CN113528536B - 一种小麦增加穗长基因hl1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦增加穗长基因HL1及其应用。一种小麦增加穗长基因HL1在通过基因工程手段提高小麦穗长中的应用。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦增加穗长基因HL1转入植物中，可以提高植物的穗长。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的转移不会影响植物的食品安全性，可以广泛应用于各种植物的增加穗长育种过程。

Description

一种小麦增加穗长基因HL1及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种小麦增加穗长基因HL1及其应用。

背景技术

小麦是我国主要的粮食作物之一，其产量的高低关系到国家粮食安全，提高产量一直是小麦育种家的最主要目标。穗是小麦籽粒着生的地方，与产量构成要素中的粒重和穗粒数密切相关，直接影响产量，在品种选育过程中历来受到育种家的关注和重视。理想的穗部形态对提高小麦单产具有重要作用。小穗密度是穗的一个重要性状，是决定穗型的重要因素(Donmez et al.2001；Kumar et al.2007)。此外，较小的小穗密度可以降低赤霉病的严重度(Suzuki et al.2012；Jones et al.2018；孙阳阳等，2017)。因此了解小穗密度的遗传基础及形成的分子机制对小麦遗传改良、促进产量提高具有重要意义。

小穗密度是多基因控制的数量性状，其遗传机制复杂，主要受加性效应基因控制，广义遗传率高达69.7-97.9％(Heidari et al.2011；Xu et al.2014；Zhai et al.2016)。目前小麦小穗密度的研究多集中在QTL定位阶段，在21条染色体上都检测到控制小穗密度的QTL(Sourdille et al.2000,2003；Marza et al.2006；Ma et al.2007；Heidari etal.2011；Mazen et al.2014；Xu et al.2014；Zhai et al.2016；Liu et al.2018)。控制小穗密度的QTL既有微效QTL也有主效QTL，其解释的表型变异从2.0％到29.9％不等。

Qcpt.nau-2D是本实验室前期利用南大2419×望水白重组自交系群体在2DS染色体上检测到的一个控制小穗密度的主效QTL，被定位于0.9cM的Xcfd53-DG371之间(Wu etal.2013)。该位点在多个种质中都被检测到与小穗密度相关，可以解释高达29.9％的表型变异(Sourdille et al.2003；Heidari et al.2011；Zhai et al.2016；Chai etal.2018)。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种小麦控制穗长的基因HL1。

本发明的又一目的是提供HL1基因的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

确定HL1基因是控制穗长的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

含有小麦控制穗长基因HL1的重组表达载体。

所述的重组表达载体,优选出发载体为HL1基因在自身启动子驱动下的载体。

本发明所述的小麦控制穗长基因HL1在小麦品种改良中的应用；优选所述的基因在增加小麦穗长中的应用。

本发明所述的重组表达载体在小麦品种改良中的应用；优选所述的重组表达载体在增加小麦穗长中的应用。

有益效果：

我们进一步通过次级分离群体将该QTL定位于Xwgrc1257-Xwgrc1366区间，与Xmag9642和Xwgrc1808共分离，该区间的物理距离约为100kb。通过亲本间序列比较，确定HL1是Qcpt.nau-2D的候选基因。本发明提供了一种新的小麦增加穗长的基因HL1。通过转基因将本发明提供的增加穗长基因HL1转入小麦中,可以增加小麦的穗长。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此该基因的存在不会影响植物的食品安全性，可在作物育种中应用。

附图说明

图1转基因小麦的PCR检测。

其中A为阳性对照携带有HL1基因的质粒；B为转HL1基因的绵阳99-323；C为转基因实验受体材料绵阳99-323，图2转基因小麦的穗

其中左为转基因实验受体材料绵阳99-323，右为转HL1基因的绵阳99-323

具体实施方式

根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：HL1基因的确定。

将绵阳99-323与携带Qcpt.nau-2D的绵阳99-323近等基因系(Wu et al.2014)进行杂交，构建次级F2群体，利用Cfd53(SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.3)和DG371(SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.5)标记进行筛选，获得在这两个标记之间发生重组的个体。根据重组体的基因型和穗长表型，将Qcpt.nau-2D限定在Xwgrc1257(SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7)和Xwgrc1366(SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9)之间的100kb的区间内。携带Qcpt.nau-2D的绵阳99-323近等基因系的该区间仅存在一个有完整转录本的编码基因，长2427bp，即HL1。对应于绵阳99-323相同的位置，基因长度为2426bp。与近等基因系中的HL1相比，绵阳99-323基因序列有一个SNP和一个INDEL变异，两个变异位于相邻位置，该变异导致绵阳99-323中翻译提前终止。由此推断HL1是Qcpt.nau-2D的候选基因。

实施例2：编码Ta FHB1蛋白的cDNA序列的获得。

以分蘖期南大2419的小穗cDNA作为模板，用英俊公司的Trizol试剂盒提取小麦穗部的总RNA，采用Promega公司的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cDNA。用引物P1(SEQID NO.10/SEQ ID NO.11)进行PCR扩增，扩增体系为25μL,包括5ng模板,F和R引物各5pmol,dATP,dTTP,dCTP和dGTP各5nmol,37.3nmol MgCl2,0.5单位的DNA聚合酶,1x PCR缓冲液。扩增的程序是:94℃变性3分钟；30个循环,94℃变性20秒,60℃退火30秒,72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。通过PCR扩增,获得了包含开放读码框的2427bp的核苷酸序列,将该核苷酸与T-载体在16℃连接30min,连接体系为10μL，包括T-载体1μL，PCR产物4μL，连接酶1μL，连接酶缓冲液1μL，ddH2O 3μL。连接产物通过42℃热击40秒，转化到大肠杆菌细胞中，送至华大基因公司测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例3：转HL1基因小麦的穗长增加

以南大2419基因组DNA作为模板，利用引物P2(SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13)进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶HindIII进行酶切后，与经过同样限制性内切酶进行酶切的pUCBS表达载体连接，构成HL1基因枪稳定转化的表达载体。构建好的载体通过热击法转化到DH5α大肠杆菌菌株中，通过含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行筛选，获得阳性克隆。参照1993年Weeks发表在PlantPhysiol第102期1077-1084页上的文章中的材料与方法，以幼胚短暂培养产生的可以较高频率再生出可育植株的愈伤组织为受体，采用基因枪法将自身启动子控制下的HL1基因导入到短穗小麦绵阳99-323中，将基因枪转化后的愈伤放置于含有20mg/LG418的MS培养基上进行筛选，待分化出幼苗后一次在30mg/L、40mg/L的MS培养基上筛选，最后获得的再生苗移入含有1mg/LNAA的MS培养基生根，待根长出后剪取叶片，提取DNA进行PCR检测(图1)，获得携带HL1的转基因小麦。转基因小麦的穗长明显增加(图2)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种小麦增加穗长基因HL1 及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2427

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 1

atgtcggcgc cggaggaggg cgacgccgcc gcctcgggat cgtcggcgcc gccgcccccc 60

gcgcccgcgc ccgcgccgcc gccgatggcc atggcggagc cgggcgcaat ggggcccgag 120

gaggccgccg ccaggaagcg ctacgaggcg ctgatgcagg tgcgggccaa ggcgctcaag 180

ggcaagggcg cctggtactg gggccacctg gagcccgtcc tcgtgccgcc gccggcctcc 240

ggggcgcccc ccaaggccgc ccgcctccga tgcgcgctct gcgccgcgac gttctccgcc 300

tccaacccct cccgcaccgc caccgagcac ctcaagcgcg gcgcctgccc taatttcgcg 360

gcggcgcagg gcgcgccgcc gccgccgccg cccccgcccc cgccgcagaa tcagcatcag 420

cagttgcagc tcgtcgccgt ctcgtccccc gcctcatcga tcgtgcccat ctcctccatc 480

cccccgtcgt cctcgtccgc gtcgcagcgc cgccactcca ccggcggcgg cggcggcggc 540

ggccgcaagc gccacgcgct cgccgcggcc tacgcgtccg tcgaggccgc ctcgcaccag 600

caccacgtca tggtcgccga cccggccggg tactccccga cgccgcccac cccgcccggg 660

atgcccgcgc ccaggcagct gctctccggc ggccggggcg acctcgcccc gctcgccatg 720

ctggaggaca gcgtcaagcg cctcaagtcg ccctcggcgt cgccgggcgc gatgctgccg 780

cggccgcagg ccgaggccgc gctctcgctg ctcgccgact ggttcctcga gtcgtccggc 840

agcgcctccc tctccgcggt cgagcacccc aagctcaaga acttcctgcg ccaggttggg 900

ctgccggaga tatcgcgggc cgacctcgcc ggcgcgcgcc tggacgcgcg cttcgccgag 960

gcccgcgccg acgccgccgc gcgcttccgt gaggcgcggt tcttccagct cgcggccgac 1020

gggctgcgcg agcaggtgat caccctctct gtcaacctcc ccaacgacac gtccgtgttc 1080

caccgagccg tgcccatgcc cgcgccggcg tcggcgtccc ctgactacgc ccaggagctg 1140

ttcctggacg cggcatcgtc cgtctccgcc tcctccggcg acattcggca ttgcgccggc 1200

atcgtcgccg accgcttcgg ctccaagact ctgcgtgatc tcgagaccaa gcaccattgg 1260

atggtgaacc ttacctgcca agtccatggc ctgtcccgct tggtaagcga catggcgcgc 1320

gagctcccac tcttcaacaa cgctgcgtca aattgcgcca agatcgccag ctacttcaac 1380

accacgccct ccgtgcgcgc gctgctgcac aagcaccaag tccaggagca cgggcacgcc 1440

ttcctcctgc ccattgccgc tccgccgtat aatggcgggg aatttgccgc cgcgttcgtg 1500

atgctcgaga gcatcctgac ctcggcgcgg ccgctccagc tcgccgtgct cgaggagtcc 1560

tacaaggtgg tctgcatcga cgaccctgcc gcgagggaga ttgcggccat ggtgcaaaat 1620

gtggcgttct ggaccgaggt cgaggcgacg cattcggttg tgaagatgat catggacttg 1680

gtgaaggaga tggagaccga gaggcccctg gtcgggcaat gcctgccgct ctgggaggac 1740

ctgcgcggca aggtcagagg ctggtgccgg aaattcagcg tagaagaggc cactgccatg 1800

aatgtggtcg agaggaggtt caggaagaac taccacccgg cgtggtcagc ggcattcata 1860

ctggacccat tgtatctgat caaggacgct ggcaggaggt accttccacc gttcaactac 1920

ttgacgccag agcaggagaa ggacgtggac aggctgatca cgaggctggt gtcgccggag 1980

gaggcgcacc tcgcgctgat ggagctgatg aaatggcggt cggaggggct cgacccattg 2040

tacgcgcagg cggtgcaggt ccggcagcca gacccgtcga cggggaagat gaagatagcc 2100

aacaagcaga gcagccgtct tgtctgggag acatgtctca gtgagttcaa gtcacttggc 2160

aaagtggccg tcaggctcat cttcctccat gcaaccgcca aggggttcaa atgcacgccg 2220

tcgatgacgc ggtggctcac cgcgccgggg agctcagccg gcagcatcgg ccgggcgcac 2280

cggctggtgt tcatcgcggc gaattcgaag ctggagagga gggatttctc aaacgacgac 2340

gacaaggacg tggagctgct gacagaaggg gacgacgaca tgctaaccga gactggcaat 2400

gtggatccct cctcctcctc agtgtag 2427

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccctatttcc cccatgtctt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaggagggca catatcgttg 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccacttgaca agcaaattaa ga 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcacgaggc tggtgtcg 18

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaggattgac aacccctctt acga 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccaaaagttg tgtatcccaa aggc 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tacaccaaca cgaacgcaga ac 22

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaacaaagag agagggaggg tcc 23

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtcggcgc cggaggaggg cgacgccgcc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggagggatcc acattgccag tctcggttag 30

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtacaagctt gagaacccat cattcgtcca aaa 33

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtacaagctt aacggcgaaa caacccttac c 31

Claims (3)

1.一种小麦控制穗长基因HL1在增加小麦穗长中的应用,其特征在于核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.含有权利要求1中所述的基因HL1的重组表达载体在增加小麦穗长中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的重组表达载体的出发载体为基因HL1在自身启动子启动下的载体。