CN105154566B - 一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法，包括：提取待测水稻植株和对照水稻植株的基因组DNA，加入特异性引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，然后进行HRM分析，以对照植株所对应的高分辨率熔解曲线为基准线，比较待测植株与对照植株对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，判定该待测植株编辑成功。本发明方法操作简便快速、有效、结果准确、高通量、使用成本低。利用本发明的方法辅助育种，能大大提高植株筛选效率。
Description
技术领域
本项发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法。
背景技术
在现代生物学研究中，基因组编辑(Genomic editing，GE)技术是人们了解和改良基因功能的重要技术手段。基因组编辑技术的发展先后经历了锌指核酸酶(Zinc fingernucleases,ZFNs)技术、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator likeeffector nucleases，TALENs)技术、和规律成簇间隔短回文重复(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat,CRISPR)/Cas(CRISPR-assoicated)技术。这些人工核酸酶都可以在DNA靶位点产生DNA双链断裂(Double strand breaks，DSBs)，然后利用生物本身拥有的非同源末端连接或同源重组两种不同的修复机制对DSBs进行修复，实现对基因组的定点编辑。
其中，CRISPR/Cas系统是近两年来刚刚兴起但表现为最有应用前景的一项基因组编辑(Genomic editing，GE)技术，它具有操作简便、效率高等特点，已在拟南芥、烟草、水稻、高粱等植物中成功实现靶向诱变(参见：Nucleic Acids Res,2013,41(20):e188；NatBiotech,2013,31(8):688–691；Nat Biotech,2013,31(8):691–693)。其原理是利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶引导到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。利用CRISPR/Cas技术进行基因编辑有特异性、靶向性、可遗传性等优势。
因为植物和动物的细胞构造不同，植物有细胞壁，不能通过显微注射的方法获得基因编辑植株，需要农杆菌介导。以水稻为例，由CRISPR/Cas技术获得基因编辑的植株步骤是：设计两条单链oligo序列，退火形成双链DNA；将双链DNA连接到载体中，转化农杆菌；农杆菌侵染水稻愈伤组织；愈伤组织分化长成待测植株。
CRISPR技术可以在目标区段内引起不同类型的基因突变，多数为1bp插入和小片段缺失以及一个或多个碱基SNP(参见PNAS,2014,111(12):4632-4637)。在利用CRISPR/Cas技术编辑产生的水稻突变群体中，有不同比例的单株出现不同状态的突变，如：嵌合体、杂合型、双等位基因突变、纯合型，不同类型突变植株的情况不同，因此需要采用特定的方法对单株进行鉴别。
目前，对单株进行鉴别的方法，主要包括有：靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法。克隆测序的方法是将靶序列PCR扩增后，把PCR产物克隆到T载体中然后进行sanger测序，经测序后可以确切知道这条靶序列上的碱基变化。克隆测序法灵敏度高，但是相比之下价格贵，时间长，一般的做法是把筛选出的阳性植株进行测序验证。错配酶法的原理是靶序列经Cas/gRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配，错配酶(主要是T7E1酶)将识别错配的杂合双链并剪切(参见：NatGenet,1995,9:177-183；Nature,2007,449:621-624；Curr Opin Struct Biol,2008,18:86-95)。PCR产物经酶切后跑琼脂糖凝胶电泳，看是否有切割条带，若出现切割条带，则代表该植株被成功编辑。若没有出现切割条带，则代表该植株未被成功编辑。这种方法比克隆测序的方法快速，花费少，但是灵敏度不如克隆测序法，且有假阳性的情况产生。因此，对于CRISPR靶向编辑群体中的突变，目前仍缺乏一种准确率高、成本低廉、快速、高通量的单株鉴别方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法，该方法快速、准确率高、且成本低廉。
一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法，包括：
(1)以未经编辑的水稻植株为对照植株，以经靶向基因编辑获得的水稻植株为待测植株，分别提取待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA；
(2)根据与所述靶向基因编辑的靶位点相邻的基因组序列来设计特异性引物，以所提取的基因组DNA为DNA模板，加入所述特异性引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，所述DNA片段长度为200～500bp；
(3)PCR扩增完毕后直接进行高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)分析，以对照植株所对应的高分辨率熔解曲线为基准线，比较待测植株所对应的高分辨率熔解曲线与对照植株所对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，视为待测植株与对照植株的结果相同，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，视为待测植株与对照植株的结果不同，判定该待测植株编辑成功。
本发明方法中，所述靶向基因编辑是指CRISPR/Cas编辑。
本发明方法中，提取所述水稻植株(包括待测植株与对照植株)DNA时，可以采用水稻的叶片、根等组织。对水稻植株(包括待测植株与对照植株)DNA的提取方法也没有特殊要求，可以为CTAB法、SDS提取法、TPS提取法等，也可以直接采用商用试剂盒，例如：博日的植物基因组DNA提取试剂盒、天根的植物DNA提取试剂盒等，进行DNA的提取。
本发明方法中，所述DNA模板可以为直接提取的单株待测植株的基因组DNA，也可以是摩尔比为1:1的待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA的混合。
本发明方法中，所述DNA片段中GC含量过高时，采用GC buffer PCR扩增。
本发明方法中，所述DNA片段优选为200～400bp。
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向基因编辑是对水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑，所述水稻LOC_Os03g55240基因的序列如SEQ ID NO:1所示，其中第453～471位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列优选如下：
上游引物B1F：5’-GCACCGCGTCGGCCTCATGT-3’(SEQ ID NO:4)
下游引物B1R：5’-CCTGCTTAAACTCCTGGGCTTCCAC-3’(SEQ ID NO:5)
或者，
上游引物B2F：5’-TCACCGAGCACGACGTGACCTT-3’(SEQ ID NO:6)
下游引物B2R：5’-CACGCTGAGGGAGACCTCGAACA-3’(SEQ ID NO:7)
优选所述PCR扩增的反应体系如下：rTaq，0.2μL；2×GC buffer，5μL；2.5mixdNTP，1.6μL；10μM的上游引物，0.2μL；10μM的下游引物，0.2μL；10×Eva Green，1μL；50ng/μL的DNA，1μL；无菌水1.3μL；矿物油10-20μL。
优选所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
在本发明的另一些实施方案中，所述的靶向基因编辑是对水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑，所述水稻大斑基因LOC_Os12g16720的序列如SEQ ID NO:8所示，其中第764～785位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列如下：
上游引物T2F:5’-CGGTGGTGATCTCCAAGCC-3’(SEQ ID NO:11)
下游引物T2R:5’-GGGAAGAAGTCGCCGATGGT-3’(SEQ ID NO:12)
优选所述PCR扩增的反应体系如下：rTaq，0.2μL；2×GC buffer，5μL；2.5mixdNTP，1.6μL；10μM的上游引物，0.2μL；10μM的下游引物，0.2μL；10×Eva Green，1μL；50ng/μL的DNA，1μL；无菌水1.3μL；矿物油10-20μL。
优选所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
本发明方法中，对包含靶向编辑的靶位点的一段核苷酸序列设计特异性引物对，进行PCR扩增后采用HRM检测，由于CRISPR/Cas靶向编辑是针对特定的位点进行突变，CRISPR/Cas靶向编辑成功的植株的DNA只在特定的靶位点上进行突变，而正常植株和未成功编辑的植株则不会产生DNA的差异，从而实现基因分型。采用本发明方法进行筛选的结果经测序验证，准确率高，假阳性低，表明本发明的筛选方法有效、结果准确。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)本发明的筛选方法中，HRM检测不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR之后可直接用HRM检测，即可完成对样品突变的分析，省去了琼脂糖电泳等步骤，该方法具有操作简便快速的优点。
(2)本发明的筛选方法中，CRISPR靶向编辑产生的各种突变类型均能与未编辑成功的植株有效区分开来，假阳性较低，并且，经由测序验证其准确率高，该方法有效、结果准确。
(3)本发明的筛选方法中，HRM引物易于高通量操作。PCR扩增产物可以在仪器上如LightScanner上直接分型，完成对突变体植株的鉴定，因此较其他方法更加适用于高通量分析。
(4)本发明的筛选方法中，一次可以同时检测96个样品，比克隆测序和错配酶检测都要节约成本，该方法具有成本低廉的优势。
(5)利用本发明的方法辅助育种，方便、准确，节约成本，能大大提高植株筛选效率。
附图说明
图1a～1e分别为实施例1中双等位突变的待测植株样本、嵌合体的待测植株样本、纯合突变的待测植株样本、杂合突变的待测植株样本、野生型待测植株样本的高分辨率熔解曲线图。
图2a～2e分别为实施例2中双等位突变的待测植株样本、嵌合体的待测植株样本、纯合突变的待测植株样本、杂合突变的待测植株样本、野生型待测植株样本的高分辨率熔解曲线图。
图3a和3b分别为实施例3中成功编辑的突变待测植株样本与未成功编辑的野生型待测植株样本的高分辨率熔解曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。
水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑群体的获得
采用现有技术可以获得水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑群体，即：根据水稻除草剂抗性基因LOC_Os03g55240基因的DNA序列信息设计CRISPR引物，构建CRISPR载体，转入农杆菌，利用农杆菌侵染水稻的愈伤组织，愈伤组织分化长成植株，即得到一批CRISPR靶向编辑群体。
本发明实施例中水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑群体(水稻LOC_Os03g55240基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第453～471位为编辑靶位点)可以通过现有技术的各种方法获得，以下给出一个具体实例进行说明：
1、根据LOC_Os03g55240基因的DNA序列设计两条单链oligo序列DNA(http://e-crisp-test.dkfz.de/E-CRISP/designcrispr.html)，其核苷酸序列如下所示：
oligo F1：5’-GGCACGAGGTCCGCGCCATGGTG-3’(SEQ ID NO:2)
oligo R1：5’-AAACCACCATGGCGCGGACCTCG-3’(SEQ ID NO:3)
按照以下步骤退火形成双链DNA：
反应体系:DNA oligo F1(100μM)，10μl；DNA oligo R1(100μM)，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水，60μl。
反应程序：95℃变性2分钟，然后，每8秒降低0.1℃直到降到4℃。
2、切开环状的载体
反应体系：pPL-sgRNA质粒载体(购自百奥迈科生物技术有限公司)，30μl(200ng/μl，大约6μg)；10×buffer，5μl；BsaI酶，2μl；无菌水：13μl。
37℃过夜孵育8小时。
回收切开的质粒载体，浓度调至50ng/μl。
3、连接
反应体系：切开的pPL-sgRNA质粒载体，1μl(约50ng/μl)；退火后的Oligo DNA，1μl；T4连接酶，1μl；10×T4酶Buffer，1μl；无菌水，6μl。
4℃孵育2小时，然后放至16℃过夜。
4、转化感受态细胞
将上述连接产物10μl加入感受态细胞中混匀，冰上放置20分钟；42℃热激90秒后立即放入冰中放置10分钟；加入1ml的SOC液体培养基中振荡培养1小时；5000rpm离心2min；弃去上清；悬浮菌体，涂在固体LB培养基上，37℃培养过夜直到菌落长出。
5、挑选阳性克隆
挑取上述长出的菌落，放入LB液体培养基中振荡培养12小时，用质粒提取试剂盒(AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 250-Prep，购自Axygen公司)提取质粒。
6、对上述提取的质粒进行测序验证。
7、将测序验证成功的质粒转入农杆菌中。
取1μg左右的质粒DNA加入到200μl农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；在37℃水浴5min或42℃水浴1min，液氮中5min，可重复1-2次；接着冰浴2min，加入800μl YEB液体培养基，28℃、175rpm摇培3小时后，涂在含50μg/ml卡那霉素的YEB平板上；28℃培养到形成单菌落。
8、由农杆菌介导导入水稻植株
1)水稻种子消毒后，将种子转移到成熟胚(NBD/N6D)诱导培养基中，28℃暗培养7-10天；用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织置入继代培养基中，继代培养1-2次，每次2周，暗培养；1-2次继代培养后，挑取愈伤组织在继代培养基上培养4-7天后用于遗传转化。
2)挑取上述验证成功的农杆菌单克隆于4ml YEP(含50mg/lKan和30mg/l Rif)培养液中，28℃，250rpm振荡过夜培养。
3)从含有农杆菌的YEP培养液中吸取1-2ml，转入25-50ml AB(Rif 30+Kan50+As100μmol/l)液体培养基中培养，28℃，250rpm，4小时左右OD600＝0.4-0.6。
4)取培养好的菌液于离心管中，4000rmp，离心8min，弃上清。用含100μmol/l As的等体积AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.4-0.6。
5)取出继代培养4-7天的愈伤组织，放入农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间不停摇晃，也可在摇床上100rpm，振荡培养30min。
6)将愈伤组织置于垫有一层无菌滤纸的共培养基上，每皿加入1ml AAM培养液湿润滤纸，28℃暗培养3天。
7)将愈伤组织取出，用0.1M甘露醇清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)的无菌水清洗5-6遍。最后置于无菌滤纸上沥干30min。
8)将晾干的愈伤转入含500mg/l羧苄青霉素和25-30mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天。
9)将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/l羧苄青霉素和50mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，暗培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
10)最后在500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)和70mg/l潮霉素的培养基上进行第三轮筛选。
11)将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，28℃，暗培养7天，之后光照培养7天。
12)挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中，放入恒温培养室中，等待分化成苗(15-30天)，待苗长至1cm左右，放入生根培养基(1/2MS培养基)中壮苗。
13)将苗根部和茎叶分化得较完好的挑出，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，获得水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑的群体。
实施例1
上述水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑的群体为待测植株，未经编辑的水稻植株为对照植株。对待测植株进行检测和筛选的步骤如下：
1、水稻基因组DNA的提取
(1)将水稻叶片剪碎后置于2.0mL离心管中，同时放入一粒钢珠，用组织碾磨仪磨碎；
(2)加入800μL CTAB提取缓冲液(Tris-HCl，100mM，pH 8.0；EDTA，20mM，pH 8.0；NaCl，500mM；CTAB，2％)，65℃水浴40min，期间摇动3-4次；
(3)加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1)，上下颠倒混匀，10000r/min离心10min；
(4)转移上清至新的1.5mL离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置-20℃下沉淀30min，10000r/min离心10min；
(5)弃上清液，70％乙醇洗涤1次，10000rpm离心10min；
(6)弃上清液，无水乙醇洗涤1次，自然风干，溶于适量(100～200μL)TE缓冲溶液中，-20℃保存。
2、针对LOC_Os03g55240基因的靶位点设计PCR引物对(LOC_Os03g55240基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第453～471位为编辑靶位点)，进行PCR扩增:
PCR引物对：
上游引物B1F：5’-GCACCGCGTCGGCCTCATGT-3’；(SEQ ID NO:4)
下游引物B1R：5’-CCTGCTTAAACTCCTGGGCTTCCAC-3’；(SEQ ID NO:5)
由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR扩增的反应体系如下：rTaq，0.2μL；2×GC buffer，5μL；2.5mix dNTP1.6μL；10μM的上游引物B1F，0.2μL；10μM的下游引物B1R，0.2μL；10×Eva Green(荧光染料)，1μL；50ng/μL的DNA，1μL；无菌水1.3μL；矿物油10-20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
3、对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析，鉴别水稻植株是否被成功编辑：
PCR结束后，打开HRM分析的软件，运行HRM检测的系统，待机器的温度升到45℃后，将样品PCR板放入LightScanner仪器中，每秒上升0.1℃，直至温度升到98℃，停止反应。在升温的过程中，机器记录反应中样品的荧光释放量，形成高分辨率熔解曲线图。每一个样品对应一条HRM熔解曲线，以对照植株(野生型)所对应的高分辨率熔解曲线为基准线(记为水平的直线)，比较待测植株所对应的高分辨率熔解曲线与对照植株所对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，视为待测植株与对照植株的结果相同，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，视为待测植株与对照植株的结果不同，判定该待测植株编辑成功。
4、筛选结果的验证：
根据HRM分析的结果，对待测植株样本进行测序验证，验证发现：在本实施例检测的植株样本中，HRM分析的结果与测序验证的结果完全一致，没有假阳性的情况出现，可见HRM分析的准确率非常高；编辑成功的待测植株样本中，有不同比例的单株出现不同状态的突变，包括：嵌合体、杂合型、双等位基因突变、纯合型。
经由测序验证为双等位突变的待测植株样本、嵌合体的待测植株样本、纯合突变的待测植株样本、杂合突变的待测植株样本的高分辨率熔解曲线，分别如图1a-1d所示。图1a-1d中，水平的直线为基准线，是对照植株(野生型)所对应的高分辨率熔解曲线，其它曲线均为各个样品的高分辨率熔解曲线，一条曲线对应一个样品，可以看出1a-1d中的曲线的峰值(与对照的最大差异，|△F|)均大于或等于0.05，说明这些样品都与对照植株有差异，所以这些样品为CRISPR成功编辑的样品；而图1e所示为野生型待测植株样本的高分辨率熔解曲线，在图1e中的曲线与对照植株不能区分(|△F|小于0.05)，说明这些样品是未成功编辑的样品。换言之，以上CRISPR成功编辑的各种类型突变的待测植株样本均能与未经编辑的对照植株明显区分开来，而CRISPR编辑未成功的野生型待测植株样本不能与未经编辑的对照植株明显区分开来。
因此，采用实施例1的方法可以将水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑的群体中的CRISPR靶向编辑产生的各种突变类型的待测植株与未成功编辑的野生型待测植株明确区分开来。CRISPR靶向编辑产生的突变类型有双等位突变、嵌合体、纯合突变和杂合突变。结果表明CRISPR靶向编辑产生的各种类型均可以区分开，而未成功编辑的植株则与野生型一致。
实施例2
采用与实施例1基本相同的方法，对待测植株进行检测和筛选，其区别仅在于PCR扩增步骤有所不同，具体如下：
本实施例中所采用的PCR引物对如下：
上游引物B2F:5’-TCACCGAGCACGACGTGACCTT-3’；(SEQ ID NO:6)
下游引物B2R:5’-CACGCTGAGGGAGACCTCGAACA-3’；(SEQ ID NO:7)
由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR扩增的反应体系如下：rTaq，0.2μL；2×GC buffer，5μL；2.5mix dNTP1.6μL；10μM的上游引物B2F，0.2μL；10μM的下游引物B2R，0.2μL；10×Eva Green(荧光染料)，1μL；50ng/μL的DNA，1μL；无菌水1.3μL；矿物油10-20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
同样，根据HRM分析的结果，对待测植株样本进行测序验证，验证同样发现：HRM分析的结果与测序验证的结果完全一致，没有假阳性的情况出现。
经由测序验证为双等位突变的待测植株样本、嵌合体的待测植株样本、纯合突变的待测植株样本、杂合突变的待测植株样本、以及野生型待测植株样本的高分辨率熔解曲线，分别如图2a-2e所示。
图2a-2d中，水平的直线为基准线，是对照植株(野生型)所对应的高分辨率熔解曲线，其它曲线均为各个样品的高分辨率熔解曲线，一条曲线对应一个样品，可以看出：2a-2d中的曲线的峰值(与对照的最大差异，|△F|)均大于或等于0.05，说明这些样品都与对照植株有差异，所以这些样品为CRISPR成功编辑的样品；而图2e所示为野生型待测植株样本的高分辨率熔解曲线，在图2e中的曲线与对照植株不能区分(|△F|小于0.05)，说明这些样品是未成功编辑的样品。换言之，以上CRISPR成功编辑的各种类型突变的待测植株样本均能与未经编辑的对照植株明显区分开来，而CRISPR编辑未成功的野生型待测植株不能与未经编辑的对照植株明显区分开来。
因此，采用实施例2的方法可以将水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑的群体中的CRISPR靶向编辑产生的各种突变类型的待测植株与未成功编辑的野生型待测植株明确区分开来。CRISPR靶向编辑产生的突变类型有双等位突变、嵌合体、纯合突变和杂合突变。结果表明CRISPR靶向编辑产生的各种类型均可以区分开，而未成功编辑的植株则与野生型一致。
水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑群体的获得：
采用现有技术可以获得水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑群体，即：根据水稻大斑基因LOC_Os12g16720的DNA序列信息设计CRISPR引物，构建CRISPR载体，转入农杆菌，利用农杆菌侵染水稻的愈伤组织，愈伤组织分化长成植株，即得到一批CRISPR的靶向编辑群体。
本发明实施例中水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑群体(水稻大斑基因LOC_Os12g16720的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，第764～785位为编辑靶位点)可以通过现有技术的各种方法获得，以下给出一个具体实例进行说明：
1、根据LOC_Os12g16720基因的DNA序列设计两条单链oligo序列DNA(http://e-crisp-test.dkfz.de/E-CRISP/designcrispr.html)，其核苷酸序列如下所示：
oligo F2:5’-GGCACCGCACCTGCTCTCCGGCCAGT-3’(SEQ ID NO:9)
oligo R2:5’-AAACACTGGCCGGAGAGCAGGTGCGG-3’(SEQ ID NO:10)
按照以下步骤退火形成双链DNA。
反应体系:DNA oligo F2(100μM)，10μl；DNA oligo R2(100μM)，10μl；10×Buffer，20μl；无菌水，60μl。
反应程序：95℃变性2分钟，每8秒降低0.1℃直到降到4℃。
2、切开环状的载体
反应体系：pPL-sgRNA质粒载体(购自百奥迈科生物技术有限公司)，30μl(200ng/μl，大约6μg)；10×buffer，5μl；BsaI酶，2μl；无菌水：13μl。
37℃过夜孵育8小时。
回收切开的质粒载体，浓度调至50ng/μl。
3、连接
反应体系：切开的pPL-sgRNA质粒载体，1μl(约50ng/μl)；退火后的Oligo DNA，1μl；T4连接酶，1μl；10×T4酶Buffer，1μl；无菌水，6μl。
4℃孵育2小时，然后放至16℃过夜。
4、转化感受态细胞
将上述连接产物10μl加入感受态细胞中混匀，冰上放置20分钟；42℃热激90秒后立即放入冰中放置10分钟；加入1ml的SOC液体培养基中振荡培养1小时；5000rpm离心2min；弃去上清；悬浮菌体，涂在固体LB培养基上，37℃培养过夜直到菌落长出。
5、挑选阳性克隆
挑取上述长出的菌落，放入LB液体培养基中振荡培养12小时，用质粒提取试剂盒(AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 250-Prep，购自Axygen公司)提取质粒。
6、对上述提取的质粒进行测序验证。
7、将测序验证成功的质粒转入农杆菌中。
取1μg左右的质粒DNA加入到200μl农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；在37℃水浴5min或42℃水浴1min，液氮中5min，可重复1-2次；接着冰浴2min，加入800μl YEB液体培养基，28℃、175rpm摇培3小时后，涂在含50μg/ml卡那霉素的YEB平板上；28℃培养到形成单菌落。
8、由农杆菌介导导入水稻植株
1)水稻种子消毒后，将种子转移到成熟胚(NBD/N6D)诱导培养基中，28℃暗培养7-10天；用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织置入继代培养基中，继代培养1-2次，每次2周，暗培养；1-2次继代培养后，挑取愈伤组织在继代培养基上培养4-7天后用于遗传转化。
2)挑取上述验证成功的农杆菌单克隆于4ml YEP(含50mg/lKan和30mg/l Rif)培养液中，28℃，250rpm振荡过夜培养。
3)从含有农杆菌的YEP培养液中吸取1-2ml，转入25-50ml AB(Rif 30+Kan50+As100μmol/l)液体培养基中培养，28℃，250rpm，4小时左右OD600＝0.4-0.6。
4)取培养好的菌液于离心管中，4000rmp，离心8min，弃上清。用含100μmol/l As的等体积AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.4-0.6。
5)取出继代培养4-7天的愈伤组织，放入农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间不停摇晃，也可在摇床上100rpm，振荡培养30min。
6)将愈伤组织置于垫有一层无菌滤纸的共培养基上，每皿加入1ml AAM培养液湿润滤纸，28℃暗培养3天。
7)将愈伤组织取出，用0.1M甘露醇清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)的无菌水清洗5-6遍。最后置于无菌滤纸上沥干30min。
8)将晾干的愈伤转入含500mg/l羧苄青霉素和25-30mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗培养14天。
9)将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含500mg/l羧苄青霉素和50mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，暗培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
10)最后在500mg/l头孢拉定(或头孢噻肟钠)和70mg/l潮霉素的培养基上进行第三轮筛选。
11)将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，28℃，暗培养7天，之后光照培养7天。
12)挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中，放入恒温培养室中，等待分化成苗(15-30天)，待苗长至1cm左右，放入生根培养基(1/2MS培养基)中壮苗。
13)将苗根部和茎叶分化得较完好的挑出，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，获得水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑的群体。
实施例3
上述水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑的群体为待测植株，未经编辑的水稻植株为对照植株。对待测植株进行检测和筛选的步骤如下：
1、水稻基因组DNA的提取
(1)将水稻叶片剪碎后置于2.0mL离心管中，同时放入一粒钢珠，用组织碾磨仪磨碎；
(2)加入800μL CTAB提取缓冲液(Tris-HCl，100mM，pH 8.0；EDTA，20mM，pH 8.0；NaCl，500mM；CTAB，2％)，65℃水浴40min，期间摇动3-4次；
(3)加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1)，上下颠倒混匀，10000r/min离心10min；
(4)转移上清至新的1.5mL离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置-20℃下沉淀30min，10000r/min离心10min；
(5)弃上清液，70％乙醇洗涤1次，10000rpm离心10min；
(6)弃上清液，无水乙醇洗涤1次，自然风干，溶于适量(100～200μL)TE缓冲溶液中，-20℃保存。
2、针对LOC_Os12g16720基因的靶位点设计PCR引物对(LOC_Os12g16720基因的核苷酸序列如SEQ NO.8所示，第764～785位为编辑靶位点)，进行PCR扩增:
PCR引物对：
上游引物T2F:5’-CGGTGGTGATCTCCAAGCC-3’；(SEQ ID NO:11)
下游引物T2R:5’-GGGAAGAAGTCGCCGATGGT-3’；(SEQ ID NO:12)
由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR扩增的反应体系如下：
rTaq，0.2μL；2×GC buffer，5μL；2.5mix dNTP 1.6μL；10μM的上游引物T2F，0.2μL；10μM的下游引物T2R，0.2μL；10×Eva Green(荧光染料)，1μL；50ng/μL的DNA，1μL；无菌水1.3μL；矿物油10-20μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
3、对PCR扩增产物进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析，鉴别水稻植株是否被成功编辑：
PCR结束后，打开HRM分析的软件，运行HRM检测的系统，待机器的温度升到45℃后，将样品PCR板放入LightScanner仪器中，每秒上升0.1℃，直至温度升到98℃，停止反应。在升温的过程中，机器记录反应中样品的荧光释放量，形成高分辨率熔解曲线图。每一个样品对应一条HRM熔解曲线，以对照植株(野生型)所对应的高分辨率熔解曲线为基准线(记为水平的直线)，比较待测植株所对应的高分辨率熔解曲线与对照植株所对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，视为待测植株与对照植株的结果相同，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，视为待测植株与对照植株的结果不同，判定该待测植株编辑成功。
4、筛选结果的验证：
根据HRM分析的结果，对待测植株样本进行测序验证，验证发现：在本实施例检测的植株样本中，HRM分析的结果与测序验证的结果完全一致，没有假阳性的情况出现，可见HRM分析的准确率非常高。
经由测序验证的突变的待测植株样本的高分辨率熔解曲线，如图3a所示。图3a中，水平的直线为基准线，是对照植株(野生型)所对应的高分辨率熔解曲线，其它曲线均为各个突变的待测植株样品的高分辨率熔解曲线，一条曲线对应一个样品，可以看出图3a中的曲线的峰值(与对照的最大差异，|△F|)均大于或等于0.05，说明这些样品都与对照植株有差异，所以这些样品为CRISPR成功编辑的样品；而图3b所示为野生型的待测植株样本的高分辨率熔解曲线，在图3b中的曲线与对照植株不能区分(|△F|小于0.05)，说明这些样品是未成功编辑的样品。换言之，以上CRISPR成功编辑的突变的待测植株样本均能与未经编辑的对照植株明显区分开来，而野生型的待测植株不能与未经编辑的对照植株明显区分开来。
因此，采用实施例3的方法可以将水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑的群体中的CRISPR靶向编辑产生的突变待测植株与未成功编辑的野生型待测植株明确区分开来。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。
Claims (7)
1.一种用于筛选水稻靶向基因编辑植株的方法，其特征在于，包括：
(1)以未经编辑的水稻植株为对照植株，以经靶向基因编辑获得的水稻植株为待测植株，分别提取待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA；
(2)根据与所述靶向基因编辑的靶位点相邻的基因组序列来设计特异性引物，以所提取的基因组DNA为DNA模板，加入所述特异性引物和荧光染料，PCR扩增所提取的基因组DNA中包含编辑位点的DNA片段，所述DNA片段长度为200～500bp；
(3)PCR扩增完毕后直接进行高分辨率熔解曲线分析，以对照植株所对应的高分辨率熔解曲线为基准线，比较待测植株所对应的高分辨率熔解曲线与对照植株所对应的高分辨率熔解曲线的最大荧光差异△F，若|△F|<0.05，视为待测植株与对照植株的结果相同，判定该待测植株未成功进行编辑；若|△F|≥0.05，视为待测植株与对照植株的结果不同，判定该待测植株编辑成功；
其中，
所述的靶向基因编辑是对水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑，所述水稻LOC_Os03g55240基因的序列如SEQ ID NO:1所示，其中第453～471位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列如下：
上游引物B1F：5’-GCACCGCGTCGGCCTCATGT-3’；
下游引物B1R：5’-CCTGCTTAAACTCCTGGGCTTCCAC-3’；
或者，
上游引物B2F：5’-TCACCGAGCACGACGTGACCTT-3’；
下游引物B2R：5’-CACGCTGAGGGAGACCTCGAACA-3’；
或者，
所述的靶向基因编辑是对水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑，所述水稻大斑基因LOC_Os12g16720的序列如SEQ ID NO:8所示，其中第764～785位为编辑位点；此时，所述特异性引物的序列如下：
上游引物T2F:5’-CGGTGGTGATCTCCAAGCC-3’；
下游引物T2R:5’-GGGAAGAAGTCGCCGATGGT-3’。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向基因编辑是对水稻LOC_Os03g55240基因的CRISPR靶向编辑时，所述PCR扩增的反应体系如下：rTaq，0.2μL；2×GCbuffer，5μL；2.5mix dNTP，1.6μL；10μM的上游引物，0.2μL；10μM的下游引物，0.2μL；10×Eva Green，1μL；50ng/μL的DNA，1μL；无菌水1.3μL；矿物油10-20μL。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向基因编辑是对水稻大斑基因LOC_Os12g16720的CRISPR靶向编辑时，所述PCR扩增的反应体系如下：rTaq，0.2μL；2×GCbuffer，5μL；2.5mix dNTP，1.6μL；10μM的上游引物，0.2μL；10μM的下游引物，0.2μL；10×Eva Green，1μL；50ng/μL的DNA，1μL；无菌水1.3μL；矿物油10-20μL。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；72℃延伸7min。
6.如权利要求1～5中任一所述的方法，其特征在于，所述DNA模板为直接提取的单株待测植株DNA，或者，所述DNA模板是摩尔比为1:1的待测植株的基因组DNA和对照植株的基因组DNA的混合。
7.如权利要求1～5中任一所述的方法，其特征在于，所述DNA片段为200～400bp。
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