CN101434963B - 组蛋白乙酰化酶基因OsELP3作为调控水稻开花期的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻组蛋白乙酰化酶基因及其编码蛋白功能与应用。本发明公开一种水稻组蛋白乙酰化酶基因OsELP3，该基因与植物的花期有关。在长日照下，超表达此基因可导致水稻开花提早，而抑制该基因表达可导致水稻开花延迟。短日照处理后，抑制材料的突变表型恢复为野生型。分析发现OsELP3基因会影响Hd3a、Hd1和OsGI三个开花基因的表达水平，且其自身表达在短日照下呈现节律变化。Western Blot实验分析发现此基因具有组蛋白乙酰化功能，位点作用于H3K9上。

Description

组蛋白乙酰化酶基因OsELP3作为调控水稻开花期的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个调控水稻开花时期的组蛋白乙酰化酶基因OsELP3(Elongation Protein 3)的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物的开花时期有关。

背景技术

高等植物从种子萌发到再结出新种子这一完整的生命周期可分为营养生长和生殖生长两个阶段，其中由营养生长向生殖生长转换的过程称为成花诱导。这一过程受到植物自身遗传因子和外界环境两方面因素的影响。不同的高等植物其成花诱导过程有一定的相似性和规律性：植物经过一定时期的营养生长达到花熟状态，其内部的成花物质就感受到外界环境，如光照、温度、湿度等的刺激，诱导下游开花基因的表达，从而促使顶端分生组织分化成花。因此，开花是植物由营养生长到生殖生长的转变，在植物的整个发育过程中起到了非常重要的作用。

近年来随着模式植物拟南芥基因组研究的深入，其开花作用机理的研究取得了显著进展，控制拟南芥成花诱导过程的主要通路已经基本探明。总体来讲，拟南芥的开花诱导受四种途径的控制：光周期途径、春化途径、GA(赤霉素)途径和自主途径(Yanovsky MJ，Kay SA.Living by the calendar：how plants know whento flower.Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4(4)：265-276.)。

光周期现象指生长在地球上不同地区的植物在长期适应环境过程中对日照长度的周期性变化表现出反应的现象。根据对不同日照长度的反应可把植物分为长日植物、短日植物和日中性植物。拟南芥就是一种典型的长日植物，即日照长度只有长于某一临界时长时才能诱导植物开花。在近些年的研究中，逐步发现了一批光周期开花途径中的关键基因，如constans(co)(Putterill et al.， The CONSTANS gene of Arabidopsispromotes flowering and encodes a protein showing similarities to

表观遗传现象的遗传基础在于染色质结构的变化对基因表达的影响。一般来讲，染色质结构的改变依赖于两类酶活性，一类是ATP水解酶活性，它可以对染色质进行重塑(Vignali M et al.，ATP-DependentChromatin-Remodeling Complexes.Mol and Cell Biol，2000，20(6)：1899-1910.)；另一类是一系列能对组蛋白尾部特定残基进行共价修饰的酶类(Meyer P，Chromatin Remodelling.Curr.Opin.Plant.Biol.2001，4：457-462)。组蛋白氨基末端的乙酰化和去乙酰化是基因活化和抑制过程中的主要调控机制。组蛋白乙酰化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。组蛋白乙酰转移酶(HAT)通常作为多亚基辅激活物复合体的一部分，催化组蛋白乙酰化，能选择性地使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因的转录，增强其表达水平。

随着成花通路的探明，植物的开花机理渐趋清晰。但是在染色质修饰水平上，植物的开花时期是如何控制的，现在仍然不是很清楚。本发明找到了一个能在组蛋白修饰水平上调控植物开花时期的基因，进一步完善了植物成花机理及表观遗传现象的内容。

经检索，在NCBI数据库中利用乙酰转移酶结构域(HAT Domain)比对搜索水稻蛋白序列发现一个组蛋白乙酰化酶OsELP3(Elongation Protein 3)，其全长cDNA登陆号为AK122179，基因ID号为4336205。(见表一)关于此基因在水稻中的功能还不清楚。

发明内容

本发明的目的在于通过克隆一种组蛋白乙酰转移酶基因，进行功能验证，通过遗传转化水稻本身，使该基因能够调控水稻植株的开花时期的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明从水稻中分离得到一个能够调控水稻开花时期的组蛋白乙酰转移酶基因OsELP3，它的编码基因如序列表SEQ ID NO：1所示。序列全长为1722个碱基，编码573个氨基酸。

经验证，所述的基因OsELP3与水稻开花时期有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与玉米泛素启动子(Ubiquitin)结合后直接转入水稻，转基因植株花期明显比野生型对照植株提前；转入RNAi抑制片段的植株花期明显比野生型对照植株延迟。通过分析发现OsELP3基因通过组蛋白修饰手段参与了Hd3a、Hd1、OsGI等一些开花基因的表达调控。

如图1所示，本发明构建了一种超表达载体pU1301和一种抑制表达载体pDS1301，获得转化载体pU1301-ELP3和pDS1301-ELP3。利用该转化载体转化水稻品种“中花11”(一个报道的粳稻亚种材料，来自中国农业科学院作物科学研究所)，得到转基因水稻植株。具体操作步骤如下：

(1)从NCBI数据库获得到该基因的DNA序列，根据该序列设计引物对，扩增CDS区域；

(2)构建超表达载体pU1301和抑制表达载体pDS1301，获得转化载体pU1301-ELP3和pDS1301-ELP3；

(3)利用农杆菌介导的转基因方法将所述的基因OsELP3导入水稻受体，获得转化植株；

(4)借助RT-PCR和Northern Blot方法分析鉴定阳性转基因植株，并观察转基因植株表型；

(5)将阳性的转基因植株发芽后进行长短日照处理并观察处理后表型，统计开花天数并进行数据分析；

(6)利用Realtime PCR和RT-PCR方法分析水稻内源OsELP3基因表达模式；

(7)利用Realtime PCR分析步骤(5)的转基因植株中目标基因的表达；

(8)借助Western Blot分析转基因植株组蛋白修饰情况。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的OsELP3基因编码区；同时显示了该基因编码的氨基酸序列。

图1：是载体图。图1A：是超表达载体PU1301；图1B：是抑制表达载体pDS1301。

图2：是OsELP3基因在T0代转基因和野生型植株中的表达检测。图2A：是OsELP3基因在超表达和野生型植株中的表达检测；图2B：是OsELP3基因在抑制表达和野生型植株中的表达检测。

图3：OsELP3转基因植株在长短日照下的表型图。图3A(包含图3A-1和图3A-2)：是长日照下超表达材料开花提早，抑制表达材料开花延迟；图3B：是短日照下，超表达材料开花提早，抑制表达材料花期不变的植株形态；图3C(包含图3C-1和图3C-2)：是转基因阳性和阴性及野生型材料在长短日照下的抽穗期统计分析，星号表示转基因家系相对野生型差异显著(*P＜0.05)或极显著(**P＜0.01)。

图4：OsELP3基因的表达模式。图4A：是OsELP3在水稻各组织部位中呈现组成型表达模式；图4B：是OsELP3基因在长日照下呈现均一表达模式，而在短日照下呈现节律表达模式

图5：是各开花基因在OsELP3转基因材料和野生型中的表达情况。图5A(包含图5A-1和图5A-2)：是Hd3a；图5B(包含图5B-1和图5B-2)：是Hd1；图5C(包含图5C-1和图5C-2)：是OsGI

图6：是Western Blot检测ELP3的组蛋白修饰功能。

具体实施方式

实施例1  OsELP3基因的克隆及序列分析：

对发明所需要的基因，通过RT-PCR方法(参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)进行扩增得到其全长编码序列，具体步骤是：根据公共数据库(http://www.ncbi.nih.gov/，http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中公布的水稻OsELP3基因的全长cDNA序列(详见表1)设计引物，PCR扩增。扩增产物通过T/A克隆连接到pGEM T-vector(Promega)进行测序验证。用来克隆全长基因的引物为：FLELP-F和FLELP-R，引物的具体序列见表4(参见说明书末尾)

同样的方法得到RNAi抑制片段。用来克隆RNAi抑制片段的引物为：ELPRNAi-F和ELPRNAi-R，引物序列见表4。

表1来源基因信息

实施例2双元Ti质粒载体的构建和转化农杆菌的建立：

具体步骤如下：

1)将带有OsELP3全长cDNA的TA克隆，用KpnI和BamHI酶切，回收目标条带，与KpnI和BamHI酶切的表达载体质粒pU1301(见附图1A，参照Huang et al.，Down-regulation of a Silent InformationRegulator2-related gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation and cell death in rice.Plant Physiol，2007，144：1508-1519.)连接，即为构建到超量表达载体。将带有OsELP3全长干涉片段的T/A克隆用KpnI和BamHI酶切，回收目标条带，与KpnI和BamHI酶切的表达载体质粒pDS1301(见附图1B，参见：Chuet al.，Promotermutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice.Genes Dev，2006，20：1250-1255.)连接(所使用的内切酶均购自TAKARA公司，用法及用量按照该公司的产品说明书；连接酶为invitrogen公司产品，用法及用量按照该公司产品说明书)；

2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入DH10B(购自Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(Roche公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养；

3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述抽提质粒，用KpnI和BamHI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的超表达双元Ti质粒载体：pU1301-ELP3、pDS1301-ELP3-1；

4)将带有OsELP3全长干涉片段的TA克隆用SpeI和SacI酶切，回收目标条带，与SpeI和SacI酶切的质粒pDS1301-ELP3-1连接，依据2)、3)步得到抑制表达载体：pDS1301-ELP3-2；

5)把新构建的表达载体pU1301-ELP3和pDS1301-ELP3-2通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数如上所述)导入农杆菌EHA105(购于CAMBIA公司)菌株中。转化后的菌株分别命名为TU-ELP3和TR-ELP3。

实施例3  双元Ti质粒载体的转化及转基因植株的阳性检测：

1)将TU-ELP3和TR-ELP3向水稻受体品种“中花11”(来自中国农业科学院作物科学研究所)转化，转化方法参照Hiei等人报道的方法(Hiei et al，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis ofthe boundaries of the T-DNA.Plant J，1994，6：271-282.)进行。所获得的T0代转基因植株命名为EU-n和ER-n，其中n＝1，2，3...代表转基因的不同家系。

2)T0代转化植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Murray et al，Rapid isolation of highmolecular weight plant DNA.Nucleic Acids Res，1980，8：4321-4325.)。然后用常用的PCR方法对T0代转化植株用潮霉素引物进行阳性检测。潮霉素引物为：Hn-F和Hn-R(由上海生工生物工程技术有限公司提供)序列见表4。PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，正向引物、反向引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃1分钟，③56℃1分钟，④72℃2.5分钟，⑤从②-④循环32次，⑥72℃10分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。因为潮霉素基因为转化载体所特有，这样能扩增出潮霉素基因特异带的转基因植株即为阳性植株。

对T0代阳性植株收种子(T1代)，为T1代的大田种植和性状调查做准备

在本实施例中，遗传转化(转基因植株获得)的主要步骤、培养基以及使用的试剂如下：转化的主要步骤和试剂如下：

(1)培养基中试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；

KT(Kinetin，激动素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；Hn(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6基本培养基的大量成分溶液)；N6mix(N6基本培养基的微量成分溶液)；MS max(MS基本培养基的大量成分溶液)；MS mix(MS基本培养基的微量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6基本培养基大量元素母液[10倍浓缩液]的配制：

硝酸钾(KNO₃)                  28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)            4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)             4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)           1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)           1.66g

将上述试剂逐一用蒸馏水溶解，然后在室温下用蒸馏水定容至1000ml，备用。

2)N6基本培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI)                    0.08g

硼酸(H₃BO₃)                   0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)           0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)           0.15g

室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(配制成100X液)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分

溶解后在70℃水浴中保持2小时，用蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid)            0.1g

维生素B1(Thiamine HCl)          0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl)        0.1g

甘氨酸(Glycine)                 0.2g

肌醇(Inositol)                  10g

加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS基本培养基的大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵                          16.5g

硝酸钾                19.0g

磷酸二氢钾            1.7g

硫酸镁                3.7g

氯化钙                4.4g

室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。

6)MS基本培养基的微量元素母液(100X)的配制

碘化钾                  0.083g

硼酸                    0.62g

硫酸锰                  0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)   0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)     0.0025g

室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后用蒸馏水定容至100ml，于室温下保存、备用。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml用蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存，备用。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

秤取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解并定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基组分及用量

1)愈伤组织诱导培养基

N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                 100ml

N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取           10ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取             10ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                 2.5ml

脯氨酸(Proline)                                    0.3g/L

CH                                                 0.6g/L

蔗糖(Sucrose)                                      30g/L

Phytagel                                           3g/L

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，在121℃下灭菌12分钟。

2)愈伤组织继代培养基

N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                        100ml

N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                       10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                  10ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                    10ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                        2.0ml

脯氨酸                                                    0.5g/l

CH                                                        0.6g/l

蔗糖                                                      30g/l

Phytagel                                                  3g/l

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口在121℃下灭菌12分钟。

3)预培养基

N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                        12.5ml

N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                       1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                  2.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                    2.5ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液)取                          0.75ml

CH                                                        0.15g/L

蔗糖                                                      5g/L

琼脂粉(Agarose)                                           1.75g/L

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                        12.5ml

N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                       1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                  2.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                    2.5ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                        0.75ml

CH                                                        0.2g/L

蔗糖                                                      5g/L

琼脂粉                                                    1.75g/L

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                        5ml

N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                       0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                  0.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                    1ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                        0.2ml

CH                                                        0.08g/L

蔗糖                                                      2g/L

加蒸馏水至100ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                    25ml

N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                   2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取              2.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                2.5ml

2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                    0.625ml

CH                                                    0.15g/L

蔗糖                                                  7.5g/L

琼脂粉                                                1.75g/L

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250μl Hn和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                    25ml

N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                   2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取              2.5ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                2.5ml

6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)取                      0.5ml

KT贮存液(从已配好的贮存液中)取                        0.5ml

NAA贮存液(从已配好的贮存液中)取                       50μl

IAA贮存液(从已配好的贮存液中)取                       50μl

CH                                                    0.15g/L

蔗糖                                                  7.5g/L

琼脂粉                                                1.75g/L

加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250μl Hn和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                    100ml

N6min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                   10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好100X浓缩液中)取                10ml

维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                10ml

6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)取                      2ml

KT贮存液(从已配好的贮存液中)取                        2ml

NAA贮存液(从已配好的贮存液中)取                       0.2ml

IAA贮存液(从已配好的贮存液中)取                       0.2ml

CH                                                    1g/L

蔗糖                                                  30g/L

Phytagel                                              3g/L

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，在121℃下灭菌12分钟。

9)生根培养基

MS max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                   50ml

MS min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                  5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取              5ml

维生素贮存液(从已配好的100X贮存液中)取          5ml

蔗糖                                            30g/L

Phytagel                                        3g/L

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，在121℃下灭菌12分钟。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤：

3.1愈伤组织诱导

(1)将成熟的水稻种子(“中花11”，中国农业科学院作物科学研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

(2)用无菌水冲洗种子4-5次；

(3)将灭过菌的水稻种子放在诱导培养基上(诱导培养基的组成如上所述)；

(4)将接种后的培养基置于25±1℃的黑暗处培养4周，得到水稻愈伤组织。

3.2愈伤组织继代培养

挑选亮黄色、紧密且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于如前所述的愈伤组织继代培养基上，在26±1℃，黑暗条件下培养2周，得到水稻继代的愈伤组织。

3.3愈伤组织的预培养

挑选紧密且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于前面所述的预培养基上，在26±1℃，黑暗条件下培养4天。

3.4农杆菌培养

(1)农杆菌EHA105接种在带有对应抗性选择的培养基LA上预培养，培养温度为28℃培养48小时；

(2)再将步骤(1)的农杆菌转移至前面描述的悬浮培养基上，在28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤组织转移至灭过菌的玻璃瓶内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

(3)将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤组织至灭好菌的滤纸上吸干；然后将其接种到如前所述的共培养基上，培养温度19-20℃，培养72小时(3天)。

3.6愈伤组织洗涤和选择培养(抗性筛选)

(1)用无菌水洗涤水稻愈伤组织至看不见农杆菌；

(2)将愈伤组织浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的无菌水中30分钟；

(3)将该愈伤组织转移至灭菌好的滤纸上，使该愈伤组织不带水；

(4)转移愈伤组织至选择培养基上选择2-3次，每次2周(第一次潮霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后潮霉素为250毫克/升)。

3.7预分化和分化

(1)将以上得到的抗性愈伤组织转移至如前所述的预分化培养基上，在黑暗处培养5-7天；培养温度26℃。

(2)转移预分化培养的愈伤组织至如前所述的分化培养基上，置光照下，光照强度20001x培养，培养温度为26℃，培养5周左右得到发少量根的转基因小植株。

3.8诱导生根

(1)剪掉上述转基因小植株的根；

(2)将其转移至如前所述的生根培养基中，在光照强度20001x下培养2-3周，培养温度为26℃，经过18天左右得到生根的转基因水稻小植株。

3.9移栽

洗掉小植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室培养，同时在移栽的最初的几天保持水分湿润。

本发明总共获得独立转基因水稻植株超表达材料23株，RNAi材料34株。

实施例4 T1代性状调查和表达分析：

1)将本发明的转基因ELP3-n的阳性家系以及野生型种植在自然长日照(LD)条件下。对各家系的开花时间进行性状调查。调查结果显示在自然长日照条件下，OsELP3的转基因家系的开花时期相对野生型，超表达材料开花提前而RNAi材料开花延迟(参见表2，图3A，C)。

表2长日照条件下转基因和野生型植株开花时间统计表

说明：

(1)家系EU2，10和20均为本发明的超表达转基因植株，其中EU2为表达量无升高的阴性对照；家系ER8，15和16均为本发明的RNAi转基因植株，其中ER16为表达量无下降的阴性对照

(2)每个家系选一定数量转基因植株，用单因素方差分析的方法来检测转基因家系和野生型开花时间的差异(P＜5％表示差异显著；P＜1％表示差异极显著)。

为了检测转基因植株中目标基因的表达量，中请人采用RT-PCR方法对转基因植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自分蘖期的叶片，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配混合液1：总RNA 2μg，DNAseI 2u，10x DNAseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于70℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，④将冷却的混合液1立即置于70℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2：混合液110μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT 2μl，10mM dNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；RT-PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP1.6μl，2.5mM Mg²⁺1.5μl，左、右引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg²⁺、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下：①94℃2分钟，②94℃1分钟，③58℃1分钟，④72℃2分钟，⑤从②-④循环30次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。RT-PCR用到的OsELP3基因的引物为：PELP-F和PELP-R，Actin基因引物为Actin-F和Actin-R。引物序列见表4。

结果显示在这些花期提早的转基因植株中OsELP3的表达量都得到很大的提高，而在花期延迟的转基因植株中OsELP3的表达都得到极大的抑制，表明花期的变异表型是由目标基因的超量表达和抑制表达引起的，表达分析结果如图2所示。

2)将OELP3转基因植株的T1代种子在含1/2000潮霉素的生根培养基中发芽，同时将野生型ZH11在无潮霉素的生根培养基中发芽，一周后，将长出的幼苗选五铢移入盛土的面包盒中放入人工气候箱(VersatileEnvironmental Test Chamber MLR-351H，SANYO)中培养，程序设定为光照9小时，温度30℃；无光照15小时，温度25℃，湿度恒定在70％。对植株进行短日照处理并对各家系的开花时间进行调查统计。调查结果显示短日照条件会将OsELP3 RNAi材料的延迟开花性状恢复为正常，而超表达材料的开花时期相对于野生型依旧提前(参见表3，图3B，C)。

表3短日照条件下转基因和野生型植株开花时间统计表

说明：

(1)家系EU2，10和20均为本发明的超表达转基因植株，其中EU2为表达量无升高的阴性对照；家系ER8，15和16均为本发明的RNAi转基因植株，其中ER16为表达量无下降的阴性对照

(2)每个家系选5株转基因植株，用单因素方差分析的方法来检测转基因家系和野生型开花时间的差异(P＜5％表示差异显著(*)；P＜1％表示差异极显著(**))。

实施例5检测水稻内源基因OsELP3的表达模式

以水稻品种“中花11”为材料，分别取样于愈伤、根、芽、幼叶、剑叶、全苗和幼穗。按实施例4中的方法提取总RNA后进行反转录，反转录的产物进行半定量PCR检测基因在植物各部位的表达水平。结果显示，OsELP3基因为组成型表达，在各部位中的表达量基本无差异(参见图4A)。

因转基因材料开花时期发生变异，所以申请人研究了本基因在长日照和短日照条件下在一天中的表达节律。方法如下：按实施例4中的方法对野生型和转基因材料T1代种子发芽，一周后，将长出的幼苗分为两份移入盛土的面包盒中放入人工气候箱(Versatile Environmental Test Chamber MLR-351H，SANYO)中培养，程序设定为光照15小时，温度30℃；无光照9小时，温度25℃，湿度恒定在70％。长日照条件培养三周后将一份材料移入短日照条件，程序设定同实施例4。另一份仍放在长日照条件下。再处理两周后取样。每份材料同时取，隔4小时取一次样，共取48小时。将样品提取总RNA后进行反转录，反转录的产物进行定量PCR，其反应的体系为25μl，其中含有1.5μl反转录产物、0.25μM的左右引物和12.5μl的SYBR Green混合物(Takara)。反应在7500 real-time定量PCR仪(Takara)上进行，反应程序按照Takara公司提供的操作手册进行，水稻actin1基因(Xue et al.，Natural variation in Ghd7 is an important regulator ofheading date and yield potential in rice.Nat Genet，2008，40：761-7)作为反应中的内参。反应40个循环，每个样设置三个重复，以actin1表达量进行平衡化处理。

结果表明，本发明克隆的基因OsELP3在长日照下表达恒定；而在短日照下呈现明显的节律现象：随着光的诱导表达量上升，在光消失后3小时达到顶峰，随后下降，到光产生后半小时达到最低(结果如图4B所示)。定量PCR用到的OsELP3引物见表4.

实施例6转基因植株中与开花时期相关基因的表达分析：

取实施例5中的RT产物，依据实施例所述的5方法检测水稻中的开花基因Hd3a、Hd1和OsGI(Xue etal.，Natural variation in Ghd7 is an important regulator of heading date and yield potential in rice.Nat Genet，2008，40：761-7)在长、短日照下OsELP3超量和抑制表达的转基因植株和野生型中的表达量。PCR所用到的各基因的引物如表4所示。

结果表明，Hd3a在短日照下的转基因OsELP3超表达材料中表达量高于野生型中的表达量，而在RNAi材料中表达量低于野生型中的表达量。Hd1在长日照白天下的OsELP3超表达材料中表达量低于野生型中的表达量，而在RNAi材料中表达量高于野生型中的表达量；在夜晚及短日照下没有特别大的差别。OsGI在长短日照下，相对于野生型，在超表达材料中表达量低而在RNAi材料中表达量高。由此可知，OsELP3可能就是通过抑制Hd1和OsGI基因的表达，从而促使Hd3a表达升高来影响水稻开花时间。结果见图5。

实施例7  OsELP3基因的蛋白功能检测

为了确定ELP3蛋白在组蛋白修饰上的作用，申请人通过提取OsELP3转基因和野生型的组蛋白，做Western Blot实验并利用组蛋白修饰类的商业化抗体对ELP3蛋白功能做了一系列研究(方法参照Huang etal.，Down-regulation of a Silent Information Regulator2-related gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation andcell death in rice.Plant Physiol，2007，144：1508-1519.)。具体操作为：分别取播种后40天左右的野生型和转基因的叶片4-5片，液氮研磨后放入3倍体积的组蛋白抽提缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5；2mM EDTA；0.25M HCl；5mM 2-mercaptoethanol；0.2mM PMSF)中充分混匀，经12000g，4℃离心10分钟后，吸取上清于另一新离心管，按体积加入三氯乙酸至终浓度为25％，17000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀用丙酮洗涤三次，晾干后溶解于上样缓冲液(62.5mM Tris-HCl，pH 6.8；2％SDS；25％ glycerol；0.01％Bromophenol Blue；10％β-mercaptoethanol)中，经浓度为15％的SDS-PAGE电泳可检测抽提效果，电泳采用Bio-Rad公司的Mini-PROTEAN3电泳槽系统，按照其说明书进行操作。

将提取好的组蛋白进行western检测，western blot转膜使用Bio-Rad公司的Mini Trans-Blot Cell转印槽系统，按照其说明书，将组蛋白转至Amersham公司的Hybond-P PVDF膜上，用配好的含2％(质量体积比)小牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L，pH 7.5)对膜封闭两小时以上，然后以1∶10000加入不同的抗体室温孵育两小时左右。所用抗体为：Upstate公司购买的抗H3K9ace(07-352)以及Abcam公司购买的抗H3(ab1791)抗体(括号内为货号)。倒掉一抗后，用PBS缓冲液洗膜三次，每次15分钟，再加入按体积比为1∶10000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(购自SouthernBiotech公司)，室温孵育1-2小时，然后用PBS洗膜三次，每次15分钟，使用SuperSingnal Pico(购自Pierce公司)试剂盒按说明书操作方法进行X光片显影，经扫描仪扫描X光片后分析结果。

实验结果显示：ELP3蛋白具有组蛋白乙酰转移酶的功能，是一种组蛋白乙酰化酶，主要作用在H3K9位点上。

表4本发明的实施例所用到的引物对序列

说明：以上引物均为上海生工生物工程技术有限公司合成。

序列表

<110>华中农业大学

<120>组蛋白乙酰化酶基因OsELP3作为调控水稻开花期的应用

<130>

<141>2008-12-18

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1722

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1722)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1722)

<223>

<400>1

atg gcc acc gcc gta gcc gcc gcc ggc ggt ggc ggc ggc ggc gag cag   48

Met Ala Thr Ala Val Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gln

1               5                   10                  15

ccg cgc agg agg aag ccg gcg ccg ggg aga ggg gga gtg gtg ctc ccc   96

Pro Arg Arg Arg Lys Pro Ala Pro Gly Arg Gly Gly Val Val Leu Pro

            20                  25                  30

gcg ggg ctg tcg gag gag gag gcg cgg gtg cgg gcc atc gcg gag atc   144

Ala Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ala Arg Val Arg Ala Ile Ala Glu Ile

        35                  40                  45

gtg tcg gcg atg ggg gag ctc tcg cgg cga ggg gag gac gtg gac ctg   192

Val Ser Ala Met Gly Glu Leu Ser Arg Arg Gly Glu Asp Val Asp Leu

    50                  55                  60

aac gcg ctc aag tcg gcc gcg tgc cgg agg tac ggg ctg gcg cgg gcg   240

Asn Ala Leu Lys Ser Ala Ala Cys Arg Arg Tyr Gly Leu Ala Arg Ala

65                  70                  75                  80

ccg aag ctg gtg gag atg atc gcg gcg gtg ccg gag gcc gac cgc gcc   288

Pro Lys Leu Val Glu Met Ile Ala Ala Val Pro Glu Ala Asp Arg Ala

                85                  90                  95

gcg ctg ctc cca agg ctg cgc gcc aag ccc gtg cgc acg gcg tcg ggc    336

Ala Leu Leu Pro Arg Leu Arg Ala Lys pro Val Arg Thr Ala Ser Gly

            100                 105                 110

att gcc gtg gtc gcc gtg atg tcg aag ccg cac cgg tgc ccc cac atc    384

Ile Ala Val Val Ala Val Met Ser Lys Pro His Arg Cys Pro His Ile

        115                 120                 125

gcc acc acg ggg aac atc tgc gtg tac tgc ccc gga ggc ccc gac tcc    432

Ala Thr Thr Gly Asn Ile Cys Val Tyr Cys Pro Gly Gly Pro Asp Ser

    130                 135                 140

gac ttc gag tac agc acc cag tcc tac acc ggc tac gag ccc acc agc    480

Asp Phe Glu Tyr Ser Thr Gln Ser Tyr Thr Gly Tyr Glu Pro Thr Ser

145                 150                 155                 160

atg cgc gcc att cga gca agg tac aat cca tat gtg cag gcc aga agc    528

Met Arg Ala Ile Arg Ala Arg Tyr Asn Pro Tyr Val Gln Ala Arg Ser

                165                 170                 175

agg ata gat cag ctc aaa agg cta ggc cat agt gta gac aag gtc gaa    576

Arg Ile Asp Gln Leu Lys Arg Leu Gly His Ser Val Asp Lys Val Glu

            180                 185                 190

ttc ata ttg atg ggt gga act ttc atg tca tta cca gct gat tat cgg    624

Phe Ile Leu Met Gly Gly Thr Phe Met Ser Leu Pro Ala Asp Tyr Arg

        195                 200                 205

gat tat ttc att aga aat ctt cat gat gcc tta tcg gga cac act tct    672

Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Leu His Asp Ala Leu Ser Gly His Thr Ser

    210                 215                 220

gct aat gtt gaa gag gct gtt tgt tat tca gaa cat ggt gca gtc aaa    720

Ala Asn Val Glu Glu Ala Val Cys Tyr Ser Glu His Gly Ala Val Lys

225                 230                 235                 240

tgt att ggc atg aca att gag acg aga cct gat tat tgc ttg ggg cct    768

Cys Ile Gly Met Thr Ile Glu Thr Arg Pro Asp Tyr Cys Leu Gly Pro

                245                 250                 255

cat ttg cgc cag atg cta tct tat ggt tgt acc cgc tta gaa att ggt    816

His Leu Arg Gln Met Leu Ser Tyr Gly Cys Thr Arg Leu Glu Ile Gly

            260                 265                 270

gtt cag agc aca tac gag gat gtt gca cgt gac aca aac aga ggt cac    864

Val Gln Ser Thr Tyr Glu Asp Val Ala Arg Asp Thr Asn Arg Gly His

        275                 280                 285

act gta gct gct gtt gct gat tgc ttt tgt ttg gct aaa gat gct ggt    912

Thr Val Ala Ala Val Ala Asp Cys Phe Cys Leu Ala Lys Asp Ala Gly

    290                 295                 300

ttt aag gtg gtc gcc cac atg atg cca gat tta cct aat gtt gga gtt    960

Phe Lys Val Val Ala His Met Met Pro Asp Leu Pro Asn Val Gly Val

305                 310                 315                 320

gaa aga gat ctg gaa agt ttc cga gaa ttt ttt gaa aat cca gca ttc    1008

Glu Arg Asp Leu Glu Ser Phe Arg Glu Phe Phe Glu Asn Pro Ala Phe

                325                 330                 335

cga gct gat ggt cta aag att tat cca act ctt gtg att cgt gga act    1056

Arg Ala Asp Gly Leu Lys Ile Tyr Pro Thr Leu Val Ile Arg Gly Thr

            340                 345                 350

ggc ctt tat gag ctc tgg aaa act ggc aga tac cga aac tat cca cct    1104

Gly Leu Tyr Glu Leu Trp Lys Thr Gly Arg Tyr Arg Asn Tyr Pro Pro

        355                 360                 365

gaa ctt ctg gtg gat att gtt gca aga att cta tcc atg gta cca cct    1152

Glu Leu Leu Val Asp Ile Val Ala Arg Ile Leu Ser Met Val Pro Pro

    370                 375                 380

tgg aca cga gtt tac cgt gta caa aga gat atc cct atg cct ctt gtt    1200

Trp Thr Arg Val Tyr Arg Val Gln Arg Asp Ile Pro Met Pro Leu Val

385                 390                 395                 400

act tct ggt gtt gaa aaa ggt aat ctt cgt gag ctt gct ttg gct cga    1248

Thr Ser Gly Val Glu Lys Gly Asn Leu Arg Glu Leu Ala Leu Ala Arg

                405                 410                 415

atg gaa gat tta ggc ttg aag tgc cga gat gtt aga act cgt gag gcg    1296

Met Glu Asp Leu Gly Leu Lys Cys Arg Asp Val Arg Thr Arg Glu Ala

            420                 425                 430

gga att cag gat atc cat cac aaa att aga cct gac gaa gta gag ctt    1344

Gly Ile Gln Asp Ile His His Lys Ile Arg Pro Asp Glu Val Glu Leu

        435                 440                 445

gtt agg cgt gac tat gct gca aat gag ggc tgg gag acc ttt ctc tca    1392

Val Arg Arg Asp Tyr Ala Ala Asn Glu Gly Trp Glu Thr Phe Leu Ser

    450                 455                 460

tac gag gat aca cag cag gat atc ctt att ggt ctg ctg cga ttg cga    1440

Tyr Glu Asp Thr Gln Gln Asp Ile Leu Ile Gly Leu Leu Arg Leu Arg

465                 470                 475                 480

aaa tgt ggc cgc aat gtt aca tgc cct gag cta gta ggg agg tgt tca    1488

Lys Cys Gly Arg Asn Val Thr Cys Pro Glu Leu Val Gly Arg Cys Ser

                485                 490                 495

att gtc cgt gaa ctt cat gta tat gga act gca gtc cct gta cat ggt    1536

Ile Val Arg Glu Leu His Val Tyr Gly Thr Ala Val Pro Val His Gly

            500                 505                 510

cgt gat gca gac aaa cta caa cac cag ggt tat ggt act ctt ttg atg    1584

Arg Asp Ala Asp Lys Leu Gln His Gln Gly Tyr Gly Thr Leu Leu Met

        515                 520                 525

gaa gaa gca gaa aga att gct cgc aag gag cat cgt tca aag aaa atc    1632

Glu Glu Ala Glu Arg Ile Ala Arg Lys Glu His Arg Ser Lys Lys Ile

    530                 535                 540

gct gtt ata tca gga gtt ggg act cgc cac tac tac cgt aaa ctg ggt    1680

Ala Val Ile Ser Gly Val Gly Thr Arg His Tyr Tyr Arg Lys Leu Gly

545                 550                 555                 560

tat gaa ctt gag ggg cct tac atg gtc aaa tgt ctg gtc taa            1722

Tyr Glu Leu Glu Gly Pro Tyr Met Val Lys Cys Leu Val

                565                 570

<210>2

<211>573

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Ala Thr Ala Val Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gln

1               5                   10                  15

Pro Arg Arg Arg Lys Pro Ala Pro Gly Arg Gly Gly Val Val Leu Pro

            20                  25                  30

Ala Gly Leu Ser Glu Glu Glu Ala Arg Val Arg Ala Ile Ala Glu Ile

        35                  40                  45

Val Ser Ala Met Gly Glu Leu Ser Arg Arg Gly Glu Asp Val Asp Leu

    50                  55                  60

Asn Ala Leu Lys Ser Ala Ala Cys Arg Arg Tyr Gly Leu Ala Arg Ala

65                  70                  75                  80

Pro Lys Leu Val Glu Met Ile Ala Ala Val Pro Glu Ala Asp Arg Ala

                85                  90                  95

Ala Leu Leu Pro Arg Leu Arg Ala Lys Pro Val Arg Thr Ala Ser Gly

            100                 105                 110

Ile Ala Val Val Ala Val Met Ser Lys Pro His Arg Cys Pro His Ile

        115                 120                 125

Ala Thr Thr Gly Asn Ile Cys Val Tyr Cys Pro Gly Gly Pro Asp Ser

    130                 135                 140

Asp Phe Glu Tyr Ser Thr Gln Ser Tyr Thr Gly Tyr Glu Pro Thr Ser

145                 150                 155                 160

Met Arg Ala Ile Arg Ala Arg Tyr Asn Pro Tyr Val Gln Ala Arg Ser

                165                 170                 175

Arg Ile Asp Gln Leu Lys Arg Leu Gly His Ser Val Asp Lys Val Glu

            180                 185                 190

Phe Ile Leu Met Gly Gly Thr Phe Met Ser Leu Pro Ala Asp Tyr Arg

        195                 200                 205

Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Leu His Asp Ala Leu Ser Gly His Thr Ser

    210                 215                 220

Ala Asn Val Glu Glu Ala Val Cys Tyr Ser Glu His Gly Ala Val Lys

225                 230                 235                 240

Cys Ile Gly Met Thr Ile Glu Thr Arg Pro Asp Tyr Cys Leu Gly Pro

                245                 250                 255

His Leu Arg Gln Met Leu Ser Tyr Gly Cys Thr Arg Leu Glu Ile Gly

            260                 265                 270

Val Gln Ser Thr Tyr Glu Asp Val Ala Arg Asp Thr Asn Arg Gly His

        275                 280                 285

Thr Val Ala Ala Val Ala Asp Cys Phe Cys Leu Ala Lys Asp Ala Gly

    290                 295                 300

Phe Lys Val Val Ala His Met Met Pro Asp Leu Pro Asn Val Gly Val

305                 310                 315                 320

Glu Arg Asp Leu Glu Ser Phe Arg Glu Phe Phe Glu Asn Pro Ala Phe

                325                 330                 335

Arg Ala Asp Gly Leu Lys Ile Tyr Pro Thr Leu Val Ile Arg Gly Thr

            340                 345                 350

Gly Leu Tyr Glu Leu Trp Lys Thr Gly Arg Tyr Arg Asn Tyr Pro Pro

        355                 360                 365

Glu Leu Leu Val Asp Ile Val Ala Arg Ile Leu Ser Met Val Pro Pro

    370                 375                 380

Trp Thr Arg Val Tyr Arg Val Gln Arg Asp Ile Pro Met Pro Leu Val

385                 390                 395                 400

Thr Ser Gly Val Glu Lys Gly Asn Leu Arg Glu Leu Ala Leu Ala Arg

                405                 410                 415

Met Glu Asp Leu Gly Leu Lys Cys Arg Asp Val Arg Thr Arg Glu Ala

            420                 425                 430

Gly Ile Gln Asp Ile His His Lys Ile Arg Pro Asp Glu Val Glu Leu

        435                 440                 445

Val Arg Arg Asp Tyr Ala Ala Asn Glu Gly Trp Glu Thr Phe Leu Ser

    450                 455                 460

Tyr Glu Asp Thr Gln Gln Asp Ile Leu Ile Gly Leu Leu Arg Leu Arg

465                 470                 475                 480

Lys Cys Gly Arg Asn Val Thr Cys Pro Glu Leu Val Gly Arg Cys Ser

                485                 490                 495

Ile Val Arg Glu Leu His Val Tyr Gly Thr Ala Val Pro Val His Gly

            500                 505                 510

Arg Asp Ala Asp Lys Leu Gln His Gln Gly Tyr Gly Thr Leu Leu Met

        515                 520                 525

Glu Glu Ala Glu Arg Ile Ala Arg Lys Glu His Arg Ser Lys Lys Ile

    530                 535                 540

Ala Val Ile Ser Gly Val Gly Thr Arg His Tyr Tyr Arg Lys Leu Gly

545                 550                 555                 560

Tyr Glu Leu Glu Gly Pro Tyr Met Val Lys Cys Leu Val

                565                 570

Claims (1)

1.一个调控水稻开花期的组蛋白乙酰化酶基因OsELP3在调控水稻开花期中的应用，其特征在于，所述基因OsELP3的编码序列如序列表SEQ ID NO：1中第1-1722位所示。

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