CN104498483A - 基于小麦和水稻EST序列的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于作物分子遗传育种领域，具体涉及希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记的建立，12个新标记的序列如序列表中序列1-24所示。还涉及这些分子标记在跟踪检测小麦背景中希尔斯山羊草染色体方面的应用。分子标记筛选与鉴定杂交后代的结果与基因组原位杂交结果一致性为100%，因此，本发明获得的特异分子标记不仅可用于杂交群体的筛选与鉴定，还可以用于辅助选育籽粒微量元素高且抗小麦白粉病的小麦新品系/品种。
Description
技术领域
本发明属于作物分子遗传育种领域， 具体涉及利用小麦和水稻EST序列来建立的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记的内容，还涉及这些分子标记在跟踪检测小麦背景中希尔斯山羊草染色体方面的应用。
背景技术
六倍体小麦（Triticum aestivum L.，2n=42，基因组AABBDD）是世界最主要的粮食作物之一。提高小麦产量和改良其品质是小麦育种的重要内容，然而，二者均受到生物或非生物胁迫的影响。 小麦远源物种中含有丰富的可以应用于小麦育种的优异农艺性状基因。远缘杂交可以将来自小麦外源物种的优异基因导入小麦，相应基因的导入可以大大改良小麦对生物或非生物胁迫的抗性。小麦的远源物种黑麦（Secale cereal，2n=14，基因组RR）是在小麦育种中应用最为成功的范例之一。导入栽培小麦的小麦-黑麦1RS.1BL易位系因为含有抗小麦条锈病基因Yr9、抗叶锈病基因Lr26、抗秆锈病基因Sr31和抗白粉病基因Pm8，大大提高了我国小麦产量和抗性，因此，受到了育种家们的普遍青睐。据报道，我国约有70%的小麦品种含有该易位系。由于长期的品种间杂交选育导致我国小麦品种抗源日趋单一化和遗传变异范围缩小，从而使小麦群体遗传多样性丧失并且使得各种病害加重。此外，由于强毒性致病生理小种及其变种的产生与流行，使得包括Pm8、Yr1-Yr4、Yr6-Yr9、Sr24、Sr31、Sr36和Sr38在内的白粉病、条锈病和秆锈病等抗性基因的抗性丧失。2014年，我国约有1.3亿亩小麦感染纹枯病，1.0亿亩小麦感染小麦白粉病，3000万亩小麦感染条锈病，导致小麦大面积减产造成直接经济损失达上百亿元人民币。所以，加强对不同小麦远源物种中抗性基因的挖掘并应用小麦育种工作中进行可持续抗源多样化育种工作对我国粮食安全具有重要意义。
希尔斯山羊草（2n=14, 基因组SsSs），是小麦的远源物种，高抗小麦叶锈病和白粉病、高抗小麦秆锈病和禾谷类二叉蚜、对干旱和盐胁迫也有较好的抗性。因此，该种质中的优异基因值得进一步向小麦转移。Friebe 等（Friebe B, Tuleen NA, and Gill BS. Standard karyotype of Triticum searsii and its relationship with other S-genome species and common wheat. Theor Appl Genet, 1995, 91(2):248-254.）鉴定了一整套中国春-希尔斯山羊草附加系，为定位优异基因在染色体上的位置提供了研究材料。 以这套附加系为工具，Garg等（Garg M, Tanaka H, Ishikawa N, Takata K, Yanaka M, Tsujimoto H. A novel pair of HMW glutenin subunits from Aegilops searsii improves quality of hexaploid wheat. Cereal Chemistry, 2009, 86:26-321.）将显著提高小麦品质的相关基因定位在希尔斯山羊草1Ss染色体上；Buloichik等（Buloichik AA, Borzyak VS, Voluevich EA. Influence of alien chromosomes on the resistance of soft wheat to biotrophic fungal pathogens. Cytol Genet, 2008, 42:9-15.）将抗小麦白粉病基因定位在2Ss染色体上；Wang等（Wang SW, Yin LN, Tanaka H, Tanaka K, Tsujimoto H. Wheat-Aegilops chromosome addition lines showing high iron and zinc contents in grains. Breeding Sci, 2011, 61: 189-195.）将显著提高小麦籽粒铁和锌元素的基因定位在1Ss 和2Ss染色体上；Liu等（Liu WX, Jin Y, Rouse M, Friebe B, Gill BS, and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat–Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet, 2011, 122:1537-1545.）将抗小麦秆锈病基因定位在3Ss染色体上。
小麦-外源物种附加系中除了含有小麦育种需要的优异基因外，还含有一些控制不利农艺性状的基因，因此，需要利用染色体工程方法将其诱导后才能应用于小麦育种工作。到目前为止，中国春-希尔斯山羊草3Ss附加系已经被成功改造（Liu WX, Jin Y, Rouse M, Friebe B, Gill BS, and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat–Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet, 2011, 122:1537-1545.），而2Ss附加系尚未被利用染色体工程方法诱导。基于此，我们开展该项工作。诱导群体的筛选与鉴定需要分子标记的辅助进行，因此，希尔斯山羊草2Ss染色体特异标记的建立对该工作的顺利开展起着重要作用。到目前为止，Sun 等（Sun X, Hu SL, Liu X, Qian WQ, Hao ST, Zhang AM, Wang DW. Characterization of the HMW glutenin subunits from Aegilops searsii and identification of a novel variant HMW glutenin subunit. Theor Appl Genet, 2006, 113:631-641.）和 Garg 等（Garg M, Tanaka H, Ishikawa N, Takata K, Yanaka M, Tsujimoto H. A novel pair of HMW glutenin subunits from Aegilops searsii improves quality of hexaploid wheat. Cereal Chemistry, 2009, 86:26-321.）均建立了希尔斯山羊草1Ss 的种子蛋白标记。Liu等（Liu WX, Jin Y, Rouse M, Friebe B, Gill BS, and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat–Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet, 2011, 122:1537-1545.）建立了希尔斯山羊草3Ss 染色体的EST-STS标记，用这些标记鉴定了小麦-希尔斯山羊草易位系并定位了来自希尔斯山羊草上的抗小麦秆锈病基因。然而，能用于快速简便实用的检测小麦背景中希尔斯山羊草2Ss 的PCR标记未见报道。
目前，尚未发现有关希尔斯山羊草基因组序列信息的报道，而小麦、水稻和包括希尔斯山羊草在内的小麦远源物种的基因具有较好的共线性，并且不同物种基因的内含子区域含有丰富的序列变异，因此，可以利用现有的小麦和水稻EST序列来设计引物，进而对希尔斯山羊草和小麦基因组DNA进行扩增并对其扩增产物进行酶切，以此来建立希尔斯山羊草染色体特异分子标记。希尔斯山羊草2Ss 染色体导入小麦能显著提高小麦籽粒铁锌含量，并且可以改良小麦白粉病抗性，因此，利用小麦和水稻EST序列来建立小麦背景中希尔斯山羊草2Ss 染色体分子标记，对快速选育抗小麦白粉病、高铁和锌含量的小麦品种，具有很重要的实际意义。
发明内容
为了解决以上现有技术中没有希尔斯山羊草2Ss染色体的PCR标记的问题，本发明提供了一种能够快捷、有效、简便地鉴定待测样本中是否含有希尔斯山羊草2Ss染色体的方法。本发明的目的是建立希尔斯山羊草2Ss染色体特异分子标记，并将建立的分子标记应用于小麦-希尔斯山羊草杂交后代的筛选工作。
本发明还提供了所述希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记在杂交种质筛选与鉴定中的应用。
本发明是通过以下措施得到的：
本发明所建立的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记是MAG3253-EST-SSR、MAG3930-EST-SSR、BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70，其序列和扩增特异片段长度如表3所示。本发明所提供的检测小麦背景中希尔斯山羊草2Ss染色体的新方法，是以待测希尔斯山羊草、小麦-希尔斯山羊草附加系及小麦对照（表1）基因组总DNA为模板，对EST-STS、EST-STS、COS和PLUG引物进行筛选，筛选出能在希尔斯山羊草和小麦-希尔斯山羊草2Ss附加系中扩增出特异DNA条带的引物，引物筛选的统计结果见表2。再用筛选出的引物对小麦-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系进行扩增，确证相应特异DNA条带仅小麦-希尔斯山羊草2Ss附加系能扩增出而其他6个附加系（1Ss、3Ss-7Ss）和小麦对照（表1）不能扩增出，确证相应DNA条带为希尔斯山羊草2Ss染色体特有。进而，利用这些引物再对2SsS和2SsL端体附加系进行PCR扩增，将这些DNA片段定位在2SsS或2SsL染色体臂上。各引物检测特异扩增产物长度如表3所示。
一种基于小麦和水稻EST序列的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记，
短臂引物对碱基序列如下：
MAG3253-EST-SSR：
F：5’- CTGCTGCTTGGGATCATTCT-3’，（见序列表中序列1）
R:：5’- GCTGGTGAGAGTTGGAAACC-3’， （见序列表中序列2）
MAG3930-EST-SSR：
F：5’- CCTCCAAAGAGAAGCCATGA-3’， （见序列表中序列3）
R:：5’- ATGCCCTTGAGGACGAACT-3’， （见序列表中序列4）
长臂引物对碱基序列如下：
BE444521-EST-STS：
F：5’-CCAATGACTGGCATGTGAAG-3’， （见序列表中序列5）
R：5’-CTTCGGATCGAGACACTTCC-3’， （见序列表中序列6）
TNAC1137-PLUG：
F：5’-GCTGAATCACTCAACCATTCC-3’， （见序列表中序列7）
R：5’-TGCTCGCGCTCTACTTCAC-3’， （见序列表中序列8）
TNAC1139-PLUG：
F：5’-ATGTTGTCCATGCCTCCACTT-3’， （见序列表中序列9）
R：5’-:CTGGAATTCTCCGTCTGCTTA-3’， （见序列表中序列10）
TNAC1210-PLUG：
F：5’-TTGTGACTGACAGCAACATCC-3’， （见序列表中序列11）
R：5’-AGAGCTTGGCCTTCTCTTCC-3’， （见序列表中序列12）
MAG4271-EST-SSR：
F：5’- CTGCTGTTAAGGCAAGCACA-3’， （见序列表中序列13）
R：5’-TACCTCCCCCAATACGTGTC-3’， （见序列表中序列14）
MAG3512-EST-SSR：
F：5’-ACGCAAAGCCCAAATACATC-3’， （见序列表中序列15）
R：5’-CAGGCTCCTCCTCTACGTCA-3’， （见序列表中序列16）
MAG3798-EST-SSR：
F：5’-ATTGCGAGACGGATAACGAA-3’， （见序列表中序列17）
R：5’-GCTTACGAGCGAACATCAGG-3’， （见序列表中序列18）
COS40：
F：5’-GTGCTGCTGCCATTACTTTAG-3’， （见序列表中序列19）
R：5’-AGCAGCAGCCAATTGAAG-3’， （见序列表中序列20）
COS65：
F：5’-GTGAGGATTCCTGATTGTGG-3’， （见序列表中序列21）
R：5’-ACGGTTAACACGAAGAATCG-3’， （见序列表中序列22）
COS70：
F：5’-AACCTTCTGTTTTGGAGGTTC-3’， （见序列表中序列23）
R：5’-TGGTAAAAAGCCCAGCTTC-3’， （见序列表中序列24）
希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记为上述12对引物中的一对以上的组合或者一对以上的短臂引物对与一对以上的长臂引物对的组合。
所述的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记的应用，使用所述的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记进行PCR扩增，对小麦背景中是否含有希尔斯山羊草2Ss染色体进行检测或辅助检测。
所述的应用，优选检测或辅助检测步骤如下：
（1）以待测的可能含有希尔斯山羊草2Ss染色体或染色体片段的小麦背景系的基因组总DNA为模板，用权利要求1所述的希尔斯山羊草2Ss染色体特异分子标记分别对模板和对照进行PCR扩增，扩增结果使用凝胶电泳进行检测；
（2）如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有特异DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中含有希尔斯山羊草2Ss染色体；如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有特异DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中不含有希尔斯山羊草2Ss染色体。
所述的应用，优选步骤（1）中使用希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系为阳性对照，以中国春小麦和/或其他不同小麦品种/品系为阴性对照。
其中， EST-STS、COS和PLUG引物扩增反应体系为15 μL ，包括25 ng/μL的模板DNA 1μL， 5 U/μL Taq DNA polymerase（申能博彩公司）0.15μL，200 μM的dNTPs（博奥公司），含Mg2+的10× PCR buffer 1.5 μL（申能博彩公司），10 μM的上、下游引物各 1 μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至15μL。PCR反应在BIO-RAD PCR扩增仪上进行，扩增程序为：94 ℃预变性3 min，随后35个循环：94 ℃变性45 S，57 ℃退火45 S，72 ℃延伸2 min，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。而EST-SSR引物扩增体系和上述扩增体系一致，仅需要把退火温度调整为52 ℃。
EST-SSR和COS引物扩增产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TBE。 取15μL扩增产物，加入3μL指示剂（含0.1％溴酚蓝和0.1％二甲苯青），混匀，上样量3 μL，180V恒定电压电泳约55min。经硝酸银染色30 min后观察照相。PLUG和EST-STS引物的扩增产物进行2%的琼脂凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE。扩增产物10ul在150V恒压下电泳约25min，然后用1ug/mL的溴化乙锭溶液进行染色30min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下扫描照像。
本发明的有益效果：
（1）本发明利用小麦和水稻EST序列建立了希尔斯山羊草2Ss染色体的新标记，拓宽了小麦和水稻EST序列的使用范围，提供了检测小麦背景中希尔斯山羊草2Ss染色体的新方法；
（2）本发明的希尔斯山羊草2Ss染色体特异标记引物序列位于小麦和水稻各FL（Fragment Length）区段，根据比较基因组学原理，这些标记也位于2Ss染色体各FL区段，因此可以综合利用这些标记鉴定涉及2Ss染色体易位断点的材料；
（3）本发明的特异性分子标记，对小麦背景中是否含有希尔斯山羊草2Ss染色体进行检测或辅助检测，特异性强，检测准确率高，提高筛选效率，对辅助选育籽粒微量元素（Fe和Zn）高且抗小麦白粉病的小麦新品系/品种具有积极的产业化价值。
附图说明
图1.引物MAG3253扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物MAG3253对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG3253对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG3253对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图2.引物MAG3930扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物MAG3930对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG3930对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG3930对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图3.引物BE444521扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物BE444521对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物BE444521对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物BE444521对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图4.引物TNAC1137扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物TNAC1137对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物TNAC1137对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物TNAC1137对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图5.引物TNAC1139扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物TNAC1139对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物TNAC1139对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物TNAC1139对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图6.引物TNAC1210扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物TNAC1210对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物TNAC1210对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物TNAC1210对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图7.引物MAG4271扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物MAG4271对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG4271对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG4271对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图8.引物MAG3512扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物MAG3512对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG3512对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG3512对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图9.引物MAG3798扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物MAG3798对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物MAG3798对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG3798对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图10.引物COS40扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物COS40对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物COS40对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物COS40对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图11.引物COS65扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物COS65对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物COS65对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物COS65对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图12.引物COS70扩增产物的凝胶电泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物COS70对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物COS70对中国春-希尔斯山羊草1Ss-7Ss附加系和中国春的扩增结果，C图为引物COS70对中国春-希尔斯山羊草2Ss 附加系、中国春-希尔斯山羊草2Ss短臂和2Ss长臂端体附加系以及中国春的扩增结果；
图13为引物MAG3253对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图14.引物MAG3930对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图15.引物BE444521对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图16.引物TNAC1137对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图17.引物TNAC1139对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图18.引物TNAC1210对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图19.引物MAG4271对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图20.引物MAG3512对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图21.引物MAG3798对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图22.引物COS40对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图23.引物COS65对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图24.引物COS70对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系、中国春、中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体的扩增产物凝胶电泳图；
图25.基因组原位杂交鉴定分子标记鉴定出的部分中国春2B缺体和中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系的部分杂交F2分离群体的杂交图谱，其中，图A、B、C分别为杂交后代植株AS-17、AS-96和AS-185的基因组原位杂交结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所用PCR体系方法与发明内容部分的描述的PCR体系及方法相同，所有引物合成均由成都瑞信生物公司完成。所用TA编号的实验材料（表1）全部由美国堪萨斯州立大学小麦基因组学与遗传资源中心Gill BS教授惠赠，公众可从美国堪萨斯州立大学小麦基因组学与遗传资源中心（http://www.k-state.edu/wgrc/）有偿获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的绵阳11小麦（MY11）和中国春（CS）（Liu C, Yang ZJ, Li GR, Zeng ZX, Zhang Y, Zhou JP, Liu ZH, Ren ZL. 2008. Isolation of a new repetitive DNA sequence from Secale africanum enables targeting of Secale chromatin in wheat background. Euphytica, 159(1-2): 249-258.）；绵阳15（MY15）（Zhou JP, Zhang HY, Yang ZJ, Li GR, Hu LJ, Lei MP, Liu C, Zhang Y, Zhang Y, Ren ZL. 2012. Characterization of a new T2DS.2DL-?R translocation triticale ZH-1 with multiple resistances to diseases.Genet Resour Crop Evol,59(6):1161-1168.）由电子科技大学生命科学与技术学院杨足君教授提供，公众可从山东省农业科学院作物所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。AeSe-1—AeSe-192为中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体。
表1. 供试材料
| 序号 | 材料 | 种质库编号 | 基因组 |
| 1 | 一粒小麦 | TA136 | AA |
| 2 | 圆锥小麦 | TA10543 | AABB |
| 3 | 绵阳11 | MY11 | AABBDD |
| 4 | 绵阳15 | MY15 | AABBDD |
| 5 | 中国春 | CS | AABBDD |
| 6 | 希尔斯山羊草 | TA1839 | SsSs |
| 7 | 中国春-希尔斯山羊草1Ss附加系 | TA3580 | AABBDD + 1对1Ss染色体 |
| 7 | 中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系 | TA 3581 | AABBDD + 1对2Ss染色体 |
| 8 | 中国春-希尔斯山羊草3Ss附加系 | TA 3582 | AABBDD + 1对3Ss染色体 |
| 9 | 中国春-希尔斯山羊草4Ss附加系 | TA 3583 | AABBDD + 1对4Ss染色体 |
| 11 | 中国春-希尔斯山羊草5Ss附加系 | TA3584 | AABBDD + 1对5Ss染色体 |
| 12 | 中国春-希尔斯山羊草6Ss附加系 | TA 3585 | AABBDD + 1对6Ss染色体 |
| 13 | 中国春-希尔斯山羊草7Ss附加系 | TA 3586 | AABBDD + 1对7Ss染色体 |
| 14 | 中国春-希尔斯山羊草2SsS端体附加系 | TA7531 | AABBDD + 1对2SsS 端体 |
| 15 | 中国春-希尔斯山羊草2SsL端体附加系 | TA7532 | AABBDD + 1对2SsL 端体 |
| 16 | 中国春2B单体 | TA6553 | AABBDD + 1条2B |
| 17 | 中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2群体 | AeSe1-AeSe192 | 未鉴定 |
注： 1Ss-7Ss为希尔斯山羊草第一到第七同源群染色体。TA7531和TA7532的2Ss后面的S和L分别代表short arm（短臂，简写为S）和 long arm（长臂，简写为L）
1、引物的设计与合成
从国际小麦EST定位工程网（http://wheat.pw.usda.gov/NSF/data.html）选用99个已经被定位在小麦染色体第二同源群的EST序列为基础来设计EST-STS引物，共设计引物99对。并且合成了依据小麦EST序列设计的小麦第二同源群的EST-STS引物99对、EST-SSR引物58对和COS引物53对；还合成了依据水稻EST序列设计的小麦第二同源群PLUG引物18对，共合成第二同源群引物228对。所有引物的合成均由成都瑞信生物公司合成，合成引物数及筛选结果如表2所示。
表2. 筛选引物的统计结果
| 引物 | 筛选引物对数 | 获得多态性的引物对数 | 多态性比例 |
| EST-STS | 99 | 1 | 1.0% |
| EST-SSR | 58 | 5 | 8.6% |
| COS | 53 | 3 | 7.5% |
| PLUG | 18 | 3 | 16.7% |
2、引物的筛选与希尔斯山羊草2Ss染色体特异DNA片段的获得
以希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系与一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春5个小麦对照为材料，提取其基因组DNA，用合成的第二同源群引物对这7份材料进行扩增，结果发现，1对EST-STS引物（1.0%）、5对EST-SSR（8.6%）、3对COS引物（7.5%）和3对PLUG引物（16.7%）能在中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系中扩增出特异DNA片段，而小麦对照中则没有这些扩增片段，说明这些特异片段来自希尔斯山羊草。可以在希尔斯山羊草和中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系中扩增出特异性片段的12对引物分别为MAG3253-EST-SSR、MAG3930-EST-SSR、BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70（表2和表3），其扩增结果分别如图1-12中的A图所示，其中箭头所示为希尔斯山羊草染色体特异片段。
表3希尔斯山羊草2S s 染色体特异标记及其相关信息
注: “-”未用限制性内切酶. “*” 表示PCR产物需要用8%的非变性聚丙烯酰胺胶（PAGE）进行分离和银染。未用*标注的引物则用2%的琼脂糖胶进行分离，用1ug/ml的EB（溴化乙锭）溶液进行染色。
3、希尔斯山羊草2Ss单染色体特异片段的验证
研究发现，同一DNA序列可能同时出现在同一物种不同同源群染色体上。为了验证上述获得的12个染色体特异片段仅分布在希尔斯山羊草2Ss染色体上，以一套中国春-希尔斯山羊草附加系（1Ss-7Ss附加系）和中国春对照为材料，用上述获得的12对第二同源群引物（表3）进行扩增，发现这12对引物仅能在中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系中扩增出目标特异片段（见图1-12中的图B，图中箭头所示为利用引物获得的希尔斯山羊草2Ss单染色体特异片段），而其余6个附加系和小麦中国春均未扩增出相应片段，说明这些片段为希尔斯山羊草2Ss染色体特异标记。
4、希尔斯山羊草2Ss单染色体臂特异标记的建立
为了进一步将获得的12个标记定位在希尔斯山羊草染色体臂上，我们以中国春-希尔斯山羊草2SsS和2SsL端体附加系为材料，用上述筛选出的12对引物对其进行扩增，结果发现，这12个标记中，MAG3253-EST-SSR和MAG3930-EST-SSR被定位在希尔斯山羊草2Ss短臂（2SsS）上，BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70被定位在2Ss长臂（2SsL）上，扩增结果见图1-12中的C图，图中箭头所示为希尔斯山羊草2SsS 或2SsL染色体端体特异片段。
5、获得标记对杂交群体筛选与鉴定的实用性
为了验证获得标记的实用性，我们从中国春2B单体（2n=41）后代中筛选出染色体数目2n=40的2B缺体植株。将中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系与中国春2B缺体进行杂交，其杂交F1中因为存在2B和2Ss双单体，不能正常配对，因此，2B和2Ss容易在着丝粒处发生断裂并重接。我们利用获得的希尔斯山羊草2Ss标记对中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss杂交F2的部分分离群体进行筛选与鉴定。
用获得的12个分子标记对中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss杂交F2的192个分离单株进行扩增，结果见表4，AeSe-1、AeSe-6和AeSe-12等53个单株可以扩增出2SsL标记BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70，而不能扩增出2SsS标记MAG3253-EST-SSR和MAG3930-EST-SSR，说明这53个单株中含有希尔斯山羊草2SsL而不含2SsS（表4）；AeSe-9、AeSe-16和AeSe-18等47个单株不能扩增出2SsL标记BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70，但是可以扩增出2SsS标记MAG3253-EST-SSR和MAG3930-EST-SSR，说明这47个单株中含有希尔斯山羊草2SsS而不含2SsL；AeSe-2、AeSe-7和AeSe-10等44个单株既不能扩增出2SsL标记BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70，也不能扩增出2SsS标记MAG3253-EST-SSR和MAG3930-EST-SSR，说明这44个单株不含希尔斯山羊草2Ss染色体；AeSe-3、AeSe-4和AeSe-8等48个单株能扩增出全部12个第二同源群标记，说明这48个植株中含有2Ss整条染色体。希尔斯山羊草2Ss染色体的12个标记对中国春2B缺体/中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系杂交F2的扩增产物的筛选群体电泳图分别如图13-24所示，扩增结果统计见表4，此标记可以应用于杂交群体的初步筛选与鉴定。
表4. 希尔斯山羊草2S
s
染色体特异标记对分离群体的扩增结果统计表
| 材料/引物 | MAG3253 | MAG3930 | BE444521 | TNAC1137 | TNAC1139 | TNAC1210 | MAG4271 | MAG3512 | MAG3798 | MAG2956 | COS40 | COS65 | COS70 |
| AeSe-1 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-2 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-3 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-4 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-5 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-6 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-7 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-8 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-9 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-10 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-11 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-12 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-13 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-14 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-15 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-16 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-17 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-18 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-19 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-20 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-21 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-22 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-23 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-24 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-25 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-26 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-27 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-28 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-29 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-30 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-31 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-32 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-33 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-34 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-35 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-36 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-37 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-38 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-39 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-40 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-41 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-42 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-43 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-44 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-45 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-46 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-47 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-48 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-49 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-50 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-51 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-52 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-53 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-54 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-55 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-56 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-57 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-58 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-59 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-60 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-61 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-62 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-63 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-64 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-65 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-66 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-67 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-68 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-69 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-70 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-71 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-72 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-73 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-74 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-75 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-76 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-77 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-78 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-79 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-80 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-81 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-82 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-83 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-84 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-85 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-86 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-87 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-88 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-89 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-90 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-91 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-92 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-93 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-94 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-95 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-96 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-97 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-98 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-99 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-100 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-101 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-102 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-103 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-104 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-105 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-106 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-107 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-108 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-109 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-110 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-111 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-112 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-113 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-114 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-115 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-116 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-117 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-118 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-119 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-120 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-121 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-122 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-123 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-124 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-125 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-126 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-127 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-128 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-129 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-130 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-131 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-132 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-133 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-134 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-135 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-136 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-137 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-138 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-139 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-140 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-141 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-142 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-143 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-144 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-145 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-146 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-147 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-148 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-149 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-150 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-151 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-152 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-153 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-154 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-155 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-156 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-157 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-158 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-159 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-160 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-161 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-162 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-163 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-164 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-165 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-166 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-167 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-168 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-169 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-170 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-171 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-172 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-173 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-174 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-175 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-176 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-177 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-178 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-179 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-180 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-181 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-182 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-183 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-184 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-185 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-186 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-187 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-188 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-189 | ＋ | ＋ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AeSe-190 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
| AeSe-191 | - | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| AeSe-192 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
注： “+”表示能扩增出相应多态性DNA带，而“-”表示不能扩增出相应多态性DNA带。
6. 利用基因组原位杂交检验标记鉴定结果的准确性
为了对所建立的分子标记的准确性进行评价，本发明使用基因组原位杂交技术对杂交群体AeSe-1至AeSe-192进行了检测。 基因组原位杂交共需经历如下5个步骤：供试材料根尖前处理、染色体制片、基因组总DNA提取、探针的标记和原位杂交，具体参照文献（刘成.多年生簇毛麦基因组新重复序列的分离及其在小麦抗病新种质鉴定中的应用[D]. 电子科技大学. 2010.），其中，用地高辛标记打碎的希尔斯山羊草的基因组DNA（长度约为400-900bp）做探针，用打碎的中国春基因组DNA(长度约为200-500bp)做封阻，用1g/mL的抗褪色剂碘化丙啶（Propidium iodide,简写为PI）进行滴片观察。PI可嵌入染色体上的DNA双链，在荧光显微镜下观察，释放红色荧光；而地高辛标记的探针可与其互补单链DNA结合，在荧光显微镜下观察，释放绿色荧光，杂交信号绿色与底色红色叠加后则观察到黄色或黄绿色荧光。因为希尔斯山羊草与小麦基因组亲缘关系很近，因此，在封阻DNA加入量偏少或探针量偏多或杂交效果不理想的情况下，会有少量探针杂交到小麦染色体上，致使小麦染色体呈现橙黄色。因此，待测小麦样品中红色或橙黄色染色体为小麦染色体，有黄绿色荧光杂交信号的待测小麦含有希尔斯山羊草染色体片段，而无黄绿色荧光杂交信号的待测小麦则不含有希尔斯山羊草染色体片段。
AeSe-1、AeSe-6和AeSe-12等53个单株可以扩增出2SsL标记BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70，而不能扩增出2SsS标记MAG3253-EST-SSR和MAG3930-EST-SSR的植株中都含有黄绿色杂交信号的2SsL端体；AeSe-9、AeSe-16和AeSe-18等47个单株不能扩增出2SsL标记BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70，但是可以扩增出2SsS标记MAG3253-EST-SSR和MAG3930-EST-SSR的植株中都含有黄绿色杂交信号的2SsS端体；AeSe-2、AeSe-7和AeSe-10等44个单株既不能扩增出2SsL标记BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70，也不能扩增出2SsS标记MAG3253-EST-SSR和MAG3930-EST-SSR的植株中未发现黄色或黄绿色杂交信号，说明这44个单株不含希尔斯山羊草2Ss染色体；AeSe-3、AeSe-4和AeSe-8等48个植株中都含有1条2Ss整条染色体。其中，部分杂交后代材料的检测结果见图25， A图为AeSe-17的基因组原位杂交图，有黄色信号的是希尔斯山羊草2SsL端体（图中箭头所指）；B图为AeSe-96的基因组原位杂交图，具有黄色信号的是希尔斯山羊草1整条2Ss染色体（图中箭头所指）；C图为AeSe-185的原位杂交结果图， 未发现黄色或黄绿色杂交信号，表明该植株中没有希尔斯山羊草染色体或染色体片段。GISH检测结果与分子标记鉴定结果（表4）一致性达100%，鉴定结果相互吻合，这表明，本发明建立的希尔斯山羊草2Ss染色体在材料筛选与鉴定方面是准确的。因此，本发明建立的分子标记可以广泛应用于涉及希尔斯山羊草2Ss染色体导入小麦的分子辅助育种工作中。
希尔斯山羊草染色体2Ss染色体任一短臂标记和/或一对以上（包含一对）的长臂标记的组合使用均能对杂交分离群体进行有效鉴定，即可确定小麦背景中是否含有希尔斯山羊草2SsS和/或2SsL染色体。而一个或两个2SsS引物和多个长臂标记同时使用，可以对小麦-希尔斯山羊草小片段易位系进行筛选与检测，并有助于染色体易位断点的确定，通过上面的论述，这部分内容，是本领域技术人员能够自行预测的，在此就不一一赘述。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>山东省农业科学院作物研究所
<120>基于小麦和水稻EST序列的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记及用途
<160>24
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
CTGCTGCTTG GGATCATTCT 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>2
GCTGGTGAGA GTTGGAAACC 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>3
CCTCCAAAGA GAAGCCATGA 20
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>4
ATGCCCTTGA GGACGAACT 19
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>5
CCAATGACTG GCATGTGAAG 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>6
CTTCGGATCG AGACACTTCC 20
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>7
GCTGAATCAC TCAACCATTC C 21
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>8
TGCTCGCGCT CTACTTCAC 19
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>9
ATGTTGTCCA TGCCTCCACT T 21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>10
CTGGAATTCT CCGTCTGCTT A 21
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>11
TTGTGACTGA CAGCAACATC C 21
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>12
AGAGCTTGGC CTTCTCTTCC 20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>13
CTGCTGTTAA GGCAAGCACA 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>14
TACCTCCCCC AATACGTGTC 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>15
ACGCAAAGCC CAAATACATC 20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>16
CAGGCTCCTC CTCTACGTCA 20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>17
ATTGCGAGAC GGATAACGAA 20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>18
GCTTACGAGC GAACATCAGG 20
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>19
GTGCTGCTGC CATTACTTTA G 21
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>20
AGCAGCAGCC AATTGAAG 18
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>21
GTGAGGATTC CTGATTGTGG 20
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>22
ACGGTTAACA CGAAGAATCG 20
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>23
AACCTTCTGT TTTGGAGGTT C 21
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>24
TGGTAAAAAG CCCAGCTTC 19
Claims (7)
1.一种基于小麦和水稻EST序列的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记，其特征在于
短臂引物对碱基序列如下：
MAG3253-EST-SSR：
F：5’- CTGCTGCTTGGGATCATTCT-3’，
R:：5’- GCTGGTGAGAGTTGGAAACC-3’，
MAG3930-EST-SSR：
F：5’- CCTCCAAAGAGAAGCCATGA-3’，
R:：5’- ATGCCCTTGAGGACGAACT-3’，
长臂引物对碱基序列如下：
BE444521-EST-STS：
F：5’-CCAATGACTGGCATGTGAAG-3’，
R：5’-CTTCGGATCGAGACACTTCC-3’，
TNAC1137-PLUG：
F：5’-GCTGAATCACTCAACCATTCC-3’，
R：5’-TGCTCGCGCTCTACTTCAC-3’，
TNAC1139-PLUG：
F：5’-ATGTTGTCCATGCCTCCACTT-3’，
R：5’-:CTGGAATTCTCCGTCTGCTTA-3’，
TNAC1210-PLUG：
F：5’-TTGTGACTGACAGCAACATCC-3’，
R：5’-AGAGCTTGGCCTTCTCTTCC-3’，
MAG4271-EST-SSR：
F：5’- CTGCTGTTAAGGCAAGCACA-3’，
R：5’-TACCTCCCCCAATACGTGTC-3’，
MAG3512-EST-SSR：
F：5’-ACGCAAAGCCCAAATACATC-3’，
R：5’-CAGGCTCCTCCTCTACGTCA-3’，
MAG3798-EST-SSR：
F：5’-ATTGCGAGACGGATAACGAA-3’，
R：5’-GCTTACGAGCGAACATCAGG-3’，
COS40：
F：5’-GTGCTGCTGCCATTACTTTAG-3’，
R：5’-AGCAGCAGCCAATTGAAG-3’，
COS65：
F：5’-GTGAGGATTCCTGATTGTGG-3’，
R：5’-ACGGTTAACACGAAGAATCG-3’，
COS70：
F：5’-AACCTTCTGTTTTGGAGGTTC-3’，
R：5’-TGGTAAAAAGCCCAGCTTC-3’，
希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记为上述12对引物中的一对以上的组合或者一对以上的短臂引物对与一对以上的长臂引物对的组合。
2.一种权利要求1所述的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记的应用，其特征在于使用权利要求1所述的希尔斯山羊草2Ss染色体分子标记进行PCR扩增，对小麦背景中是否含有希尔斯山羊草2Ss染色体进行检测或辅助检测。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于检测或辅助检测步骤如下：
（1）以待测的可能含有希尔斯山羊草2Ss染色体或染色体片段的小麦背景系的基因组总DNA为模板，用权利要求1所述的希尔斯山羊草2Ss染色体特异分子标记分别对模板和对照进行PCR扩增，扩增结果使用凝胶电泳进行检测；
（2）如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有特异DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中含有希尔斯山羊草2Ss染色体；如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有特异DNA条带，则说明待测小麦背景系的基因组中不含有希尔斯山羊草2Ss染色体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（1）中使用希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草2Ss附加系为阳性对照，以中国春小麦和/或其他不同小麦品种/品系为阴性对照。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于引物BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG、TNAC1210-PLUG、COS40、COS65和COS70扩增15 μL PCR反应体系为：
25 ng/μL的模板DNA 1μL， 5 U/μL TaqDNA polymerase 0.15μL，200 μM的dNTPs，含Mg2+的10× PCR buffer 1.5 μL，10μM的上、下游引物各1 μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至15 μL；
PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性3 min，随后35个循环：94 ℃变性45 S，57 ℃退火45 S，72 ℃延伸2 min，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于MAG3253-EST-SSR、MAG3930-EST-SSR、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR和MAG3798-EST-SSR扩增15 μL PCR反应体系为：
25 ng/μL的模板DNA 1μL， 5 U/μL TaqDNA polymerase 0.15μL，200 μM的dNTPs，含Mg2+的10× PCR buffer 1.5 μL，10μM的上、下游引物各1 μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至15 μL；
PCR反应扩增程序为：94 ℃预变性3 min，随后35个循环：94 ℃变性45 S，52℃退火45 S，72 ℃延伸2 min，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于MAG3253-EST-SSR、MAG3930-EST-SSR、MAG4271-EST-SSR、MAG3512-EST-SSR、MAG3798-EST-SSR、COS40、COS65和COS70引物扩增产物进行8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色；BE444521-EST-STS、TNAC1137-PLUG、TNAC1139-PLUG和TNAC1210-PLUG引物的扩增产物进行2%的琼脂让凝胶电泳，然后用1ug/mL的溴化乙锭溶液进行染色。
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| CN101760536A (zh) * | 2008-12-19 | 2010-06-30 | 李祥 | 小麦ssr标记的发展 |
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2014
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Patent Citations (1)
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