CN116497152B - 一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子标记技术领域。本发明提供了一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用，所述分子标记为Cmamg‑01，所述Cmamg‑01由DNA片段1和DNA片段2组成；所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的分子标记与控制印度南瓜果皮颜色基因紧密连锁，可以在植株苗期对其基因型进行直接选择，加快育种的进程，并为解析南瓜果皮颜色形成的调控机制提供新的基因资源和理论依据，有利于南瓜果皮颜色的精准育种。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
印度南瓜（Cucurbita maxima ）属于葫芦科（Cucurbitaceae）南瓜属（Cucurbita）一年生蔓性草本植物，起源于南美洲，种质资源丰富，具有很高的营养价值、药用价值和栽培价值，种植广泛。果皮颜色是葫芦科作物重要的农艺性状之一，不同地域的消费人群对于南瓜果皮颜色有着不同的需求，其颜色的深浅以及均匀程度直接影响南瓜的商品价值。印度南瓜果皮颜色丰富多样，南瓜子房在授粉前呈浅黄或浅绿色，随着发育逐渐变为白色、浅黄色、深黄色、绿色、深绿色、橙红色、黑色等，可以大体分为绿色系，红色系和黄色系。其中绿色系果皮主要色素成分为叶绿素，红色系果皮从浅橙色到深红色变化与类胡萝卜素总含量及组成有关，黄色系果皮中叶绿素和类胡萝卜素含量都较低。
果皮着色程度是评价园艺作物成熟度和是否采收的重要指示标准，不仅对植物的生长发育具有重要的生理意义，也是消费者对不可鲜食蔬菜进行挑选时最直观的选择标准。因此，对于葫芦科作物来说，果皮颜色一直是育种家和种植者在育种以及栽培过程中的重点关注性状。目前，有关印度南瓜果皮颜色基因定位及相关分子标记开发的研究较少。基于此，提出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用，在植株苗期对其基因型进行直接选择，加快育种的进程。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记，所述分子标记为Cmamg-01，所述Cmamg-01由DNA片段1和DNA片段2组成；
所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为优选，所述DNA片段1与灰色果皮基因Cmamg连锁，所述DNA片段2与绿色果皮基因CmaMG连锁。
本发明还提供了所述分子标记在南瓜果皮颜色检测中的应用。
本发明还提供了一种用于检测分子标记的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了所述引物对在南瓜果皮颜色检测中的应用。
本发明还提供了所述引物对在扩增所述分子标记中的应用。
本发明还提供了一种利用引物对扩增分子标记的方法，所述方法包括如下扩增程序：92~96℃ 3.5~4.5min；92~96℃ 28~32s；62~66℃ 28~32秒；70~74℃ 38~42s，33~37个循环；70~74℃ 4.5~5.5min，降温至2~6℃。
本发明还提供了一种所述引物对检测所述分子标记的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）提取待测印度南瓜材料的全基因组DNA；
（2）利用所述引物对进行PCR扩增；
（3）观察扩增的结果，具有灰色果皮表型的单株通过PCR扩增产生312 bp单一特征条带；具有绿色果皮表型的纯合单株产生892 bp的单一特征条带；具有绿色果皮表型但该位点为杂合基因型时，PCR扩增获得892 bp和312 bp的两条特征条带。
本发明提供了一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用，所述分子标记为Cmamg-01，所述Cmamg-01由DNA片段1和DNA片段2组成；所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的分子标记与控制印度南瓜果皮颜色基因紧密连锁，可以在植株苗期对其基因型进行直接选择，加快育种的进程，并为解析南瓜果皮颜色形成的调控机制提供新的基因资源和理论依据，有利于南瓜果皮颜色的精准育种。
附图说明
图1为InDel标记Cmamg-01 F2群体PCR产物条带，M代表Marker，P1为印度南瓜品系银辉二号，P2为印度南瓜品系谢花面， F1为利用这两个亲本配制F1代，1~93为部分F2群体；
图2为InDel标记Cmamg-01 种质资源PCR产物条带，M代表Marker，种质资源有14个绿色果皮种质和9个灰色果皮种质。
具体实施方式
本发明提供了一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记，所述分子标记为Cmamg-01，所述Cmamg-01由DNA片段1和DNA片段2组成；
所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1：
AGTCCTCTTCAGCGGCTCCGTTGGACAACCTCCTTGTTCCGGTTAATTTTCAGGCCTATTAGTCGGAAGAACAGTAACGAATCTATCGATATTCTGCTGGCTACAGTTTGTTTCACTGTTCAGTTAGGGTTTACTCCGAGTTGCCTTCTTCAGGTGTAGATTCGTTAGTATTATGTTTCGTTTGGTGCATTATTCTCATTTCATGTTTGTGGCCTCGTAGATCGGTGCACCGCCGGAGGTCGCTAATATCCTAGGCAGAAGCGTTCGAGGAAGAGACATCGGCGAAAGAACTTCGGGCGTTTCAACTTGCTT；
所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.2：
AGTCCTCTTCAGCGGCTCCGTTGGACAACCTCCTTGTTCCGGTTAATTTTCAGGCCTATTCTACTGCTTCTGCAGACTATTCTCATTGGCTTCAGGTTTTTGGATCGGGACACGTACCGTCGGTGTCGTCGGGGGACTACGATGCCGCTTTGGCGGTTGTTTCCGAGGAGGAGTCTGCCGGTGCAATTAGAGAGAAAATTGCTTCTCATCCTCTTTACCCTAGACTTGTCGATGCGTTTGTTGACTGCCAAAAGGTGGTTTTCTACTCTAAGCTTTAAGGCCACGACGTTCTAAACTTTAAAGAAATAATGCAATGCTTATGGTTGGATGTTAAGGAATGAAGAAAGATTCTTAAGAAATTTGTATGAGTGAGTAATTCTTTACGCCGTCAAAAAACTCGATACAGACTTGTTAACACTCACGAAATTAATTCAAAGACGGCATAGTACATGTCAAACTAGTTCAGTAGTTTTTAAGTTAATCGTTTACATGTTGAGTGATGAAATTGTGCGAATCTGTTCCTCTTGTATTCTGGAAGCCTAGAGTAAATCTTCTGGCCTTTTTCGTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTATATACTCAATCGGATTTCAGTAAGGAGAAAAATGAACGAAAACCGAAGATATTAGTCGGAAGAACAGTAACGAATCTATCGATATTCTGCTGGCTACAGTTTGTTTCACTGTTCAGTTAGGGTTTACTCCGAGTTGCCTTCTTCAGGTGTAGATTCGTTAGTATTATGTTTCGTTTGGTGCATTATTCTCATTTCATGTTTGTGGCCTCGTAGATCGGTGCACCGCCGGAGGTCGCTAATATCCTAGGCAGAAGCGTTCGAGGAAGAGACATCGGCGAAAGAACTTCGGGCGTTTCAACTTGCTT。
在本发明中，所述分子标记位于印度南瓜基因组DNA第11号染色体KASP422和KASP454标记之间的32.34 kb区间内，在染色体上的物理位置在422692~454930 bp之间。
在本发明中，所述DNA片段1优选与灰色果皮基因Cmamg连锁，所述DNA片段2优选与绿色果皮基因CmaMG连锁。
本发明还提供了所述分子标记在南瓜果皮颜色检测中的应用。
本发明还提供了一种用于检测分子标记的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
SEQ ID NO.3：AGTCCTCTTCAGCGGCTC；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.4：GGGCGTTTCAACTTGCTT。
本发明还提供了所述引物对在南瓜果皮颜色检测中的应用。
本发明还提供了所述引物对在扩增所述分子标记中的应用。
本发明还提供了一种利用引物对扩增分子标记的方法，所述方法优选包括如下扩增程序：92~96℃ 3.5~4.5min；92~96℃ 28~32s；62~66℃ 28~32秒；70~74℃ 38~42s，33~37个循环；70~74℃ 4.5~5.5min，降温至2~6℃，进一步优选为94℃ 4min；94℃ 30s；64℃ 30秒；72℃ 40s，35个循环；72℃ 5min，降温至4℃。
本发明还提供了一种所述引物对检测所述分子标记的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）提取待测印度南瓜材料的全基因组DNA；
（2）利用所述引物对进行PCR扩增；
（3）观察扩增的结果，具有灰色果皮表型的单株通过PCR扩增产生312 bp单一特征条带；具有绿色果皮表型的纯合单株产生892 bp的单一特征条带；具有绿色果皮表型但该位点为杂合基因型时，PCR扩增获得892 bp和312 bp的两条特征条带。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 亲本材料的来源
灰色果皮亲本为印度南瓜品系银辉二号，果皮颜色为灰色，种子大、雪白。
绿色果皮亲本为印度南瓜品系谢花面，果皮颜色为绿色、种子颜色为黄色，果肉甜糯。
实施例2 F2分离群体的构建
将作为灰色果皮亲本的印度南瓜银辉二号编号为P1，作为绿色果皮亲本的印度南瓜谢花面编号为P2，利用P1和P2这两个亲本配制F1代，F1代自交产生F2代群体。在F2群体鉴定果皮颜色表型，最后分析F1表型和F2分离比，卡方分析法进行验证，得出印度南瓜灰色果皮性状是由一个单基因控制的隐性性状。
实施例3 印度南瓜基因组DNA的提取
用CTAB法提取亲本及F2分离群体叶片的基因组总DNA。取刚刚展开的一片真叶至2.0 mL离心管中，并将离心管标注植株编号，在离心管中加入3颗已消毒的钢珠，于-80℃冷冻1小时，使钢珠及叶片冷冻充分。将冷冻后的材料通过磨样机研磨。研磨充分的样品加入1ml的CTAB溶液（CTAB提前配置完成，加入2% 的β-巯基乙醇并于65℃恒温水浴锅中预热），将样品在65℃恒温水浴锅中温浴1h，水浴过程中每间隔10min颠倒混匀样品，使其水浴均匀。水浴结束后，12000rpm离心12min。提取上清液800µl，等体积加入24:1氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀。12000rpm离心15min。取上清600µl，加入24:1氯仿/异戊醇600µl，轻轻混匀。12000rpm离心15min。取上清400µl于无菌的1.5ml离心管中，加入提前预冷的异丙醇400µl，混匀充分后于-20℃冰箱中，使DNA沉淀1h。12000rpm离心15min，弃上清液。取200µl的70 %乙醇溶液清洗DNA沉淀两次，放在通风橱中晾干DNA。加入100 µl超纯水，加入2µl去RNA酶37℃恒温水浴1h，4℃过夜溶解DNA。利用琼脂糖凝胶电泳对DNA质量进行检测，紫外分光光度计对DNA的浓度进行检测。
实施例4 InDel标记开发与验证
结合BSA-Seq技术、InDel分子标记和KASP基因分型精细定位控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg，根据该基因参考基因组序列，克隆两个亲本中的该基因，根据克隆出的序列，最终开发了一个位于该基因内部的InDel分子标记。利用该分子标记扫描上述F2分离群体，验证标记型是否与性状表现型一致。PCR体系： DNA模板0.5 µL，上下引物各0.25 µL，2×Es Taq MasterMix 4.5 µL，ddH2O 4.5 µL。总反应体系为10 μL。PCR程序：94℃ 4分钟；94℃ 30秒；64 ℃ 30秒；72℃ 40秒，35个循环；72℃ 5 分钟，降温至4℃。PCR产物通过2 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测，通过琼脂糖凝胶成像系统观察成像结果。InDel标记Cmamg-01在两个亲本、F1和F2群体中扩增产物进行电泳检测，结果如图1所示。具有灰色果皮表型的单株通过PCR扩增产生312 bp单一特征条带；具有绿色果皮表型的纯合单株产生892bp的单一特征条带；正常绿色果皮但该位点为杂合基因型时，PCR扩增获得892bp和312bp的两条特征条带。InDel标记Cmamg-01在种质资源群体中扩增产物进行电泳检测，结果如图2所示。具有灰色果皮表型的单株通过PCR扩增产生312 bp单一特征条带；具有绿色果皮表型的单株产生892bp的单一特征条带。
结论：
本发明利用印度南瓜灰色果皮品系银辉二号和印度南瓜绿色果皮品系谢花面杂交获得F1植株，F1植株自交的1703株F2分离群体，通过遗传规律分析确定了印度南瓜绿色果皮属于单基因控制的显性性状，灰色果皮属于隐性性状。分别取F2分离群体和BC1分离群体每株嫩叶提取基因组DNA，结合BSA-Seq技术、InDel分子标记和KASP基因分型精细定位出控制印度南瓜灰色果皮基因位于印度南瓜基因组DNA第11号染色体KASP422和KASP454标记之间的32.34 kb区间内，在染色体上的物理位置在422692~454930 bp之间。通过对双亲的序列分析可知，根据银辉二号的DNA基因组第11染色体的第446398 bp处存在580bp的序列缺失，最终开发了一个InDel分子标记，该分子标记的开发便于印度南瓜果皮颜色性状的分子标记辅助育种体系建立。本发明的分子标记可简便、快捷、高通量的应用于育种实践中。
由以上实施例可知，本发明提供了一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记及其应用，所述分子标记为Cmamg-01，所述Cmamg-01由DNA片段1和DNA片段2组成；所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的分子标记与控制印度南瓜果皮颜色基因紧密连锁，可以在植株苗期对其基因型进行直接选择，加快育种的进程，并为解析南瓜果皮颜色形成的调控机制提供新的基因资源和理论依据，有利于南瓜果皮颜色的精准育种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种与控制印度南瓜灰色果皮颜色基因Cmamg紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Cmamg-01，所述Cmamg-01由DNA片段1和DNA片段2组成；
所述DNA片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述DNA片段1与灰色果皮基因Cmamg连锁，所述DNA片段2与绿色果皮基因CmaMG连锁。
3.权利要求1或2所述分子标记在印度南瓜果皮颜色检测中的应用。
4.一种用于检测权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.权利要求4所述引物对在印度南瓜果皮颜色检测中的应用。
6.权利要求4所述引物对在扩增权利要求1所述分子标记中的应用。
7.一种利用权利要求4所述引物对扩增权利要求1所述分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括如下扩增程序：92～96℃3.5～4.5min；92～96℃28～32s；62～66℃28～32秒；70～74℃38～42s，33～37个循环；70～74℃4.5～5.5min，降温至2～6℃。
8.一种利用权利要求4所述引物对检测权利要求1所述分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测印度南瓜材料的全基因组DNA；
(2)利用权利要求4所述引物进行PCR扩增；
(3)观察扩增的结果，具有灰色果皮表型的单株通过PCR扩增产生312bp单一特征条带；具有绿色果皮表型的纯合单株产生892bp的单一特征条带；具有绿色果皮表型但该位点为杂合基因型时，PCR扩增获得892bp和312bp的两条特征条带。
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106636393A (zh) * | 2016-12-19 | 2017-05-10 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 与南瓜皮色基因连锁的snp分子标记及其应用 |
| CN106916897A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-07-04 | 东北农业大学 | 一种用于鉴定印度南瓜‘银辉三号’杂交种子纯度的分子标记及其应用 |
| WO2019128461A1 (zh) * | 2017-12-26 | 2019-07-04 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 与南瓜光周期不敏感性状紧密连锁的Indel分子标记及其应用 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Genetic Mapping and Identification of the Candidate Gene for White Seed Coat in Cucurbita maxima";Yuzi Shi et al.;《Int. J. Mol. Sci.》;第22卷;第1-19页 * |
| "印度南瓜果皮和果肉颜色遗传分析及基因定位";葛宇等;《西北植物学报》;第35卷(第8期);第1524-1529页 * |
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