CN105177129B - 芝麻抗枯萎病基因紧密连锁分子标记SiFWR2145 - Google Patents

芝麻抗枯萎病基因紧密连锁分子标记SiFWR2145 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的SNP分子标记SiFWR2145。该标记在芝麻SNP遗传图谱中的位置为111.5~112.7cM，位于第8连锁群，对抗枯萎病病指的解释率为51.66%（Vg/Vp），该标记包含107bp，其序列如SEQ ID No.1所示。与现有芝麻育种方法相比，本发明主要优点有：（1）本发明针对芝麻育种技术进行创新，与目前应用的常规育种技术方法相比，检测方法简单高效，结果可靠；（2）本发明所提供分子标记SiFWR2145，用于分子辅助育种时可以显著提高育种效率，节约科研成本和时间，并为完善芝麻分子育种技术平台奠定坚实基础。

Description

芝麻抗枯萎病基因紧密连锁分子标记SiFWR2145
技术领域
本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的SNP分子标记SiFWR2145。
背景技术
芝麻（Sesamum indicum L.，2n=26），属胡麻科胡麻属，是我国重要的特色优质油料作物。我国是芝麻四大主产国之一，年种植面积1200万亩左右，总产量约75万吨，在国际油料贸易中具有重要的地位。
芝麻枯萎病是芝麻两大主要真菌病害之一，在世界范围内普遍发生。芝麻枯萎病由尖孢镰刀菌芝麻专化型（Fusarium oxysporum f. sp. sesami）侵染引起，主要在芝麻苗期和成株期发生。该病主要发生在我国东北、华北、西北、黄淮以及江淮部分地区，常年发病率在5%～10%，病情严重时达30%以上，常导致芝麻种子不成熟、籽粒瘦瘪，并在收获前炸落，严重影响了芝麻的产量的提高。
已有研究表明，现有芝麻种质资源库中抗枯萎病的芝麻种质资源比例较低，育种过程中缺乏高抗病的优异种质资源，加之芝麻抗枯萎病特性表现复杂，因而世界范围内芝麻抗病育种进展均较为缓慢。例如，EL-Bramawy（2006，Plant Protection Science）在大田环境下利用15个芝麻杂交组合对芝麻枯萎病的抗性进行分析，发现不同的组合对芝麻枯萎病的抗性表现出较大的差异。
为准确评价芝麻种质资源的抗枯萎病特性，近几年来我国先后建立了室内苗期鉴定和人工大田成株鉴定技术体系，并应用于芝麻抗病遗传育种研究（仇存璞等，芝麻枯萎病病原茵致病力室内鉴定方法，2014，植物病理学报）；相应鉴定技术也申请了专利保护（ZL201110412325.7）。
近年来，利用基因遗传工程进行的分子辅助育种在农作物新品种培育工作表现出了较好地应用效果。针对芝麻的种质资源，2011年以来，我国研究人员开展了较为广泛地芝麻种质资源抗枯萎病基因组扫描工作，结合病圃多年多点鉴定结果，在分析连锁不平衡、群体结构和kinship的基础上，运用全基因组关联方法（GWAS）开发出了抗病基因定位和功能性分子标记数十个，这些分子标记对表型变异表现出了不同的解释率，较好地推动了芝麻抗病育种的研究发展。
但是，由于芝麻枯萎病抗性为数量性状，抗病水平易受气温、降雨等环境影响，抗病分子遗传和分子辅助育种研究进展不够明显。因此，当前仍需进一步探索获得新的芝麻抗枯萎病紧密关联的分子标记，从而为加快芝麻抗病遗传基础和抗病育种研究提供技术支撑。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种与芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的SNP分子标记SiFWR2145，同时提供了一种利用PCR技术检测该分子标记的检测方法。
本发明所采取的详细技术方案如下。
一种与芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的分子标记SiFWR2145，该标记在SNP遗传图谱中的位置为111.5~112.7cM，位于第8连锁群，对抗枯萎病病指的解释率为51.66%（Vg/Vp），该标记包含107bp，其序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
AGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAATGCAGCTTTTGCAATTGCTTCTCTTGTGCCTTTTCACATTCTGTTTTTGGGTTTTGCAAGAAGCTCCAATCCCTCCTATTTC。
需要说明的是，上述SNP位点序列中第25个碱基A，当A变为G时，植株抗病性往往发生显著变化，多表现为感病；
换言之，本申请SiFWR2145等位位点序列为：
AGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAGTGCAGCTTTTGCAATTGCTTCTCTTGTGCCTTTTCACATTCTGTTTTTGGGTTTTGCAAGAAGCTCCAATCCCTCCTATTTC。
对于所述分子标记SiFWR2145的检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测芝麻种子资源的基因组DNA；
（2）利用Primer premier 5.0软件设计引物对，引物序列设计如下：
正向引物1 Primer 9-1F序列为：5’ AGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAA 3'；
正向引物2 Primer 9-2F序列为：5' ATACAAGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAG 3'；
反向引物Primer 9-R 序列为：5' GAAATAGGAGGGATTGGAGC 3'；
以步骤（1）中所提取DNA为模板，进行PCR扩增；
需要解释的是，为区分被检测基因组DNA不同SNP等位位点，研究人员通常将SNP引物对设计成3条，在含有SNP位点的2个正向或反向引物中，其中1条引物序列的5’端随机增加5个碱基即可，其主要目的是为了不同位点的PCR产物在后续凝胶电泳图谱区分时能够较为便捷的区分开来；
本申请根据SNP位点设计了上述2个正向引物和1个反向引物，具体如上；在用正向引物1、反向引物进行芝麻基因组DNA扩增时，PCR扩增产物大小为107bp；在用正向引物2、反向引物扩增时，PCR产物大小为112bp；
（3）对步骤（2）中PCR扩增产物进行凝胶电泳，判断待测芝麻种子资源的基因组DNA中是否含有分子标记SiFWR2145，如果含有，则表明待测芝麻种子资源遗传组中应含有与该标记紧密连锁的抗枯萎病基因，可以用于培育新的抗枯萎病芝麻品种，如果不含有该分子标记，则表明待测芝麻种子资源遗传组中可能不含有与该标记紧密连锁的抗枯萎病基因，不适宜用于培育抗芝麻枯萎病新品种。
所述分子标记SiFWR2145在芝麻育种中的应用，采用分子辅助育种方法进行芝麻育种时，含有该分子标记的芝麻材料可以用于培育抗枯萎病芝麻新品种。
总体而言，本发明创新点主要体现在以下几个方面：
（1）本发明通过对抗、感枯萎病芝麻种质资源遗传图谱构建，筛选、提供了一种与芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的SNP标记SiFWR2145，同时提供了一种鉴定种质资源中是否含有该标记位点的PCR鉴定方法，该方法可以较为便捷和快速地初步确定待测芝麻品种的枯萎病抗性水平，为新品种培育提供参考；
（2）本发明所获得的抗枯萎病基因紧密关联标记位点明确，检测结果稳定；由于本发明所提供的标记SiFWR2145筛选时所用的亲本之一是芝麻育种中常用的优异亲本，与我国大部分芝麻品种和现有常用芝麻育种亲本均有直接或间接亲缘关系，因而该标记位点SiFWR2145具有较好地应用基础；
（3）本发明所提供的芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的SNP标记的检测方法，技术成熟，检测结果稳定性好，对提高芝麻抗病育种工作效率、提升我国芝麻遗传育种研究技术水平具有重要意义。
与现有芝麻育种方法相比，本发明优点可以概况为：（1）本发明针对芝麻育种技术进行创新，与目前应用的常规育种技术方法相比，检测方法简单高效，结果可靠；（2）本发明所提供分子标记SiFWR2145，用于芝麻分子辅助育种时可以显著提高育种效率，节约科研成本和时间，并为完善芝麻分子育种技术平台奠定坚实基础。
附图说明
图1为本发明利用F2群体建立的芝麻SNP高密度遗传图谱；
图2为本发明的遗传图谱F2部分群体（含亲本）枯萎病病情指数测定结果；
图3为本发明的SNP标记SiFWR2145在芝麻SNP遗传图谱中的定位结果；
图4为本发明的SNP标记SiFWR2145引物对Primer 9-1F、Primer 9-2F和Primer 9-R在F2群体中的部分PCR扩增结果，泳道1，5~7，10和12为含等位位点2（即SiFWR2145序列中第25个碱基A变为G时序列）的材料（多为感病，DI＞70）；泳道4，8，9和11为含等位位点1（即SiFWR2145序列）的材料（多为抗病，DI＜30）；泳道2和3为中间杂合型材料；M为D，L2000Marker，条带从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步解释说明。介绍具体实施例前，首先对本发明中所用主要芝麻种质资源计品种简要介绍如下。
现有技术中，常用的芝麻品种豫芝11号是我国重要的芝麻育种优异亲本材料，目前我国育成品种中约有40%以上都与之有较近的亲缘关系。因而理论而言，利用与该品系有直接亲缘关系的亲本开展芝麻高抗病新品种选育，将会加速芝麻育种研究进程。
本申请中所采用的芝麻品种豫芝DS899，是由河南省农业科学院芝麻研究中心从豫芝11号经EMS诱变选出的新品系（2015年已进行国家新品种权保护申请，正在进行芝麻新品种区试鉴定），其主要特征为：高抗枯萎病，每叶腋3花，花序有限，单杆，蒴果四棱，白粒。
本申请中所采用的芝麻资源JS012，来自于河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库，主要特征为：高感枯萎病，每叶腋单花，分枝，蒴果四棱，黑粒。
上述种质材料均可从公开渠道获得（或者均可直接从河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库获得）并种植应用。
本申请中对于芝麻枯萎病抗性水平测定及等级划分，参考仇存璞等（芝麻枯萎病病原茵致病力室内鉴定方法，2014，植物病理学报）划分方法，具体划分等级如下表。
本申请中检测芝麻感病时所用病菌枯萎病株HSFO09095，由河南省农业科学院芝麻研究中心从安徽阜阳芝麻病株样品中分离获得，目前保存于河南省农业科学院芝麻研究中心芝麻枯萎病菌株库。
芝麻植株人工感病处理过程如下：选取健康饱满种子，经清水冲洗后，在超净工作台上分别用70%酒精处理30 s和3%次氯酸钠处理15 min，无菌水冲洗3~5次后，于120 r/min、25℃条件下振荡培养24 h催芽。取不同浓度的分生孢子悬浮液与2倍体积的无菌蛭石混合拌匀，然后与无菌土混匀（1：3比例），等份分装于纸钵中。将催芽露白的无菌芝麻种子播种在纸钵中，每钵10粒，于25℃、12 h/天光暗交替培养，相对湿度为80%。以无菌水为阴性对照。4周后即可调查统计各处理病情指数。
实施例1
本实施例主要介绍对于芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的SNP分子标记SiFWR2145的筛选过程，具体如下。
一、芝麻抗、感枯萎病亲本的F2遗传群体构建
2013年7月，利用芝麻高抗枯萎病品系豫芝DS899（DI 6.1%）、高感枯萎病种质JS012（DI 100%）配置杂交组合，获得F1。
2013年11月，将F1种子采用营养钵点播，种植在河南省农业科学院芝麻研究中心三亚基地，2对真叶后，适时移栽各植株，确保株系数量大于200个。
二、F2群体SNP遗传图谱构建及基因定位
（1）F2群体亲本及122个F2单株基因组重测序
从F2群体中随机挑选120个株系，采集120个株系单株和2个亲本单株的幼嫩叶片，参照魏利斌等（2008）中的改良CTAB法提取各植株DNA（芝麻DNA和RNA同步提取方法，2008，分子植物育种），采用Illumina测序方法对122份材料进行基因组重测序，测序覆盖度≥30×。
（2）参考豫芝11基因组数据（Zhang et al.，Genome sequencing of theimportant oilseed crop Sesamum indicum L.，2013，Genome Biology；Miao et al.，Thesesame genome project and genome sequencing. XXII International Plant andAnimal Genome Conference (San Diego, USA). 2014 (Conference posterabstract)），选用BWA（Burrows- Wheeler Aligner）软件将各株系的测序数据进行拼接。
（3）利用Joinmap_linkage map软件构建芝麻F2群体SNP高密度遗传图谱。
所构建遗传连锁图谱如图1所示。
图谱共有13个连锁群，包含3101个Bin区段，12.4万个标记，图谱全长1872.2 cM，平均144.0 cM/连锁群，0.015 cM/标记区间。
（4）采用室内苗期芝麻抗枯萎病特性检测方法（仇存璞等，芝麻枯萎病病原茵致病力室内鉴定方法，2014，植物病理学报）随机测定了F2群体90个株系及2个亲本对高致病力枯萎病菌HSFO09095的抗性（芝麻植株人工感病处理过程参考前述具体实施方式部分内容）。
结果表明，F2代植株对枯萎病菌的病情指数（DI）范围为5~100。病情指数具体分布如图2所示。
（5）结合上述SNP高密度遗传图谱，采用WinQTL cart软件确定了1个与芝麻抗枯萎病性状紧密连锁的主效位点：SiFWR2145，其序列包括107bp，具体序列为：
AGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAATGCAGCTTTTGCAATTGCTTCTCTTGTGCCTTTTCACATTCTGTTTTTGGGTTTTGCAAGAAGCTCCAATCCCTCCTATTTC。
该位点位于第8连锁群，位置为111.5-112.7cM区间，R2值为51.66%，P值＜0.001（结果如图3所示）。
需要说明的是，上述SNP位点序列中第25个碱基A，当A变为G时，即为SNP等位位点，但此时植株抗病性往往发生显著变化，多表现为感病。
实施例2：与芝麻抗枯萎病紧密连锁的分子标记SiFWR2145的验证
本实施例主要介绍对于与芝麻抗枯萎病紧密连锁的分子标记SiFWR2145的验证，即该分子标记的检测方法，包括以下步骤：
（1）2014年7月，在河南省农业科学院芝麻研究中心原阳基地利用芝麻高抗枯萎病品系豫芝DS899（DI 6.1%）、高感枯萎病种质JS012（DI 100%）配置杂交组合，获得F1。
2014年11月，在三亚基地种植F1代种子，单株罩网自交，随后获得F2代种子，群体大于200株。
2015年2月，随机选取50个F2单株的饱满种子，采用室内苗期芝麻抗枯萎病特性检测方法进行F2株系后代苗期枯萎病抗性水平鉴定。选用高致病力枯萎病菌HSFO09095进行接菌侵染，每个株系设定4个重复，每个重复处理10棵植株（芝麻植株人工感病处理过程参考前述具体实施方式部分内容）。
调查结果显示，F2代植株对枯萎病菌的病情指数（DI）范围为5~100。在50个F2后代中，表现为高抗（0≤DI≤15）的植株数为2株；抗病(15＜DI≤30)的为2株；中抗（30＜DI≤55）的为13株；感病（55＜DI≤70）的为14株，高感（70＜DI≤100）的为19株。
（2）设计引物，利用Primer Premier 5.0软件，依据实施例1中分子标记SiFWR2145的序列，设计相应的TPFLD-PCR（三引物荧光定量PCR）引物，具体SNP引物设计方法参照Wei等（Development of SNP and InDel markers via de novo transcriptome assembly inSesamum indicum L.，2014，Molecular Breeding）进行，引物序列设计如下：
正向引物1 Primer 9-1F序列为：5’ AGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAA 3'；
正向引物2 Primer 9-2F序列为：5' ATACAAGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAG 3'；
反向引物Primer 9-R 序列为：5' GAAATAGGAGGGATTGGAGC 3'；
需要说明的是，为区分被检测基因组DNA不同SNP等位位点，同时为了不同位点的PCR产物在后续凝胶电泳图谱区分能够较为便捷的区分开来，正向引物2 Primer 9-2F的5’端前5个碱基为随机增加。
上述SNP引物由华大基因公司合成。
（3）利用上述SNP标记引物对对上述F2群体的50个单株个体进行检测，从而评价SNP标记的可靠性。
需要解释的是，在用步骤（2）中所设计引物进行芝麻材料基因组DNA扩增时，以正向引物1和反向引物扩增的PCR产物大小为107bp；以正向引物2和反向引物扩增的PCR产物大小为112bp。
PCR扩增时以F2群体50个单株和2个亲本个体所提取DNA为模板，DNA提取采用CTAB法提取。
PCR反应采用10 µL反应体系，设置如下：
模板DNA (50ng/µL)，1.0µL；
10×PCR Buffer (Mg2+)，1.0µL；
Taqase酶 (5U/µL)，0.2µL；
dNTP (10mmol/L)，0.2µL；
Forward Primer 1 (10µM)，0.5µL；
Forward specific Primer 2 (10µM)，0.5µL；
Reverse Primer (10µM)，1.0µL；
加入超纯水5.6µL。
上述相关试剂均购自于上海生工试剂公司。
PCR反应在PTC-100 (MJ research公司产品)热循环仪上进行，反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30sec，53℃退火30 sec，72℃复性1min，30个循环；72℃延伸6min；14℃保温1min。
（4）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离。
对步骤（3）中PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，凝胶浓度为8~10%，凝胶大小180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒压交流电电泳1.5~2小时。
电泳结束后，在凝胶加入浓度为0.1%的硝酸银水溶液，置于水平摇床上渗透银染10min；再加入2%氢氧化钠和0.4%甲醛混合溶液，置于水平摇床中适度显色；最后清水漂洗凝胶并记录读取数据。
部分电泳图谱如图4所示。
（5）SNP分子标记检测与被检测样品抗枯萎病水平一致性分析。
从SiFWR2145位点筛选过程我们可以知晓，理论上具有SiFWR2145等位位点1（条带大小107bp，即本申请SiFWR2145位点）的植株应该表现为抗病（或多数表现为抗病）；具有SiFWR2145等位位点2（条带大小112bp，即SiFWR2145位点中第25个碱基A变为G时位点）的植株应该表现为感病。
检测结果显示，在有SiFWR2145等位位点1（条带大小107bp）的4个植株中，有2株表现为抗枯萎病（DI＜30），可靠度为50%；
在有SiFWR2145等位位点2（条带大小112bp）的30个植株中，有19株表现为高感枯萎病（DI＞70），可靠度为63.33%。
SiFWR2145杂合型植株（有107bp、112bp两条带）则多表现为中等抗性（55≤DI≤70）（部分植株PCR扩增结果如图4所示）。
综上，我们可以认为该SNP标记与抗枯萎病主效基因紧密连锁，具有较好地可靠性和稳定性，可以用于预测芝麻品种的枯萎病抗性水平，即可以用于抗枯萎病芝麻新品种培育。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院芝麻研究中心
<120> 芝麻抗枯萎病基因紧密连锁分子标记SiFWR2145
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> DNA
<213> Sesamum indicum
<400> 1
agatgtttta aaaagagaca gtaaatgcag cttttgcaat tgcttctctt gtgccttttc 60
acattctgtt tttgggtttt gcaagaagct ccaatccctc ctatttc 107

Claims (3)

1.一种与芝麻抗枯萎病基因紧密连锁的分子标记SiFWR2145，其特征在于，该标记包含107bp，其序列如SEQ ID NO. 1所示，具体为：
AGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAATGCAGCTTTTGCAATTGCTTCTCTTGTGCCTTTTCACATTCTGTTTTTGGGTTTTGCAAGAAGCTCCAATCCCTCCTATTTC。
2.权利要求1所述分子标记SiFWR2145的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）提取待测芝麻种子资源的基因组DNA；
（2）设计引物序列，具体设计如下：
正向引物1 Primer 9-1F序列为：5’-AGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAA-3'；
正向引物2 Primer 9-2F序列为：5'–ATACAAGATGTTTTAAAAAGAGACAGTAAG-3'；
反向引物Primer 9-R 序列为：5'-GAAATAGGAGGGATTGGAGC-3'；
以步骤（1）中所提取DNA为模板，进行PCR扩增；
（3）对步骤（2）中PCR扩增产物进行凝胶电泳，判断待测芝麻种子资源的基因组DNA中是否含有分子标记SiFWR2145，如果含有分子标记SiFWR2145，则表明待测芝麻种子资源遗传组中含有与该标记紧密连锁的抗枯萎病基因，是用于培育新的抗枯萎病芝麻品种；如果不含有该分子标记SiFWR2145，则表明待测芝麻种子资源遗传组中不含有抗枯萎病基因，不适宜用于培育抗芝麻枯萎病新品种。
3.权利要求1所述分子标记SiFWR2145在芝麻育种中的应用，其特征在于，采用分子辅助育种方法进行芝麻育种时，含有该分子标记的芝麻材料是用于培育抗枯萎病芝麻新品种。
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