CN101691584B - 组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1作为提高水稻杂种优势的应用 - Google Patents

组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1作为提高水稻杂种优势的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域。分离克隆得到一种提高水稻杂种优势利用能力组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1，该基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表SEQ NO：1中第1-894位所示的DNA序列；或2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。所述组蛋白乙酰化酶基因OsHDT1与提高水稻的杂种优势利用能力有关。将无表型的转基因材料与珍汕97A杂交后，超表达杂种F1代相对于野生型的杂种F1代表现出明显的开花提早。另外，杂种RNAi抑制材料比杂种阴性对照材料结实率降低，同时亲本的RNAi抑制材料和阴性对照材料在结实率性状上无明显差异。利用Western Blot实验分析发现该基因具有组蛋白去乙酰化功能，位点作用于H4K16上，并且明恢63、珍汕97和汕优63的组蛋白乙酰化水平有着显著差异。

Description

组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1作为提高水稻杂种优势的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1的分离克隆、遗传转化来在组蛋白修饰水平上提高作为水稻杂种优势能力的应用。 
背景技术
杂种优势是一种在生物学上很普遍的现象，它指两种遗传性状不同的亲本杂交后，杂种一代在性状表现上优于双亲的现象(Birchler et al.In search of the molecular basis of heterosis.Plant Cell，2003，15：2236-2239.)。这一现象已经在生产上得到了非常广泛的应用，而对于其形成机理的研究还显得有点滞后。显性假说与超显性假说是两个关于杂种优势形成机理的经典理论(胡建广等.作物杂种优势的遗传学基础.遗传，1999：47-50)。但是两种假说仍然无法对所有遗传现象作出圆满解释。在这样的背景下，本实验室利用水稻强优势组合汕优63为材料，研究了其产量及其构成因子的基因效应，提出了上位性(指非等位基因间的相互作用)效应在杂种优势的形成中起决定作用，是汕优63杂种优势的重要遗传基础(Yu et al.Importance of epistasis as the genetic basis of heterosis in an elite rice hybrid.Proc Natl Acad Sci，1997，94：9226-9231.)。另外，鲍文奎教授提出了网络系统假说。亲本中的两个不同基因群通过杂交在杂种一代中组合成新的网络系统，使得等位基因处于最佳的工作状态，从而实现杂种优势(鲍文奎.机会与风险——40年育种研究的思考.植物杂志，1990：4-5)。华金平利用水稻“永久F2”群体在一定程度上为基因网络系统提供了分子证据(Hua et al.Single-locus heterotic effects and dominance by dominance interactions canadequately explain the genetic basis of heterosis in an elite rice hybrid.Proc Natl Acad Sci，2003，100：2574-2579.)。 
表观遗传学是指基于非基因序列改变导致的基因表达水平变化，其涉及的机制是DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等。植物中大量的证据表明，DNA甲基化与基因表达调节有关(Meyer et al.，1994)。近年来，人们开始从DNA甲基化和转录水平的调控来研究杂种优势产生的遗传机制。 
对玉米杂交种及其双亲中甲基化胞嘧啶的比例研究发现，杂交种的甲基化程度低于双亲(亲本甲基化程度为31.4％和28.3％，杂交种为27.4％)，而且基因表达活性与DNA甲基化存在显著的负相关，由此认为：杂交使基因表达得到了增强，从而导致杂种优势的形成(Tsaftaris A S，and KafkaM.Mechanism of heterosis incrop plants.Journal of Crop Production，1998，1：95-111.)。但对水稻杂交种汕优63及其双亲珍汕97和明恢63的DNA甲基化的研究却得出相反的结果(双亲均为16.3％，而其杂交种高达18％)。水稻杂种中的总体DNA甲基化程度与杂种优势不相关，但某些特异性位点上甲基化程度增强或减弱对杂种优势有显著效应。这一分析结果和基因差异表达与杂种优势关系的分析结果能够相互印证(Xiong et al.Patterns of cytosinemethylation in an elite rice hybrid and its parental lines，detected by a methylation-sensitive amplificationpolymorphism technique.Mol Gen Genet，1999，261：439-446.)。 
可见，杂种优势其实是一种基因调控的结果。而组蛋白修饰作为表观遗传学的重要内容，其本身作为一种基因调控的方式对基因转录有着重要的作用，因此它也应当与杂种优势有着某种程度的联系。近年来 在拟南芥中的研究表明，杂种的某些调控基因在组蛋白乙酰化水平上较亲本有一定的变化，这些变化会影响下游的基因表达，从而使得植物的生理和代谢途径发生改变，进而使植株表型发生变异(Ni et al.Alteredcircadian rhythms regulate growth vigour in hybrids and allopolyploids.Nature，2008.)。 
随着杂种优势分子机理的探明，杂种优势的理论基础渐趋清晰。但是杂种优势在染色质修饰水平上的机理是如何的，现在仍然不是很清楚。本发明通过一个组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1的分离克隆、遗传转化来在组蛋白修饰水平上探求水稻杂种优势的分子基础，找到了一些有变化的性状，并进行了分子水平上的分析。初步建立了杂种优势及表观遗传现象的联系。 
经检索，在NCBI数据库中利用去乙酰化酶结构域(HDAC Domain)比对搜索水稻蛋白序列发现一个组蛋白去乙酰化酶OsHDT1，它属于水稻HD2家族(植物中特有的一类组蛋白去乙酰化酶家族)。其全长cDNA登陆号为AK072845，基因ID号为4339823。(见表一)关于此基因在水稻中的功能还不清楚。 
发明内容
本发明的目的在于通过分离克隆一种组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1，利用该基因作为提高水稻杂种优势能力的应用。 
本发明通过以下技术方案实现： 
本发明从水稻中分离得到一个能够杂种优势调控水稻开花时期和结实率的组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1，它的编码基因如序列表SEQ ID NO：1所示。序列全长为894个碱基，编码298个氨基酸。 
经验证，所述的基因OsHDT1与水稻杂种优势有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与玉米泛素启动子(Ubiquitin)结合后直接转入水稻，再与不育系珍汕97A(来自江西省农科所)杂交，转基因杂种植株花期明显比野生型对照杂种植株提前；而转入双链抑制载体的亲本材料杂交后其结实率明显比野生型对照杂种植株减少。通过分析发现OsHDT1基因通过组蛋白修饰手段调控了亲本与杂种中的乙酰化水平，进而导致了水稻品种间的性状差异。 
如图1所示，本发明构建了一种超表达载体pU1301和一种抑制表达载体pDS1301，获得转化载体pU1301-HDT1和pDS1301-HDT1。利用该转化载体转化水稻品种“明恢63”(一个报道的籼稻亚种材料，来自福建省三明市农科所)，得到转基因水稻植株。具体操作步骤如下： 
(1)从NCBI数据库获得到该基因的DNA序列，根据该序列设计引物对，扩增CDS区域； 
(2)构建超表达载体pU1301和抑制表达载体pDS1301，获得转化载体pU1301-HDT1和pDS1301-HDT1； 
(3)利用农杆菌介导的转基因方法将所述的基因OsHDT1导入水稻受体，获得转化植株； 
(4)借助RT-PCR和Northern Blot方法分析鉴定阳性转基因植株，Southern Blot方法检测转基因植株拷贝数，观察转基因植株表型； 
(5)对无表型的单拷贝转基因植株与水稻不育系珍汕97A杂交，并将杂交后代与自交后代同时种到田里观察表型，考察农艺性状并进行统计分析； 
(6)利用Northern Blot方法分析水稻内源OsHDT1基因在各品种中的表达模式； 
(7)利用RT-PCR方法分析转基因和野生型亲本和杂种中的表达水平； 
(8)借助WesternBlot分析转基因植株组蛋白修饰情况。 
更详细的技术发明细节由以下实施例给出，但并不是限制该发明的保护范围。 
附图说明
序列表SEQ IDNO：1显示的是本发明分离克隆的OsHDT1基因编码区；同时显示了该基因编码的氨基酸序列。 
图1载体图。A超表达载体PU1301；B抑制表达载体pDS1301。 
图2OsHDT1基因在T0代转基因MH63中的拷贝数检测，除PR-8家系有两个拷贝，其余检测的转基因家系都为单拷贝。 
图3：OsHDT1转基因植株亲本及杂种的表型图。A表型照片显示超表达杂种抽穗期明显提早；B各材料开花时间的统计分析星号表示转基因家系相对野生型差异显著(*P＜0.05)或极显著(**P＜0.01)；C各材料开花时间的t测验分析(A、B、C表示P＜0.01差异极显著；a、b、c表示P＜0.05差异显著)。D亲本及杂种中转基因阳性与阴性对照在结实率性状上的方差分析。 
图4：OsHDT1基因的表达模式。A OsHDT1在水稻MH63各组织部位中的表达模式，芽、茎、幼穗(3期、5期)中表达较高，幼叶剑叶中表达较低；B OsHDT1在品种间的表达水平没有明显差异。 
图5：HDT1亚细胞定位结果显示此蛋白定位在核里。(a，GFP对照图；b，HDT1-GFP图；c，PI染色；d，明场。Bar＝40μm) 
图6：OsHDT1在转基因和野生型亲本和杂种中的表达水平分析。 
图7：Western Blot检测HDT1的组蛋白修饰功能。 
具体实施方式
实施例1  OsHDT1基因的克隆及序列分析： 
对发明所需要的组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1为报道基因(见表1的信息)，通过RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)进行扩增得到其全长编码序列。 
具体步骤是：根据公共数据库(http://www.ncbi.nih.gov/，http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中公布的水稻OsHDT1基因的全长cDNA序列(详见表1)设计引物，PCR扩增。扩增产物通过T/A克隆连接到pGEMT-vector(Promega)进行测序验证。用来克隆全长基因的引物为：FLHDT1-F和FLHDT1-R，引物的具体序列见表4(参见说明书末尾) 
同样的方法得到RNAi抑制片段。用来克隆RNAi抑制片段的引物为：HDT1RNAi-F和HDT1RNAi-R，引物序列见表2。 
表1  本发明的来源基因OsHDT1的相关信息 
Figure G2009100618291D00031
实施例2  双元Ti质粒载体的构建和转化农杆菌的建立： 
具体步骤如下： 
1)将带有OsHDT1全长cDNA的TA克隆，用KpnI和BamHI酶切，回收目标条带，与KpnI和BamHI酶切的表达载体质粒pU1301(见附图1A，参照Huang et al.，Down-regulation of a Silent InformationRegulator2-related gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation and cell death in rice.Plant Physiol，2007，144：1508-1519.)连接，即为构建到超量表达载体。将带有OsHDT1全长干涉片段的T/A克隆用KpnI和BamHI酶切，回收目标条带，与KpnI和BamHI酶切的表达载体质粒pDS1301(见附图1B，参见：Chuet al.，Promotermutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice.Genes Dev，2006，20：1250-1255.)连接(所使用的内切酶均购自TAKARA公司，用法及用量按照该公司的产品说明书；连接酶为invitrogen公司产品，用法及用量按照该公司产品说明书)； 
2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入DH10B(购自Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(Roche公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养； 
3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述抽提质粒，用KpnI和BamHI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的超表达双元Ti质粒载体：pU1301-HDT1、pDS1301-HDT1-1； 
4)将带有OsHDT1全长干涉片段的TA克隆用SpeI和SacI酶切，回收目标条带，与SpeI和SacI酶切的质粒pDS1301-HDT1-1连接，依据2)、3)步得到抑制表达载体：pDS1301-HDT1-2； 
5)把新构建的表达载体pU1301-HDT1和pDS1301-HDT1-2通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数如上所述)导入农杆菌EHA105(购于CAMBIA公司)菌株中。转化后的菌株分别命名为TU-HDT1和TR-HDT1。 
实施例3  双元Ti质粒载体的转化和T0代转基因植株表达检测及拷贝数检测： 
1)将TU-HDT1和TR-HDT1向水稻受体品种“明恢63”(来自福建省三明市农科所)转化，转化方法参照Hiei等人报道的方法(Hiei et al，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacteriurnand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J，1994，6：271-282.)进行。所获得的T0代转基因植株命名为PU-n和PR-n，其中n＝1，2，3...代表转基因的不同家系。 
2)为了检测转基因植株中的拷贝数，申请人采用Southern Blot方法对转基因植株进行了分析。Southern杂交方法参照(Lu et al.Localization of pms3，a gene for photoperiod-sensitive genic male sterility，to a28.4-kb DNA fragment.Mol Genet Genomics，2005，273：507-511.)所述的方法。总DNA在37℃条件下，用适当的核酸内切酶消化过夜，然后在1％(w/v)的琼脂糖凝胶上分离并转移到硝酸纤维膜上。探针标记采用随机引物标记的方法，所使用的同位素标记物为α-32P-dCTP，膜在杂交管中先预杂交8-10h左右；然后加入同位素标记的探针，继续杂交10h；杂交完后，用1×SSC，0.1％SDS常温下将杂交膜漂洗两次，第1次5min，第2次10min，接着用相同浓度的洗膜液在65℃条件下热洗两次，每次10min；洗膜完毕，将膜放在干净的滤纸上晾干，用保鲜膜包好，压磷屏，扫描，读出结果。使用后的杂交膜放入防辐射专用装置中自然衰变 或者用探针洗液洗去探针。检测拷贝数用潮霉素探针。结果显示，PR-8家系有两个拷贝，其余检测家系只有一个拷贝。结果如图2所示。 
3)为了检测转基因植株中目标基因的表达量，申请人采用Northern Blot方法对转基因植株进行了表达检测。实验所用的总RNA来自分蘖期的叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；Northern转膜上样量为15μg，探针标记方法如southern杂交所述方法。膜在杂交管中先预杂交3h左右，然后加入同位素标记的探针，继续杂交12h；杂交结束后，用2×SSC，0.1％SDS常温下将杂交膜漂洗两次，每次10min，接着用含0.5×SSC，0.1％SDS的洗膜液在65℃条件下热洗一次，时间为3-5min，如果杂交信号依然很高，则改用含0.1×SSC，0.1％SDS的洗膜液在65℃条件下热洗一次，时间为3min或者更长，直至杂交信号适当为止；洗膜完毕，将膜放在干净的滤纸上晾干，用保鲜膜包好，压磷屏，扫描，读出结果。使用后的杂交膜放入防辐射专用装置中自然衰变或者用2×SSC在100℃左右热洗3min以洗去探针。Northern用到的OsHDT1基因的探针为用KpnI+PstI在PU1301-HDT1质粒上切下的酶切片段。 
对T0代植株收种子(T1代)，为T1代的大田种植和田间杂交做准备 
在本实施例中，遗传转化(转基因植株获得)的主要步骤、培养基以及使用的试剂如下： 
转化的主要步骤和试剂如下： 
(1)培养基中试剂和溶液缩写 
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；Hn(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6基本培养基的大量成分溶液)；N6mix(N6基本培养基的微量成分溶液)；MS max(MS基本培养基的大量成分溶液)；MS mix(MS基本培养基的微量成分溶液) 
(2)主要溶液配方 
1)N6基本培养基大量元素母液[10倍浓缩液]的配制： 
硝酸钾(KNO3)        28.3g 
磷酸二氢钾(KH2PO4)  4.0g 
硫酸铵((NH4)2SO4)   4.63g 
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 1.85g 
氯化钙(CaCl2·2H2O) 1.66g 
将上述试剂逐一用蒸馏水溶解，然后在室温下用蒸馏水定容至1000ml，备用。 
2)N6基本培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制 
碘化钾(KI)            0.08g 
硼酸(H3BO3)           0.16g 
硫酸锰(MnSO4·4H2O)   0.44g 
硫酸锌(ZnSO4·7H2O)   0.15g 
室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。 
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(配制成100X液)的配制 
准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，用蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。 
4)维生素贮存液(100X)配制 
烟酸(Nicotinic acid)        0.1g 
维生素B1(Thiamine HCl)      0.1g 
维生素B6(Pyridoxine HCl)    0.1g 
甘氨酸(Glycine)             0.2g 
肌醇(Inositol)              10g 
加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。 
5)MS基本培养基的大量元素母液(10X)的配制 
硝酸铵                      16.5g 
硝酸钾                      19.0g 
磷酸二氢钾                  1.7g 
硫酸镁                      3.7g 
氯化钙                      4.4g 
室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。 
6)MS基本培养基的微量元素母液(100X)的配制 
碘化钾                      0.083g 
硼酸                        0.62g 
硫酸锰                      0.86g 
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)       0.025g 
硫酸铜(CuSO4·5H2O)         0.0025g 
室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。 
7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制： 
秤取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后用蒸馏水定容至100ml，于室温下保存、备用。 
8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制： 
秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml用蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存，备用。 
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制： 
秤取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。 
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制： 
秤取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml。 
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制： 
秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。 
12)AS贮存液的配制： 
秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。 
13)1N氢氧化钾贮存液 
秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解并定容至100ml，室温保存备用。 
(3)用于水稻遗传转化的培养基组分及用量 
1)愈伤组织诱导培养基 
N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取        100ml 
N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取       10ml 
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取  10ml   
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取    10ml 
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取        2.5ml 
脯氨酸(Proline)                           0.3g/L 
CH                                        0.6g/L 
蔗糖(Sucrose)                             30g/L 
Phytagel                                  3g/L 
加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，在121℃下灭菌12分钟。 
2)愈伤组织继代培养基 
N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取        100ml 
N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取       10ml 
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取  10ml 
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取    10ml 
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取        2.0ml 
脯氨酸                                    0.5g/l 
CH                                        0.6g/l 
蔗糖                                      30g/l 
Phytagel                                  3g/l 
加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口在121℃下灭菌12分钟。 
3)预培养基 
N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取    12.5ml 
N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取         1.25ml 
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取    2.5ml 
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取      2.5ml 
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液)取            0.75ml 
CH                                          0.15g/L 
蔗糖                                        5g/L 
琼脂粉(Agarose)                             1.75g/L 
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，在121℃下灭菌12分钟。 
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。 
4)共培养基 
N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取        12.5ml 
N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取       1.25ml 
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取  2.5ml 
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取    2.5ml 
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取        0.75ml 
CH                                        0.2g/L 
蔗糖                                      5g/L 
琼脂粉                                    1.75g/L 
加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口，在121℃下灭菌12分钟。 
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。 
5)悬浮培养基 
N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取         5ml 
N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取        0.5ml 
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取   0.5ml 
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取     1ml 
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取         0.2ml 
CH                                         0.08g/L 
蔗糖                                       2g/L 
加蒸馏水至100ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。 
6)选择培养基 
N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取     25ml 
N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取    2.5ml 
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取          2.5ml 
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取            2.5ml 
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                0.625ml 
CH                                                0.15g/L 
蔗糖                                              7.5g/L 
琼脂粉                                            1.75g/L 
加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250μl Hn和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。 
7)预分化培养基 
N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取        25ml 
N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取       2.5ml 
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取  2.5ml 
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取    2.5ml 
6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)取          0.5ml 
KT贮存液(从已配好的贮存液中)取            0.5ml 
NAA贮存液(从已配好的贮存液中)取           50μl 
IAA贮存液(从已配好的贮存液中)取           50μl 
CH                                        0.15g/L 
蔗糖                                      7.5g/L 
琼脂粉                                    1.75g/L 
加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250μl Hn和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。 
8)分化培养基 
N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取        100ml 
N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取       10ml 
Fe2+EDTA贮存液(从已配好100X浓缩液中)取    10ml 
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取    10ml 
6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)取          2ml 
KT贮存液(从已配好的贮存液中)取            2ml 
NAA贮存液(从已配好的贮存液中)取           0.2ml 
IAA贮存液(从已配好的贮存液中)取           0.2ml 
CH                                        1g/L 
蔗糖                                      30g/L 
Phytagel                                  3g/L 
加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0。 
煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，在121℃下灭菌12分钟。 
9)生根培养基 
MS max母液(从已配好的10X浓缩液中)取        50ml 
MS min母液(从已配好的100X浓缩液中)取       5ml 
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取   5ml 
维生素贮存液(从已配好的100X贮存液中)取     5ml 
蔗糖                                       30g/L 
Phytagel                                   3g/L 
加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.8。 
煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，在121℃高压蒸汽下灭菌12分钟。 
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤： 
3.1愈伤组织诱导 
(1)将成熟的水稻种子(“明恢63”，来自福建省三明市农科所)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟； 
(2)用无菌水冲洗种子4-5次； 
(3)将灭过菌的水稻种子放在诱导培养基上(诱导培养基的组成如上所述)； 
(4)将接种后的培养基置于2541℃的黑暗处培养4周，得到水稻愈伤组织。 
3.2愈伤组织继代培养 
挑选亮黄色、紧密且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于如前所述的愈伤组织继代培养基上，在26±1℃，黑暗条件下培养2周，得到水稻继代的愈伤组织。 
3.3愈伤组织的预培养 
挑选紧密且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于前面所述的预培养基上，在26±1℃，黑暗条件下培养4天。 
3.4农杆菌培养 
(1)农杆菌EHA105接种在带有对应抗性选择的培养基LA上预培养，培养温度为28℃培养48小时； 
(2)再将步骤(1)的农杆菌转移至前面描述的悬浮培养基上，在28℃摇床上培养2-3小时。 
3.5农杆菌侵染 
(1)将预培养的愈伤组织转移至灭过菌的玻璃瓶内； 
(2)调节农杆菌的悬浮液至OD600 0.8-1.0； 
(3)将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟； 
(4)转移愈伤组织至灭好菌的滤纸上吸干；然后将其接种到如前所述的共培养基上，培养温度19-20℃，培养72小时(3天)。 
3.6愈伤组织洗涤和选择培养(抗性筛选) 
(1)用无菌水洗涤水稻愈伤组织至看不见农杆菌； 
(2)将愈伤组织浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的无菌水中30分钟； 
(3)将该愈伤组织转移至灭菌好的滤纸上，使该愈伤组织不带水； 
(4)转移愈伤组织至选择培养基上选择2-3次，每次2周(第一次潮霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后潮霉素为250毫克/升)。 
3.7预分化和分化 
(1)将以上得到的抗性愈伤组织转移至如前所述的预分化培养基上，在黑暗处培养5-7天；培养温度26℃。 
(2)转移预分化培养的愈伤组织至如前所述的分化培养基上，置光照下，光照强度2000lx培养，培养温度为26℃，培养5周左右得到发少量根的转基因小植株。 
3.8诱导生根 
(1)剪掉上述转基因小植株的根； 
(2)将其转移至如前所述的生根培养基中，在光照强度2000lx下培养2-3周，培养温度为26℃，经过18天左右得到生根的转基因水稻小植株。 
3.9移栽 
洗掉小植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室培养，同时在移栽的最初的几天保持水分湿润。 
实施例4  转基因T1代阳性检测和田间杂交： 
取实施例3的OHDT1转基因植株超表达PU阴性三个家系(PU29、PU30、PU31)和阳性三个家系(PU5、PU6、PU22)以及RNAi抑制表达PR阴性三个家系(PR6、PR14、PKG-转RNAi空载体)和阳性三个家系(编号分别为PR1、PR8、PR9)的T1代种子，种入田间。 
1)对阳性家系的T1代植株在DNA水平上做阳性检测，步骤如下：叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Murray et al，Rapid isolation of hiGH molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Res，1980，8：4321-4325.)。然后用常用的PCR方法对T0代转化植株用潮霉素引物进行阳性检测。潮霉素引物为：Hn-F和Hn-R(由上海生工生物工程技术有限公司提供)序列见表4。PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg2+1.5μl，正向引物、反向引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃1分钟，③56℃1分钟，④72℃2.5分钟，⑤从②-④循环32次，⑥72℃10分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。因为潮霉素基因为转化载体所特有，这样能扩增出潮霉素基因特异带的转基因植株即为阳性植株，否则即为分离出的阴性材料。 
2)取上述各家系阳性材料连同野生型明恢63一起作父本，与母本珍汕97A(来自江西省农科所)做杂交，并收获杂交种与自交种。 
实施例5  自交后代与杂交后代田间性状考察 
将实施例4中收获的自交和杂交种于06年5月和08年5月两次种入田里，每一家系种三次重复，每 一重复种10×6棵，取中间的8×4课进行表型观察和性状调查。性状调查数据用SAS软件进行方差分析。分析结果显示，杂种超表达材料比杂种野生型材料及阴性对照表现出明显的早开花性状，同时亲本的转基因材料和野生型材料在花期上没有明显差异。另外，杂种RNAi抑制材料比杂种阴性对照材料结实率降低，同时亲本的RNAi抑制材料和阴性对照材料相比在结实率性状上无明显差异(如图3所示) 
实施例6  检测水稻内源基因OsHDT1的表达模式和亚细胞定位 
1)以水稻品种“明恢63”为材料，分别取样于愈伤、根、芽、幼叶、剑叶、全苗和幼穗的3期5期。按实施例3中的方法提取总RNA后进行Northern Blot检测基因在植物各部位的表达水平。结果显示，OsHDT1基因在芽、茎以及3期5期的幼穗中表达量较高，而在幼叶、剑叶和全苗中表达量较低(参见图4A)。 
另外，为了研究本发明克隆的基因在不同品种中的表达有无差异，申请人选取水稻品种明恢63、珍汕97以及它们的杂交后代汕优63三个品种，分别取三个品种的幼叶、剑叶和全苗三个部位用Northern Blot方法进行表达检测，检测结果见图4B，各品种间在三个部位上表达基本无差异。 
2)对基因亚细胞定位的研究通过粒子轰击的办法进行，用到的载体为pU1391GFP(方法参照Huang etal.，Down-regulation of a Silent Information Regulator2-related gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation andcell death in rice.Plant Physiol，2007，144：1508-1519.)。具体方法为：通过PCR扩增出这些基因除去终止密码的全长编码序列，并将其构建到pU1391GFP载体上，使目标基因的读码框与GFP的读码框一致。粒子轰击的过程如下：将构建好的质粒DNA(5μg)与3mg直径1μm的金粉混匀，然后用60μl无水酒精将这些混合物重悬浮，将悬浮液分成5等分进行粒子轰击。粒子轰击前将洋葱表皮撕下，切成1cm2左右的小片，紧凑地铺在湿润的培养皿上。利用仪器PDS-1000System(购自BioRad公司)，在1100psi的氦压下进行粒子轰击，轰击后的洋葱表皮在25℃的暗环境中培养24小时后进行观察。利用Leica公司的共聚焦显微镜用来观察荧光蛋白(GFP)在洋葱表皮细胞中的表达部位。 
本实验中用于亚细胞定位研究的引物为：HDTNLS-F和HDTNLS-R。引物序列见表2。实验结果显示，HDT1::GFP定位在洋葱表皮细胞的核中(见图5)。 
实施例7  OsHDT1基因的表达分析和蛋白功能检测 
为了分析OsHDT1亲本和杂种中转基因和野生型的表达水平差异，申请人采用RT-PCR方法对转基因植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自分蘖期水稻的叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配混合液1：总RNA2μg，DNAseI2u，10xDNAseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于70℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，④将冷却的混合液1立即置于70℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2：混合液1 10μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT 2μl，10mMdNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小 时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；RT-PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg2+ 1.5μl，左、右引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCRbuffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自TAKARA或称之为宝生物工程(大连)有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃2分钟，②94℃1分钟，③58℃1分钟，④72℃2分钟，⑤从②-④循环30次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。RT-PCR用到的OsELP3基因的引物为：RTHDT-F和RTHDT-R，Actin基因引物为Actin-F和Actin-R。引物序列见表4。 
结果如图6所示，亲本与杂种中转基因和野生型表达量与预期相同。超表达材料具有超量效应，RNAi材料具有抑制效应，且亲本和杂种间各对应材料表达无明显差异。 
为了确定HDT1蛋白在组蛋白修饰上的作用以及亲本和杂种之间的修饰水平差异，申请人通过提取亲本和杂种中OsHDT1转基因和野生型的组蛋白，做Western Blot实验并利用组蛋白修饰类的商业化抗体对HDT1蛋白功能做了一系列研究(方法参照Huang et a1.，Down-regulation of a Silent Information Regulator2-related gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation and cell death in rice.Plant Physiol，2007，144：1508-1519.)。具体操作为：分别取播种后40天左右的野生型和转基因的水稻植株叶片4-5片，液氮研磨后放入3倍体积的组蛋白抽提缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5；2mM EDTA；0.25M HCl；5mM 2-mercaptoethano1；0.2mMPMSF)中充分混匀，经12000g，4℃离心10分钟后，吸取上清于另一新离心管，按体积加入三氯乙酸至终浓度为25％，17000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀用丙酮洗涤三次，晾干后溶解于上样缓冲液(62.5mM Tris-HCl，pH 6.8；2％SDS；25％glycerol；0.01％Bromophenol Blue；10％β-mercaptoethanol)中，经浓度为15％的SDS-PAGE电泳可检测抽提效果，电泳采用Bio-Rad公司的Mini-PROTEAN3电泳槽系统，按照其说明书进行操作。 
将提取好的组蛋白进行western检测，western blot转膜使用Bio-Rad公司的Mini Trans-Blot Cell转印槽系统，按照其说明书，将组蛋白转至Amersham公司的Hybond-P PVDF膜上，用配好的含2％(质量体积比)小牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L，pH 7.5)对膜封闭两小时以上，然后以1∶10000加入不同的抗体室温孵育两小时左右。所用抗体为：Upstate公司购买的抗H4K16(07-329)、H4ace(06-866)、H3ace(06-599)以及Abcam公司购买的抗H3(ab1791)、H4K5(ab51997)抗体(括号内为货号)。倒掉一抗后，用PBS缓冲液洗膜三次，每次15分钟，再加入按体积比为1∶10000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(购自SouthernBiotech公司)，室温孵育1-2小时，然后用PBS洗膜三次，每次15分钟，使用SuperSingnal Pico(购自Pierce公司)试剂盒按说明书操作方法进行X光片显影，经扫描仪扫描X光片后分析结果。 
实验结果如图7显示：HDT1蛋白具有组蛋白去乙酰化的功能，是一种组蛋白去乙酰化酶，主要作用在H4K16位点上。另外，明恢63、珍汕97以及汕优63三个品种在组蛋白修饰水平上存在显著差异，珍汕97的乙酰化水平极低，这也可能是导致其发生雄性不育的一个原因。 
表2  本发明的实施例所用到的引物对序列 
Figure G2009100618291D00131
Figure G2009100618291D00141
说明：以上引物均为上海生工生物工程技术有限公司合成。 
序列表 
<110>华中农业大学 
<120>组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1作为提高水稻杂种优势的应用 
<130> 
<141>2009-04-28 
<160>2 
<170>PatentIn version 3.1 
<210>1 
<211>894 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
<221>gene 
<222>(1)..(894) 
<223> 
<220> 
<221>CDS 
<222>(1)..(894) 
<223> 
<400>1 
atg gag ttc tgg ggt ctt gaa gtc aag cct gga cag act gtc aaa tgt 48 
Met Glu Phe Trp Gly Leu Glu Val Lys Pro Gly Gln Thr Val Lys Cys 
1               5                   10                  15 
gag cct gaa gat gaa cgc ttt ttg cac ctt tct cag gct gct ctt ggg 96 
Glu Pro Glu Asp Glu Arg Phe Leu His Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly 
            20                  25                  30 
gaa tca aag aaa gga tct gac aat gca gta atg tat gtt aaa act gat 144 
Glu Ser Lys Lys Gly Ser Asp Asn Ala Val Met Tyr Val Lys Thr Asp 
        35                  40                  45 
gat caa aag cta gtc att gga acc ctc tca gct gac aag ttc cct caa 192 
Asp Gln Lys Leu Val Ile Gly Thr Leu Ser Ala Asp Lys Phe Pro Gln 
    50                  55                  60 
atc cag ttt gat ttg gtc ttt gac aaa gag ttt gag ctg tca cac act 240 
Ile Gln Phe Asp Leu Val Phe Asp Lys Glu Phe Glu Leu Ser His Thr 
65                  70                  75                  80 
tca aag act gct agt gtg ttc ttt tct ggc tac aaa gtt tcc cag ccg 288 
Ser Lys Thr Ala Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Lys Val Ser Gln Pro 
                85                  90                  95 
gct gag gaa gat gaa atg gat ttt gat tct gaa gaa gtt gaa gat gaa 336 
Ala Glu Glu Asp Glu Met Asp Phe Asp Ser Glu Glu Val Glu Asp Glu 
            100                 105                 110 
gag gag gaa gaa aag atc att cca gct ccc agg gca aat ggc aaa gtt 384 
Glu Glu Glu Glu Lys Ile Ile Pro Ala Pro Arg Ala Asn Gly Lys Val 
        115                 120                 125 
gaa ggg aag gaa aat gag cag aaa aaa caa ggc aag aca gat tct tca 432 
Glu Gly Lys Glu Asn Glu Gln Lys Lys Gln Gly Lys Thr Asp Ser Ser 
    130                 135                 140 
gct tca aaa tca aag gct gca gtg aat gac gat gat gat gat gat gac 480 
Ala Ser Lys Ser Lys Ala Ala Val Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 
145                 150                 155                 160 
agt gca gag gat gat tct cag gac gaa gat ctt tct cct gag gat gat 528 
Ser Ala Glu Asp Asp Ser Gln Asp Glu Asp Leu Ser Pro Glu Asp Asp 
                165                 170                 175 
gat gat gat tct tct gag gat gat tcc agc gaa gat gat gag gat gag 576 
Asp Asp Asp Ser Ser Glu Asp Asp Ser Ser Glu Asp Asp Glu Asp Glu 
            180                 185                 190 
agt gac gag gaa gat act ccc aag aag cca gag act gga aag agg aaa 624 
Ser Asp Glu Glu Asp Thr Pro Lys Lys Pro Glu Thr Gly Lys Arg Lys 
        195                 200                 205 
gta gct gaa att gtg ttg aag aca cct tcg tct gat aag aaa gca aag 672 
Val Ala Glu Ile Val Leu Lys Thr Pro Ser Ser Asp Lys Lys Ala Lys 
    210                 215                 220 
att gct aca ccg tca ggc cag aag aca ggt gac aag aag ggt gtc cat 720 
Ile Ala Thr Pro Ser Gly Gln Lys Thr Gly Asp Lys Lys Gly Val His 
225                 230                 235                 240 
gta gca act cca cat ccg gca aag cag gct agc aag acc ccc gtg aat 768 
Val Ala Thr Pro His Pro Ala Lys Gln Ala Ser Lys Thr Pro Val Asn 
                245                 250                 255 
gac aag tca aag gag aag tcc cca aaa tcc ggt ggt ggg tca att tct 816 
Asp Lys Ser Lys Glu Lys Ser Pro Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Ser 
            260                 265                 270 
tgc aag tca tgc agc aag acg ttc aac agt gaa atg gct ctg caa tct 864 
Cys Lys Ser Cys Ser Lys Thr Phe Asn Ser Glu Met Ala Leu Gln Ser 
        275                 280                 285 
cac tcg aag gcc aag cac ccc gcc aag tga                         894 
His Ser Lys Ala Lys His Pro Ala Lys 
    290                 295 
<210>2 
<211>297 
<212>PRT 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<400>2 
Met Glu Phe Trp Gly Leu Glu Val Lys Pro Gly Gln Thr Val Lys Cys 
1               5                   10                  15 
Glu Pro Glu Asp Glu Arg Phe Leu His Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly 
            20                  25                  30 
Glu Ser Lys Lys Gly Ser Asp Asn Ala Val Met Tyr Val Lys Thr Asp 
        35                  40                  45 
Asp Gln Lys Leu Val Ile Gly Thr Leu Ser Ala Asp Lys Phe Pro Gln 
    50                  55                  60 
Ile Gln Phe Asp Leu Val Phe Asp Lys Glu Phe Glu Leu Ser His Thr 
65                  70                  75                  80 
Ser Lys Thr Ala Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Lys Val Ser Gln Pro 
                85                  90                  95 
Ala Glu Glu Asp Glu Met Asp Phe Asp Ser Glu Glu Val Glu Asp Glu 
            100                 105                 110 
Glu Glu Glu Glu Lys Ile Ile Pro Ala Pro Arg Ala Asn Gly Lys Val 
        115                 120                 125 
Glu Gly Lys Glu Asn Glu Gln Lys Lys Gln Gly Lys Thr Asp Ser Ser 
    130                 135                 140 
Ala Ser Lys Ser Lys Ala Ala Val Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 
145                 150                 155                 160 
Ser Ala Glu Asp Asp Ser Gln Asp Glu Asp Leu Ser Pro Glu Asp Asp 
                165                 170                 175 
Asp Asp Asp Ser Ser Glu Asp Asp Ser Ser Glu Asp Asp Glu Asp Glu 
            180                 185                 190 
Ser Asp Glu Glu Asp Thr Pro Lys Lys Pro Glu Thr Gly Lys Arg Lys 
        195                 200                 205 
Val Ala Glu Ile Val Leu Lys Thr Pro Ser Ser Asp Lys Lys Ala Lys 
    210                 215                 220 
Ile Ala Thr Pro Ser Gly Gln Lys Thr Gly Asp Lys Lys Gly Val His 
225                 230                 235                 240 
Val Ala Thr Pro His Pro Ala Lys Gln Ala Ser Lys Thr Pro Val Asn 
                245                 250                 255 
Asp Lys Ser Lys Glu Lys Ser Pro Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Ser 
            260                 265                 270 
Cys Lys Ser Cys Ser Lys Thr Phe Asn Ser Glu Met Ala Leu Gln Ser 
        275                 280                 285 
His Ser Lys Ala Lys His Pro Ala Lys 
序列表 
<110>华中农业大学 
<120>组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1作为提高水稻杂种优势的应用 
<130> 
<141>2009-11-27 
<160>12 
<170>PatentIn version 3.1 
210>1 
<211>29 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<223> 
<400>1 
gggggtaccc cgattccgat ggagttctg                       29 
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<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<223> 
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gggggatccg aagctcagtt cgcaccacag                      30 
<210>3 
<211>35 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
<221>primer_bind 
<222>(1)..(35) 
<223> 
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gggactagtg gtaccggctg cagtgaatga cgatg                35 
<210>4 
<211>35 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<222>(1)..(35) 
<223> 
<400>4 
ggggagctcg gatcctcact tggcggggtg cttgg               35 
<210>5 
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<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<223> 
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ggggaattcc cgattccgat ggagttctg                      29 
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<211>29 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<223> 
<400>6 
gggggatccc ttggcggggt gcttggcct                      29 
<210>7 
<211>21 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<223> 
<400>7 
cgctttttgc acctttctca g                              21 
<210>8 
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<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<223> 
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actttgccat ttgccctgg                                 19 
<210>9 
<211>21 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
<221>primer_bind 
<222>(1)..(21) 
<223> 
<400>9 
agaagaagat gttggcgacc t                              21 
<210>10 
<211>20 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<223> 
<400>10 
gtcctgcggg taaatagctg                                20 
<210>11 
<211>20 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<223> 
<400>11 
tatggtcaag gctgggttcg                                20 
<210>12 
<211>20 
<212>DNA 
<213>水稻(Oryza sativa) 
<220> 
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<222>(1)..(20) 
<223> 
<400>12 
ccatgctcga tggggtactt                           20 

Claims (1)

1.组蛋白去乙酰化酶基因OsHDT1在调控水稻开花期中的应用，其特征在于，所述OsHDT1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
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