CN103757115A - 一种基于多重微滴pcr偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法 - Google Patents

一种基于多重微滴pcr偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法。首先，设计特异性引物并对其选择性地进行不同荧光基团标记，随后应用上述荧光标记的特异性引物进行微滴PCR扩增，扩增产物经纯化后，用荧光分光光度计或酶标仪来测量纯化后的PCR产物中各个发射波长和荧光值含量，达到自动检测的目的，可同时进行定性、定量和高通量检测。本发明方法可实现对大量目标DNA分子同时进行高通量的扩增和定性、定量和高通量检测。

Description

一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法
技术领域
本发明属生物基因检测技术领域，涉及一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法。
背景技术
传统生物基因定性、定量PCR检测技术每次只能对单一一种的基因进行检测，而对于基因成分不明确的样品，需要通过多种检测方法、进行多次实验才能确定，周期长、工作量大，且成本高。虽然多重常规PCR、定量PCR能一次实验可同时检测几种基因，但在同一反应管中进行多重PCR效果常常很差，产生非特异扩增，短的片段经常会被优先扩增，在同源区的重组常会产生人工片段。其关键是引物的设计，引物和引物之间，引物本身，产物和产物之间不能有错配，复杂的多重PCR引物设计必须依赖于较为大型的数据库和计算机模拟PCR结果，以及后期的验证，这个不是一般小型实验室可以完成的事情。
目前国内外一些机构及公司开展了高通量检测方法的研究，如Bio-Rad公司、SGS检测机构开发了一些转基因检测试剂盒等以及已经广泛应用于临床研究的基因芯片技术。然而这些检测方法成本非常高，技术复杂、人员要求高并且需要昂贵的仪器来完成。目前国内外的生物基因产品检测方法仍以单一的定性、定量PCR的检测方法为主。
因此，在未来的生物基因检测中，这些检测技术已越来越不能胜任一次处理含有几种、十几种、几十种生物基因的样品检测的特殊需要，尤其是大数量的生物样品，需要更有效的、快速的高通量检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法，以弥补现有技术的缺陷（现有的PCR检测技术要么只能对生物样品进行定性检测，如常规PCR；要么只能进行定量检测，如荧光定量PCR；有的只能高通量检测，如基因芯片技术；因而大大限制了其应用），同时实现快速定性、定量和高通量检测。
本发明方法可作为生物学研究中高通量DNA分子分析的一种手段，可对多个DNA分子同时进行检测，提高了分析的通量，还可同时进行定性、定量检测，减少了宝贵样品和试剂的消耗。
本发明所述的多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量的检测方法，首次由本申请发明人提出，属于本领域的创新之举。该方法具体是指将油相和PCR反应体系的水相混合在一起，利用“油包水”的乳化技术将PCR反应体系分隔成109的独立微滴，每个微滴含有一个或二个模板和引物，每个微滴代表一个反应，这些反应可以在相同的条件下平行地进行扩增，同时进行多重PCR；用不同的荧光基团标记不同待测产品的特异性引物，通过微滴PCR进行扩增，不同的PCR产物被不同的荧光标记，因而不同的待测产品由不同的荧光识别，进而可以通过荧光分光光度法，例如利用荧光酶标仪或荧光分光光度计等对生物基因进行定性检测；同时对荧光的强度进行测量，通过标准曲线进而可以对生物基因产品进行定量检测。由于同一个PCR管中的多种不同生物基因有不同的荧光标识，因而可以同时检测多种生物基因，进而实现高通量检测。
在本发明方法中，首先将设计好的引物选择性地进行不同荧光基团标记，随后在单一的微滴PCR方法中应用上述荧光标记的引物进行PCR扩增，扩增PCR产物经过纯化后，最后应用荧光分光光度计或酶标仪等来测量纯化后的产物中的各个发射波长和荧光值的含量，达到自动检测的目的，并同时进行定性、定量和高通量检测。本发明这种组合检测方法可实现对大量目标DNA分子同时进行高通量的扩增和定性、定量和高通量检测。
具体来讲，本发明所述的基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法，包括如下步骤：
第一步，针对待测生物样品的DNA序列分别设计PCR特异性引物（包括上游引物或下游引物），要求各对引物Tm值要相近、各目标片段的长度分别要尽可能相近，从而有利于在等同的PCR参数下进行扩增。引物长度一般在20-25bp之间，扩增的目的片段大小在200-250bp之间。并选择合适的荧光基团并按具体情况对该已设计好的上游引物或下游引物进行荧光基团标记。
所述荧光基团的激发光谱与发射光谱的带宽之和应大于该荧光基团的斯托克斯位移；这样才能避免激发光谱与发射光谱发生重叠，两个不同的荧光基团的激发光谱不能发生重叠，发射光谱也不能发生重叠。
第二步，使用上述已标记荧光基团的特异性引物对在水油乳化剂中对相应的DNA模板进行多重微滴PCR扩增；
所述水油乳化剂具体配制方法为：25℃下，取200μl微滴如表1所示的PCR水相在1.5分钟内逐滴加入到400μl微滴PCR油相（其成分如表2所示）中，混合后形成均匀的水油乳化剂，所述水油乳化剂中微滴的直径为1～8μM，每微升的水油乳化剂包含3×106到1×107个微滴；
表1微滴PCR水相成分
Figure BDA0000458257820000031
进一步，所述微滴PCR油相的成分如表2所示：
表2微滴PCR油相成分
试剂 终浓度
Span80（司盘80） 4.5%
Tween80（吐温80） 0.4%
Triton X-100（曲拉通X-100） 0.05%
石蜡油 95.5%
第三步，PCR产物分离及纯化。微滴PCR完成后，收集相同反应的水油乳化剂，并在室温下13000rmp离心5分钟，取下层包含微滴PCR扩增产物的水相，并用PCR产物纯化试剂盒纯化该水相，去除引物、酶、无机盐离子、dNTPs等。
第四步，用荧光分光度法对微滴PCR产物进行定性、定量、高通量检测分析：用不同的荧光基团标记不同的特异性引物，因而不同的PCR产物被不同荧光基团标记即待测生物样品由不同的荧光识别，用荧光分光度法根据荧光基团的发射波长对待测生物样品进行定性检测；同时，测量荧光的强度，通过标准曲线对待测生物样品进行定量检测；上述微滴PCR扩增过程中在等同的PCR参数下同时进行多重PCR反应，同时检测出至少7种待测生物样品，实现高通量检测。
进一步，上述第四步荧光分光度法中可利用荧光分光度计或荧光酶标仪检测微滴PCR产物。可具体使用Thermo VarioSkan Flash多功能酶标仪，根据其参数特性，即激发带宽为5nm/12nm，发射带宽为12nm，所以可选择的荧光基团的斯托克斯位移只需大于17nm。而两个不同的荧光基团的最佳激发波长间隔只需大于等于10nm，最佳发射波长间隔只需大于等于24nm。
根据上述选择荧光标记物即荧光基团的原则，本发明可从300多种荧光标记物中（具体参见表3）选择符合条件的荧光标记物进行实验，经过计算在同一PCR管中，可供同时进行标记的标记物可达到12种左右，且可以有多种不同组合，其中表4为其中一种组合。在不影响荧光标记物强度和灵敏度的情况下，适当调整激发和发射波长，那么可供同时检测的荧光标记物将接近20种。
表3可供选择的荧光标记物
Figure BDA0000458257820000041
Figure BDA0000458257820000051
Figure BDA0000458257820000061
Figure BDA0000458257820000071
Figure BDA0000458257820000081
Figure BDA0000458257820000091
Figure BDA0000458257820000101
Figure BDA0000458257820000121
Figure BDA0000458257820000131
表4可选用的一组12种荧光标记物组合
Figure BDA0000458257820000132
本发明针对七种转基因玉米（Bt11、MON863、TC1507、NK603、BT176、GA21、T25）设计的特异性引物对及标记的荧光基团如表5所示。
表5待测玉米品系、引物及标记的荧光基团
Figure BDA0000458257820000133
本发明所述的检测方法中由于不同的引物被不同荧光基团标记，则这些引物扩增出来的片段就相应带有不同的荧光基团，用荧光分光光度计或荧光酶标仪等根据不同的荧光基团对应的发射峰或者发射峰的波长来鉴定微滴PCR扩增的产物，并进行定性、定量和高通量检测。
本发明的有益效果：
1.本发明设计了带有荧光基团的目标特异性引物，采用多重微滴PCR扩增方法并结合荧光酶标仪、荧光分光光度计等检测产物的分析方法，使不同的DNA模板分子可独立地在微滴平行进行扩增，极大地提高了分析效率和通量。本发明以应用转基因作物的检测序列为目标，进一步优化该方法的扩增体系和条件，提高了本发明的灵活性和可适用性，使其具有高通量、高特异性和高灵敏度。
2.本发明所述检测方法可适应当前分子生物学研究中对多目标DNA进行高通量分析的要求，可以同时进行生物基因的定性、定量和高通量检测。
3.本发明所述检测方法不仅可应用于转基因成分的分析，也为其他领域中DNA分子分析提供了一个新的定性、定量和高通量分析的选择。因此，所述检测方法除了应用于多种转基因产品定性、定量和高通量检测，还可应用于食源性病原微生物、畜牧兽医致病微生物、人类致病微生物、水产致病微生物、环境微生物、植物致病微生物定性、定量和高通量检测，亦还可以用于多种人类疾病相关基因的定性、定量和高通量检测及根据检测出来的变异基因用于遗传咨询。总之，本发明所述检测方法可以用于所有生物基因的定性、定量和高通量检测。
附图说明
图1为本发明的微滴PCR流程示意图；
图2为本发明实施例1中Bt11特异性检测结果，其中，1：BT11阳性对照，2：BT11玉米基因组，3：无模板对照，4：阴性对照5：油菜，6：BT176玉米，7：阴性玉米，8：MON863玉米，9：TC1507玉米，10：NK603玉米，11：GA21玉米，12：大豆，13：棉花，14：水稻，15：小麦，发射峰位于555nm处；
图3为本发明实施例1中MON863特异性检测结果，其中，1：MON863阳性对照，2：MON863玉米基因组，3：水稻，4：无模板对照，5：阴性玉米，6：BT11玉米，7：TC1507玉米，8：NK603玉米，9：GA21玉米，10：BT176玉米，11：大豆，12：棉花，13：阴性对照，14：小麦，15：油菜，发射峰位于564nm处；
图4为本发明实施例1中TC1507特异性检测结果，其中，1：TC1507阳性对照，2：TC1507玉米基因组，3：无模板对照，4：NK603玉米，5：阴性玉米，6：BT11玉米，7：MON863玉米，8：GA21玉米，9：BT176玉米，10：大豆，11：棉花，12：水稻，13：小麦，14：油菜，发峰位于610nm处；
图5为本发明实施例1中NK603特异性检测结果，其中，1：NK603阳性对照，2：NK603玉米基因组，3：无模板对照，4：水稻，5：油菜，6：阴性对照，7：阴性玉米，8：BT11玉米，9：MON863玉米，10：TC1507玉米，11：大豆，12：棉花，13：小麦，发射峰位于442nm处；
图6为本发明实施例1中玉米内标基因特异性检测结果，其中，1：MON863，2：BT176，3：BT11，4：NK603，5：GA21，6：阴性玉米，7：TC15078：阴性对照，9：无模板对照，10：大豆，11：玉米内标基因阳性对照，12：棉花，13：水稻，14：小麦，15：油菜，发射峰位于665nm处；
图7为本发明实施例3中混合物中BT11检测限，其中，1：70%，2：50%，3：30%，4：10%，5：5%，6：3%，7：1%，8：0.5%，9：阴性对照，10：无模板对照，BT11发射峰位于555nm；
图8为本发明实施例3中混合物中MON863检测限，其中，1：70%，2：50%，3：30%，4：10%，5：5%，6：3%，7：1%，8：0.5%，9：阴性对照，10：无模板对照，MON863发射峰位于564nm；
图9为本发明实施例3中混合物中TC1507检测限，其中，1：70%，2：50%，3：30%，4：10%，5：5%，6：3%，7：1%，8：0.5%，9：阴性对照，10：无模板对照，发射峰位于610nm处；
图10为本发明实施例3中混合物中NK603检测限，其中，1：50%，2：30%，3：10%，4：5%，5：3%，6：1%，7：0.5%，8：阴性对照，9：无模板对照，NK603发射峰位于442nm；
图11为本发明实施例4中BT11微滴PCR标准曲线（102-106拷贝/微升），纵坐标为荧光值，横坐标为模板的拷贝数的对数；
图12为本发明实施例4中MON863微滴PCR标准曲线（102-106拷贝/微升），纵坐标为荧光值，横坐标为模板的拷贝数的对数；
图13为本发明实施例4中TC1507微滴PCR标准曲线（102-106拷贝/微升），纵坐标为荧光值，横坐标为模板的拷贝数的对数；
图14为本发明实施例4中NK603微滴PCR标准曲线（102-106拷贝/微升），纵坐标为荧光值，横坐标为模板的拷贝数的对数；
图15为本发明实施例4混合物中的BT11的标准曲线（103-107拷贝/微升），纵坐标为荧光值，横坐标为模板的拷贝数；
图16为本发明实施例4混合物中的MON863的标准曲线（103-107拷贝/微升），纵坐标为荧光值，横坐标为模板的拷贝数；
图17为本发明实施例4混合物中的TC1507的标准曲线（103-107拷贝/微升），纵坐标为荧光值，横坐标为模板的拷贝数；
图18为本发明实施例4混合物中的NK603的标准曲线（103-107拷贝/微升），纵坐标为荧光值，横坐标为模板的拷贝数。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。应当说明的是，以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
下面实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂所建议的条件。
实施例1：检测4个转基因品系和内参基因的特异性，即定性检测。
第一步：植物材料及其DNA提取
转基因作物：Bt11玉米、MON863玉米、TC1507玉米、NK603玉米。
植物DNA提取：应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA，取各个样品的260ng的DNA作为本实例中进一步实验的模板进行微滴PCR。
第二步：目标特异性引物设计及其荧光标记
设计4对目标特异性引物（参看表5），特异性扩增片段大小在250bp左右。
第三步：微滴制备
(1)油-表面活性剂混合物制备
25℃下按表2中的比例混合各试剂，制备油-表面活性剂混合物即微滴PCR油相。
(2)水油乳化剂配制
25℃下，取200μl微滴PCR水相（表1）在1.5分钟内逐滴加入到400μl微滴PCR油相中，与此同时利用调速式磁力搅拌器进行混匀。加完后，继续混合5分钟，形成均匀的水油乳化剂。水油乳化剂包含大小不等的微滴。
第四步：微滴PCR扩增
取600μl的水油乳化剂平均分配分装到12个PCR管中，另外取50μl微滴PCR水相（表1）直接加入PCR管中为非乳化对照，按如下表6条件进行微滴PCR扩增。
表6微滴PCR扩增条件
循环数 温度（℃） 时间
1 94 5min
94 30s
35 56 40s
72 30s
1 72 7min
第五步：PCR产物分离及纯化
将微滴PCR扩增完成的反应液收集到一个1.5ml的eppendof管中，在13000rpm条件下，将其中的油相和水相分离开，取出下层的水相反应液100ul，用Anygen AxyPrep PCR清洁试剂盒对产物进行清洁，有效去除反应剩余的引物和一些无机盐离子、酶等等，用60ul ddH2O洗脱。
第六步：荧光酶标仪等检测微滴PCR产物
使用Thermo荧光酶标仪对样品进行荧光检测。在384孔酶标板孔中加入30ul纯化过的样品。用各个荧光基团的激发光波长对样品进行激发，之后观察得到发射光谱，进而通过区分各种不同的发射光谱对应着的不同PCR产物。设定阳性阈值为阴性对照的平均值+/-4SD，目标特异性产物峰值高于此阈值的检测结果表明样品中含有此目标序列，目标特异性产物峰值低于此阈值的检测结果表明样品中不含有此目标序列。
第七步：定性检测及结果分析
应用本实施例的引物荧光标记的微滴PCR方法对4个转基因品系中含有DNA目标序列（Bt11、MON863、TC1507、NK603）同时进行分析。分别应用四个标记有不同荧光基团（发光基团）引物对进行微滴PCR扩增，同时用标记好的玉米内标基因（Ivrl）的引物对转基因玉米、非转基因玉米和其他作物的基因组DNA分别进行微滴PCR。随后的扩增产物用清洁试剂盒进行纯化，再进行荧光酶标仪的荧光检测，荧光酶标仪荧光检测结果参看图2～图5。从图2～图5可以看出，用4种荧光基团JOE、CY3、ROX、AMCA分别标记的转基因玉米Bt11、MON863、TC1507、NK603品系的正/反引物进行特异性验证，通过荧光酶标仪扫描，4种荧光基团的发射光谱可以被明显识别出来，阳性转基因玉米样品与阳性对照波峰很高，其它转基因玉米、非转基因玉米、大豆、油菜、棉花、水稻波峰很低，基本上处于本底水平。因此，通过引物荧光标记的微滴PCR和荧光酶标仪荧光扫描可以对某一品系的转基因玉米进行识别，明显的将某一品系的转基因玉米与其它转基因玉米、非转基因玉米、大豆、油菜、棉花、水稻区别开来，本底很干净，无非特异性条带。
在图2中，分别对Bt11玉米、Bt11阳性对照、无模板对照、野生型玉米、MON863玉米、TC1507玉米、NK603玉米、GA21玉米、BT176玉米、大豆、棉花、水稻、小麦、油菜进行微滴PCR，经荧光酶标仪荧光扫描，结果发现只有Bt11玉米和Bt11阳性对照在550nm处有波峰，而其他的没有波峰，接近本底值。因此，通过引物荧光标记的微滴PCR和荧光酶标仪荧光扫描可以对Bt11转基因玉米进行识别，明显的将Bt11转基因玉米与其它转基因玉米、非转基因玉米、大豆、油菜、棉花、水稻区别开来，本底很干净，无非特异性条带。
在图3中，分别对MON863玉米、MON863阳性对照、无模板对照、野生型玉米、Bt11玉米、TC1507玉米、NK603玉米、GA21玉米、BT176玉米、大豆、棉花、水稻、小麦、油菜进行微滴PCR，经荧光酶标仪荧光扫描，结果发现只有MON863玉米和MON863阳性对照在564nm处有波峰，而其他的没有波峰，接近本底值。因此，通过引物荧光标记的微滴PCR和荧光酶标仪荧光扫描可以对MON863转基因玉米进行识别，明显的将MON863转基因玉米与其它转基因玉米、非转基因玉米、大豆、油菜、棉花、水稻区别开来，本底很干净，无非特异性条带。
在图4中，分别对TC1507玉米、TC1507阳性对照、无模板对照、野生型玉米、Bt11玉米、MON863玉米、NK603玉米、GA21玉米、BT176玉米、大豆、棉花、水稻、小麦、油菜进行微滴PCR，经荧光酶标仪荧光扫描，结果发现只有TC1507玉米和TC1507阳性对照在610nm处有波峰，而其他的没有波峰，接近本底值。因此，通过引物荧光标记的微滴PCR和荧光酶标仪荧光扫描可以对TC1507转基因玉米进行识别，明显的将TC1507转基因玉米与其它转基因玉米、非转基因玉米、大豆、油菜、棉花、水稻区别开来，本底很干净，无非特异性条带。
在图5中，分别对NK603玉米、NK603阳性对照、无模板对照、野生型玉米、Bt11玉米、MON863玉米、TC1507玉米、GA21玉米、BT176玉米、大豆、棉花、水稻、小麦、油菜进行微滴PCR，经荧光酶标仪荧光扫描，结果发现只有NK603玉米和NK603阳性对照在442nm处有波峰，而其他的没有波峰，接近本底值。因此，通过引物荧光标记的微滴PCR和荧光酶标仪荧光扫描可以对NK603转基因玉米进行识别，明显的将NK603转基因玉米与其它转基因玉米、非转基因玉米、大豆、油菜、棉花、水稻区别开来，本底很干净，无非特异性条带。
从图2～图5可以看出，用4种荧光基团JOE、CY3、ROX、AMCA分别标记转基因玉米Bt11、MON863、TC1507、NK603品系的正反引物进行特异性验证，通过荧光酶标仪扫描，4种荧光基团的发射光谱可以被明显识别出来，阳性转基因玉米样品与阳性对照波峰很高，其它转基因玉米、非转基因玉米、大豆、油菜、棉花、水稻波峰很低，基本上处于本底水平。因此，通过引物荧光标记的微滴PCR和荧光酶标仪荧光扫描可以对某一品系的转基因玉米进行识别，明显的将某一品系的转基因玉米与其它转基因玉米、非转基因玉米、大豆、油菜、棉花、水稻区别开来，本底很干净，无非特异性条带。
图6为玉米内标基因（Ivrl）扩增之后的荧光扫描图，可以看出：只有转基因玉米、非转基因玉米有很高的波峰，而其他大豆、棉花、水稻、小麦、油菜均没有波峰，基本上处于本底水平，说明微滴PCR对内参基因的扩增特异性很好的。
实施例2：高通量检测
转基因作物：Bt11玉米、MON863玉米、TC1507玉米、NK603玉米、Bt76玉米、GA21玉米、T25玉米。
参看实施例1，进行第一步～第六步操作，取各个样品的260ng的DNA混合物作为模板进行微滴PCR。
第七步：高通量检测结果分析
应用本实施例荧光基团标记的正反引物（具体参见表5）进行微滴PCR对7个转基因品系（Bt11、MON863、TC1507、NK603、Bt76、GA21、T25）中含有的DNA目标序列同时进行分析。首先，应用七个标记有不同荧光基团（发光基团）的引物对（具体参见表5）在同一PCR管中进行微滴PCR扩增，随后扩增产物用清洁试剂盒纯化，再进行荧光酶标仪荧光检测。荧光酶标仪荧光检测结果参看表7，根据不同荧光基团标记的引物，不同的荧光在相应的波长处会有发射的荧光值，且这七种转基因玉米检测的荧光值都远远高于于它们的阴性对照的荧光值，且样品荧光值>阴性对照平均值+/-4SD。因而不同的转基因产品可以被区分开来并同时检出。
表7转基因玉米高通量检测荧光值
转基因玉米 荧光基团 荧光值 阴性对照荧光值
BT11 6-JOE 16.50 0.13
MON863 CY3 24.00 0.55
TC1507 5-ROX 34.20 0.16
NK603 AMCA 1.73 0.24
BT176 BO-PROTM-1 3.48 0.33
GA21 APC 37.53 0.27
T25 CY5.5TM 42.40 0.36
上述结果表明，使用本实施例的引物荧光标记的微滴PCR检测方法可以实现高通量分析多个DNA目标核酸分子。
研究表明：一个荧光基团的激发光谱与发射光谱的带宽之和应小于该荧光基团的斯托克斯位移，这样才能避免激发光谱与发射光谱发生重叠；两个不同的荧光基团的激发光谱不能发生重叠，发射光谱也不能发生重叠。根据实验中使用的Thermo VarioSkanFlash多功能酶标仪的参数特性，即激发带宽为5nm/12nm，发射带宽为12nm，所以可选择的荧光基团的斯托克斯位移只需大于17nm。而两个不同的荧光基团的最佳激发波长间隔只需大于等于10nm，最佳发射波长间隔只需大于等于24nm。
对于一个发射波长范围从400-800nm的荧光分光光度计和荧光酶标仪，可检测一个孔中含有20几种的荧光基团标记的产物。一个检测96孔酶标板的酶标仪一次可检测2000多种基因，如果用384孔酶标板一次可检测的基因种类更多，因此本发明可以高通量检测生物基因。
实施例3：检测四种转基因玉米混合样品中不同浓度下的转基因DNA目标序列，即混合样品中不同转基因玉米的灵敏度检测。
第一步：植物材料及其DNA提取
转基因作物：Bt11玉米、Mon863玉米、TC1507玉米、NK603玉米。
非转基因作物：野生型玉米(农大108)。
植物DNA提取：应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA，上述的4种转基因玉米粉按照相同的质量比同非转基因玉米粉混合配制模拟的玉米粉样品评估本实施例方法的灵活性。8份混合样品中的每种转基因品系所占的质量比分别为：0.5%、1%、3%、5%、10%、30%、50%、70%。取各个模拟混合样品的260ng的DNA作为模板进行微滴PCR
参看实施例1，进行第二步～第六步操作。
第七步：灵敏度检测及结果分析
应用本实施例的被荧光基团标记的引物（具体参见表5）进行微滴PCR，对四种不同浓度下的转基因DNA目标序列进行分析，荧光分光光度计检测到的结果参看图7～图10。首先分别应用四个标记有不同荧光基团（发光基团）引物对进行微滴PCR扩增，随后扩增产物用清洁试剂盒纯化，再进行荧光酶标仪荧光检测。根据检测到的荧光数值不同可以知道该转基因品系在其中的含量。
从图7可以看出：混合物进行微滴PCR后，对其产物进行荧光扫描，其中对混合物中Bt11的最低检测限为0.5%。
从图8可以看出：混合物进行微滴PCR后，对其产物进行荧光扫描，其中对混合物中MON863的最低检测限为0.5%。
从图9可以看出：混合物进行微滴PCR后，对其产物进行荧光扫描，其中对混合物中TC1507的最低检测限为0.5%。
从图10可以看出：混合物进行微滴PCR后，对其产物进行荧光扫描，其中对混合物中MON863的最低检测限为0.5%。
从图7～10可以看出，扫描所得到的波峰呈现出梯度，当各品系的转基因DNA浓度为一个梯度时，所得的目的片段被标记的荧光值也呈现梯度，这些结果表明使用本实施例的引物荧光标记的微滴PCR检测方法具有很好的灵敏度。
实施例4：转基因玉米的定量检测
第一步：植物材料及其DNA提取
转基因作物：Bt11玉米、MON863玉米、TC1507玉米、NK603玉米。
植物DNA提取：应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA。转基因玉米Bt11的DNA用非转基因玉米基因组DNA进行梯度稀释，单一样品稀释梯度统一为:102～106拷贝/微升作为模板，混合样品的稀释梯度为：103～107拷贝/微升作为模板。
参看实施例1，进行第二步～第五步操作。
第六步：荧光分光光度计或荧光酶标仪检测微滴PCR产物
使用Thermo荧光酶标仪对样品进行荧光检测。用各个荧光基团的激发光波长，对样品进行激发，测定各个基因不同稀释度的荧光值，绘制标准曲线。
第七步：定量检测及结果分析
应用本实施例方法对单一样品：4个转基因品系（Bt11、MON863、TC1507、NK603）的DNA目标序列分别进行分析。首先应用四个标记有不同荧光基团（发光基团）引物对（具体参见表5）分别进行微滴PCR扩增，扩增产物用清洁试剂盒纯化，随后再通过荧光酶标仪测定转基因玉米不同梯度稀释的DNA各个拷贝数所对应的荧光值，绘制相应的标准曲线。单一样品Bt11、MON863、TC1507、NK603的标准曲线如图11-14。
应用本实施例方法对混合样品中4个转基因品系（Bt11、MON863、TC1507、NK603）的DNA目标序列同时进行分析。首先应用四个标记有不同荧光基团（发光基团）引物对进行微滴PCR扩增，扩增产物用清洁试剂盒纯化，随后再通过荧光酶标仪测定转基因玉米不同梯度稀释的DNA各个拷贝数所对应的荧光值，绘制相应的标准曲线。混合样品中Bt11、MON863、TC1507、NK603的标准曲线如图15-18。
从图11可以看出：Bt11进行微滴PCR之后，在500nm激发光条件下，测量555nm处各个不同稀释度DNA发射光的荧光值，做出标准曲线，R2＝0.9704，说明该图具有很好的线性关系。
从图12可以看出：MON863进行微滴PCR之后，在530nm激发光条件下，测量564nm处各个不同稀释度DNA发射光的荧光值，做出标准曲线，R2＝0.9298，说明该图具有很好的线性关系。
从图13可以看出：TC1507进行微滴PCR之后，在550nm激发光条件下，测量610nm处各个不同稀释度DNA发射光的荧光值，做出标准曲线，R2＝0.9152，说明该图具有很好的线性关系。
从图14可以看出：NK603进行微滴PCR之后，在353nm激发光条件下，测量442nm处各个不同稀释度DNA发射光的荧光值，做出标准曲线，R2＝0.9063，说明该图具有很好的线性关系。
从图15可以看出：四种玉米混合物进行微滴PCR之后，检测混合物中的Bt11在500nm激发光条件下，测量555nm处各个不同稀释度DNA发射光的荧光值，做出标准曲线，R2＝0.9916，说明该图具有很好的线性关系。
从图16可以看出：四种玉米混合物进行微滴PCR之后，检测混合物中的MON863在530nm激发光条件下，测量564nm处各个不同稀释度DNA发射光的荧光值，做出标准曲线，R2＝0.9739，说明该图具有很好的线性关系。
从图17可以看出：四种玉米混合物进行微滴PCR之后，检测混合物中的TC1507在550nm激发光条件下，测量610nm处各个不同稀释度DNA发射光的荧光值，做出标准曲线，R2＝0.9209，说明该图具有很好的线性关系。
从图18可以看出：四种玉米混合物进行微滴PCR之后，检测混合物中的NK603在353nm激发光条件下，测量442nm处各个不同稀释度DNA发射光的荧光值，做出标准曲线，R2＝0.9259，说明该图具有很好的线性关系。
从图11-14可以看出Bt11、MON863、TC1507、NK603定量限位都为102拷贝；从图15-18可以看出混合样品中的Bt11、MON863、TC1507、NK603的定量限为103拷贝。
实施例5：转基因玉米模拟样品检测
第一步：植物材料及其DNA提取
转基因作物：Bt11玉米、MON863玉米、TC1507玉米、NK603玉米、非转基因玉米。
植物DNA提取：应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA。转基因玉米Bt11、MON863、TC1507、NK603各自与非转基因玉米按照1%、3%、5%的质量比进行混合制成不同的GM含量的模拟混合样品，再分别取各个模拟混合样品的260ng的DNA作为模板进行微滴PCR，来对该研究建立的实验方法的准确性和精密性进行评估。
参看实施例1，进行第二步～第五步操作。
第六步：荧光分光光度计或荧光酶标仪检测微滴PCR产物
使用Thermo荧光酶标仪对样品进行荧光检测。用各个荧光基团的激发光波长，对样品进行激发，测定各个样品不同稀释度的荧光值，并进行三次实验，计算平均荧光值。
第七步：定量检测及结果分析
应用本实施例方法对混合样品中4个转基因品系（Bt11、MON863、TC1507、NK603）的DNA目标序列同时进行分析。首先应用四个标记有不同荧光基团（发光基团）引物对进行微滴PCR扩增，扩增产物用清洁试剂盒纯化，随后再通过荧光酶标仪测定转基因玉米不同梯度稀释的DNA各个拷贝数所对应的荧光值，根据实施例4中得到的混合样品中各个单个样品的标准曲线方程可计算出它们的拷贝数，继而可推算出它们的的GM含量。实验结果见表8。
表8转基因玉米模拟样品检测
从表8中可知：模拟样品的BT11、MON863、TC1507、NK603经过微滴PCR扩增后测的的荧光值，并计算出它们的的GM含量基本与事先预混的样品的理论值接近，稍微存在偏差，因此，在本发明中描述了用于检测转基因玉米的定量方法可用于进行各种生物基因的定量检测。
实施例6：转基因玉米检测重复性实验
第一步：植物材料及其DNA提取
转基因作物：Bt11玉米、Mon863玉米、TC1507玉米、NK603玉米。
植物DNA提取：应用上海市农业科学院和上海出入境检验检疫局联合研制的植物DNA抽提试剂盒提取和纯化植物基因组DNA。转基因玉米Bt11的DNA用非转基因玉米基因组DNA进行梯度稀释，取单一样品稀释梯度为106拷贝/微升作为模板。
参看实施例1，进行第二步～第五步操作。
第六步：荧光分光光度计或荧光酶标仪检测微滴PCR产物
使用Thermo荧光酶标仪对样品进行荧光检测。用各个荧光基团的激发光波长，对样品进行激发，测定各个基因稀释度为106拷贝的荧光值，计算各组实验的批内和批间的变异系数。
第七步：重复性实验结果分析
应用本实施例方法对4个转基因品系（Bt11、MON863、TC1507、NK603）的DNA目标序列进行分析。首先应用四个标记有不同荧光基团（发光基团）引物对进行微滴PCR扩增，扩增产物用清洁试剂盒纯化，随后再通过荧光酶标仪测定转基因玉米稀释梯度为106的DNA这一拷贝数微滴PCR之后所得的对应的荧光值，计算各组实验的批内和批间的变异系数。重复性实验结果见表9。
表9转基因玉米重复性实验
Figure BDA0000458257820000251
从表9中可知：批内各个转基因玉米的扩增情况的变异系数都在10%以内，说明本发明建立的实验方法是稳定可靠的，批间各个转基因玉米的扩增情况的变异系数都在15%以内，同样说明了本发明的检测方法的重复性是很好的。

Claims (6)

1.一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，针对待测生物样品分别设计PCR特异性引物，并选择性对特异性引物进行不同荧光基团标记；所述荧光基团的激发光谱与发射光谱的带宽之和大于该荧光基团的斯托克斯位移；
第二步，使用上述已标记荧光基团的特异性引物对在水油乳化剂中对相应的DNA模板进行多重微滴PCR扩增；
第三步，PCR产物分离及纯化；
第四步，用荧光分光度法对微滴PCR产物进行定性、定量、高通量检测分析：用不同的荧光基团标记不同的特异性引物，因而不同的PCR产物被不同荧光基团标记即待测生物样品由不同的荧光识别，用荧光分光度法根据荧光基团的发射波长对待测生物样品进行定性检测；同时，测量荧光的强度，通过标准曲线对待测生物样品进行定量检测；上述微滴PCR扩增过程中在等同的PCR参数下同时进行多重PCR反应，同时检测出至少7种待测生物样品，实现高通量检测。
2.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述待测生物样品和对应的特异性引物对及其标记的荧光基团如下所示：
Figure FDA0000458257810000011
3.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述水油乳化剂具体配制方法为：25℃下，取200μl微滴如下表所示的PCR水相在1.5分钟内逐滴加入到400μl微滴PCR油相中，混合后形成均匀的水油乳化剂，所述水油乳化剂中微滴的直径为1～8μM，每微升的水油乳化剂包含3×106到1×107个微滴；
微滴PCR水相成分
Figure FDA0000458257810000021
4.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述微滴PCR油相的成分如下所示：
Figure FDA0000458257810000022
5.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，第四步荧光分光度法中利用荧光分光度计或荧光酶标仪检测微滴PCR产物。
6.根据权利要求1或5所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述荧光分光光度法中利用Thermo VarioSkan Flash多功能荧光酶标仪检测微滴PCR产物，此时，第一步中所述荧光基团的斯托克斯位移大于17nm；两个不同的荧光基团的激发波长间隔大于等于10nm，发射波长间隔大于等于24nm。
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