鎖地図を作成した。
【０１２４】
（２）結果および考察
DH94系統における各STSマーカーを用いて多型を検出した結果（図１３、１４参照）それらより推定した遺伝子型を図１５に示した。その結果ABG314、ABC718、およびHVM6は、５Ｈ染色体の長腕末端部にマッピングされた。Mather(1995)（非特許文献６）の連鎖地図によると、ABC309およびMWG632が５Ｈ染色体の長腕末端部のＤＮＡマーカーであると報告されている（図１６（ａ）参照）。今回の実験でABG314は、ABG057とABC309の間に座乗し、HVM6はMWG632の下に座乗した。また、ABC718は、MWG632とHVM6との間に座乗した（図１６（ｂ）、図１８参照）。
【０１２５】
すなわち、今回の実験により作製された連鎖地図によれば、ABG463-ABG057B間の距離は２．６ｃＭ、ABG057B-ABG314間の距離は４．３ｃＭ、ABG314-ABC309間の距離は１．６ｃＭ、ABC309-MWG632間の距離は２．４ｃＭ、MWG632-ABC718間の距離は０．７ｃＭ、ABC718-HVM6間の距離は８．０ｃＭである。
【０１２６】
深播耐性のＱＴＬがこの長腕末端部（MWG632）付近にあると推測される。よって、新たにマッピングされたこのマーカーの地図を使用し、ＱＴＬ解析を行うこととする。
【０１２７】
MWG851は７Ｈ染色体の短腕末端部にマッピングされた。MWG851は目的の５Ｈ染色体には座乗しなかった。しかし７H染色体の短腕末端部には深播耐性に関連のある第１節間長のＱＴＬがある。よってMWG851のRFLPマーカーをSTS化された事によって、第１節間長の遺伝子を解明する手がかりとなるものである。
【０１２８】
〔３〕深播耐性のＱＴＬ解析
（１）材料および方法
「Harrington」と「TR306」のDH94系統の深播耐性の検定結果データ（非特許文献３）を用いた。この検定では発芽した種子だけを深さ12cmに播種し、出芽数を数えて播種粒数に対する出芽率が深播耐性の強弱であると示している。
【０１２９】
連鎖地図上に平均マーカー距離5cMの効率良く配置された127（H/T）のマーカー（非特許文献６）に新しくマッピングしたABG314とHVM6を加え、改めてＱＴＬ解析を行った。ＱＴＬ解析には、MAPMAKER/QTLを用いてインターバルマッピングを行った。LODスコア2.0以上を有意なQTLとした。
【０１３０】
あわせて、DH系統をSTSマーカー毎に得られた遺伝子型データに基づきグループ化し、グループ間の平均値の有意差検定（ｔ検定）を行った。ここでは特定の染色体（連鎖地図）領域で最も各グループの対象形質の平均値に有意差が認められたマーカーの近傍が、推定上のQTLの存在領域であるとして分析した。
【０１３１】
（２）結果および考察
HVM6が５Ｈ染色体長腕の最末端にマッピングした結果が図12である。ここで深播耐性のQTLの位置はこれまでの報告（図１７）と異なった位置が推定された（図１８参照）。これまでの報告では「Harrington」と「TR306」の連鎖地図によると、５Ｈ染色体長腕末端部のＤＮＡマーカーはABC309およびMWG632であると報告されていた（非特許文献６）。この地図を用いたＱＴＬ解析の結果、深播耐性のQTLはMWG632の位置もしくはより末端部に位置するものとみられた。本研究において、HVM6が５Ｈ染色体長腕の最末端にマッピングされた結果、深播耐性のＱＴＬ解析におけるLOD曲線に谷を作り、スコアの比較をした（図１９）。既知のABC309-MWG632間の比較では、距離が2.7cMあるうちの約8割の位置にQTLがある。つまりABC309-MWG632間の比較では、QTLがMWG632に近い場所にあると示される。しかし新規のMWG632- HVM6間の比較では距離が6.8cMあるうちの約2割の位置にQTLが見出された。つまり、QTLがMWG632とHVM6の間にあり、かつMWG632の近くに存在することを示している。また、LODスコアが13.5から14.4に、ｒ2（寄与率）が約35％から38％になった。このQTLを持つことで深播耐性を約17％高めた。逆にこのQTLがないと、17％下げると言える。新たにマーカーを追加したことで、QTLの位置の正確性と信頼性を増加させた。
【０１３２】
本実験の結果から、ＱＴＬ解析を行う上では、染色体の全域をカバーするようなＤＮＡマーカーの必要性が示唆される。特に、染色体末端のマーカーにQTLがマッピングされる時は、ピークを明らかにできるようなマーカーを作る必要がある。HVM6マーカーをベースマップに加えたことで、QTLの山と谷を作り、よって正確なマーカーがより正確なQTLの位置を導くと推察された。
【０１３３】
また、系統をＤＮＡマーカー毎に得られた遺伝子型データに基づきグループ化し、グループ間の平均値の有意差検定（ｔ検定）を行った結果（図２０）、ABG314およびHVM6は、５Ｈ染色体上にあること、MWG851が異なる染色体上にあることが示され、上記の結果とよく類似した。各マーカーにおける深播耐性について強弱系統の遺伝子型を比較した結果（図２１）、深播耐性の強いDH系統のMWG632とHVM6の遺伝子型はTR306型、弱いDH系統の遺伝子型はHarrington型であった。ABG314、ABC309、MWG632およびHVM6のマーカーのうちMWG632が最も深播耐性に関連しているマーカーとみられ、インターバルマッピングの結果と同様であった。
【０１３４】
今後、MWG632とHVM6の間で、新たなマーカーを開発することにより、深播耐性系統を育成する際の助けとなるものである。さらに５Ｈ染色体末端部には多種のストレス耐性のQTLが報告されていることから、今後ムギ類にストレス耐性を付与したり、強い品種を選抜するための良き手がかりになると思われる。
【０１３５】
〔実施例２〕深播耐性の地理的分化
（１）材料および方法
オオムギの深播耐性の極強品種と極弱品種計14品種から抽出したＤＮＡを供試した（図２２）。
【０１３６】
シーケンスには、STS化されたABG314のプライマー対を用いた。
【０１３７】
極強・極弱品種のＤＮＡを鋳型にABG314のプライマー対のPCRを行い、反応液中の増幅されたＤＮＡ以外の酵素および未反応のプライマーとdNTPはQIAquick PCR Purification Kit（キアゲン）によって除去し、シーケンス反応の鋳型ＤＮＡとして供試した（図２３）。
【０１３８】
シーケンス反応ならびに解析は、第1章 第2項の方法に従った。
【０１３９】
電気泳動のGelFileからSequencing Analysis 3.4（アプライドバイオシステムズ）により各サンプルの波形データとして抽出し、SeqEd（アプライドバイオシステムズ）によりベースコールの修正およびテキストファイルへの変換を行った。極強・極弱品種の間の塩基配列の違いの検察にはGENETYX-MAC Ver.11.0を用いた。表の作成は、Tanno(2002)（Tanno, K., Taketa, S., Takeda, K., Komatsuda, T, 2002. A ＤＮＡ marker closely linked to the vrs1 locus (row-type gene) indicates multiple origins of six-rowed cultivated barley (Hordeum vulgare L.) Theor Appl Genet 104:54-60）を参考に行った。
【０１４０】
（２）結果および考察
今回用いたABG314は断片サイズが1 kbより大きいため、プライマーより20〜30塩基目から500塩基程度の塩基配列を確認できた。各品種の塩基配列の結果を図２４に示した。
【０１４１】
５Ｈ染色体長腕末端部に座上したABG314マーカーを用いて、深播耐性が極強・極弱と評価されている計14品種の塩基配列を比較すると、12ヵ所に1塩基多型が検出され、供試品種の地域間に共通する塩基配列がいくつか認められた。
【０１４２】
深播き耐性に強い品種は、北アフリカ・ネパール・トルコ・日本が知られている。弱い品種では、ドイツ・朝鮮半島・日本が知られている。14品種の塩基配列を比較したところ、直接深播耐性との関係が示されなかったが、地域による違いがみられた。374番目塩基から、北アフリカとその他の地域に分類でき、その他の地域においては、418番目の塩基に違いのあるトルコと388番目の塩基の違うドイツとに分類された。ABG314の塩基比較の結果、北アフリカのグループ、トルコのグループ、ドイツのグループ、ネパールや日本や朝鮮半島のグループに分類でき、５Ｈ染色体末端部の遺伝子座には地理的な分化があるものと考えられる。
【０１４３】
以上の結果をまとめると、以下のようになる。すなわち、連鎖地図の作成はＤＮＡを利用した多型解析が可能となり、染色体全体をカバーする連鎖地図の作成、さらにＤＮＡマーカーの開発に伴ってその解析能力の向上がみられ、詳細な連鎖地図の作成が可能になった。
【０１４４】
本実験で用いたプライマー対によるPCRは、再現性よくPCR増幅断片が確認でき、PCR増幅断片が1種（シングルバンド）とみられた。これらのプライマー対によるSTSのシーケンス多型の解析から、1塩基の多型が確認できた。さらにMWG851、ABG314の多型においては、Nhe I、およびAfa Iによる制限酵素認識部位であった。ABC622に関しては、多型配列がPCRプライマーの3'末になるよう新規にプライマーを設計した。HVM6のSTSプライマーによるPCR増幅断片は、「Harrington」と「TR306」において多型が検出できた。MWG851、ABG314、ABC622およびHVM6は、STSマーカーとして、今後使用することが可能である。
【０１４５】
次に、大麦品種の「Harrington」と「TR306」のDH系統を使用して、新規に作成したSTSマーカーおよびマイクロサテライトマーカーのマッピングを試みた。ABG314およびHVM6は５Ｈ染色体上に、MWG851は７Ｈ染色体にマッピングされた。
【０１４６】
５Ｈ染色体の連鎖地図上に配置された新たなマーカーであるHVM6とABG314を加え、QTLを再解析した。HVM6が５Ｈ染色体長腕の最末端にマッピングされた結果、深播耐性のピークを決定することができた。QTLがMWG632とHVM6の間にあり、かつMWG632の近くに見出された。非特許文献３のTakahashiら（2001）の報告と近傍のマーカーはMWG632と同様であったが、QTLピークのLODスコアは上昇し、変異の約38％を説明した。このQTLを持つことで深播耐性を約17％高めることが示された。マーカーを追加したことで、よりQTLの位置の正確性と信頼性を増加させることができた。
【０１４７】
一方、Kleinhofsら（1994）（Kleinhofs, A., Kilian, A and the NABGMP, 1994. The NABGMP Steptoe X Morex mapping progress report. BGN 23:79-83.）の連鎖地図によると、MWG632よりも末端部にはABC718がある。ABC718は子葉由来のｃＤＮＡマーカーであることなどから、深播耐性の強い系統の選抜に利用可能とも考えられる。また、子葉鞘長および第１節間のQTLや植物ホルモンに対する反応も深播耐性のQTLとほぼ同座あるいは近傍に位置することが報告されている（非特許文献３）。よって今後、ABC718は作物にストレス耐性を付与したり、強い品種を選抜するための良き手がかりになると思われる。
【０１４８】
ABG314を用いて深播耐性の強い品種と弱い品種の塩基配列を比較したところ、地域間において共通する塩基がいくつか見られた。北アフリカのグループ、トルコのグループ、ドイツのグループ、ネパールや日本や朝鮮半島のグループの４つに分類できた。今回、ABG314座の塩基配列と深播耐性との関係は示されなかった。しかし、オオムギ品種の深播耐性の地理的変異を調べると、北アフリカ、ネパール、エチオピア、トルコおよび西南アジアの品種が強く、中国およびヨーロッパ地域に深播耐性の弱い品種が分布していると報告されている。よって、今回の分類の結果と類似が見られる。このことから、品種数を増やすことによって大麦の系統進化が推測できる可能性があると思われる。
【０１４９】
【発明の効果】
以上のように、本発明の遺伝マーカーによれば、信頼性の高い連鎖地図を作製することができるだけでなく、深播耐性、ストレス耐性、または休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬについて、より精度の高いＱＴＬ解析を行うことができるという効果を奏する。したがって、深播耐性、ストレス耐性、または休眠性に関する遺伝子またはＱＴＬを単離・同定するための非常に有用な手段となるという効果を奏する。
【０１５０】
さらに、上記の遺伝マーカーを指標とすることにより、簡便かつ高効率で、深播耐性、休眠性、ストレス耐性等の諸形質を有する植物を選抜したり、または深播耐性、休眠性、ストレス耐性等の諸形質を有する植物を作出したりできるという効果を奏する。
【０１５１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】主なＤＮＡマーカーの特徴を示す図である。
【図２】オオムギの深播耐性について模式的に説明する図である。
【図３】本実施の一形態におけるオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のSTSプライマーを示す図である。
【図４】本実施の一形態におけるＰＣＲの反応液の組成を示す図である。
【図５】本実施の一形態における、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のSTSプライマーにおけるＰＣＲ条件を示す図である。
【図６】 RFLPマーカーのSTS化を調べた電気泳動の結果を示す図である。
【図７】本実施の一形態における、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部のＤＮＡマーカーの多型検索結果を示す図である。
【図８】本実施の一形態における、ABC622-Rプライマーを用いた「Harrington」と「TR306」との塩基配列を比較した図である。
【図９】図９（ａ）は本実施の一形態における、制限酵素処理に使用する制限酵素名を示す図であり、図９（ｂ）は、酵素処理反応液の組成を示す図である。
【図１０】本実施の一形態におけるタッチダウンＰＣＲのプログラムを示す図である。
【図１１】本実施の一形態における、HVM6（マイクロサテライトマーカー）のPCR条件を示す図である。
【図１２】本実施の一形態の「Harrington」および「TR306」におけるABG314の多型を調べた結果を示す図である。
【図１３】（ａ）（ｂ）は、本実施の一形態の「Harrington」、「TR306」およびそのDH系統におけるABG314の多型を調べた結果を示す図である。
【図１４】本実施の一形態の「Harrington」および「TR306」のDH系統におけるHVM6の多型を調べた結果を示す図である。
【図１５】本実施の一形態の各マーカーにおけるDH94系統の遺伝子型を示す図である。
【図１６】図１６（ａ）は従来（Mather）のオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部の連鎖地図を示す図であり、図１６（ｂ）は本実施の一形態におけるオオムギ５Ｈ染色体長腕末端部の連鎖地図を示す図である。
【図１７】従来（Mather）の連鎖地図を利用したＱＴＬ解析の結果を示す図である。
【図１８】本実施の形態における、新規の連鎖地図を利用したＱＴＬ解析の結果を示す図である。
【図１９】本実施の形態における、各マーカー間の深播耐性の位置とLODスコアの比較を示す図である。
【図２０】本実施の形態における、５Ｈ染色体末端部のマーカーの遺伝子型別による深播耐性（％）を示す図である。
【図２１】深播耐性の強い１０系統と弱い１０系統における各マーカーの遺伝子型を示す図である。
【図２２】供試した深播耐性の極強・極弱品種を示す図である。
【図２３】本実施の形態における、ABG314プライマー対を用いた深播耐性の極強・極弱品種のPCR増幅断片を示す図である。
【図２４】本実施の形態における、ABG314を用いた深播耐性の極強・極弱品種の塩基配列の比較を示す図である。
Claims (4)
- オオムギの深播耐性に関連する量的形質遺伝子座と連鎖する遺伝マーカーであって、
配列番号１〜２２のいずれかに示される塩基配列を有することを特徴とする遺伝マーカー。 - 上記遺伝マーカーは、オオムギ５Ｈ染色体長腕末端部における遺伝マーカーであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝マーカー。
- 上記遺伝マーカーは、ＳＴＳマーカーであることを特徴とする請求項１または２に記載の遺伝マーカー。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを指標として、深播耐性を有するオオムギを選抜する方法。
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