CN117144054A - 一种核酸检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于定量检测的探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real‑time PCR检测方法。本发明建立了实时荧光PCR定量检测体系，该体系特异性好、重复性强、准确度高，检测灵敏度为100拷贝/μL，可快速准确的鉴定出生物材料及其加工产品中的目标核酸拷贝数，为转基因产品的监测和精准定量检测提供方法和工具。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及用于定量检测的探针、探针和引物组合、标准品、Real-time PCR检测试剂盒和检测方法。
背景技术
外源基因检测主要利用普通PCR方法，但其缺点是灵敏度不高，检测通量太低，且无法实时监控PCR过程，不能定量。随着分子生物学技术的发展，Real-time PCR（实时荧光定量PCR）已广泛应用于转基因检测，与常规PCR技术相比，其具有耗时短、操作简便、特异性好、灵敏度高的特点，过程可实时监控，结果可直接观察，可以进行高通量定量检测。
Real-time PCR方法可分为染料法和探针法两种。染料法Real-time PCR中的荧光染料能与双链DNA结合发出荧光，其结合是非特异性的，体系中的引物二聚体、DNA模板等都会与其结合，所以染料法的特异性不高。而探针法中的探针能与模板特异性结合，其扩增曲线反映的就是特异性产物的积累，不会含有非特异扩增的成分，灵敏度比染料法高出10倍。另外，染料法只支持单通道反应，如果需要进行多通道试验，或是检测相同样本的不同靶标，最常用的还是探针法Real-time PCR。
中国专利ZL202311346824X提供了一种优化的cry1F基因，可用于培育转基因抗虫植物产品。开发定量检测cry1F基因的方法能为转基因生物鉴定和监管提供有效的检测手段，为农业转基因生物安全管理提供技术支撑。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了用于检测含有cry1F基因的探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒和Real-time PCR检测方法。上述的产品可以是转cry1F基因的生物转化体，也可以是上述转化体的衍生品系，或是含有上述转化体的混杂生物材料，或是以上述样品为原材料加工获得的各种产品等。由于SEQ ID NO. 1所示序列是cry1F基因序列，因此只要含有SEQ ID NO. 1所示序列核酸分子的样品均可以用本发明提供的方法进行定性和定量检测。
本发明通过设计高灵敏度、特异性的探针、上游引物和下游引物，可准确鉴定含有cry1F基因的产品。该检测方法具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性等优点，弥补了常规PCR方法流程繁琐、检测灵敏度低和染料法Real-time PCR无法准确定量的缺点。
本发明提供了一种检测cry1F基因的探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'- ACTGGTCCCTCTTCCTCCTGCA-3'。
在一些实施方案中，所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。当探针处于游离状态时，荧光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，与模板紧密结合的探针5’端荧光基团会被Taq酶切开，从而远离3’端的淬灭基团，荧光基团发出的荧光能被仪器接收，产生的荧光信号与样本中扩增产物的量成正比。
在一些实施方案中，所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX、CY5、TAMRA或Texas中的任一种；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ-X、TAMRA、DABCYL或MGB中的任一种；
在一些实施方案中，所述荧光基团/淬灭基团的组合为FAM/BHQ1、FAM/BHQ2、CY3/BHQ-X、HEX/DABCYL、JOE/TAMRA或VIC/BHQ2中的任一种；
在随机选取的荧光基团和淬灭基团测试试验中，上述荧光基团和淬灭基团标记的探针均能够得到特异性的检测结果。同时，5’端标记FAM、3’端标记BHQ1的探针标记成本最低，可以作为最优选的探针标记方案。
本发明还提供了一种检测cry1F基因的引物和探针组合，其特征在于：包括上述的探针和两条引物，所述引物的核苷酸序列为5'-CCTCTTCGACCTGATCTG-3'和5'-CCTCGATGTAGATCTCGTA-3'；
上述的探针以及探针和引物组合是以SEQ ID NO. 1所示序列的全部或部分片段为模板，通过软件设计、试验筛选验证挑选出来的。
本发明还提供了检测cry1F基因的标准品，其特征在于：所述标准品为浓度不低于100拷贝/μL的一个或多个核酸样品；所述核酸样品含有SEQ ID NO. 1所示序列的核酸分子；
在一些实施方案中，所述检测标准品为6个浓度分别为1.0×107拷贝/μL、106拷贝/μL、105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL的质粒样品；所述核酸样品含有SEQID NO. 1所示的核酸分子；
在一些实施方案中，所述标准品的制备方法为：取47.6 μL浓度为25.8 ng/μL的含有SEQ ID NO. 1所示的核酸分子的全长11198 bp的质粒样品，加入952.4 μL ddH2O后，分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍。
本发明还提供了检测cry1F基因的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括上述的探针和引物组合以及上述的标准品；
在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括：
引物1，序列为5'- CCTCTTCGACCTGATCTG -3'；
引物2，序列为5'- CCTCGATGTAGATCTCGTA -3'；
探针，序列为5'- ACTGGTCCCTCTTCCTCCTGCA-3'；
标准品，所述检测标准品为6个浓度分别为1.0×107拷贝/μL、1.0×106拷贝/μL、1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL、1.0×102拷贝/μL的质粒样品；所述核酸样品含有SEQ ID NO. 1所示序列的核酸分子；
其中，所述探针5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1。
本发明还提供了检测cry1F基因的Real-time PCR方法，其特征在于：使用上述的检测试剂盒进行Real-time PCR检测，其中PCR反应体系中的引物1和引物2终浓度均为0.3μM，探针终浓度为0.15 μM。
本发明还提供了上述的探针、探针和引物组合、检测标准品、检测试剂盒、检测方法在定性或定量检测核酸样品中的应用；其中，所述核酸样品含有SEQ ID NO. 1所示序列的核酸分子。
本发明的有益效果是：经过软件设计和试验筛选，从100多组探针引物组合中获得了1条探针和2条引物的组合，在此基础上利用合适浓度梯度的标准品建立并优化了Real-time PCR检测方法，应用上述探针、探针和引物组合、标准品、检测试剂盒、Real-time PCR检测方法可以特异性地检测不低于100拷贝/μL的含有SEQ ID NO. 1的核酸样品，具有极高的灵敏度和特异性。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1 用探针法Real-time PCR反应检测组合A4和A5的引物和探针的扩增结果。可见，组合A4和A5都扩增成功，形成稳步上扬的扩增曲线，Ct值分别为21.68和28.55。
图2 灵敏度试验曲线。其中，1：1.0×106拷贝/μL；2：1.0×105拷贝/μL；3：1.0×104拷贝/μL；4：1.0×103拷贝/μL；5：1.0×102拷贝/μL；6：1.0×10拷贝/μL。
图3 标准品扩增曲线。其中，1：1.0×106拷贝/μL；2：1.0×105拷贝/μL；3：1.0×104拷贝/μL；4：1.0×103拷贝/μL；5：1.0×102拷贝/μL。
图4 绘制标准曲线和线性方程。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 cry1F基因的特异性引物和探针的设计和筛选
1、用软件设计引物和探针组合
以cry1F基因（序列如SEQ ID NO. 1所示）的全长序列（1818 bp）或部分序列（>300bp）作为模板输入软件（如ABI Primer Express 3.0）中；按以下要求设置软件中的相关参数后，共得到了超过100组的引物和探针组合。其中，每个组合中包含2条引物和1条探针。
探针和引物满足如下所有要求：
① 引物的长度在18~25 bp之间，探针的长度在18~30 bp之间；
② 引物的Tm值在58~60℃，探针的Tm值比引物高8-10℃；
③ 探针内部、引物内部或探针与引物之间避免产生3个碱基以上的互补序列；
④ 探针5’端第一个碱基避免是G；
⑤ 探针和引物在目标检测样品中具有特异性；
⑥ 两条引物之间的PCR产物长度介于80-300 bp之间。
最后从中选取软件评分较高的5组引物和探针作为候选组合，以备进一步筛选。候选组合如表1所示。
表1 软件设计评分较高的5组候选引物和探针
2、引物合成和筛选
合成表1所示的5组引物，并进行引物的特异性筛选。筛选过程如下：
（1）用普通PCR扩增反应检测5个候选组合的引物1和引物2。电泳结果如表2所示。结果表明，组合A1扩增出来的条带大小不符合预期，组合A2的引物扩增出多条带，均存在非特异性扩增；组合A3-A5的引物扩增出符合预期大小（100-250 bp）的单一特异性条带，因此组合A3-A5的引物1和引物2符合要求，进一步测试。组合A1-A2淘汰。
表2 普通PCR筛选特异性引物
（2）用SYBR Green染料法Real-time PCR反应检测组合A3-A5的引物1和引物2。Real-time PCR反应结果如表3所示。结果表明：组合A3的扩增曲线正常，Ct值为29，小于35，但熔解曲线为双峰；A4和A5的扩增曲线正常，其Ct值分别为21和28，均小于35，熔解曲线均为单峰。因此，将组合A4和A5中的引物1和引物2符合要求，进一步测试。组合A3淘汰。
表3 SYBR Green染料法Real-time PCR筛选特异性引物
3、探针合成和筛选
合成组合A4和A5中的探针，5’端用荧光标记基团FAM修饰，3’端用荧光淬灭基团BHQ1修饰。
用探针法Real-time PCR反应检测组合A4和A5中的引物和探针，反应结果如表4和图1所示。结果表明：组合A4和A5均扩增成功，具有稳步上扬的扩增曲线， Ct值分别为21.68和28.55。因此，选择Ct值更低（即扩增效率更高）的组合A4为检测cry1F的探针和引物组合。
表4 探针法Real-time PCR筛选特异性引物、探针组合
组合A4的探针（字体加粗部分）和引物（下划线部分）在cry1F片段中的位置如下所示：
AACTGCCTCAACAACCCCGAGGTGGAGATCCTGAACGAGGAGCGCAGCACGGGCAGGCTCCCCCTGGACATCTCCCTCAGCCTGACCCGCTTCCTCCTGTCCGAGTTCGTCCCCGGCGTGGGCGTGGCTTTCGGCCTCTTCGACCT GATCTGGGGCTTCATCACGCCGAGCGACTGGTCCCTCTTCCTCCTGCAGATCGAGCAGCTGATCGAGCAGCGCATCGAGACCCTGGAGCGCAACCGGGCTATCACGACCCTCAGGGGCCTGGCCGACAGCTACGAGATCTACATCGAGGCCCTGAGGGAGTGGGAGGCTAACCCGAACAACGCGCAGCTCAGGGA
引物和探针序列
引物1： 5'-CCTCTTCGACCTGATCTG-3'
引物2： 5'-CCTCGATGTAGATCTCGTA-3'
探针：FAM-ACTGGTCCCTCTTCCTCCTGCA-BHQ1
利用Real-time PCR对样品的初始模板量进行定量分析，需要利用已知拷贝数的标准品作出标准曲线，再通过PCR获得待测样品的Ct值，最后从标准曲线上计算出该样品的拷贝数。因此，首先要制备适宜的标准品，其制备方法如下：
1、将含有SEQ ID NO. 1所示序列的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1F-bar作为阳性质粒（长度为11198 bp），制备标准品；
2、用紫外分光光度计测量质粒DNA的吸光度A260和A280，分别计算质粒的浓度和纯度；
3、进行Real-time PCR时，标准品模板浓度需要以“拷贝/μL”为单位。
计算公式：模板拷贝数/μL=阿伏伽德罗常数×模板摩尔数，其中阿伏伽德罗常数=6.02×1023拷贝/mol，模板分子量=模板DNA长度（碱基数量）×660（碱基的平均分子量）。
4、测得质粒浓度为25.8 ng/μL，根据上述公式，质粒拷贝数/μL =6.02×1023拷贝/mol×（25.8×10-9g/μL）/（11198×660g/mol），即为2.10×109拷贝/μL。
5、取47.6 μL上述质粒溶液，加入ddH2O 952.4 μL，得到浓度为1.0×108拷贝/μL的标准品，再进行10倍比梯度稀释，分别得到浓度为1.0×107 ~1.0×10拷贝/μL的标准品。置于-20℃保存备用。
本发明通过实施例1的操作获得了可用的探针和引物，通过实施例2得到了系列浓度梯度的标准品，然而具体的Real-time PCR反应体系能否有更好的效果还受到引物和探针浓度等因素的影响，因此要想获得高效准确的定量结果，还需要进一步对PCR反应体系进行优化。
一、建立初步的Real-time PCR反应体系
通过对实施例1筛选的引物和探针组合A4进行稀释，加入去离子水将其浓度稀释为10 μM的工作液，进行探针法Real-time PCR扩增，建立反应体系。
PCR反应体系为：2×qPCR Mix 10 μL，10 μM上游引物0.5 μL，10 μM下游引物0.5μL，10 μM探针0.25 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O补足至总体积为20 μL。阳性对照（浓度为1.0×105拷贝/μL的质粒DNA）作为模板，ddH2O为空白对照。
Real-time PCR反应程序为：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 40 s（收集荧光信号），共进行40-45个循环。
二、优化Real-time PCR反应体系
引物终浓度设置为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μM 5个浓度梯度，对应的探针浓度为引物浓度的1/2倍。各处理的Real-time PCR试验结果如表5所示。
表5 不同引物和探针浓度的测试
结果表明：引物浓度0.3 μM、探针浓度0.15 μM的PCR反应体系的Ct值最小，荧光信号值最高。因此，确定后续试验引物终浓度为0.3 µM，探针浓度为0.15 µM。
优化后的反应体系为：
2×qPCR Mix 10 μL，10 μM上游引物0.6 μL，10 μM下游引物0.6 μL，10 μM探针0.3 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O补足至总体积为20 μL。阳性对照（浓度为1.0×107拷贝/μL的质粒DNA）作为模板，ddH2O为空白对照。
实施例4 Real-time PCR体系检测cry1F的灵敏度试验
灵敏度是指PCR扩增反应能检出样品的最低拷贝数，即最低检测限。用Real-timePCR检测不同浓度的标准品时，当某个浓度的标准品能形成扩增曲线但Ct值>35时，则认为该浓度标准品超出了PCR体系的最低检测限。
使用实施例1中所述的探针、引物组合A4、实施例3所优化的反应体系，以及以实施例2的标准品（浓度1.0×106~1.0×10拷贝/μL）为模板（每个浓度3次平行试验），ddH2O为空白对照，进行Real-time PCR扩增，以确定本发明检测方法的最低检测限。根据仪器检测的荧光信号获得扩增曲线，结果见图2和表6。结果显示，当标准品浓度＜100拷贝/μL时，扩增曲线Ct＞35。因此，Real-time PCR的检出下限为100拷贝/μL。
上述灵敏度检测结果表明，当样品未出现典型扩增曲线或Ct值大于35，即样品中核酸分子cry1F浓度低于100拷贝/μL，则认为样品中未检出cry1F基因，检测结果为阴性。
表6 灵敏度试验结果
以梯度浓度的多个标准品作为模板进行Real-time PCR并记录Ct值，根据初始模板量（拷贝数的对数）及Ct值绘制标准曲线，得到标准方程。当需要对待测样品初始模板进行定量时，只需要得到扩增曲线，读得Ct值，带入标准方程即可算出待测样品的初始模板量。
以实施例2的标准品（浓度1.0×106~1.0×102拷贝/μL）为模板（每个浓度3次平行试验），ddH2O为空白对照，使用实施例1探针、引物组合A4，采用实施例2中的反应体系，进行Real-time PCR扩增，扩增曲线见图3。
以标准品浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，见图4。本发明标准曲线方程为y = -3.257x+39.750 （y表示Ct值，x为拷贝数的对数），标准曲线呈良好的线性关系，R2＝0.9983，相关系数高，满足Real-time PCR定量检测的要求。
实施例6 检测cry1F的Real-time PCR试剂盒
按照下列组成配制用于检测cry1F的试剂盒：2×qPCR Mix，10 μM上游引物、10 μM下游引物、10 μM探针、实施例2的标准品（浓度1.0×106 ~1.0×102拷贝/μL）和ddH2O。
引物、探针为实施例1中所述组合A4。
该试剂盒的反应体系可以为：2×qPCR Mix 10μL，10 μM上游引物0.6 μL，10 μM下游引物0.6 μL，10 μM探针0.3 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7.5 μL，反应总体积为20 μL。
该试剂盒进行Real-time PCR的反应程序为：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 20s，72℃ 40 s（收集荧光信号），共进行40-45个循环。
应用该试剂盒对样品进行检测时，通过仪器所检测到的荧光信号获得扩增曲线，根据标准品建立的标准方程和待测样品的Ct值计算样品拷贝数。
用CTAB法提取以下8个样品的基因组DNA，分别是转cry1F基因玉米CHZM12（中国专利ZL2023113084269）、受体对照玉米B104、转Vip3Aa基因玉米、上述3种玉米材料混合物；转cry1F基因水稻CHOS07（中国专利ZL 2023112995965）、受体对照水稻日本晴，转cry1Ab/cry1Ac基因水稻、上述3种水稻材料混合物。
以这8种基因组DNA为模板，ddH2O为空白对照，使用实施例6中所述的试剂盒，采用实施例3的反应体系进行Real-time PCR扩增，以进行上述8个样品的cry1F基因的阳性检测。根据仪器所检测到的荧光信号获得扩增曲线，并根据扩增曲线中各个样品的Ct值计算其拷贝数，结果如表7所示：
转cry1F基因玉米CHZM12及其混合物CBV、转cry1F基因水稻CHOS07及其混合物CBB均形成了扩增曲线，且Ct值均小于35，检测结果均为阳性；而受体对照材料以及其他Bt基因的转基因材料都没有形成扩增曲线，检测结果均为阴性。由此可见，本发明建立的cry1F基因检测体系具有很好的特异性和灵敏度。
表7 受试样品检测结果
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.探针，其特征在于：所述探针的核苷酸序列为5'- ACTGGTCCCTCTTCCTCCTGCA-3'。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述探针5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；
所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX、CY5、TAMRA或Texas中的任一种；所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ-X、TAMRA、DABCYL或MGB中的任一种。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述荧光基团和淬灭基团的组合为FAM/BHQ1、FAM/BHQ2、CY3/BHQ-X、HEX/DABCYL、JOE/TAMRA或VIC/BHQ2中的任一种。
4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于：所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。
5.引物和探针组合，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的探针和两条引物，所述引物的核苷酸序列为5'-CCTCTTCGACCTGATCTG-3'和5'-CCTCGATGTAGATCTCGTA-3'。
6.标准品，其特征在于：所述标准品为浓度不低于100拷贝/μL的一个或多个核酸样品；所述核酸样品含有SEQ ID NO. 1所示序列的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的标准品，其特征在于：所述标准品为浓度分别为1.0×107拷贝/μL、1.0×106拷贝/μL、1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL、1.0×102拷贝/μL的质粒样品；所述质粒样品含有SEQ ID NO. 1所示的核酸分子。
8.检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括权利要求5所述的探针和引物组合以及权利要求6-7任一项所述的标准品。
9.检测方法，其特征在于：使用权利要求8所述的检测试剂盒进行Real-time PCR检测，其中PCR反应体系中的引物1和引物2终浓度均为0.3 μM，探针终浓度为0.15 μM。
10.权利要求1-4任一项所述的探针、权利要求5所述的探针和引物组合、权利要求6-7任一项所述的标准品、权利要求8所述的检测试剂盒、权利要求9所述的检测方法在定性或定量检测核酸样品中的应用；
其中，所述核酸样品含有SEQ ID NO.1所示序列的核酸分子。
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