CN101323853B - 一个调控水稻根生长发育的转录因子基因OsWOX20的克隆及应用 - Google Patents

一个调控水稻根生长发育的转录因子基因OsWOX20的克隆及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个调控水稻根生长发育的转录因子基因OsWOX20的分离克隆、功能验证和应用。本发明的特征是，分离得到一种调控水稻根生长发育的转录因子基因OsWOX20DNA，其具有(a)序列表SEQ ID NO：1中第1-786位所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。本发明的启动子具有如序列表SEQ ID NO：3中的第1-2078位所示的DNA序列。用克隆的基因序列对水稻品种进行了转化，获得根生长发育明显改善的转基因水稻植株；该启动子驱动的报告基因在水稻的根中特异表达。本发明显示了克隆的目标基因和启动子在培育改善根生长发育性能的转基因水稻上的良好应用前景。

Description

一个调控水稻根生长发育的转录因子基因OsWOX20的克隆及应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个调控水稻根生长发育的转录因子基因OsWOX20的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物根的发育及结构建成有关。
背景技术
根是植物在进化过程中出现的非常重要的营养器官。种子植物的根系统一般由种子根、不定根和侧根组成。种子根是在胚胎发育过程中形成的；不定根和侧根则是在胚后发育过程中通过细胞的分化形成的。植物的根在植物的整个生长发育过程一般有两大主要功能：固定植物；吸收水分和无机盐。整个根系的正确建成及其基本结构的产生是完成这两大功能的重要保证。所以根系的结构、发育程度与植物的生物产量密切相关。
相对于拟南芥而言，单子叶植物(禾本科植物)除了具有种子根、侧根外还可以产生数量很多的冠状根。目前在水稻中已经分离和鉴定了几个与根发育相关的突变体和基因，这些基因或突变体不同程度地影响种子根(SR)、侧根(LR)和冠状根(CR)的发育。最早报道的QHB基因是一个WUS-type homeobox的转录因子，其超量表达后没有CR的形成(Noriko Kamiya et al.，Isolation and characterization of a riceWUSCHEL-type homeobox gene that is specifically expressed in the central cells of a quiescent center in the rootapical meristem.The Plant Journal.2003，35，429-441)；Crll编码植物特有的ASYMMETRICLEAVES2/LATERAL ORGAN BOUNDARIES家族的蛋白，该突变体根的表型与过量auxin产生的表型一致：LR数量减少，根向重力性消失(Yoshiaki Inukai et al.，Crown rootless1，Which Is Essential for Crown RootFormation in Rice，Is a Target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in Auxin Signaling，The Plant Cell.2005，17，1387-1396)；ARL是一个参与细胞脱分化的生长素应答因子，它通过促进中柱鞘细胞分裂的起始而参与不定根的产生(Hongjia Liu et al.，ARL1，a LOB-domain protein required for adventitious root formation in rice。The Plant Journal(2005)43，47-56)；OsAGAP编码水稻中的一种ADP-核糖基化因子(ARF)GTPase的激活蛋白，它可以破坏生长素的极性运输，从而影响初生根和侧根的发育(Xiaolei Zhuang etal.，Over-expression of OsAGAP，an ARF-GAP，interferes with auxin influx，vesicle traffi cking and rootdevelopment.The Plant Journal，2006)；依赖Trp的生长素合成途径中的YUCCA家族的YUCCA1基因通过影响生长素的合成来影响水稻根的发育(Yuko Yamamoto et al.，Auxin Biosynthesis by the YUCCA Genes in Rice.Plant Physiology，March 2007，Vol.143，pp.1362-1371)；OsPID正向调节PIN生长素的输出载体，影响生长素分布，其超量表达可以推迟不定根的发育，使根失去向重力性(Yutaka Morita and JunkoKyozuka，Characterization of OsPID，the Rice Ortholog of PINOID，and its Possible Involvement in the Control ofPolar Auxin Transport.Plant Cell Physiol.48(3)：540-549，2007)。
从以上的研究结果可知植物根的生长发育与生长素的合成、运输和分布密切相关，已报导的基因只影响水稻根发育的一个方面。本发明找到了一个来源于水稻，同时调控水稻SR，CR，LR数量和伸长等多方面的转录因子基因，该基因超量表达后能影响内源生长素的含量、极性运输和分布，从而引起植物体内与生长素代谢相关的一系列基因表达的改变，并最终引转基因植株地下产生多根和异位根的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控水稻根生长发育相关的转录因子基因的克隆，通过转化水稻本身，培育一种能够调控根发育的转基因水稻。利用这个基因改良水稻或其它植物根系结构的建成。对这个基因进行结构分析其属于植物特异的转录因子WOX家族，将该基因命名为OsWOX20。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明从水稻中分离得到一个调控植物根发育的转录因子基因OsWOX20，它是下列核苷酸序列之一：
1)序列表SEQ NO：1中第1-786位所示的DNA序列；或
2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质DNA序列。
本发明的转录因子OsWOX20的编码基因(SEQ ID NO：1)来源于水稻，由786个碱基组成，其推测的蛋白质编码序列有786个碱基，是序列1自5’端第1位碱基到786位碱基组成。
所述的基因OsWOX20与水稻根发育有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与玉米泛素启动子(Ubiquitin)结合后直接转入水稻，转基因植株侧根和冠状根明显比野生型对照植株增多；在外源生长素(NAA和IAA)的作用下OsWOX20的表达量在30分钟后开始上升，1小时就可达到最高；在生长素输出抑制剂(NPA)作用下，转基因植株的冠状根、侧根的数量及长度与未处理的相比明显减少。进一步的分析发现，本发明的转基因植株内与生长素合成、极性运输和分布、生长素的最初应答因子(ARF)、根发育相关基因的表达均受到了影响。表明本发明转录因子基因OsWOX20能够调控水稻内源生长素的合成、含量、极性运输和分布；与水稻的根发育及其结构建成密切相关。
如图8A所示，本发明构建了一种超表达载体pU1301，获得转化载体pU1301-WOX20。利用该转化载体转化水稻品种“中花11”(一种粳稻亚种)，得到转基因水稻植株。
具体操作步骤如下：
(1)利用农杆菌介导的转基因方法将所述的基因OsWOX20导入水稻受体，获得转化植株；
(2)借助RT-PCR方法分析鉴定阳性转基因植株；
(3)将步骤(2)的转基因植株在试管中发芽并对其根系的性状进行观察；
(4)利用RT-PCR分析转基因植株中目标基因的表达；
(5)用生长素抑制剂(NPA)对转基因植株进行处理，并观察其侧根、冠状根的形态、数量和长度；
(6)借助realtime-PCR分析转基因植株和野生型植株中参与生长素合成、极性运输、分布与根发育相关基因的表达。
本发明克隆的转录因子基因OsWOX20可用于改良水稻根系结构，为水稻增产奠定基础。更详细的技术发明细节由以下实施例给出，但并不是限制该发明的保护范围：
附图说明
序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的OsWOX20基因编码区；序列表SEQ ID NO：2显示的是本发明分离克隆的OsWOX20基因编码的氨基酸序列；序列表SEQ ID NO：3显示的是本发明分离克隆的OsWOX20基因的启动子区的DNA片段序列。
图1：是本发明的OsWOX20基因分离和鉴定流程图。
图2：采用ClustalW软件(公开使用软件)将OsWOX20基因与拟南芥中的WOX类转录因子进行同源性比较结果。
图3：采用GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因结构预测软件对OsWOX20基因完整序列分析的结果。
图4：OsWOX20基因在转基因植株中的表达情况，图中：第一道为对照，其余为转基因独立转基因植株。
图5：为野生型植株及OsWOX20转基因植株CR(冠状根)，LR(侧根)的长度、数量的对比及异位根的产生。
图6用realtime-PCR检测OsWOX20基因在外源生长素(见图6A和6B)、细胞分裂素(见图6C)和光(见图6D)等处理下不同时间点的表达水平。
图7OsWOX20基因在植物细胞内的亚细胞定位及自身启动子表达。图7A为在荧光显微镜下检测OsWOX20-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达情况；图7B为OsWOX20::GUS在水稻根发育的不同阶段的表达情况。
图8是本发明的超量表达载体pU1301和启动子和亚细胞定位载体pCAMBIA1381-GUS，pU1391-GFP结构示意图。
图9为OsWOX20转基因植株和对照植株体内与根发育相关基因的表达分析。
具体实施方式
实施例1 OsWOX20基因的克隆及序列分析：
用拟南芥的WUSCHEL(WOX类转录因子，NCBI蛋白质登陆号为AAP37133.1)基因的蛋白质序列在REDB(http://redb.ncpgr.cn/)网站中选择Regular blast工具，在“Rice EST”数据库做tblastx分析，找到水稻中的同源克隆(EI#73-I23)，从cDNA文库(见参考文献：储昭晖等，水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定，科学通报.2002，47(21)，1656-1662)获得这个克隆，测序获得全长cDNA序列(序列测定由上海国家基因测序中心完成)，将其命名为OsWOX20，它的cDNA核苷酸序列如序列表SEQ NO：1所示(见说明书末尾的序列表)。用GenDoc软件(版本：GenDoc3.2)对WUSCHEL和OsWOX20的蛋白质序列分析发现，OsWOX20具有典型的WOX类转录因子特征，即具有典型的同源盒结构域(homodomain)(见图2)。
实施例2双元Ti质粒载体的构建和转化农杆菌的建立：
具体步骤如下：
1)将带有OsWOX20的cDNA克隆，装载质粒为pSPORT1用KpnI和BamHI酶切后，分离目标基因片段(加上pSPORT1来源的酶切接头片段，OsWOX20基因的大小为940bp)，直接与KpnI和BamHI酶切的表达载体质粒pU1301(见附图8A)连接(所使用的内切酶均购自TAKARA公司，用法及用量按照产品说明书；连接酶为invitrogen公司产品，用法及用量按照产品说明书)；
2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入DH10B(购自Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(Roche公司产品)的LA(LA配方参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002年版)抗性培养基上涂皿培养；
3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述抽提质粒，用KpnI和BamHI酶切并电泳检测，根据插入片段的大小获得阳性的超表达双元Ti质粒载体：pU1301-WOX20；
4)把新构建的表达载体pU1301-WOX20通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数如上所述)导入农杆菌EHA105(购于CAMBIA公司)菌株中。转化后的菌株命名为T-WOX20。
实施例3双元Ti质粒载体的转化及转基因植株的阳性检测：
1)将T-WOX20向水稻受体品种“中花11”转化，转化方法参照Hiei等人报道的方法(参见：Efficienttransformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)进行。所获得的T0代转基因植株命名为WOX20-n，其中n＝1，2，3...代表转基因的不同家系。
2)T0代转化植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，1992，Theor Appl Genet，83，495-499)。然后用PCR方法对T0代转化植株用潮霉素引物进行阳性检测。潮霉素引物的序列如下：Hn-F5′-agaagaagatgttggcgacct-3′，Hn-R 5′-gtcctgcgggtaaatagctg-3′(上海生物技术公司提供)。PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg2+ 1.5μl，左、右引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃1分钟，③56℃1分钟，④72℃2.5分钟，⑤从②-④循环32次，⑥72℃10分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。因为潮霉素基因为转化载体所特有，这样能扩增出潮霉素基因特异带的转基因植株即为阳性植株。
2、对T0代阳性植株收种子(T1代)，为T1代的大田和水培种植和性状调查做准备
在本实施例中，遗传转化(转基因植株获得)的主要步骤、培养基以及使用的试剂如下：
转化的主要步骤和试剂如下：
(1)培养基中试剂和溶液缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；Hn(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亚砜)；N6 max(N6基本培养基的大量成分溶液)；N6 mix(N6基本培养基的微量成分溶液)；MS max(MS基本培养基的大量成分溶液)；MS mix(MS基本培养基的微量成分溶液)
(2)主要溶液配方
1)N6基本培养基大量元素母液[10倍浓缩液]的配制：
硝酸钾(KNO3)                          28.3g
磷酸二氢钾(KH2PO4)                    4.0g
硫酸铵((NH4)2SO4)                     4.63g
硫酸镁(MgSO4·7H2O)                   1.85g
氯化钙(CaCl2·2H2O)                   1.66g
将上述试剂逐一用蒸馏水溶解，然后在室温下用蒸馏水定容至1000ml，备用。
2)N6基本培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制
碘化钾(KI)                            0.08g
硼酸(H3BO3)                           0.16g
硫酸锰(MnSO4·4H2O)                   0.44g
硫酸锌(ZnSO4·7H2O)                   0.15g
室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(配制成100X液)的配制
准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，用蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)配制
烟酸(Nicotinic acid)                  0.1g
维生素B1(Thiamine HCl)                0.1g
维生素B6(Pyridoxine HCl)              0.1g
甘氨酸(Glycine)                       0.2g
肌醇(Inositol)                        10g
加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MS基本培养基的大量元素母液(10X)的配制
硝酸铵                                16.5g
硝酸钾                                19.0g
磷酸二氢钾                            1.7g
硫酸镁                                3.7g
氯化钙                                4.4g
室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。
6)MS基本培养基的微量元素母液(100X)的配制
碘化钾                                0.083g
硼酸                                  0.62g
硫酸锰                                0.86g
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)                 0.025g
硫酸铜(CuSO4·5H2O)                   0.0025g
室温下用蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至1000ml，备用。
7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后用蒸馏水定容至100ml，于室温下保存、备用。
8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml用蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存，备用。
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：
秤取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后并用蒸馏水定容至100ml。
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：
秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液的配制：
秤取AS 0.392g，DMSO 10ml，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
秤取氢氧化钾5.6g，并用蒸馏水溶解并定容至100ml，室温保存备用。
(3)用于水稻遗传转化的培养基组分及用量
1)愈伤组织诱导培养基
N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                          100ml
N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                         10ml
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                     10ml
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                       10ml
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                           2.5ml
脯氨酸(Proline)                                              0.3g/L
CH                                                           0.6g/L
蔗糖(Sucrose)                                                30g/L
Phytagel                                                     3g/L
加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，在121℃下灭菌12分钟。
2)愈伤组织继代培养基
N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                          100ml
N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                         10ml
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                     10ml
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                       10ml
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                           2.0ml
脯氨酸                                                       0.5g/l
CH                                                           0.6g/l
蔗糖                                                         30g/l
Phytagel                                                     3g/l
加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口在121℃下灭菌12分钟。
3)预培养基
N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                   12.5ml
N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                  1.25ml
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取              2.5ml
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                2.5ml
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液)取                      0.75ml
CH                                                    0.15g/L
蔗糖                                                  5g/L
琼脂粉(Agarose)                                       1.75g/L
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，在121℃下灭菌12分钟。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                   12.5ml
N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                  1.25ml
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取              2.5ml
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                2.5ml
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                    0.75ml
CH                                                    0.2g/L
蔗糖                                                  5g/L
琼脂粉                                                1.75g/L
加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口，在121℃下灭菌12分钟。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
5)悬浮培养基
N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                   5ml
N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                  0.5ml
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取              0.5ml
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                1ml
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                    0.2ml
CH                                                    0.08g/L
蔗糖                                                  2g/L
加蒸馏水至100ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基
N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                   25ml
N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                  2.5ml
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取              2.5ml
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                2.5ml
2，4-D贮存液(从已配好的贮存液中)取                    0.625ml
CH                                                    0.15g/L
蔗糖                                                  7.5g/L
琼脂粉                                                1.75g/L
加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250μl Hn和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                    25ml
N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                   2.5ml
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取               2.5ml
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                 2.5ml
6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)取                       0.5ml
KT贮存液(从已配好的贮存液中)取                         0.5ml
NAA贮存液(从已配好的贮存液中)取                        50μl
IAA贮存液(从已配好的贮存液中)取                        50μl
CH                                                     0.15g/L
蔗糖                                                   7.5g/L
琼脂粉                                                 1.75g/L
加蒸馏水至250ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.9，封口，在121℃下灭菌12分钟。使用前溶解培养基，加入250μl Hn和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
N6 max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                    100ml
N6 min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                   10ml
Fe2+EDTA贮存液(从已配好100X浓缩液中)取                 10ml
维生素贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取                 10ml
6-BA贮存液(从已配好的贮存液中)取                       2ml
KT贮存液(从已配好的贮存液中)取                         2ml
NAA贮存液(从已配好的贮存液中)取                        0.2ml
IAA贮存液(从已配好的贮存液中)取                        0.2ml
CH                                                     1g/L
蔗糖                                                   30g/L
Phytagel                                               3g/L
加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至6.0。
煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，在121℃下灭菌12分钟。
9)生根培养基
MS max母液(从已配好的10X浓缩液中)取                    50ml
MS min母液(从已配好的100X浓缩液中)取                   5ml
Fe2+EDTA贮存液(从已配好的100X浓缩液中)取               5ml
维生素贮存液(从已配好的100X贮存液中)取                 5ml
蔗糖                                                   30g/L
Phytagel                                               3g/L
加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值至5.8。
煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，在121℃下灭菌12分钟。
(4)农杆菌介导的遗传转化步骤：
3.1愈伤组织诱导
(1)将成熟的水稻种子(“中花11”，中国农业科学院作物科学研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；
(2)用无菌水冲洗种子4-5次；
(3)将灭过菌的水稻种子放在诱导培养基上(诱导培养基的组成如上所述)；
(4)将接种后的培养基置于25±1℃的黑暗处培养4周，得到水稻愈伤组织。
3.2愈伤组织继代培养
挑选亮黄色、紧密且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于如前所述的愈伤组织继代培养基上，在26±1℃，黑暗条件下培养2周，得到水稻继代的愈伤组织。
3.3愈伤组织的预培养
挑选紧密且相对干燥的胚性愈伤组织，接种于前面所述的预培养基上，在26±1℃，黑暗条件下培养4天。
3.4农杆菌培养
(1)农杆菌EHA105接种在带有对应抗性选择的培养基LA上预培养，培养温度为28℃培养48小时；
(2)再将步骤(1)的农杆菌转移至前面描述的悬浮培养基上，在28℃摇床上培养2-3小时。
3.5农杆菌侵染
(1)将预培养的愈伤组织转移至灭过菌的玻璃瓶内；
(2)调节农杆菌的悬浮液至OD600 0.8-1.0；
(3)将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
(4)转移愈伤组织至灭好菌的滤纸上吸干；然后将其接种到如前所述的共培养基上，培养温度19-20℃，培养72小时(3天)。
3.6愈伤组织洗涤和选择培养(抗性筛选)
(1)用无菌水洗涤水稻愈伤组织至看不见农杆菌；
(2)将愈伤组织浸泡在含400mg/L羧苄青霉素(CN)的无菌水中30分钟；
(3)将该愈伤组织转移至灭菌好的滤纸上，使该愈伤组织不带水；
(4)转移愈伤组织至选择培养基上选择2-3次，每次2周(第一次潮霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后潮霉素为250毫克/升)。
3.7预分化和分化
(1)将以上得到的抗性愈伤组织转移至如前所述的预分化培养基上，在黑暗处培养5-7天；培养温度26℃。
(2)转移预分化培养的愈伤组织至如前所述的分化培养基上，置光照下，光照强度2000lx培养，培养温度为26℃，培养5周左右得到发少量根的转基因小植株。
3.8诱导生根
(1)剪掉上述转基因小植株的根；
(2)将其转移至如前所述的生根培养基中，在光照强度2000lx下培养2-3周，培养温度为26℃，经过18天左右得到生根的转基因水稻小植株。
3.9移栽
洗掉小植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室培养，同时在移栽的最初的几天保持水分湿润。
将获得的转基因水稻植株被命名为T217UN(其中：T217U为载体编号，N表示转化品种为中花11)。本发明总共获得独立转基因水稻植株36株。
实施例4 T1代性状调查和表达分析：
1)将本发明的转基因WOX20-n的阳性家系以及野生型按20株/家系进行T1代大田和水培(水培液的配方参考国际水稻水培液的配方：
http://www.knowledgebank.irri.org/grcOpsManual/Tables_Chapter_9.htm)种植。在各家系的全生育期进行性状调查。调查结果显示在OsWOX20的转基因家系中，绝大部分家系的根系表现出多根的变异表型(参见图5A)，有的家系在水稻的幼穗上和近地面的节部也有长根的特征(参见图5B所示)。
2)为了比较OsWOX20转基因多根植株的根系相对于野生型根系的变化，我们对OWOX20转基因植株中的5个多根家系在稻粒完全成熟以后取各家系的种子进行发芽，对其根的生长情况进行调查。结果发现，转基因植株的根生长情况在种子发芽的前3天基本没有很大的变化，但在7天以后根明显增多；(参见图5A)：
1)另外，我们对根增多家系的种子用10-6mol/L NPA(生长素运输抑制剂)处理，发现根的生长明显受到了抑制。表明OsWOX20的超量表达使转基因植株根增多与植物生长素相关(参见表1)。
表1 10-6mol/L生长素抑制剂(NPA)对野生型和转基因植株(家系1、2)根的长度、冠状根和侧根数量的影响
Figure G07152664220070808D000091
说明：
(1)家系1，2和3均为本发明的转基因植株，家系1+，2+，3+和野生型+，为加10-6mol/L NPA处理；家系1-，2-，3-和野生型-为不加NPA的处理；
(2)每个家系选30株转基因植株，用t-测验的方法来检测NPA处理对转基因家系和野生型根的长度、冠状根和侧根数量的影响(P＜5％表示差异显著；P＜1％表示差异极显著)。
为了检测转基因植株中目标基因的表达量，申请人采用RT-PCR方法对转基因植株进行了表达分析。实验所用的总RNA来自发芽10天的幼苗，RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配混合液1：总RNA 2μg，DNAseI 2u，10x DNAseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于70℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，④将冷却的混合液1立即置于70℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2：混合液110μl，5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTPmixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴3分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；RT-PCR用到的体系为20μl，具体配法为：cDNA第一链模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 1.6μl，2.5mM Mg2+ 1.5μl，左、右引物各0.4μl，TAQ酶0.2μl，加水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自TAKARA公司)。PCR反应条件如下：①94℃2分钟，②94℃1分钟，③56℃1分钟，④72℃1分钟，⑤从②-④循环30次，⑥72℃7分钟，⑦4℃保存。PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳检测。RT-PCR用到的OsWOX20基因的引物为：WOX20-F5′-GGGACTAGTGGTACC GGATCTCCTCCGACTGCTTC-3′，WOX20-R5′-GGGGAGCTCGGATCCATCGACGAATCGCTCAACTC-3′，Actin引物为Actin-F5′-tatggtcaaggctgggttcg-3′，Actin-R5′-ccatgctcgatggggtactt-3′(均为上海生物技术公司提供)。
结果显示在这些多根植株中OsWOX20的表达量都得到很大的提高，表明多根的变异表型是由目标基因的超量表达引起的，表达分析结果如图4所示。
实施例5检测水稻内源基因OsWOX20的诱导表达
以水稻品种“中花11”为材料，在发芽10天时分别进行生长素、细胞分裂素、生长素抑制剂和光处理。生长素处理是用10uM的IAA(吲哚乙酸)和10uM NAA(萘乙酸)浸泡幼苗根部，0h，0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，9h，12h，24h后取样。细胞分裂素处理是用10uM 6-BA(商品名为6-苄基氨基嘌呤)浸泡幼苗根部，0h，0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，9h，12h，24h后取样生长素抑制剂NPA(商品名为1-萘氨甲酰苯甲酸)处理是将幼苗根部浸泡在1μM/L NPA溶液中并在0h，0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，9h，12h，24h后取样；光处理是水稻中华11种子分别在黑暗和光照的情况下发芽，在黑暗中发芽5天的幼苗置放在光下进行生长分别在光照1h，2h，4h，8h和12h取样中。提取整株的总RNA(Trizol试剂，购自Invitrogen公司)后按实施例4中的方法进行反转录，反转录的产物进行定量PCR，其反应的体系为25μl，其中含有1.5μl反转录产物、0.25μM的左右引物和12.5μl的SYBR Green混合物(Applied Biosystems)。反应在7500real-time定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行，反应程序按照Applied Biosystems提供的操作手册进行，水稻actin1基因作为反应中的内参。所有引物均在58℃退火，反应40个循环，每个样设置三个重复，以actin1表达量进行平衡化处理。结果表明，本发明克隆的基因OsWOX20能被生长素(结果如图6A，6B所示)、细胞分裂素(如图6C所示)和光诱导(结果如图6D所示)表达。这说明OsWOX20是一个与生长素和光诱导相关的转录因子。定量PCR用到的OsWOX20引物为
Realtime OsWOX20-F：5′-GCTCTTCTTCCAGCCAACGA-3’，
Realtime OsWOX20-R：5′-GGAAGTAGCTCTCGCCCATCT-3’，
Realtime Actin-F 5′-TGTATGCCAGTGGTCGTACCA-3′，
Realtime Actin-R 5′-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3′：
实施例6转基因多根植株中与根发育和生长素合成、运输相关基因的表达分析：
对OsWOX20超量和抑制表达的转基因植株各三个家系(如实施例5所述)和野生型对照生长素分布、运输和合成过程中基因的表达进行了分析。所用到的总RNA、反转录方法、RT-PCR和定量PCR反应体系和反应条件如实施例4和5中所述，PCR所用到的各基因的引物如表2所示(参见说明书末尾)。
结果表明，在这些转基因植株中，与生长素合成、分布及运输相关基因表达的表达都有变化。从而说明OsWOX20控制水稻根的发育与植物激素生长素密切相关，结果见图9A，9B和9C。
实施例7OsWOX20基因的启动子功能验证及其亚细胞定位
为了确定OsWOX20基因在细胞的表达部位及自身启动子(1-2078bp)的活性，进一步进行了OsWOX20-GFP NLS(核定位信号)和启动子-GUS融合蛋白载体的构建，即根据GFP和GUS的表达情况来确定基因的表达模式。首先参照前人发表的关于水稻OsWOX3基因(Mingqiu Dai，Yongfeng Hu，Yu Zhao etal.，A WUSCHEL-LIKE HOMEOBOX Gene Represses a YABBY Gene Expression Required for Rice LeafDevelopment1[C][W]Plant Physiology，May 2007，Vol.144，pp.380-390，.Plant J(2004)39，863-876)与GFP融合后在细胞内的表达部位可确定该基因的亚细胞定位。将本发明序列的整个cDNA片段融合到pU1391-GFP载体上，目的根据GFP的表达部位来确定该基因在细胞的表达情况；再将ATG上游2KB左右的片段融合到pCAMBIA1381-GUS载体上。GUS前不带有任何启动子，pCAMBIA1381载体来自澳大利亚CAMBIA实验室公开使用(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)。
亚细胞定位的融合基因载体构建的具体方法如下：设计引物NLSF(5′-ggg GGTACCGACACCGAACAAGGCAGCTA-3，加接头KpnI位点)和NLSR(5′-ggg GGATCCAGACGACCTCGTGACCAGG-3’，加入接头BamHI)，以上述实施例2中构建的载体Pu1301-WOX20为模板，通过扩增程序(94℃预变性3min；94℃30sec，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸8min)将其扩增出来，扩增产物通过KpnI和BamHI双酶切，连入已进行同样双酶切的pU1391-GFP载体；启动子的融合基因载体构建的具体方法如下：设计引物PF(5′-GGG GAATTC CCCAATCAAATGCTCTGCC-3，加接头EcoRI位点)和PR(5′-GGG GGATCC CTGCCTTGTTCGGTGTCGA-3，加入接头BamHI)，以“中花11”总DNA为模板，通过扩增程序(94℃预变性3min；94℃30sec，68℃3min，30个循环；68℃延伸10min)将其扩增出来，扩增产物通过EcoRI和BamHI双酶切，连入已进行同样双酶切的pCAMBIA1381-GUS载体。将这启动子融合载体用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻愈伤(其具体方法同实施例3所述)，在潮霉素(其具体方法同实施例3所述)的选择压力下得到抗性愈伤，在显微镜下观察到GUS的表达(如图7B所示)，表明该序列的1-2018bp已包含完整的启动子，可启动基因的表达，从图中可以看出该基因的表达与根的发育相关。为了确定该基因表达的蛋白是否在核内将其在细胞内定位，我们采用基因枪法瞬时表达洋葱表皮。具体过程：将构建好的质粒DNA(5μg)与3mg直径1μm的金粉混匀，然后用60μl无水酒精将这些混合物重悬浮，将悬浮液分成5等分进行粒子轰击。粒子轰击前将洋葱表皮撕下，切成1cm2左右的小片，紧凑地铺在湿润的培养皿上。利用PDS-1000 System(BioRad)，在1100psi的氦压下进行粒子轰击，轰击后的洋葱表皮在25℃的暗环境中培养24小时后进行观察。Leica公司的共聚焦显微镜用来观察GFP在洋葱表皮细胞中的表达部位(如图7A所示)。
表2 实施例6中与生长素合成、分布及运输相关基因表达分析所用到的引物
Figure G07152664220070808D000111
序列表
Figure G07152664220070808D000121
Figure G07152664220070808D000131
Figure G07152664220070808D000141
Figure G07152664220070808D000151
Figure G07152664220070808D000161

Claims (1)

1.一种调控水稻根生长发育的转录因子基因OsWOX20在促进水稻根生长发育中的应用，其特征在于，该转录因子基因OsWOX20的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中第1-786位所示。
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