CN104388421B

CN104388421B - 转基因水稻品系134Bt的外源插入片段旁侧序列、其扩增引物及其应用

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Publication number: CN104388421B
Application number: CN201410431657.3A
Authority: CN
Inventors: 朴钟泽; 杨瑞芳; 白建江; 方军; 李钢燮; 池铉昭; 朴成韩; 林惠敏
Original assignee: NAAS(NATIONAL ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE); Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: NAAS(NATIONAL ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE); Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-08-28
Also published as: CN104388421A

Abstract

本发明提供一种转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的3’端和5’端旁侧序列及其应用以及所述旁侧序列的扩增引物。利用该旁侧序列作为目的DNA扩增片段，可以建立灵敏、特异性的转基因水稻品系134Bt的品系特异性定性PCR检测方法，可广泛用于生物技术领域中的转基因水稻的安全评估和检测。

Description

转基因水稻品系134Bt的外源插入片段旁侧序列、其扩增引物及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种转基因水稻品系134Bt外源插入片段旁侧序列以及用于检测该序列的PCR引物。此外，本发明还涉及所述旁侧序列和引物进行转基因水稻品系检测或鉴定的方法和试剂盒。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物之一，随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用，已经有多个转基因水稻品系获准环境释放。对此，需要对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展。例如对转基因植物进行转化事件特异性的检测。

转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物转化事件特异性检测方法的重要技术资料。目前已经有部分专利和文献报道了关于转基因植物外源插入载体旁侧序列，如张大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因MON863玉米品系的特异性检测方法；杨永义等分析了转基因水稻品系223f-S21的外源插入片段的旁侧序列，并进一步建立了转基因系特异性PCR的检测方法，张秀杰等公开了转基因水稻PA110-5品系特异性PCR定性检测引物及定性检测方法和试剂盒。

水稻品系134Bt是利用农杆菌介导的遗传转化方法，将人工改造后的cry1Ac1基因(GENBANK登记号：AY126450)导入江浙沪地区目前广泛种植的高产优质粳稻品种“秀水134”中，通过分子手段筛选出具有cry1Ac1转录活性的单拷贝的、整合了完整目的基因且T-DNA插入位点未打断已知功能基因的独立转化体，并通过后代自交分离筛选获得纯系。但是，到目前为止，尚未建立关于转抗虫基因134Bt品系的特异性PCR检测方法。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的一个目的为提供一种转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁侧序列，并针对该旁侧序列提供对其进行特异性检测的DNA序列，例如PCR扩增引物序列。本发明的另一个目的为提供所述旁侧序列和引物的应用，包括提供旁侧序列或引物在检测水稻中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分中的用途，或者制备检测水稻中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分的试剂盒中的用途。此外，本发明的又一个目的为提供一种转基因水稻品系134Bt的检测方法。

本发明的转基因水稻品系134Bt按如下方式获得：

取授粉后12-15天的未成熟的秀水134水稻种子经70％乙醇表明消毒1分钟，于NaClO溶液中(体积比1:4，加2-3滴吐温20)消毒90分钟，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并接种于N6培养基上诱导愈伤组织，置于28℃，暗室培养，5天后获得的初生愈伤组织用于转化。

菌液的准备具体为：含pZTRT-Bt质粒(T-DNA结构域见图1，其构建参见Eun HyeKim等人，Chloroplast-targeted expression of synthetic cry1Ac in transgenicrice as an alternative strategy for increased pest protection,Planta(2009)230:397–405)的农杆菌离心收集后用含200μM的乙酰丁香酮(AS)AA液体培养基悬浮(简称AA-AS)；超净工作台上将幼胚诱导的初生愈伤组织置于农杆菌AA-AS悬浮液中20min，期间不断摇动；倒掉菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸上风干5～10min；然后，转移至表面以无菌滤纸覆盖的CC-AS(200μM)共培养培养基中，28℃黑暗条件下培养50～55小时；共培养后的愈伤组织转移到含2.0mg/L的2,4-D和500mg/L头孢霉素的N6抑菌培养基中，使愈伤组织恢复3～4天；愈伤组织转移到含2.0mg/L的2,4-D、500mg/L头孢霉素和5mg/L Basta的N6筛选培养基上继代培养3-4次就可以获得抗性愈伤组织；抗性愈伤组织转移到再生培养基获得转基因植株；再生植株转移到Yoshida营养液中水培过渡，后移栽入大田或温室土培直到成熟，共获得12个独立转化体。

利用荧光定量PCR方法对12个独立转化体分析插入基因拷贝数，具体方法为：水稻基因组DNA提取采用CTAB法，用BioPhotometer分光光度计(Eppendorf公司)检测DNA含量及纯度。水稻内标准基因蔗糖磷酸合成酶基因(Sucrose phosphate synthase gene，SPSGeneBank No.U33175)引物序列参照Ding等报道(Ding J Y,Jia J W,Yang L T,etal.Validation of a rice specific gene,sucrose phosphate synthase,used as theendogenous reference gene for qualitative and real-time quantitative PCRdetection of transgenes.J Agric Food Chem,2004,52(11):3372-3377.)，利用PrimerPremier 5软件设计了Cry1Ac1引物序列(见表1)。引物由上海生物工程有限公司合成，其核苷酸序列和扩增片段长度见表1。

定量PCR体系为：Premix Ex Taq^TM(2×)12.5μl，PCR上游引物(10μmol/L)0.5μl，PCR下游引物(10μmol/L)0.5μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水9.5μl，总体积25μl。定量PCR的反应程序为(两步法PCR反应程序)：预变性95℃30s，循环数1：PCR反应第一步95℃5s；第二步，60℃退火延伸40s，共进行45个循环。荧光定量PCR仪为ABI PRISM 7000Real-TimePCR system。每个试样做3个生物学重复，每个生物学重复做3次技术重复。12个独立转化体中获得3个单拷贝转化体。

表1定量PCR引物和探针序列

采用发芽试验分离转基因纯合系。将实时荧光定量PCR法分析的单拷贝植株T0-5套袋自交，T1代海南分株系种植，成熟后收获各株系种子，每单株取50粒左右的种子消毒后放在10mg/L Basta 1/2Ms培养基进行发芽，7天后观察结果，全部发芽成苗的则为纯合134Bt株系。

获得的转基因水稻品系134Bt已于2014年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为普通栽培稻种粳稻(拉丁名为：Oryza sativa)，保藏号为CGMCC No.9349。

本发明提供的技术方案如下。

一方面，本发明提供上述转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3’端旁侧序列，并如SEQ ID No:1所示。该3’端旁侧序列通过提取转基因水稻品系秀水134Bt植物基因组DNA，通过TAIL-PCR方法扩增得到。

另外，本发明还提供转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的5’端旁侧序列，如SEQ ID No:2所示。该5’端旁侧序列是通过提取转基因水稻品系秀水134Bt植物基因组DNA，通过PCR扩增获得的。

本发明提供的3’端和5’端旁侧序列可以作为目的DNA扩增片段，由此建立转基因水稻品系134Bt的特异性的定性PCR检测方法。因此，另一方面，本发明提供本发明的3’端和/或5’端旁侧序列在检测水稻或其制品中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分中的用途。本文中提到水稻制品是指源于植株、植物组织、种子等各种制品。

本领域公知，可以利用试剂盒来检测水稻或其制品中是否含有转基因成分。因此，又一方面，本发明提供所述3’端和/或5’端旁侧序列在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测水稻或其制品中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。

基于本发明提供的转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁侧序列，本发明还提供转基因水稻品系134Bt的检测方法，所述检测方法包括，通过检测待检测水稻的基因组DNA中是否存在本发明提供的3’端和/或5’端旁侧序列或其片段，来检测所述水稻是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。

其中，所述检测方法可以包括，依据SEQ ID No:1所示序列设计PCR扩增的正向引物和反向引物，以待检测水稻的基因组DNA作为模板，采用所述正向引物和反向引物进行PCR扩增，通过检测是否扩增得到SEQ ID No:1所示序列或其片段，检测所述水稻是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分；和/或

依据SEQ ID No:2所示序列设计PCR扩增的正向引物和反向引物，以待检测水稻的基因组DNA作为模板，采用所述正向引物和反向引物进行PCR扩增，通过检测是否扩增得到SEQ ID No:2所示序列或其片段，检测所述水稻是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。

优选地，可以依据SEQ ID No:1中第1-246位序列设计正向引物，依据SEQ ID No:1所示序列中第247-501位序列设计反向引物；其中所述正向引物优选为SEQ ID No:3所示序列(本文又命名为“LBF”)，所述反向引物优选为SEQ ID No:4所示序列(本文又命名为“LBR”)。

根据本发明的具体实施方式，提取待检测水稻样品的总DNA，利用引物LBF/LBR组合进行PCR扩增，PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，鉴定是否存在目的大小的扩增产物，如果存在就说明该样品中含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。

此外或替代地，可以依据SEQ ID No:2中第1-298位序列设计正向引物，依据SEQID No:2中第301-882位序列设计反向引物；其中，所述正向引物优选为SEQ ID No:5所示序列(本文又命名为“RBF”)，所述反向引物优选为SEQ ID No:6所示序列(本文又命名为“RBR”)。

根据本发明的具体实施方式，提取待检测水稻样品的总DNA，利用引物RBF/RBR组合进行PCR扩增，PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，鉴定是否存在目的大小的扩增产物，如果存在就说明样品中含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。

再一方面，本发明提供用于检测本发明提供的3’端旁侧序列的DNA序列，所述DNA序列与SEQ ID No:1所示序列特异性退火；优选地，所述DNA序列为PCR扩增SEQ ID No:1所示序列的扩增引物；更优选地，所述扩增引物为SEQ ID No:3所示的正向引物和SEQ ID No:4所示的反向引物，此两个扩增引物组合为本发明提供的3’端旁侧序列的特异性引物的示例。

此外，本发明还提供用于检测本发明提供的5’端旁侧序列的DNA序列，所述DNA序列与SEQ ID No:2所示序列特异性退火；优选地，所述DNA序列为PCR扩增SEQ ID No:2所示序列的扩增引物；更优选地，所述扩增引物为SEQ ID No:5所示的正向引物和SEQ ID No:6所示的反向引物，此两个扩增引物组合为本发明提供的5’端旁侧序列的特异性引物的示例。

上述DNA序列同样可以用于检测水稻或其制品中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。因此，本发明在另一方面提供所述DNA序列在检测水稻或其制品中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分中的用途。

所述DNA序列还可以制备成试剂盒，用于检测水稻中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。因此，本发明还提供包含上述DNA序列在制备检测水稻或其制品中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分的试剂盒中的用途。

因此，本发明还提供一种检测试剂盒及其在检测转基因水稻品系134Bt中的用途，所述检测试剂盒包括上述DNA序列，例如SEQ ID No:3所示的正向引物和SEQ ID No:4所示的反向引物，和/或SEQ ID No:5所示的正向引物和SEQ ID No:6所示的反向引物。

本发明首次克隆了水稻品系134Bt的外源插入片段的旁侧序列，并且明确了转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁侧序列可以用作目的DNA扩增片段，由此建立转基因水稻品系134Bt的特异性的定性PCR检测。本发明所获得的外源插入片段的旁侧序列可以进一步用于建立转基因特异性PCR检测方法。利用该旁侧序列设计特异性引物用于目的DNA的扩增，能建立特异性的转基因水稻品系134Bt的品系特异性定性、定量PCR检测。

本发明建立的水稻品系134Bt特异性定性PCR检测方法，用于检测转基因水稻品系Bar68-1，灵敏度高，特异性强，对于筛检转基因水稻品系134Bt有重要意义，可广泛用于转基因水稻的安全评估和检测。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为转基因水稻品系134Bt的转化载体PZTRT-Bt的T-DNA区域结构示意图。

图2为通过TAIL-PCR方法获得的转基因水稻品系134Bt的3’端边界扩增结果，其中M：Marker(100bp DNA ladder marker)；-：阴性对照为转基因水稻品系秀水134；1：转基因水稻品系134Bt的3’端边界扩增结果。

图3为通过PCR方法获得的转基因水稻品系134Bt的5’端旁侧序列扩增结果，其中M：Marker(DL1000)；-：阴性对照为转基因水稻品系秀水134；1：转基因水稻品系134Bt的5’端边界扩增结果。

图4为转基因水稻品系134Bt载体插入水稻2号的染色体位置结构示意图。

图5为采用引物LBF/LBR扩增转基因水稻品系134Bt的3’端旁侧序列的检测结果，其中M：DNA Marker(DL2000)；-：阴性对照为转基因水稻品系秀水134；1-3：134Bt转基因水稻品系的扩增结果。

图6为采用引物RBF/RBR扩增转基因水稻品系134Bt的5’端旁侧序列的检测结果，其中M：DNA Marker(DL2000)；-：阴性对照为转基因水稻品系秀水134；1-3：134Bt转基因水稻品系的扩增结果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1转基因水稻品系134Bt的外源插入载体的旁侧序列的测序获取

根据已获知的pZTRT-Bt质粒的序列从左边界终止子以内100-200bp的区域各设计3个向外的特异性巢式引物TL1、TL2和TL3，参考文献设计5个随机简并引物AD1-AD5(表2)。

进行TAIL-PCR，包括3个反应。第一轮反应(20μl)体系包含10×buffer(包含Mg²⁺)2μl；dNTP，0.2mM；特异引物TL1，0.5μM；3μM简并引物AD1-AD5；Taq聚合酶，1.25U；转基因水稻品系134Bt基因组DNA 1μl。第二轮反应的模板为第一轮PCR反应物稀释40倍，第三轮反应的模板为第二轮产物的10倍稀释液。3轮PCR反应程序见参照黄海清论文(黄海清，2004，几个转基因材料的外源基因在受体染色体上的定位，硕士学位论文，华中农业大学植物科学技术学院，导师：凃巨民，pp.21-23)。

用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。经过凝胶电泳检测，将特异性条带按需要选择用XYGEN生产的琼脂糖DNA纯化试剂盒进行纯化回收，分别用TL3引物做测序引物，将回收产物用于直接测序。

将测序产物除去质粒上的序列后得到T-DNA插入位点的侧翼序列。得到的侧翼序列在NCBI(美国国立生物技术信息中心)中用BLAST程(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对查找同源序列，确定T-DNA左边界插入位置旁侧序列，如SEQ ID No:1所示。根据与134Bt转基因左边界插入位点的上游(Chr.2 20855789-20856150)设计特异引物PrbF(表2)，针对pZTRT-Bt质粒的Rbcs3启动子设计特异引物PrbscoR(表2)，使用引物PrbF和PrbscoR，进行转基因水稻品系134Bt基因组DNA的PCR扩增，获得特异片段，对获得PCR特异产物进行测序和已知同源序列比对，结果分析获得转基因插入位点的右边界5’端旁侧序列(SEQ ID No:2)，1％琼脂糖凝胶电泳，其电泳图谱见图2。

表2TAIL-PCR中特异引物及随机简并引物序列

利用Thermal asymmetric interlaced PCR(TAIL-PCR)法分析转基因株系134Bt的T-DNA在基因组上的插入位点。分析结果表明，134Bt的T-DNA包含完整的目的基因插入在水稻2号染色体的20856153到20856229位置，没有插入到已知基因的编码区上。T-DNA的插入造成插入位点附近水稻基因组缺失77bp的碱基，T-DNA区的左右边序列完全缺失且没有载体骨架序列的插入。插入T-DNA位于Os02G0539500(Chromosome:2:20858661-20860159)基因上游约2.4kb，OS02G0539200(Chromosome:2；20839396-20841038)基因的上游约15.4kb处，见图4。

实施例2转基因水稻134Bt的插入片段旁侧序列的定性PCR检测

一、实验材料

转基因水稻：转基因水稻品系134Bt，

常规非转基因水稻：秀水134。

二、实验方法与过程

1.CTAB法提取植物基因组DNA。

采用小量CTAB法提取DNA，具体方法如下：取少量叶片于研钵中(约0.1g)，加入700μl 1.5×CTAB DNA提取液，研磨充分后倒入1.5mL Eppendorf管中，置于56℃水浴20分钟，期间不断晃动；水浴后冷却至室温，加入600μL氯仿，剧烈摇动使充分混匀，静置5分钟；12000rpm离心5min，吸取400μL上清到新的1.5mL Eppendorf管中；加入800μL纯酒精，上下颠倒混匀，-20℃放置10分钟；12000rpm离心3min，弃去上清，保留管底离心沉淀物；加入70％酒精600-800μL，轻摇离心管，离心，去上清；Eppendorf管倒置于吸水纸上，待DNA沉淀室温干燥后，加入300μL ddH2O溶解，备用。

2.基于3’端和5’端旁侧序列的品系特异性PCR检测

根据实施例1中测定的3’端和5’端旁侧序列，分别在其水稻基因组序列部分和转化载体序列部分设计引物，见表3。进行PCR扩增。

PCR扩增采用25μL的反应体系：10×PCR缓冲液(Mg²⁺)，2.5μL；dNTP(10mM)，0.5μL；上游引物(20μM)，0.25μL；下游引物(20μM)，0.25；Taq酶，0.5μL；DNA模板1μL；去离子水ddH2O，20μL。反应结束后1％琼脂糖凝胶电泳，3’端和5’端旁侧序列的扩增序列电泳结果分别见图5和图6。

PCR扩增结果表明，采用分别针对3’端和5’端旁侧序列的扩增引物组合，对于转基因水稻品系134Bt的3’端和5’端旁侧序列扩增得到了预期的324bp和575bp的扩增片段，而对照秀水134则没有相应的扩增片段。因此，本发明通过TAIL-PCR方法和PCR法获取的外源载体的旁侧序列可以进一步用于建立水稻转基因品系134Bt特异性PCR检测方法。

表3秀水134Bt品系特异性PCR检测引物

引物	序列(5'-3')
		LBF(SEQ ID No:3)	GAATCCTGTTGCCGGTCTT
LBR(SEQ ID No:4)	CGTGTGAAACGGATGGAGTA
		RBF(SEQ ID No:5)	CTGCGATTTTAGCCTCAGGA
RBR(SEQ ID No:6)	CACCCGAGAGTATTCCAAGG

实施例3转基因水稻品系134Bt特异性定性PCR检测试剂盒

检测试剂盒包含表3中所示引物。

以引物LBF/LBR和RBF/RBR进行水稻的定性PCR灵敏度扩增，结果显示，可以以高灵敏度特异性检测出含有转基因水稻品系134Bt来源的成分的水稻品系。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims

1.转基因水稻品系134Bt的外源插入片段的旁侧序列组，其特征在于，所述转基因水稻品系134Bt的保藏号为CGMCC No.9349，所述旁侧序列组由如SEQ ID No:1所示的3’端旁侧序列和如SEQ ID No:2所示的5’端旁侧序列组成。

2.转基因水稻品系134Bt的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括，通过检测待检测水稻的基因组DNA中是否存在如权利要求1所述的旁侧序列组，来检测所述水稻是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分，所述转基因水稻品系134Bt的保藏号为CGMCC No.9349。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括，依据SEQ ID No:1所示序列设计PCR扩增的正向引物和反向引物，以待检测水稻的基因组DNA作为模板，采用所述正向引物和反向引物进行PCR扩增，通过检测是否扩增得到SEQ ID No:1所示序列，检测所述水稻是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分；和

依据SEQ ID No:2所示序列设计PCR扩增的正向引物和反向引物，以待检测水稻的基因组DNA作为模板，采用所述正向引物和反向引物进行PCR扩增，通过检测是否扩增得到SEQID No:2所示序列，检测所述水稻是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分。

4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，依据SEQ ID No:1中第1-246位序列设计正向引物，依据SEQ ID No:1所示序列中第247-501位序列设计反向引物。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述正向引物为SEQ ID No:3所示序列，所述反向引物为SEQ ID No:4所示序列。

6.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，依据SEQ ID No:2中第1-298位序列设计正向引物，依据SEQ ID No:2中第301-882位序列设计反向引物。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述正向引物为SEQ ID No:5所示序列，所述反向引物为SEQ ID No:6所示序列。

8.用于检测如权利要求1所述的旁侧序列组的DNA序列组，其特征在于，所述DNA序列组由下述组成：

1)与SEQ ID No:1所示序列特异性退火的DNA序列，所述DNA序列为PCR扩增SEQ ID No:1所示序列的SEQ ID No:3所示的正向引物和SEQ ID No:4所示的反向引物；和

2)与SEQ ID No:2所示序列特异性退火的DNA序列，所述DNA序列为PCR扩增SEQ ID No:2所示序列的SEQ ID No:5所示的正向引物和SEQ ID No:6所示的反向引物。

9.如权利要求8所述的DNA序列组在检测水稻或其制品中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分中的用途，所述转基因水稻品系134Bt的保藏号为CGMCC No.9349。

10.如权利要求8所述的DNA序列组在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测水稻或其制品中是否含有转基因水稻品系134Bt来源的成分，所述转基因水稻品系134Bt的保藏号为CGMCC No.9349。

11.检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求8所述的DNA序列组。

12.如权利要求11所述的试剂盒在检测转基因水稻品系134Bt中的用途，所述转基因水稻品系134Bt的保藏号为CGMCC No.9349。