CN107868841A - 用于检测高大山羊草染色体臂的成套分子标记及其应用 - Google Patents

用于检测高大山羊草染色体臂的成套分子标记及其应用 Download PDF

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CN107868841A CN201711240973.2A CN201711240973A CN107868841A CN 107868841 A CN107868841 A CN 107868841A CN 201711240973 A CN201711240973 A CN 201711240973A CN 107868841 A CN107868841 A CN 107868841A
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王坤杨
王轲
林志珊
杜丽璞
李仕金
王静
石磊
陈海强
马晓兰
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Abstract

本发明公开了一种用于检测高大山羊草染色体臂的成套分子标记及其应用。本发明保护特异引物组合，由序列表的序列1‑序列28所示的单链DNA分子组成。所述引物组合可应用于高大山羊草染色体臂的检测。本发明的发明人通过RNA‑seq和生物信息学分析相结合的方法，同时再利用一组普通小麦‑高大山羊草附加系进一步证实，开发出了一套用于鉴定高大山羊草染色体臂和染色体片段的特异分子标记。本发明对于转移小麦育种所需的高大山羊草染色体片段将是非常有用的。

Description

用于检测高大山羊草染色体臂的成套分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测高大山羊草染色体臂的成套分子标记及其应用。
背景技术
高大山羊草(2n＝2x＝14，SlSl，Aegilops longissima L.)是小麦族山羊草属的一个二倍体种，它主要分布在中东地区的埃及和巴勒斯坦的海岸，另外，约旦等地也有少量的分布，属于一年生植物。在进化关系上，高大山羊草的基因组与六倍体小麦的B基因组比较接近。高大山羊草对于生物胁迫(如锈病、白粉病、孢囊线虫、根结线虫、麦廮蝇和绿蚜等)和非生物胁迫(如干旱、寒冷和高盐等)具备很广泛的抗性，并含有特异麦谷蛋白等优质基因，因此是小麦抗性育种和品质育种的优质基因源。例如，来自高大山羊草的3S染色体的Pm13基因，赋予了小麦对白粉病(PM)的广泛抗性，并在小麦育种和生产中发挥了重要作用；通过对Pm13的应用，已经培育了多个具有抗白粉病的小麦品种，并应用于小麦生产；另外，在高大山羊草1Sl染色体长臂上发现存在编码高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的2个基因(1Sx2.3和1Sy16)，在高大山羊草1Sl染色体短臂上发现存在编码低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)的基因(1SLMW-s)。
目前，对于高大山羊草的各条染色体上所蕴含的抗病、抗逆和优质基因向普通小麦的导入，主要还是以染色体易位的形式进行。但是，迄今为止对高大山羊草的研究报道还较少，尤其对于高大山羊草的特定染色体上的特异性DNA片段进行克隆、分子标记开发也鲜有报道。因此，目前所取得的关于高大山羊草的研究结果，还远远不能满足将高大山羊草中大量优异基因向小麦中易位转移的需要。所以，开发高大山羊草各个染色体臂和不同染色体区段特异的分子标记，对于将高大山羊草中存在的抗病、抗逆和优质等基因以染色体易位方式高效导入普通小麦，创制普通小麦-高大山羊草易位系材料，培育小麦新品种，改良小麦抗病、抗旱、耐盐和品质等性状，具有重要时间意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测高大山羊草染色体臂的成套分子标记及其应用。
本发明首先提供了特异引物组合，由14个引物对组成；
引物对1由引物1SL-F和引物1SL-R组成；
所述引物1SL-F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物1SL-R为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
引物对2由引物1SS-F和引物1SS-R组成；
所述引物1SS-F为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物1SS-R为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
引物对3由引物2SL-F和引物2SL-R组成；
所述引物2SL-F为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物2SL-R为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
引物对4由引物2SS-F和引物2SS-R组成；
所述引物2SS-F为如下(b5)或(b6)：
(b5)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(b6)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物2SS-R为如下(b7)或(b8)：
(b7)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(b8)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
引物对5由引物3SL-F和引物3SL-R组成；
所述引物3SL-F为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物3SL-R为如下(c3)或(c4)：
(c3)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
引物对6由引物3SS-F和引物3SS-R组成；
所述引物3SS-F为如下(c5)或(c6)：
(c5)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c6)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物3SS-R为如下(c7)或(c8)：
(c7)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c8)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
引物对7由引物4SL-F和引物4SL-R组成；
所述引物4SL-F为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(d2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物4SL-R为如下(d3)或(d4)：
(d3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(d4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
引物对8由引物4SS-F和引物4SS-R组成；
所述引物4SS-F为如下(d5)或(d6)：
(d5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物4SS-R为如下(d7)或(d8)：
(d7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(d8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
引物对9由引物5SL-F和引物5SL-R组成；
所述引物5SL-F为如下(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(e2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物5SL-R为如下(e3)或(e4)：
(e3)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(e4)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；
引物对10由引物5SS-F和引物5SS-R组成；
所述引物5SS-F为如下(e5)或(e6)：
(e5)序列表的序列19所示的单链DNA分子；
(e6)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物5SS-R为如下(e7)或(e8)：
(e7)序列表的序列20所示的单链DNA分子；
(e8)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
引物对11由引物6SL-F和引物6SL-R组成；
所述引物6SL-F为如下(f1)或(f2)：
(f1)序列表的序列21所示的单链DNA分子；
(f2)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物6SL-R为如下(f3)或(f4)：
(f3)序列表的序列22所示的单链DNA分子；
(f4)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；
引物对12由引物6SS-F和引物6SS-R组成；
所述引物6SS-F为如下(f5)或(f6)：
(f5)序列表的序列23所示的单链DNA分子；
(f6)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；
所述引物6SS-R为如下(f7)或(f8)：
(f7)序列表的序列24所示的单链DNA分子；
(f8)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子；
引物对13由引物7SL-F和引物7SL-R组成；
所述引物7SL-F为如下(g1)或(g2)：
(g1)序列表的序列25所示的单链DNA分子；
(g2)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；
所述引物7SL-R为如下(g3)或(g4)：
(g3)序列表的序列26所示的单链DNA分子；
(g4)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；
引物对14由引物7SS-F和引物7SS-R组成；
所述引物7SS-F为如下(g5)或(g6)：
(g5)序列表的序列27所示的单链DNA分子；
(g6)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；
所述引物7SS-R为如下(g7)或(g8)：
(g7)序列表的序列28所示的单链DNA分子；
(g8)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子。
所述特异引物组合的用途为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：
(h1)鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂；
(h2)制备用于鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂的试剂盒；
(h3)鉴定待测植物是否为高大山羊草附加系；
(h4)制备用于鉴定植物是否为高大山羊草附加系的试剂盒。
本发明还保护所述特异引物组合的应用，为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：
(h1)鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂；
(h2)制备用于鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂的试剂盒；
(h3)鉴定待测植物是否为高大山羊草附加系；
(h4)制备用于鉴定植物是否为高大山羊草附加系的试剂盒。
本发明还保护含有所述特异引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体或鉴定待测植物是否为高大山羊草附加系。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂的方法，包括如下步骤：
以待测植物的总DNA为模板，分别采用所述特异引物组合中的各个引物对进行PCR扩增，进行如下判断：
采用所述引物对1时：如果得到275bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草1S1染色体长臂；如果不能得到275bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草1S1染色体长臂；
采用所述引物对2时：如果得到752bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草1S1染色体短臂；如果不能得到752bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草1S1染色体短臂；
采用所述引物对3时：如果得到603bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草2S1染色体长臂；如果不能得到603bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草2S1染色体长臂；
采用所述引物对4时：如果得到862bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草2S1染色体短臂；如果不能得到862bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草2S1染色体短臂；
采用所述引物对5时：如果得到628bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草3S1染色体长臂；如果不能得到628bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草3S1染色体长臂；
采用所述引物对6时：如果得到935bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草3S1染色体短臂；如果不能得到935bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草3S1染色体短臂；
采用所述引物对7时：如果得到187bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草4S1染色体长臂；如果不能得到187bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草4S1染色体长臂；
采用所述引物对8时：如果得到209bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草4S1染色体短臂；如果不能得到209bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草4S1染色体短臂；
采用所述引物对9时：如果得到645bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草5S1染色体长臂；如果不能得到645bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草5S1染色体长臂；
采用所述引物对10时：如果得到669bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草5S1染色体短臂；如果不能得到669bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草5S1染色体短臂；
采用所述引物对11时：如果得到150bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草6S1染色体长臂；如果不能得到150bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草6S1染色体长臂；
采用所述引物对12时：如果得到970bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草6S1染色体短臂；如果不能得到970bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草6S1染色体短臂；
采用所述引物对13时：如果得到782bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草7S1染色体长臂；如果不能得到782bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草7S1染色体长臂；
采用所述引物对14时：如果得到974bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草7S1染色体短臂；如果不能得到974bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草7S1染色体短臂。
所述方法中，所述PCR扩增的反应体系具体可为：模板DNA 100ng，上游引物(10μmol·L-1)0.5μL，下游引物(10μmol·L-1)0.5μL，2×Taq MasterMix(Mg2+、dNTP)7.5μL，加ddH2O至15μL。
所述方法中，PCR扩增的反应程序具体可为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃8min。
本发明还保护一种鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂的方法，包括如下步骤：
检测待测植物总DNA中是否存在所述特异引物组合中所述引物对1至引物对14的靶序列，进行如下判断：
如果所述总DNA中存在所述引物对1的靶序列，待测植物中含有高大山羊草1S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对1的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草1S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对2的靶序列，待测植物中含有高大山羊草1S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对2的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草1S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对3的靶序列，待测植物中含有高大山羊草2S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对3的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草2S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对4的靶序列，待测植物中含有高大山羊草2S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对4的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草2S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对5的靶序列，待测植物中含有高大山羊草3S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对5的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草3S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对6的靶序列，待测植物中含有高大山羊草3S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对6的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草3S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对7的靶序列，待测植物中含有高大山羊草4S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对7的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草4S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对8的靶序列，待测植物中含有高大山羊草4S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对8的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草4S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对9的靶序列，待测植物中含有高大山羊草5S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对9的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草5S1染色体长臂；
如果所述总DNA存在所述引物对10的靶序列，待测植物中含有高大山羊草5S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对10的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草5S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对11的靶序列，待测植物中含有高大山羊草6S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对11的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草6S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对12的靶序列，待测植物中含有高大山羊草6S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对12的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草6S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对13的靶序列，待测植物中含有高大山羊草7S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对13的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草7S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对14的靶序列，待测植物中含有高大山羊草7S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对14的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草7S1染色体短臂。
本发明还保护所述引物对1或引物对2或引物对3或引物对4或引物对5或引物对6或引物对7或引物对8或引物对9或引物对10或引物对11或引物对12或引物对13或引物对14。
本发明还保护引物组合A或引物组合B或引物组合C或引物组合D或引物组合E或引物组合F或引物组合G。
所述引物组合A由所述引物对1和引物对2组成。
所述引物组合B由所述引物对3和引物对4组成。
所述引物组合C由所述引物对5和引物对6组成。
所述引物组合D由所述引物对7和引物对8组成。
所述引物组合E由所述引物对9和引物对10组成。
所述引物组合F由所述引物对11和引物对12组成。
所述引物组合G由所述引物对13和引物对14组成。
本发明还保护所述引物对1在鉴定高大山羊草1S1染色体长臂中的应用，或，所述引物对2在鉴定高大山羊草1S1染色体短臂中的应用，或，所述引物对3在鉴定高大山羊草2S1染色体长臂中的应用，或，所述引物对4在鉴定高大山羊草2S1染色体短臂中的应用，或，所述引物对5在鉴定高大山羊草3S1染色体长臂中的应用，或，所述引物对6在鉴定高大山羊草3S1染色体短臂中的应用，或，所述引物对7在鉴定高大山羊草4S1染色体长臂中的应用，或，所述引物对8在鉴定高大山羊草4S1染色体短臂中的应用，或，所述引物对9在鉴定高大山羊草5S1染色体长臂中的应用，或，所述引物对10在鉴定高大山羊草5S1染色体短臂中的应用，或，所述引物对11在鉴定高大山羊草6S1染色体长臂中的应用，或，所述引物对12在鉴定高大山羊草6S1染色体短臂中的应用，或，所述引物对13在鉴定高大山羊草7S1染色体长臂中的应用，或，所述引物对14在鉴定高大山羊草7S1染色体短臂中的应用。
本发明还保护所述引物组合A在鉴定高大山羊草1S1染色体臂中的应用，或，所述引物组合B在鉴定高大山羊草2S1染色体臂中的应用，或，所述引物组合C在鉴定高大山羊草3S1染色体臂中的应用，或，所述引物组合D在鉴定高大山羊草4S1染色体臂中的应用，或，所述引物组合E在鉴定高大山羊草5S1染色体臂中的应用，或，所述引物组合F在鉴定高大山羊草6S1染色体臂中的应用，或，所述引物组合G在鉴定高大山羊草7S1染色体臂中的应用。
以上任一所述植物具体可为小麦或高大山羊草或小麦-高大山羊草附加系。所述小麦具体可为中国春。所述高大山羊草具体可为高大山羊草PI542196。所述小麦-高大山羊草附加系具体可为中国春-高大山羊草附加系DA1S#3、中国春-高大山羊草附加系DA2S#3、中国春-高大山羊草附加系DA3S#2、中国春-高大山羊草附加系DA4S#3、中国春-高大山羊草附加系DA5S#3、中国春-高大山羊草附加系DA6S#3或中国春-高大山羊草附加系DA7S#3。
本发明的发明人通过RNA-seq和生物信息学分析相结合的方法，同时再利用一组普通小麦-高大山羊草附加系进一步证实，开发出了一套用于鉴定高大山羊草染色体臂和染色体片段的特异分子标记。本发明对于转移小麦育种所需的高大山羊草染色体片段将是非常有用的。
附图说明
图1为实施例3中引物对1的PCR验证结果。
图2为实施例3中引物对2的PCR验证结果。
图3为实施例3中引物对3的PCR验证结果。
图4为实施例3中引物对4的PCR验证结果。
图5为实施例3中引物对5的PCR验证结果。
图6为实施例3中引物对6的PCR验证结果。
图7为实施例3中引物对7的PCR验证结果。
图8为实施例3中引物对8的PCR验证结果。
图9为实施例3中引物对9的PCR验证结果。
图10为实施例3中引物对10的PCR验证结果。
图11为实施例3中引物对11的PCR验证结果。
图12为实施例3中引物对12的PCR验证结果。
图13为实施例3中引物对13的PCR验证结果。
图14为实施例3中引物对14的PCR验证结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置3次重复实验，结果取平均值。
高大山羊草PI542196：参考文献“王顺利.山羊草属品质相关蛋白编码基因分子克隆与蛋白质组分析.2012年,首都师范大学,博士论文”；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
小麦品种中国春：中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质资源库。
中国春-高大山羊草附加系DA1S#3(具有21对小麦中国春染色体+1对高大山羊草1S1染色体)：参考文献“齐珊珊，白福强，夏晴，张玉丹，郑雅月，刘金燕，刘文轩.小麦亲缘种属添加系耐低磷胁迫性状鉴定与基因染色体定位.2016年，17(4)：710-718”；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
中国春-高大山羊草附加系DA2S#3(具有21对小麦中国春染色体+1对高大山羊草2S1染色体)：参考文献“齐珊珊，白福强，夏晴，张玉丹，郑雅月，刘金燕，刘文轩.小麦亲缘种属添加系耐低磷胁迫性状鉴定与基因染色体定位.2016年，17(4)：710-718”；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
中国春-高大山羊草附加系DA3S#2(具有21对小麦中国春染色体+1对高大山羊草3S1染色体)：参考文献“齐珊珊，白福强，夏晴，张玉丹，郑雅月，刘金燕，刘文轩.小麦亲缘种属添加系耐低磷胁迫性状鉴定与基因染色体定位.2016年，17(4)：710-718”；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
中国春-高大山羊草附加系DA4S#3(具有21对小麦中国春染色体+1对高大山羊草4S1染色体)：参考文献“齐珊珊，白福强，夏晴，张玉丹，郑雅月，刘金燕，刘文轩.小麦亲缘种属添加系耐低磷胁迫性状鉴定与基因染色体定位.2016年，17(4)：710-718”；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
中国春-高大山羊草附加系DA5S#3(具有21对小麦中国春染色体+1对高大山羊草5S1染色体)：参考文献“齐珊珊，白福强，夏晴，张玉丹，郑雅月，刘金燕，刘文轩.小麦亲缘种属添加系耐低磷胁迫性状鉴定与基因染色体定位.2016年，17(4)：710-718”；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
中国春-高大山羊草附加系DA6S#3(具有21对小麦中国春染色体+1对高大山羊草6S1染色体)：参考文献“齐珊珊，白福强，夏晴，张玉丹，郑雅月，刘金燕，刘文轩.小麦亲缘种属添加系耐低磷胁迫性状鉴定与基因染色体定位.2016年，17(4)：710-718”；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
中国春-高大山羊草附加系DA7S#3(具有21对小麦中国春染色体+1对高大山羊草7S1染色体)：参考文献“齐珊珊，白福强，夏晴，张玉丹，郑雅月，刘金燕，刘文轩.小麦亲缘种属添加系耐低磷胁迫性状鉴定与基因染色体定位.2016年，17(4)：710-718”；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
实施例1、检测高大山羊草各个染色体臂成套引物的设计
提取高大山羊草PI542196幼苗叶片总RNA，经过转录组测序及序列分析、比对，获得了若干用于鉴定高大山羊草染色体臂的引物。通过比较灵敏度、特异性等性能，获得了一套用于检测高大山羊草染色体臂的引物组合。如下所示：
用于检测高大山羊草1S1染色体长臂的引物对1(产物大小：275bp)：
1SL-F(序列表的序列1)：5'-CCATACACCAGTACATCCATA-3'；
1SL-R(序列表的序列2)：5'-GTACATTACCATCTGACATAGG-3'；
用于检测高大山羊草1S1染色体短臂的引物对2(产物大小：752bp)：
1SS-F(序列表的序列3)：5'-TACCACATCCATCACTCCT-3'；
1SS-R(序列表的序列4)：5'-ATTCTCCACACTCCAATCAA-3'；
用于检测高大山羊草2S1染色体长臂的引物对3(产物大小：603bp)：
2SL-F(序列表的序列5)：5'-TGGTATCTCACGCCTTCG-3'；
2SL-R(序列表的序列6)：5'-AAGACTTACATTTGGGAAC-3'；
用于检测高大山羊草2S1染色体短臂的引物对4(产物大小：862bp)：
2SS-F(序列表的序列7)：5'-ATTAACAACCGCAGGCTTA-3'；
2SS-R(序列表的序列8)：5'-ACACTTACCACTTCAGACAA-3'；
用于检测高大山羊草3S1染色体长臂的引物对5(产物大小：628bp)：
3SL-F(序列表的序列9)：5'-GGAACTCTGGACATATACTCA-3'；
3SL-R(序列表的序列10)：5'-TTCTGCTGCTCCTTGTTG-3'；
用于检测高大山羊草3S1染色体短臂的引物对6(产物大小：935bp)：
3SS-F(序列表的序列11)：5'-AACACTTGTGCCAATGCA-3'；
3SS-R(序列表的序列12)：5'-GAGCCACTAACCAGGAAA-3'；
用于检测高大山羊草4S1染色体长臂的引物对7(产物大小：187bp)：
4SL-F(序列表的序列13)：5'-ACGGTTCCTATGGTGCTG-3'；
4SL-R(序列表的序列14)：5'-GCACAGCCTTGTCAGATC-3'；
用于检测高大山羊草4S1染色体短臂的引物对8(产物大小：209bp)：
4SS-F(序列表的序列15)：5'-TTCTCGCAGGAAGTCTTG-3'；
4SS-R(序列表的序列16)：5'-TCATCAGTAACCGTTCCG-3'；
用于检测高大山羊草5S1染色体长臂的引物对9(产物大小：645bp)：
5SL-F(序列表的序列17)：5'-GGGTTTATCTAAGGAGGT-3'；
5SL-R(序列表的序列18)：5'-AGTAGTTGTGCCTATGTTCT-3'；
用于检测高大山羊草5S1染色体短臂的引物对10(产物大小：669bp)：
5SS-F(序列表的序列19)：5'-CGTAACACAATGAGGACATC-3'；
5SS-R(序列表的序列20)：5'-GTGCGTATCCACATATAACC-3'；
用于检测高大山羊草6S1染色体长臂的引物对11(产物大小：150bp)：
6SL-F(序列表的序列21)：5'-CATTCCTAACATCGATAACAG-3'；
6SL-R(序列表的序列22)：5'-TCTTGTGTTAGTAGTAGATCAGT-3'；
用于检测高大山羊草6S1染色体短臂的引物对12(产物大小：970bp)：
6SS-F(序列表的序列23)：5'-TCACTTGCTCTGCTTCGTA-3'；
6SS-R(序列表的序列24)：5'-TCAGCACCGTGACCAATT-3'；
用于检测高大山羊草7S1染色体长臂的引物对13(产物大小：782bp)：
7SL-F(序列表的序列25)：5'-GCGGTATGATTCACAGTTG-3'；
7SL-R(序列表的序列26)：5'-CCATATCTTATTGCCTGCTT-3'；
用于检测高大山羊草7S1染色体短臂的引物对14(产物大小：974bp)：
7SS-F(序列表的序列27)：5'-GCTTAGAATCGCCTGGAG-3'；
7SS-R(序列表的序列28)：5'-AATGTGAGGTCGTTATCGTA-3'。
实施例2、高大山羊草各个染色体臂检测方法的建立
1、提取待测植物总DNA。
2、以步骤1得到的总DNA为模板，分别采用实施例1中的引物对1至引物对14进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增的反应体系：模板DNA 100ng，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2×TaqMasterMix(Mg2+、dNTP)7.5μL，加ddH2O至15μL。
所述上游引物和下游引物均已引物溶液的形式加至反应体系中，每条引物在引物溶液中的浓度为10μmol·L-1。
PCR扩增的反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃8min，然后4℃保存。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对电泳结果进行分析，分析方法如下：
采用引物对1对模板进行PCR扩增，如果得到275bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草1S1染色体长臂；如果不能得到275bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草1S1染色体长臂；
采用引物对2对模板进行PCR扩增，如果得到752bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草1S1染色体短臂；如果不能得到752bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草1S1染色体短臂；
采用引物对3对模板进行PCR扩增，如果得到603bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草2S1染色体长臂；如果不能得到603bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草2S1染色体长臂；
采用引物对4对模板进行PCR扩增，如果得到862bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草2S1染色体短臂；如果不能得到862bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草2S1染色体短臂；
采用引物对5对模板进行PCR扩增，如果得到628bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草3S1染色体长臂；如果不能得到628bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草3S1染色体长臂；
采用引物对6对模板进行PCR扩增，如果得到935bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草3S1染色体短臂；如果不能得到935bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草3S1染色体短臂；
采用引物对7对模板进行PCR扩增，如果得到187bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草4S1染色体长臂；如果不能得到187bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草4S1染色体长臂；
采用引物对8对模板进行PCR扩增，如果得到209bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草4S1染色体短臂；如果不能得到209bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草4S1染色体短臂；
采用引物对9对模板进行PCR扩增，如果得到645bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草5S1染色体长臂；如果不能得到645bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草5S1染色体长臂；
采用引物对10对模板进行PCR扩增，如果得到669bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草5S1染色体短臂；如果不能得到669bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草5S1染色体短臂；
采用引物对11对模板进行PCR扩增，如果得到150bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草6S1染色体长臂；如果不能得到150bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草6S1染色体长臂；
采用引物对12对模板进行PCR扩增，如果得到970bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草6S1染色体短臂；如果不能得到970bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草6S1染色体短臂；
采用引物对13对模板进行PCR扩增，如果得到782bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草7S1染色体长臂；如果不能得到782bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草7S1染色体长臂；
采用引物对14对模板进行PCR扩增，如果得到974bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草7S1染色体短臂；如果不能得到974bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草7S1染色体短臂。
实施例3、检测方法验证
待测材料：高大山羊草PI542196、小麦品种中国春、中国春-高大山羊草附加系DA1S#3、中国春-高大山羊草附加系DA2S#3、中国春-高大山羊草附加系DA3S#2、中国春-高大山羊草附加系DA4S#3、中国春-高大山羊草附加系DA5S#3、中国春-高大山羊草附加系DA6S#3和中国春-高大山羊草附加系DA7S#3。
提取待测材料幼苗叶片的总DNA；以总DNA为模板，采用实施例2中的方法进行检测。
结果如图1-14所示。图1-14中，泳道M为Marker 2000+，泳道2为中国春-高大山羊草附加系DA1S#3，泳道3为中国春-高大山羊草附加系DA2S#3，泳道3为中国春-高大山羊草附加系DA3S#2，泳道4为中国春-高大山羊草附加系DA4S#3，泳道5为中国春-高大山羊草附加系DA5S#3，泳道6为中国春-高大山羊草附加系DA6S#3，泳道7为中国春-高大山羊草附加系DA7S#3，泳道8为小麦品种中国春，泳道9为高大山羊草PI542196。
结果表明，采用引物对1对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA1S#3和高大山羊草PI542196得到275bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对2对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA1S#3和高大山羊草PI542196得到752bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对3对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA2S#3和高大山羊草PI542196得到603bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对4对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA2S#3和高大山羊草PI542196得到862bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对5对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA3S#2和高大山羊草PI542196得到628bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对6对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA3S#2和高大山羊草PI542196得到935bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对7对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA4S#3和高大山羊草PI542196得到187bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对8对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA4S#3和高大山羊草PI542196得到209bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对9对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA5S#3和高大山羊草PI542196得到645bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对10对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA5S#3和高大山羊草PI542196得到669bp的扩增产物，其他7个材料中没有得到669bp的扩增产物；采用引物对11对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA6S#3和高大山羊草PI542196得到150bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对12对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA6S#3和高大山羊草PI542196得到970bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对13对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA7S#3和高大山羊草PI542196得到782bp的扩增产物，其他7个材料中没有任何扩增产物；采用引物对14对待测材料的模板DNA进行扩增，只有中国春-高大山羊草附加系DA7S#3和高大山羊草PI542196得到974bp的扩增产物，其他7个材料中没有得到974bp的扩增产物。
上述实验结果表明，本发明建立的引物组合和检测方法检测各个高大山羊草染色体臂，具有很好的特异性。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 用于检测高大山羊草染色体臂的成套分子标记及其应用
<160> 28
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ccatacacca gtacatccat a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gtacattacc atctgacata gg 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
taccacatcc atcactcct 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 4
attctccaca ctccaatcaa 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
tggtatctca cgccttcg 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
aagacttaca tttgggaac 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 7
attaacaacc gcaggctta 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
acacttacca cttcagacaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 9
ggaactctgg acatatactc a 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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ttctgctgct ccttgttg 18
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aacacttgtg ccaatgca 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
gagccactaa ccaggaaa 18
<210> 13
<211> 18
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<213> 人工序列
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acggttccta tggtgctg 18
<210> 14
<211> 18
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gcacagcctt gtcagatc 18
<210> 15
<211> 18
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ttctcgcagg aagtcttg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 16
tcatcagtaa ccgttccg 18
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<213> 人工序列
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gggtttatct aaggaggt 18
<210> 18
<211> 20
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<213> 人工序列
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<400> 18
agtagttgtg cctatgttct 20
<210> 19
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cgtaacacaa tgaggacatc 20
<210> 20
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<212> DNA
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<223>
<400> 20
gtgcgtatcc acatataacc 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 21
cattcctaac atcgataaca g 21
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tcttgtgtta gtagtagatc agt 23
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<212> DNA
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<400> 23
tcacttgctc tgcttcgta 19
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<212> DNA
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<400> 24
tcagcaccgt gaccaatt 18
<210> 25
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<212> DNA
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gcggtatgat tcacagttg 19
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<220>
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<400> 26
ccatatctta ttgcctgctt 20
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 27
gcttagaatc gcctggag 18
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
aatgtgaggt cgttatcgta 20

Claims (10)

1.特异引物组合，由14个引物对组成；
引物对1由引物1SL-F和引物1SL-R组成；
所述引物1SL-F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物1SL-R为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
引物对2由引物1SS-F和引物1SS-R组成；
所述引物1SS-F为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物1SS-R为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
引物对3由引物2SL-F和引物2SL-R组成；
所述引物2SL-F为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物2SL-R为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
引物对4由引物2SS-F和引物2SS-R组成；
所述引物2SS-F为如下(b5)或(b6)：
(b5)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(b6)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物2SS-R为如下(b7)或(b8)：
(b7)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(b8)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
引物对5由引物3SL-F和引物3SL-R组成；
所述引物3SL-F为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物3SL-R为如下(c3)或(c4)：
(c3)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
引物对6由引物3SS-F和引物3SS-R组成；
所述引物3SS-F为如下(c5)或(c6)：
(c5)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c6)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物3SS-R为如下(c7)或(c8)：
(c7)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c8)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
引物对7由引物4SL-F和引物4SL-R组成；
所述引物4SL-F为如下(d1)或(d2)：
(d1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(d2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物4SL-R为如下(d3)或(d4)：
(d3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(d4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
引物对8由引物4SS-F和引物4SS-R组成；
所述引物4SS-F为如下(d5)或(d6)：
(d5)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(d6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物4SS-R为如下(d7)或(d8)：
(d7)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(d8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
引物对9由引物5SL-F和引物5SL-R组成；
所述引物5SL-F为如下(e1)或(e2)：
(e1)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(e2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物5SL-R为如下(e3)或(e4)：
(e3)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(e4)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；
引物对10由引物5SS-F和引物5SS-R组成；
所述引物5SS-F为如下(e5)或(e6)：
(e5)序列表的序列19所示的单链DNA分子；
(e6)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物5SS-R为如下(e7)或(e8)：
(e7)序列表的序列20所示的单链DNA分子；
(e8)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
引物对11由引物6SL-F和引物6SL-R组成；
所述引物6SL-F为如下(f1)或(f2)：
(f1)序列表的序列21所示的单链DNA分子；
(f2)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物6SL-R为如下(f3)或(f4)：
(f3)序列表的序列22所示的单链DNA分子；
(f4)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子；
引物对12由引物6SS-F和引物6SS-R组成；
所述引物6SS-F为如下(f5)或(f6)：
(f5)序列表的序列23所示的单链DNA分子；
(f6)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相同功能的DNA分子；
所述引物6SS-R为如下(f7)或(f8)：
(f7)序列表的序列24所示的单链DNA分子；
(f8)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相同功能的DNA分子；
引物对13由引物7SL-F和引物7SL-R组成；
所述引物7SL-F为如下(g1)或(g2)：
(g1)序列表的序列25所示的单链DNA分子；
(g2)将序列25经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列25具有相同功能的DNA分子；
所述引物7SL-R为如下(g3)或(g4)：
(g3)序列表的序列26所示的单链DNA分子；
(g4)将序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列26具有相同功能的DNA分子；
引物对14由引物7SS-F和引物7SS-R组成；
所述引物7SS-F为如下(g5)或(g6)：
(g5)序列表的序列27所示的单链DNA分子；
(g6)将序列27经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列27具有相同功能的DNA分子；
所述引物7SS-R为如下(g7)或(g8)：
(g7)序列表的序列28所示的单链DNA分子；
(g8)将序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列28具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述的特异引物组合的应用，为如下(h1)或(h2)或(h3)或(h4)：
(h1)鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂；
(h2)制备用于鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂的试剂盒；
(h3)鉴定待测植物是否为高大山羊草附加系；
(h4)制备用于鉴定植物是否为高大山羊草附加系的试剂盒。
3.含有权利要求1所述的特异引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体或鉴定待测植物是否为高大山羊草附加系。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂的方法，包括如下步骤：
以待测植物的总DNA为模板，分别采用所述特异引物组合中的各个引物对进行PCR扩增，进行如下判断：
采用所述引物对1时：如果得到275bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草1S1染色体长臂；如果不能得到275bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草1S1染色体长臂；
采用所述引物对2时：如果得到752bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草1S1染色体短臂；如果不能得到752bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草1S1染色体短臂；
采用所述引物对3时：如果得到603bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草2S1染色体长臂；如果不能得到603bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草2S1染色体长臂；
采用所述引物对4时：如果得到862bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草2S1染色体短臂；如果不能得到862bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草2S1染色体短臂；
采用所述引物对5时：如果得到628bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草3S1染色体长臂；如果不能得到628bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草3S1染色体长臂；
采用所述引物对6时：如果得到935bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草3S1染色体短臂；如果不能得到935bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草3S1染色体短臂；
采用所述引物对7时：如果得到187bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草4S1染色体长臂；如果不能得到187bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草4S1染色体长臂；
采用所述引物对8时：如果得到209bp的扩增产物，待测植物含有或候选含有高大山羊草4S1染色体短臂；如果不能得到209bp的扩增产物，待测植物不含有或候选不含有高大山羊草4S1染色体短臂；
采用所述引物对9时：如果得到645bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草5S1染色体长臂；如果不能得到645bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草5S1染色体长臂；
采用所述引物对10时：如果得到669bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草5S1染色体短臂；如果不能得到669bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草5S1染色体短臂；
采用所述引物对11时：如果得到150bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草6S1染色体长臂；如果不能得到150bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草6S1染色体长臂；
采用所述引物对12时：如果得到970bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草6S1染色体短臂；如果不能得到970bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草6S1染色体短臂；
采用所述引物对13时：如果得到782bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草7S1染色体长臂；如果不能得到782bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草7S1染色体长臂；
采用所述引物对14时：如果得到974bp的扩增产物，待测植物中含有或候选含有高大山羊草7S1染色体短臂；如果不能得到974bp的扩增产物，待测植物中不含有或候选不含有高大山羊草7S1染色体短臂。
6.一种鉴定待测植物中是否含有高大山羊草染色体臂的方法，包括如下步骤：
检测待测植物总DNA中是否存在权利要求1所述的特异引物组合中所述引物对1至引物对14的靶序列，进行如下判断：
如果所述总DNA中存在所述引物对1的靶序列，待测植物中含有高大山羊草1S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对1的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草1S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对2的靶序列，待测植物中含有高大山羊草1S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对2的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草1S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对3的靶序列，待测植物中含有高大山羊草2S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对3的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草2S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对4的靶序列，待测植物中含有高大山羊草2S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对4的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草2S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对5的靶序列，待测植物中含有高大山羊草3S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对5的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草3S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对6的靶序列，待测植物中含有高大山羊草3S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对6的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草3S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对7的靶序列，待测植物中含有高大山羊草4S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对7的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草4S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对8的靶序列，待测植物中含有高大山羊草4S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对8的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草4S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对9的靶序列，待测植物中含有高大山羊草5S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对9的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草5S1染色体长臂；
如果所述总DNA存在所述引物对10的靶序列，待测植物中含有高大山羊草5S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对10的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草5S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对11的靶序列，待测植物中含有高大山羊草6S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对11的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草6S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对12的靶序列，待测植物中含有高大山羊草6S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对12的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草6S1染色体短臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对13的靶序列，待测植物中含有高大山羊草7S1染色体长臂；如果所述总DNA不存在所述引物对13的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草7S1染色体长臂；
如果所述总DNA中存在所述引物对14的靶序列，待测植物中含有高大山羊草7S1染色体短臂；如果所述总DNA不存在所述引物对14的靶序列，待测植物中不含有高大山羊草7S1染色体短臂。
7.权利要求1中所述的引物对1或引物对2或引物对3或引物对4或引物对5或引物对6或引物对7或引物对8或引物对9或引物对10或引物对11或引物对12或引物对13或引物对14。
8.引物组合A或引物组合B或引物组合C或引物组合D或引物组合E或引物组合F或引物组合G；
所述引物组合A由权利要求1中所述的引物对1和引物对2组成；
所述引物组合B由权利要求1中所述的引物对3和引物对4组成；
所述引物组合C由权利要求1中所述的引物对5和引物对6组成；
所述引物组合D由权利要求1中所述的引物对7和引物对8组成；
所述引物组合E由权利要求1中所述的引物对9和引物对10组成；
所述引物组合F由权利要求1中所述的引物对11和引物对12组成；
所述引物组合G由权利要求1中所述的引物对13和引物对14组成。
9.权利要求1中所述的引物对1在鉴定高大山羊草1S1染色体长臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对2在鉴定高大山羊草1S1染色体短臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对3在鉴定高大山羊草2S1染色体长臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对4在鉴定高大山羊草2S1染色体短臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对5在鉴定高大山羊草3S1染色体长臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对6在鉴定高大山羊草3S1染色体短臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对7在鉴定高大山羊草4S1染色体长臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对8在鉴定高大山羊草4S1染色体短臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对9在鉴定高大山羊草5S1染色体长臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对10在鉴定高大山羊草5S1染色体短臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对11在鉴定高大山羊草6S1染色体长臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对12在鉴定高大山羊草6S1染色体短臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对13在鉴定高大山羊草7S1染色体长臂中的应用，或，权利要求1中所述的引物对14在鉴定高大山羊草7S1染色体短臂中的应用。
10.权利要求8所述的引物组合A在鉴定高大山羊草1S1染色体臂中的应用，或，权利要求8所述的引物组合B在鉴定高大山羊草2S1染色体臂中的应用，或，权利要求8所述的引物组合C在鉴定高大山羊草3S1染色体臂中的应用，或，权利要求8所述的引物组合D在鉴定高大山羊草4S1染色体臂中的应用，或，权利要求8所述的引物组合E在鉴定高大山羊草5S1染色体臂中的应用，或，权利要求8所述的引物组合F在鉴定高大山羊草6S1染色体臂中的应用，或，权利要求8所述的引物组合G在鉴定高大山羊草7S1染色体臂中的应用。
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Application publication date: 20180403

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