CN103588865A - 杀虫的蛋白质 - Google Patents
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Abstract
在此披露了多种用于控制植物害虫的组合物和方法。具体而言，提供了至少对玉米根虫具有毒性的新颖的工程化的杂合杀虫蛋白质（eHIP）。通过融合至少两种不同的苏芸金芽胞杆菌（Bt）Cry蛋白质或经修饰的Cry蛋白质的多个完整或部分的可变区以及保守区块的独特组合，设计出了具有针对玉米根虫活性的eHIP。还提供了对这些新颖的eHIP进行编码的核酸分子。还披露了制造eHIP的法以及使用eHIP的方法以及对本发明的eHIP进行编码的核酸，例如，在转基因植物中来赋予免于昆虫损害的保护。
Description
本申请是申请日为2008年3月26日，申请号为“200880017597.3”，发明名称为“杀虫的蛋白质”发明专利申请的分案申请。
背景
本发明涉及蛋白质工程、植物分子生物学以及害虫控制的领域。更具体地，本发明涉及具有杀虫活性的新颖的工程化的杂合蛋白质、核酸（其表达产生了杀虫的蛋白质）、以及制造和使用这些杀虫的蛋白质和相应的核酸来控制昆虫的方法。
虫害是引起作物损失的主要原因。仅在美国，由于各个属的昆虫的侵染每年就损失数十亿美元。除了大田作物的损失之外，虫害对于菜农和果农、对于观赏性花卉的生产商而言也是负担，并且对于园丁和房屋所有者而言是令人讨厌的东西。
玉米(corn)根虫的多个种被认为是最具破坏性的玉米害虫。在美国，三个重要的种是玉米根叶甲（Diabrotica virgifera virgifera，又称西方玉米根虫）、长角根叶甲（D.longicornis barberi，又称北方玉米根虫）、黄瓜十一星叶甲食根亚种（D.undecimpunctata howardi，又称南方玉米根虫）。在美国玉米带中，只有西方和北方玉米根虫被认为是主要的玉米害虫。美国南部的重要的玉米根虫害虫是墨西哥玉米根虫（Diabrotica virgifera zeae）。玉米根虫的幼虫通过几乎专一以玉米根为食而造成最为实质性的植物损害。已显示这种损伤增加了植物倒伏、减少了谷物产量以及营养物质的产量连同改变了谷物的营养物含量。幼虫摄食了在整个根部通过为导致根腐病和茎腐病的细菌和真菌感染打开了途径还对玉米造成了间接的影响。成年玉米根虫在晚夏时活跃在玉米地中，其中它们以穗、穗丝以及花粉为食，由此干扰了正常的授粉。
玉米根虫主要是通过密集使用化学杀虫剂而得到控制的，这些化学杀虫剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而具有活性。由此可以达到良好的玉米根虫控制，但这些化学品有时也能影响其他有益的生物。由化学杀虫剂的广泛使用而产生的另一个问题是出现了抵抗昆虫的品种的出现。又一个问题是由于玉米根虫幼虫在地下摄食因此使得应用杀虫剂的救护处理变得困难。因此，大多数杀虫剂的应用是在种植时预防性地进行的。这种操作导致了巨大的环境负担。通过各种农田管理实践已部分地改善了这种状况，但对替代性虫害控制的机理存在着不断增加的需要。
生物性虫害控制剂，如表达杀虫毒素像δ-内毒素（δ-内毒素；也被称为结晶毒素或Cry蛋白质）的苏芸金芽胞杆菌（Bt）菌株，也已经应用至作物中，产生了主要针对鳞翅目(lepidopteran)虫害的令人满意的结果。这些δ-内毒素是在结晶基质内所容纳的蛋白质，已知这些蛋白质当被某些昆虫摄入时拥有杀虫活性。已经根据各种δ-内毒素的活性谱和序列同源性对其进行分类。在1990年之前，主要的分类是由以下蛋白质的活性谱来限定的：对鳞翅目（蛾和蝴蝶）具有活性的Cry1蛋白质、对鳞翅目和双翅目(Diptera)（蝇和蚊）这二者具有活性的Cry2蛋白质、对鞘翅目(coleoptera)（甲虫）具有活性的Cry3蛋白质以及对双翅目具有活性的Cry4蛋白质（Hofte&Whitely,1989,Microbiol.Rev.53:242-255）。1998年发展了新命名法，这种命名法基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶特异性对Cry蛋白质进行系统性分类（Crickmore et al.1998,Microbiol.Molec.Biol.Rev.62:807-813）。
来自Bt的单独的δ-内毒素的杀虫活性谱相当窄，其中给定的δ-内毒素仅对目之内的一些种是有活性的。例如，已知Cry3A毒素对马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）(Colorado potato beetle)具有很大的毒性，但对叶甲属（Diabrotica）相关的甲虫具有非常小的毒性或没有毒性（Johnson et al.,1993,J.Econ.Entomol.86:330-333）。根据Slaney等人（1992,Insect Biochem.Molec.Biol.22:9-18），Cry3A毒素对南方玉米根虫幼虫的毒性比对马铃薯甲虫的毒性小至少2000倍。还已知的是Cry3A对西方玉米根虫或北方玉米根虫具有很小的毒性或没有毒性。
δ-内毒素的特异性是以下不同步骤的效率的结果，这些步骤涉及产生有效的毒性蛋白质及其随后与昆虫中肠中的上皮细胞的相互作用。为了杀虫，大多数已知的δ-内毒素必须首先被昆虫摄入并且被蛋白质水解性激活以形成活性毒素。这些杀虫晶体（Cry）蛋白质的激活是多步骤的过程。在摄入之后，这些晶体必须首先溶解在昆虫的肠中。一旦被溶解，这些δ-内毒素通过特异性蛋白酶剪切而被激活。昆虫肠中的这些蛋白质酶通过确定对δ-内毒素进行加工的地点而能在特异性方面发挥作用。一旦δ-内毒素已经被溶解并被加工，它与昆虫中肠上皮表面上的特异性受体相结合并接着被整合至刷状缘膜的脂质双层中。然后，一些离子通道形成，扰乱中肠的正常功能最终导致昆虫的死亡。
在具有碱性pH的肠道的鳞翅目中，肠蛋白质酶处理了δ-内毒素，例如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B以及Cry1F，从130至140kDa的原毒素至大约60至70kDa的毒性蛋白质。已报道将原毒素加工成毒素是通过去除N端和C端的氨基酸而进行的，其中进行加工的准确部位取决于所涉及的特异性δ-内毒素以及特异性昆虫肠液体（Ogiwara et al.,1992,J.Invert.Pathol.60:121-126）。因此，激活需要将整个C端原毒素尾部区域切除。δ-内毒素的这种蛋白质水解激活在确定其特异性方面能够发挥重要作用。
鞘翅目昆虫具有更为中性至酸性的肠道并且对鞘翅目特异的δ-内毒素与已激活的对鳞翅目的特异的毒素的大小相类似。因此，以前对鞘翅目特异的δ-内毒素进行加工被认为是对于毒性而言不是必需的。然而，这些数据提示具有鞘翅目活性的δ-内毒素被溶解并被蛋白水解成多个较小的毒性多肽。由苏芸金芽孢杆菌变种（B.thuringiensis var.tenebrionis）所产生的一种73kDa Cry3Aδ-内毒素蛋白质在该细菌中在N端很容易被加工，在结晶形成过程中或之后失去49至57个残基，产生常见的分离的67kDa形式（Carroll etal.,1989,Biochem.J.261:99-105）。McPherson等人（1988,Biotechnology6:61-66）也证实天然的cry3A编码序列在同一个阅读框中包含两个功能性的翻译起始密码子，一个编码了一种73kDa蛋白质，而另一个编码了一种67kDa蛋白质，这两种蛋白质分别起始于推导出的氨基酸序列的Met-1和Met-48。于是，这两种蛋白质均可被认为是自然发生的全长Cry3A蛋白质。
因为已经获得了更多的关于δ-内毒素如何发挥作用的知识，对δ-内毒素进行工程化以具有新活性的尝试已经增加。1991年，通过解出Cry3A的三维结构，对δ-内毒素进行工程化变得更有可能（Li et al.,1991,Nature353:815-821）。Li等人确定Cry3A蛋白质具有三个结构域：N端的结构域I（从残基58至290）由7个α螺旋组成；结构域II（从残基291至500），在被称为希腊钥匙（Greek key）的构象中包含三个β-折叠；以及C端的结构域III（从残基501至644），它是处于被称为果冻卷饼（jellyroll）构象的β-三明治。针对鳞翅目具有活性的Cry1Aa毒素的三维结构也已经被解出（Grochulski et al.,1995,J.Mol.Biol.254:447-464）。Cry1Aa毒素也具有三个结构域：N端的结构域I（从残基33至253），结构域II（从残基265至461）、以及结构域III（从残基463至609）（在来自残基254至264的β-折叠之一中具有一个额外的外部链）。如果将Cry3A和Cry1Aa的结构投射至其他的Cry1序列上，则结构域I从大约氨基酸残基28延展至260，结构域II从大约260延伸至460，并且结构域III从大约460延伸至600。参见Nakamura etal.,Agric.Biol.Chem.54(3):715-724(1990)；Li et al.,Nature353:815-821(1991)；Ge et al.,J.Biol.Chem.266(27):17954-17958(1991)；以及Honee et al.,Mol.Microbiol.5(11):2799-2806(1991)；以上文献中每一篇均通过引用并入在此。因此，目前已知的是基于氨基酸序列同源性，这些已知的Bt δ-内毒素具有包含三个结构域的一个相似的三维结构。
Bt Cry蛋白质的毒素部分的特征还在于遍及其氨基酸序列具有五个保守区块（conserved block），从N端至C端分别编号为CB1至CB5（Hofte&Whiteley，上述）。保守区块1（CB1）包括大约29个氨基酸，保守区块2（CB2）包括大约67个氨基酸，保守区块3（CB3）包括大约48个氨基酸，保守区块4（CB4）包括大约10个氨基酸并且保守区块5（CB5）包括大约12个氨基酸。在这五个保守区块之前和之后的的序列是高度可变的，并因此被命名为“可变区”V1至V6。Bt δ-内毒素的结构域I典型地包括可变区1、保守区块1、可变区2、以及保守区块2的N端的52个氨基酸。结构域II典型地包括保守区块2的C端的大约15个氨基酸、可变区3、以及保守区块3的N端的大约10个氨基酸。结构域III典型地包括保守区块3的C端的大约38个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、以及保守区块5。Cry1鳞翅目活性的毒素在其他δ-内毒素之外还具有一个可变区6，该可变区6在结构域III之内具有大约1至3个氨基酸。
许多Bt菌株和δ-内毒素针对不同昆虫种和线虫是有活性的。然而，这些菌株和毒素中相对很少的菌株和毒素具有针对鞘翅目昆虫的活性。此外，大多数目前已知的天然的对鞘翅目昆虫具有活性的δ-内毒素（例如Cry3A、Cry3B、Cry3C、Cry7A、Cry8A、Cry8B、以及Cry8C）如果（例如）通过微生物或转基因植物进行递送，则具有不足以提供足够的田间控制的针对玉米根虫的口服毒性。因此，需要探索用于产生对玉米根虫具有活性的新颖的毒素的其他方法。
已经对具有鳞翅目活性的δ-内毒素进行工程化以试图改善特异的活性或拓宽杀虫活性谱。例如，将来自Cry1Aa蛋白质的蚕蛾（Bombyx mori）特异性结构域移至Cry1Ac蛋白质，由此将新的杀虫活性传递至得到的杂合Bt蛋白质中（Ge et al.1989,PNAS86:4037-4041）。而且，Bosch等人1998（美国专利5,736,131，通过引用并入在此）说明了苏芸金芽胞杆菌的杂合毒素，该毒素在其C端包含第一Cry蛋白质的结构域III，并且在其N端包含第二Cry蛋白质的结构域I和结构域II。已显示此类杂合毒素具有针对鳞翅目昆虫的经改变的杀虫特异性。例如，H04杂合毒素（该毒素还说明于De Maagd etal.,Appl.Environ.Microbiol.62(5):1537-1543(1996)中）在其N端包含Cry1Ab的结构域I和结构域II，并且在其C端包含Cry1C的结构域III。据报道与亲代的Cry1Ab毒素比较，H04对鳞翅目昆虫甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)（甜菜粘虫）是高毒性，并且与Cry1C亲代毒素相比毒性显著性更高。已显示这些毒素的结构域III（对甜菜粘虫没有活性，如Cry1E和Cry1Ab）被Cry1C的结构域III（对甜菜粘虫有活性）替换，能够产生针对这种昆虫具有活性的杂合毒素。披露于Bosch等人中的所有这些杂合毒素使用了来自具有鳞翅目活性的Cry蛋白质的结构域来制造具有鳞翅目活性的新的毒素。这些结果确实提示Cry1C的结构域III是针对甜菜粘虫的特异性的重要的决定簇。还参见Bosch et al.,FEMS Microbiology Letters118:129-134(1994)；Bosch et al.,Bio/Technology12:915-918(1994)；De Maagd et al.,Appl.Environ.Microbiol.62(8):2753-2757(1996)；以及De Maagd et al.,Mol.Microbiol.31(2):463-471(1999)；以上文献中的每一篇均通过引用并入在此。
已经报道了对具有鞘翅目活性的δ-内毒素进行工程化的几种尝试。Chen和Stacy（美国专利7,030,295，通过引用并入在此）通过将非自然发生的蛋白质酶识别位点插至Cry3A蛋白质的结构域I、结构域III、或这二者中而成功地创造出具有玉米根虫活性的毒素。这些得到的经修饰的Cry3A蛋白质中有（被命名为Cry3A055，具有插至在结构域Ι中的蛋白质酶识别位点）对叶甲属的几种是活性的。Van Rie等人1997（美国专利号5,659,123）通过在结构域II中用氨基酸丙氨酸随机替换多个氨基酸而对Cry3A进行工程化，该Cry3A被认为在溶剂的可接近性方面是重要的。据报道限定于结构域II的这些随机替换中有几个涉及了西方玉米根虫毒性的增加。然而，其他报道已显示在Cry3Ad的结构域II中的一些丙氨酸的替换导致了受体结合或结构不稳定性的破坏（Wu and Dean,1996,J.Mol.Biol.255:628-640）。English等人1999（国际专利申请公开号WO99/31248）报道了Cry3Bb中的氨基酸替换，它造成了针对南方和西方玉米根虫的毒性的提高。然而，在35个已报道的Cry3Bb突变体中只有三个（具有主要位于结构域II以及结构域Ι-结构域II交界处的突变）针对西方玉米根虫是有活性的。此外，在相同的试验中针对西方玉米根虫的野生型Cry3Bb的毒性的变化似乎比在突变型Cry3Bb毒素与野生型Cry3Bb之间的差别中的任何一种差异更大。Shadenkov等人（1993,Mol.Biol.27:586-591）通过将Cry3A蛋白质的氨基酸48至565与Cry1Aa蛋白质的氨基酸526至725相融合而制造出一种杂合蛋白质。因此，Cry3A与Cry1Aa序列之间的交换是在位于结构域III中的保守区块4之中的。Cry3A针对马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）是非常具有活性的。然而，由Shadenkov等人所披露的杂合蛋白质对马铃薯甲虫是没有活性的，即使超过75%的杂合蛋白质是由Cry3A序列所组成。因此，仅添加25%的Cry1Aa序列破坏了针对鞘翅目昆虫（亲代Cry3A对其是具有活性的）的活性。这提示通过将一种具有鞘翅目活性的Cry蛋白质（例如Cry3A）与一种具有鳞翅目活性的Cry蛋白质（例如Cry1A）的部分进行融合而制得的杂合蛋白质将不具有针对鞘翅目昆虫的活性，特别是对Cry3A自然不敏感的一种鞘翅目昆虫（像玉米根虫）。
考虑到以上讨论，仍需要设计新型并有效的虫害控制剂，这些虫害控制剂为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要的是对叶甲属物种（一种主要的玉米害虫）具有毒性的蛋白质，与现存的昆虫控制产品相比这些蛋白质作为缓和抵抗性的演化的一个途径具有一种不同的作用方式。此外，通过这些使环境负担最小化的产品（如通过转基因植物）递送控制剂是令人希望的。
发明概述
考虑到这些需要，本发明的一个目的是提供新颖的工程化的杂合杀虫蛋白质（eHIP）。通过以下方法制造此类新颖的eHIP：将至少两种不同的Cry蛋白质的可变区以及保守区块的独特组合相融合并可任选地包括在C端的来自Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域或N端的肽基片段或二者皆有。例如，没有限制，通过将来自第一Cry蛋白质（具有鞘翅目活性）的多个完整或部分的可变区和保守区块与来自第二Cry蛋白质（具有鳞翅目活性，且不同于该第一Cry蛋白质）的完整或部分的可变区和保守区块相组合，并可任选地包括来自具有鳞翅目活性的Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域、或N端的肽基片段或二者皆有，创造出新的工程化的杂合杀虫蛋白质，这些蛋白质所具有不同于该第一或第二亲代Cry蛋白质或不同于这二者的针对一系列昆虫的活性。此类新颖的eHIP可以包括来自经修饰的Cry3A蛋白质和Cry蛋白质（不同于该经修饰的Cry3A蛋白质）的完整或部分的可变区、保守区块或结构域。肽基片段可能对该eHIP赋予了杀虫活性，或者可能将该eHIP的杀虫活性提高使之超过没有肽基片段的eHIP，或者使该eHIP比没有肽基片段的eHIP更加稳定。本发明的eHIP具有针对玉米根虫（Diabrotica sp.）的令人惊讶且出乎意外的毒性。本发明进一步指向多种核酸，这些核酸对eHIP进行编码或与在严格条件下与根据本发明的重组杂合核酸进行杂交的核酸是互补的。
还包括在本发明中的是多种载体（包含此类重组（或与其互补）的核酸）；植物或微生物（它包括此类核酸并能够使此类核酸表达）；用此类核酸所转化的多种植物，例如转基因玉米植物；此类植物的子代（这些植物包含稳定整合的并且可以按照孟德尔方式进行遗传的核酸），和/或此类植物以及这种子代的种子。
本发明还包括包含这些eHIP的组合物和配制品(formulation)，这些组合物和配制品能够抑制虫害存活、生长以及繁殖的能力，或能够限制与昆虫有关的损害或作物的损失，例如将这些eHIP或组合物或配制品施用至昆虫侵袭的区域，或施用至预防性处理易感染昆虫的区域或植物以赋予针对这些虫害的保护。
本发明进一步描绘了制造这些eHIP的方法以及使用这些核酸的多种方法，例如，在微生物中控制昆虫或者在转基因植物中赋予免于昆虫损害的保护。
这些此处说明的新颖的eHIP对昆虫是具有高度活性的。例如，本发明的eHIP可被用来控制经济上重要的昆虫，如西方玉米根虫（Diabroticavirgifera virgifera）、北方玉米根虫（D.longicornis barberi）以及墨西哥玉米根虫（D.virgifera zeae）。某些eHIP还可用来控制欧洲玉米螟（Ostrinianubilalis）以及其他鳞翅目昆虫。eHIP可以单独使用或与其他昆虫控制策略组合使用以赋予具有最小环境影响的最大虫害控制效率。
本发明的其他方面和优点从本发明的以下说明以及非限制性实例的一项研究中对于本领域的普通技术人员而言应当是很显然的。
附图简要说明
以下附图形成了部分的本说明书并且被包括在内以进一步证实本发明的某些方面。通过这些附图中的一个或多个与在此呈现的特定的实施方案的详细说明相结合进行参考本发明可以得到更好的理解。
图1A至1E示出了带有用于构建多种eHIP（包括Cry3A、Cry1Ab、以及Cry3A055）的亲代Cry蛋白质或经修饰的Cry3A的一些eHIP实施方案的序列比对，并指明了百分比同一性。对N端的肽基片段加下划线。五个保守区块被标记为CB1至CB5。结构域I、结构域II以及结构域III之间的接点的部位用垂直的虚线指示。一种组织蛋白质酶G识别序列AAPF用粗体表示。
图2A至2E示出了至少对西方玉米根虫具有活性的多个eHIP实施方案的比对，并指明了与8AF eHIP相比的百分比同一性。对N端的肽基片段加单下划线。对C端的原毒素尾部区域加双下划线。五个保守区块被标记为CB1至CB5。结构域I、结构域II以及结构域III之间的接点的部位用“↓”指示并相应地进行标记。交换位置的部位用“◆”指示。一种组织蛋白质酶G识别序列AAPF用粗体表示。
图3示出了用来转化玉米的重组载体12207的图谱，该玉米包含表达盒，该表达盒具有玉米泛素启动子，该启动子可操作地连接至FRCG编码序列上，该FRCG编码序列可操作地连接至NOS终止子上。
图4示出了用来转化玉米的重组载体12161的图谱，该玉米包含表达盒，该表达盒具有玉米泛素启动子，该启动子可操作地连接至FR8a编码序列上，该FR8a编码序列可操作地连接至NOS终止子上。
图5示出了用来转化玉米的重组载体12208的图谱，该玉米包含表达盒，该表达盒具有夜香树黄化曲叶（cestrum yellow leaf curling）病毒启动子（cmp），该启动子可操作地连接至FRCG编码序列上，该FRCG编码序列可操作地连接至NOS终止子上。
图6示出了用来转化玉米的重组载体12274的图谱，该玉米包含表达盒，该表达盒具有夜香树黄化曲叶病毒启动子（cmp），该启动子可操作地连接至FR8a编码序列上，该FR8a编码序列可操作地连接至NOS终止子上。
图7示出了用来转化玉米的重组载体12473的图谱，该玉米包含表达盒，该表达盒具有玉米泛素启动子（ubi），该启动子可操作地连接至FRD3编码序列上，该FRD3编码序列可操作地连接至NOS终止子上。
图8示出了用来转化玉米的重组载体12474的图谱，该玉米包含表达盒，该表达盒具有夜香树黄化曲叶病毒启动子（cmp），该启动子可操作地连接至FRD3编码序列上，该FRD3编码序列可操作地连接至NOS终止子上。
序列表中序列的简要说明
SEQ ID NO:1是2OL-8a核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1进行编码的2OL-8a。
SEQ ID NO:3是FR8a核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是由SEQ ID NO:3进行编码的FR8a。
SEQ ID NO:5是FRCG核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是由SEQ ID NO:5进行编码的FRCG。
SEQ ID NO:7是FR8a-9F核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是由SEQ ID NO:7进行编码的FR8a-9F。
SEQ ID NO:9是FR-9F-catg核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是由SEQ ID NO:9进行编码的FR-9F-catg。
SEQ ID NO:11是FR8a-12AA核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是由SEQ ID NO:11进行编码的FR8a-12AA。
SEQ ID NO:13是WR-9mut核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是由SEQ ID NO:13进行编码的WR-9mut。
SEQ ID NO:15是FRD3核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是由SEQ ID NO:15进行编码的FRD3。
SEQ ID NO:17是FR-12-cg-dm3核苷酸序列。
SEQ ID NO:18是由SEQ ID NO:17进行编码的FR-12-cg-dm3。
SEQ ID NO:19是9F-cg-del6核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是由SEQ ID NO:19进行编码的9F-cg-del6。
SEQ ID NO:21是FR-cg-dm3核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是由SEQ ID NO:21进行编码的FR-cg-dm3。
SEQ ID NO:23是9F-cg-dm3核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是由SEQ ID NO:23进行编码的9F-cg-dm3。
SEQ ID NO:25是B8a核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是由SEQ ID NO:25进行编码的B8a。
SEQ ID NO:27是5*B8a核苷酸序列。
SEQ ID NO:28是由SEQ ID NO:27进行编码的5*B8a。
SEQ ID NO:29是V3A核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是由SEQ ID NO:29进行编码的V3A。
SEQ ID NO:31是V4F核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是由SEQ ID NO:31进行编码的V4F。
SEQ ID NO:33是5*V4F核苷酸序列。
SEQ ID NO:34是由SEQ ID NO:33进行编码的5*V4F。
SEQ ID NO:35是2OL-7核苷酸序列。
SEQ ID NO:36是由SEQ ID NO:35进行编码的2OL-7。
SEQ ID NO:37是T7-2OL-7核苷酸序列。
SEQ ID NO:38是由SEQ ID NO:37进行编码的T7-2OL-7。
SEQ ID NO:39是5*2OL-7核苷酸序列。
SEQ ID NO:40是由SEQ ID NO:39进行编码的5*2OL-7。
SEQ ID NO:41是2OL-10核苷酸序列。
SEQ ID NO:42是由SEQ ID NO:41进行编码的2OL-10。
SEQ ID NO:43是5*2OL-10核苷酸序列。
SEQ ID NO:44是由SEQ ID NO:43进行编码的5*2OL-10。
SEQ ID NO:45是2OL-12A核苷酸序列。
SEQ ID NO:46是由SEQ ID NO:45进行编码的2OL-12A。
SEQ ID NO:47是2OL-13核苷酸序列。
SEQ ID NO:48是由SEQ ID NO:47进行编码的2Ol-13。
SEQ ID NO:49是V5&6核苷酸序列。
SEQ ID NO:50是由SEQ ID NO:49进行编码的V5&6。
SEQ ID NO:51是5*V5&6核苷酸序列。
SEQ ID NO:52是由SEQ ID NO:51进行编码的5*V5&6。
SEQ ID NO:53是88A-dm3核苷酸序列。
SEQ ID NO:54是由SEQ ID NO:53进行编码的88A-dm3。
SEQ ID NO:55是FR(1Fa)核苷酸序列。
SEQ ID NO:56是由SEQ ID NO:55进行编码的FR(1Fa)。
SEQ ID NO:57是FR(1Ac)核苷酸序列。
SEQ ID NO:58是由SEQ ID NO:57进行编码的FR(1Ac)。
SEQ ID NO:59是FR(1Ia)核苷酸序列。
SEQ ID NO:60是由SEQ ID NO:59进行编码的FR(1Ia)。
SEQ ID NO:61是DM23A核苷酸序列。
SEQ ID NO:62是由SEQ ID NO:61进行编码的DM23A。
SEQ ID NO:63是8AF核苷酸序列。
SEQ ID NO:64是由SEQ ID NO:63进行编码的8AF。
SEQ ID NO:65是5*cry3A055核苷酸序列。
SEQ ID NO:66是由SEQ ID NO:65进行编码的5*cry3A055。
SEQ ID NO:67是一种玉米优化的cry3A核苷酸序列。
SEQ ID NO:68是由SEQ ID NO:67进行编码的Cry3A。
SEQ ID NO:69是cry3A055核苷酸序列。
SEQ ID NO:70是由SEQ ID NO:69进行编码的Cry3A055。
SEQ ID NO:71是一种玉米优化的cry1Ab核苷酸序列。
SEQ ID NO:72是由SEQ ID NO:71进行编码的Cry1Ab。
SEQ ID NO:73是一种玉米优化的cry1Ba核苷酸序列。
SEQ ID NO:74是由SEQ ID NO:73进行编码的Cry1Ba。
SEQ ID NO:75是一种玉米优化的cry1Fa核苷酸序列。
SEQ ID NO:76是由SEQ ID NO:75进行编码的Cry1Fa。
SEQ ID NO:77是一种cry8Aa核苷酸序列。
SEQ ID NO:78是由SEQ ID NO:77进行编码的Cry8Aa。
SEQ ID NO:79是一种cry1Ac核苷酸序列。
SEQ ID NO:80是由SEQ ID NO:79进行编码的Cry1Ac。
SEQ ID NO:81是一种cry1Ia核苷酸序列。
SEQ ID NO:82是由SEQ ID NO:81进行编码的Cry1Ia。
SEQ ID No:83至125是在本发明中有用的引物序列。
SEQ ID NO:126至134是N端的肽基片段。
SEQ ID NO:135是一种全长Cry3A蛋白质。
SEQ ID Nos:136至143是在本发明中有用的引物序列。
SEQ ID NO:144是T7-8AF编码序列。
SEQ ID NO:145是由ASEQ ID NO:144进行编码的T7-8AF。
SEQ ID NO:146是-catG8AF编码序列。
SEQ ID NO:147是由SEQ ID NO:146进行编码的-CatG8AF。
SEQ ID NO:148是8AFdm3编码序列。
SEQ ID NO:149是由SEQ ID NO:148进行编码的8AFdm3。
SEQ ID NO:150是8AFlongdm3编码序列。
SEQ ID NO:151是由SEQ ID NO:150进行编码的8AFlongdm3。
SEQ ID NO:152是cap8AFdm3编码序列。
SEQ ID NO:153是由SEQ ID NO:152进行编码的cap8AFdm3。
SEQ ID NO:154是8AFdm3T编码序列。
SEQ ID NO:155是由SEQ ID NO:154进行编码的8AFdm3T。
SEQ ID NO:156是8AFlongdm3T编码序列。
SEQ ID NO:157是由SEQ ID NO:156进行编码的8AFlongdm3T。
SEQ ID NO:158是cap8AFdm3T编码序列。
SEQ ID NO:159是由SEQ ID NO:158进行编码的cap8AFdm3T。
SEQ ID NO:160是FR8a+34eHIP。
定义
为了清晰，对在本说明书中所使用的某些术语进行定义并呈现如下：
本发明的eHIP的“活性”是指eHIP作为口服活性的昆虫控制剂发挥作用，具有一种毒性作用、或者能够干扰或阻止昆虫摄食，这可能引起或者可能不引起昆虫的死亡。当本发明的eHIP被递送至昆虫时，这种结果典型地是该昆虫的死亡，或者该昆虫不以使该eHIP可供该昆虫使用的来源为食。
“与……相关联/可操作地连接”指物理上或功能上相关的两种核酸。例如，启动子或调解性DNA序列被说成“关联于”(与……相关联)对RNA或蛋白质进行编码的DNA序列，条件是将这两条序列可操作地连接，或设定为使该调解性DNA序列将影响该编码或结构DNA序列的表达水平。
在本发明的背景中，“嵌合的杀虫蛋白质”（CIP）是杀虫蛋白质，包含与eHIP的N端相融合的肽基片段。该肽基片段可能对该eHIP赋予了杀虫活性，或者可能将该eHIP的杀虫活性提高使之超过没有肽基片段的eHIP，或者使该eHIP比没有该肽基片段的eHIP更加稳定，特别是针对至少西方玉米根虫。该肽基片段是氨基酸序列，该氨基酸序列典型地对于Bt Cry蛋白质是异源的（并非衍生自Bt Cry蛋白质）但可以是衍生自Bt Cry蛋白质。此类肽基片段从杀虫蛋白质的N端延伸并且不自然地发生于Bt Cry蛋白质的N端。N端的肽基片段的例子具有氨基酸序列MTSNGRQCAGIRP（SEQ IDNO:129），该序列并非衍生自Bt Cry蛋白质。
“编码序列”是核酸序列，该核酸序列被转录成RNA，如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA。优选地，该RNA接着在生物体中进行翻译，产生蛋白质。
在本发明的背景中，“连接”(connecting)核酸是指使用本领域已知的任何手段将两个或多个核酸结合在一起。例如，没有限制，可以使用（例如）DNA连接酶将这些核酸连结在一起，或者可以使用PCR对这些核酸进行退火。也可以使用两种或多种分离的核酸的序列通过化学合成核酸而将这些核酸结合。
“控制”昆虫是指通过毒性作用来抑制害虫存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的损害或作物的损失。“控制”昆虫可能指或可能不指杀死这些昆虫，尽管它优选地是指杀死这些昆虫。
在本发明的背景中，“对应于”是指当某些蛋白质（例如Bt Cry蛋白质或经修饰的Cry3A蛋白质）的氨基酸序列彼此进行比对时，这些氨基酸在（例如但不限于）Cry3A毒素（SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:134）、Cry3A055毒素（SEQ ID NO:70）、或Cry1Ab毒素（SEQ ID NO:72）中与某些列举的位置对齐，但这些氨基酸不必处于相对于参考氨基酸序列的这些精确的用数字表示的位置中，特别是当它涉及结构域I、II以及III、和/或多个保守的模块以及可变区的识别时，这些氨基酸位置“对应于”彼此。例如，在所描绘的杂合蛋白质的结构域I中，Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸11至244对应于天然Cry3A毒素（SEQ ID NO:135）的氨基酸58至290或天然Cry3A毒素（SEQ ID NO:68）的氨基酸11至243或天然Cry1Ab毒素的氨基酸33至254。
在本发明的背景中，词“Cry蛋白质”可与词“delta-内毒素”或“δ-内毒素”互换使用。
在本发明的背景中，“工程化的杂合杀虫蛋白质”（eHIP）是通过将至少两种不同的Cry蛋白质的可变区和保守区块的独特的组合相融合而创造的杀虫蛋白质。此类新颖的eHIP可以包括来自经修饰的Cry3A蛋白质和Cry蛋白质（不同于该经修饰的Cry3A蛋白质）的多个完整或部分的可变区、保守区块或结构域。本发明的eHIP可以任选地包括来自Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域或N端的肽基片段或二者皆有。例如，没有限制，通过以N端至C端的方向将Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至468（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）与Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5以及可变区6），以及Cry1Ab原毒素尾部的38个氨基酸的区域相组合而创造出eHIP。包括N端的肽基片段的eHIP也可以被命名为“嵌合的杀虫蛋白质（CIP）”。
“递送”eHIP是指该eHIP与昆虫相接触，产生毒性作用以及对昆虫的控制。这种eHIP可以按照许多公认的方式进行递送，例如，通过表达该eHIP的转基因植物、或多种配制的蛋白质组合物、或多种可喷洒的蛋白质组合物、一种诱饵基质、或领域识别的任何一种其他的毒素递送系统。
“有效的昆虫控制量”是指eHIP的浓度，它通过毒性作用抑制了害虫存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的损害或作物的损失。“有效的昆虫控制量”可能指或可能不指杀死昆虫，尽管它优选地是指杀死这些昆虫。
如此处所用的“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指导特定的核苷酸序列的表达的核酸序列，包含与启动子，该启动子可操作地连接至所感兴趣的核苷酸序列上，该核苷酸序列可操作地连接至终止信号上。它还典型地包括该核苷酸序列的适当翻译所需求的序列。包含该感兴趣的核苷酸序列的表达盒可能具有其组分中的至少一个，该组分相对于它的其他组分中至少一个而言是异源的。该表达盒也可以是自然发生的但已经是以可用于异源表达的重组体形式而获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒对于该宿主是异源的，即，该表达盒的特殊核酸序列不自然发生于该宿主细胞内，并且必须已通过转化事件而被引至该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可能处于组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有在该宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激时才引发转录。在多细胞生物体（例如，植物）的情况下，该启动子对特定的组织，或器官，或者发育阶段也可能是特异的。
“基因”是限定的区域，该区域位于基因组之内，并且除了前述的编码核酸序列之外，它还包含其他（主要是调控性的）负责该编码部分的表达控制（也就是转录和转译）的核酸序列。基因也可包含其他5'和3'未翻译序列以及终止序列。其他可能存在的元件是，例如内含子。如在自然界中所发现，基因的调节性核酸序列在正常情况下可能不与该相关联的核酸序列进行可操作地连接，并因此不会是嵌合基因。
“感兴趣的基因”是指以下任何基因，当被转移至植物中时，它赋予该植物所希望的特性，如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性，或者抵抗其他害虫，除草剂耐受性，改进的营养价值，在工业加工中改进的性能或者改变的繁殖能力。“感兴趣的基因”也可以是被转移至植物用于在植物中生产具有商业价值的酶类或代谢产物的基因。
“异源”核酸序列是核酸序列（该核酸序列与引入该核酸序列的宿主细胞并非自然地相关联），包括自然发生的核酸序列的非自然存在的多个拷贝。异源氨基酸序列是不与天然的氨基酸序列自然地相关联的序列，例如，Cry蛋白质的氨基酸序列。
“同源”核酸序列是核酸序列，该核酸序列与引入该核酸序列的宿主细胞自然地相关联。
“同源重组”是在多个同源核酸分子之间的核酸片段的相互交换。
“同一性”或“百分比同一性”是指在两种核酸或蛋白质序列之间的相似性的程度。对于序列比较，典型地是一个序列充当与这些测试进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将这些测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标（subsequence coordinate），并指定序列算法程序的参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算出该一个或多个测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
用于比较的序列的最佳比对可以通过以下方法进行，例如Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性方法的搜索、这些算法（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575ScienceDr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA）的计算机实现方式、或视觉观察（总体上参见Ausubel等人，下文）。
适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个例子是BLAST算法，它说明于Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心（National Center forBiotechnology Information）公开地获得（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。这种算法涉及首先通过识别查询序列中具有具有长度W的短词而识别得分高的序列对（HSP），这些得分高的序列对当与数据库的序列中具有相同长度的词（word）进行比对时匹配或满足某个阳性值的阈值分值T。T是指邻近词的分值阈值（neighborhood word score threshold）（Altschul et al.,1990）。这些最初的邻近词的命中记录充当用于起始搜索的种子来寻找包含它们的更长的HSP。接着，只要累积的比对分值可得到提高，这些词的命中记录就沿着每个序列在两个方向延伸。对于核苷酸序列，使用参数M（一对配对残基的奖赏分值；总是>0）和N（错配残基的处罚分值；总是<0）计算累积的分值。对于氨基酸序列，使用一种评分矩阵来计算累积的分值。当累积的比对得分从它所达到的最大值降低了数量X，由于一个或多个负得分的残基比对使累积的得分降至0或0以下时，这些词的命中记录在每个方向的延伸停止，或者到达了各自序列的末端。BLAST算法参数W、T、和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序（对核苷酸序列来说）使用字长（W）为11、期望值（E）为10、阈值（cutoff）为100、M=5、N=-4、以及两个链的比较作为默认设置。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长（W）为3、期望值（E）为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认设置（参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989)）。
除了计算百分比序列同一性之外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计分析（参见例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993)）。由BLAST算法所提供的一种相似性的量度是最小和的概率（smallest sum probability）（P(N)），它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指标。例如，在一种测试核酸序列与一种参考序列的比较中，如果最小和的概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为该测试核酸序列与该参考序列是相似的。
用于进行序列比对的另一种被广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6（Thompson,et al.Nuc.Acids Res.,22:4673-4680,1994）。将匹配的碱基或氨基酸的数目除以碱基或氨基酸的总数目并乘以100，获得百分比同一性。例如，如果两个580个碱基对序列具有145个匹配的碱基，则它们会是25%相同的。如果两个进行比较的序列具有不同的长度，则将匹配的数目除以这两个长度中较短的一个。例如，如果在200个氨基酸的蛋白质与400个氨基酸的蛋白质之间存在100个匹配的氨基酸，则相对于较短的序列这两个蛋白质是50%相同的。如果该较短的序列在长度上小于150个碱基或50个氨基酸，则将匹配的数目除以150（对于核酸碱基而言）或50（对于氨基酸而言）并乘以100，获得百分比同一性。
两个核酸基本上相同的另一个指标是这两个分子在严格条件下彼此进行杂交。术语“与之特异地杂交”是指一个分子在严格条件下（当此序列存在于一种复杂混合物的（例如，总细胞的）DNA或RNA中时）仅与一个特定的核苷酸序列进行结合、形成双链、或杂交。“基本上结合”是指在一种探针核酸与一种靶核酸之间的互补性杂交，并且包括较少的错配，这些错配可通过将杂交介质的严格性降低而得到调节以实现所希望的靶核酸序列的检出。
在核酸杂交实验（例如Southern和Northern杂交）的背景中，“严格的杂交条件”和“严格的杂交洗涤条件”是序列(sequence)依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下进行特异地杂交。针对核酸杂交的广泛的指导发现于Tijssen(1993)Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probespart I chapter2"Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays"Elsevier,New York中。通常，在一个已限定的离子强度和PH值条件下，针对该特异序列选择严格性高的杂交和洗涤条件以便比该热熔点（Tm）低约5℃。典型地，在“严格的条件”下，探针将与其靶标子序列进行杂交，而不与其他序列杂交。
Tm是（在已限定的离子强度和PH值条件下）50%的该靶序列与完全匹配的探针进行杂交的温度。选择非常严格的条件以应对等价于特定探针的Tm。针对互补性核酸（这些互补性核酸在DNA印迹或RNA印迹的滤纸上具有多于100个互补的残基）的杂交的严格性的杂交条件的实例是50％甲酰胺与1mg肝素在42℃杂交过夜。严格性高的洗涤条件的实例是0.15MNaCl，在72℃下持续约15分钟。严格的洗涤条件的实例是0.2x SSC洗涤，在65℃下持续15分钟（对于SSC缓冲液的说明，参见，Sambrook，下文）。通常，低严格性洗涤在高严格性洗涤之前进行以消除背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双链体的实例性中等严格性洗涤是1x SSC，在45℃持续15分钟。对于（例如）多于100个核苷酸的双链体的实例性低严格洗涤是4-6x SSC，在40℃持续15分钟。对于短探针（例如大约10至50个核苷酸），严格的条件典型地涉及低于约1.0M Na离子的盐浓度，典型地为约0.01至1.0M Na离子浓度（或其他盐），pH7.0至8.3，并且温度典型地为至少约30℃。增加去稳定剂（例如甲酰胺）也能达到严格的条件。一般而言，2倍（或更高）于在特定的杂交测定中观察到的不相关的探针的信噪比，表明检测到特异的杂交。若它们编码的蛋白质基本上相同，则在严格的条件下彼此不杂交的核酸仍基本上相同。例如，当使用该遗传密码允许的最大程度的密码子简并而创造出核酸的拷贝时，发生该情况。
以下是杂交/洗涤条件的组的实例，这些条件可被用来克隆与本发明的参考核苷酸序列基本上相同的同源核苷酸序列：参考核苷酸序列优选地在7%十二烷基硫酸钠（SDS），0.5M NaPO4，1mM EDTA，50℃条件下杂交至该参考核苷酸序列，并在2X SSC，0.1%SDS，50℃条件下洗涤，更希望在7%十二烷基硫酸钠（SDS），0.5M NaPO4，1mM EDTA，50℃条件下杂交，并在1X SSC，0.1%SDS，50℃条件下洗涤，仍更希望在7%十二烷基硫酸钠（SDS），0.5M NaPO4,1mM EDTA，50℃条件下杂交，并在0.5X SSC，0.1%SDS，50℃条件下洗涤，优选地在7%十二烷基硫酸钠（SDS），0.5MNaPO4，1mM EDTA，50℃条件下杂交，并在0.1X SSC，0.1%SDS，50℃条件下洗涤，更优选地在7%十二烷基硫酸钠（SDS），0.5M NaPO4，1mMEDTA，50℃条件下杂交，并在0.1X SSC，0.1%SDS，65℃条件下洗涤。
两种核酸或蛋白质是基本上相同的另指标是由第一核酸所编码的蛋白质与由第二核酸所编码的蛋白质具有免疫交叉反应性或与其特性结合。因此，蛋白质典型地另蛋白质基本上相同，例如，其中这两种蛋白质仅由于保守性置换而不同。
“杀虫的”被定义为能够控制昆虫（优选是通过杀死它们）的毒性的生物活性。
当核酸序列编码了多肽，该多肽与由参考核酸序列所编码的多肽具有相同的氨基酸序列时，这种核苷酸序列与这种参考核酸序列“同类编码”（isocoding with）。
“分离的”核酸分子或分离的毒素是通过人工从其天然环境中分开而存在的核酸分子或毒素并因此不是自然的产物。分离的核酸分子或毒素可能以纯化的形式存在或可能存在于非天然的环境中，例如没有限制，重组的微生物细胞、植物细胞、植物组织或植物。
本发明的“经修饰的Cry3A毒素”或“Cry3A055”是指由Cry3A衍生的毒素，该毒素具有由靶标昆虫的肠蛋白质酶所识别的至少额外的蛋白质酶识别位点，该位点并不自然发生于Cry3A毒素中，如在美国专利7,030,295中所说明，该专利通过引用并入在此。
根据本发明的“经修饰的cry3A编码序列”可以衍生自天然的cry3A编码序列或从合成的cry3A编码序列，并且包括并非自然发生于未经修饰的cry3A基因中的至少额外的蛋白质酶识别位点的编码序列。
“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源中分离的单链或双链DNA或RNA的片段。在本发明的背景中，这种核酸分子典型地是DNA的片段。
“植物”是处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。
“植物细胞”是植物的结构和生理的单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可能是处于分离的单一细胞或培养的细胞的形式，或者是作为较高级的有机体的单位（例如，植物组织、植物器官、或整个植物）的一部分。
“植物细胞的培养物”是指植物单位的培养物，例如原生质体、细胞培养物的细胞、处于不同的发育阶段的植物组织、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子以及胚中的细胞。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的独特的、并且具有可见结构的、并且已分化的部分，如根、茎、叶、花、花芽、或胚。
如在此所使用的“植物组织”是指被组织成为结构和功能单位的多个植物细胞的组。原位转化（in planta）或培养的植物的任何组织都包括在内。这个术语包括（但不限于）整个植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织成为结构和/或功能单位的多个植物细胞的任何群。这个术语与如以上所列出的或被这个定义以其他方式包含的任何特定类型的植物组织结合使用或在其不存在的情况下使用并非旨在排除任何其他类型的植物组织。
“启动子”是编码区上游的非翻译DNA序列，它包含了针对RNA聚合酶的结合位点并启动该DNA的转录。启动子区域也可包括充当基因表达的调节物的多个其他的元件。
“调节元件”是指参与控制核苷酸序列的表达的序列。调节元件包括启动子（可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列上）以及多个终止信号。它们还典型地涵盖了该核苷酸序列的适当翻译所要求的序列。
“转化”是将异源核酸引至宿主细胞或生物体中的过程。具体而言，“转化”是指将DNA分子稳定地整合至感兴趣的生物体的基因组中。
“转化的/转基因的/重组的”是指已经引入异源核酸分子的宿主生物体，如细菌或植物。这种核酸分子能够被稳定地整合至该宿主的基因组中或者该核酸分子也能作为染色体外的分子而存在。这样染色体外的分子能够自动复制。转化的细胞、组织或者植物应当理解为不仅涵盖转化过程的最终产物，还涵盖其转基因的子代。“非转化的”、“非转基因的”，或“非重组的”宿主是指野生型生物体（例如，细菌或植物），它不包含异源核酸分子。
核苷酸是由其碱基通过以下标准缩写来表示：腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、以及鸟嘌呤（G）。氨基酸同样是由以下标准缩写来表示：丙氨酸（Ala；A）、精氨酸（Arg；R）、天冬酰胺（Asn；N）、天冬氨酸（Asp；D）、半胱氨酸（Cys；C）、谷氨酰胺（Gln；Q）、谷氨酸（Glu；E）、甘氨酸（Gly；G）、组氨酸（His；H）、异亮氨酸（Ile；I）、亮氨酸（Leu；L）、赖氨酸（Lys；K）、蛋氨酸（Met；M）、苯丙氨酸（Phe；F）、脯氨酸（Pro；P）、丝氨酸（Ser；S）、苏氨酸（Thr；T）、色氨酸（Trp；W）、酪氨酸（Tyr；Y）、以及缬氨酸（Val；V）。
说明
本发明涉及多种新颖的工程化的杂合杀虫蛋白质（eHIPS），所创造的蛋白质具有针对至少西方玉米根虫的活性，并且可进一步包括北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、和/或马铃薯甲虫。一些eHIP具有针对鳞翅目害虫、欧洲玉米螟的活性。通过将至少两种不同的Cry蛋白质的完整或部分的可变区以及保守区块的独特组合相融合并且可任选地包括在C端的来自Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域或N端的肽基片段或二者皆有而制得此类新颖的eHIP。例如，没有限制，通过将来自第一Cry蛋白质（具有鞘翅目昆虫活性）的完整或部分的可变区和保守区块与来自第二Cry蛋白质（具有鳞翅目昆虫活性且不同于该第一Cry蛋白质）的完整或部分的可变区和保守区块相组合，并且可任选地包括在C端的来自Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域或N端的肽基片段或二者皆有，创造出新的工程化的杂合杀虫蛋白质，这些蛋白质具有针对广泛的昆虫的活性（不同于第一或第二亲代Cry蛋白质或不同于这二者）。此类新颖的eHIP还可以包括来自经修饰的Cry3A蛋白质和Cry蛋白质（不同于该经修饰的Cry3A蛋白质）的完整或部分的可变区、保守区块或结构域。N端的肽基片段或原毒素尾部区域可以对该eHIP赋予了杀虫活性，可以使eHIP的杀虫活性提高使之超过没有该肽基片段或原毒素尾部区域的eHIP，和/或可能使该eHIP比没有该肽基片段或原毒素尾部区域的eHIP更加稳定，特别是针对至少西方玉米根虫。该肽基片段的氨基酸序列对于Bt Cry蛋白质典型地是异源的（即，并非衍生自Bt Cry蛋白质）。然而，基于在此所披露的教导，熟练的技术人员应当认识到N端的肽基片段可以使用源自Bt Cry蛋白质的氨基酸序列而产生。本发明的eHIP具有针对玉米根虫（特别是西方、北方以及墨西哥玉米根虫）的令人惊讶且出人意外的毒性。本发明还涉及多种核酸（它们的表达产生了eHIP），并涉及制造和使用eHIP以控制虫害的方法。这些核酸的表达所产生的eHIP可用来控制鞘翅目昆虫（如西方、北方或墨西哥玉米根虫）或用来控制鳞翅目昆虫（如欧洲玉米螟），特别是当表达于转基因植物（如转基因玉米植物）中时。
在一个实施方案中，本发明涵盖了工程化的杂合杀虫蛋白质，该杀虫蛋白质包括来自第一苏芸金芽胞杆菌（Bt）Cry蛋白质的氨基酸序列，该氨基酸序列包括该第一Cry蛋白质的完整或部分的可变区以及保守区块，这些可变区和保守区块与来自不同于该第一Bt Cry蛋白质的第二Bt Cry蛋白质的氨基酸序列相融合，该第二Bt Cry蛋白质的氨基酸序列包括该第二Cry蛋白质的完整或部分的可变区以及保守区块，并且该杀虫蛋白质可任选地包括：(a)位于C端的Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域；或(b)N端的肽基片段；或(a)和(b)二者，其中该eHIP具有针对至少西方玉米根虫活性。
在另一个实施方案中，本发明涵盖了eHIP，该eHIP包括第一苏芸金芽胞杆菌（Bt）Cry蛋白质的N端区域，该N端区域与不同于该第一Bt Cry蛋白质的第二Bt Cry的C端区域相融合，其中在该第一和第二Bt Cry蛋白质之间的至少一个交换位置是位于保守区块2、保守区块3、可变区4或保守区块4之中，并且该eHIP可任选地包括：(a)位于C端的Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域；或(b)N端的肽基片段；或(a)和(b)二者，其中该eHIP具有针对至少西方玉米根虫的杀虫活性。
在另一个实施方案中，根据本发明的eHIP从N端至C端包括与第二Bt Cry蛋白质的保守区块3、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6的C端部分相融合的第一Bt Cry蛋白质的的可变区1或可变区1的C端部分、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端部分。
在另一个实施方案中，本发明的eHIP包括在来自该第一Bt Cry蛋白质的氨基酸序列与来自该第二Bt Cry蛋白质的氨基酸序列之间的至少两个交换位置。在一个实施方案中，第一交换位置位于保守区块2，而第二交换位置位于保守区块3。在另一个实施方案中，第一交换位置位于保守区块3，而第二交换位置位于保守区块4。
在另一个实施方案中，本发明的eHIP包括在C端的Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域。该原毒素尾部区域可以对该eHIP赋予了杀虫活性（是指没有该原毒素尾部区域，该eHIP将不会有活性），可以将eHIP的活性提高使之超过没有该原毒素尾部区域的eHIP，或可以使该eHIP比没有原毒素尾部区域的eHIP更加稳定。在实施方案中，该原毒素尾部区域是来自具有鞘翅目昆虫活性的Bt Cry蛋白质。在另一个实施方案中，该原毒素尾部区域是来自Cry1A蛋白质。在又另一个实施方案中，该原毒素尾部区域是来自Cry1Aa或Cry1Ab蛋白质。本发明的原毒素尾部区域可以包括Bt Cry蛋白质的整个原毒素尾部区域或其任何片段。在这个实施方案的方面，eHIP的原毒素尾部区域包括来自Cry1Ab蛋白质的原毒素尾部区域的N端的至少38个氨基酸。在这个实施方案的另一个方面，该原毒素尾部区域包括对应于SEQ IDNO:72的氨基酸611至648的氨基酸序列。在这个实施方案的又另一个方面，该原毒素尾部区域包括SEQ ID NO:72的氨基酸611至648。
在又另一个实施方案中，eHIP包括N端的肽基片段。该N端的肽基片段可以对该eHIP赋予了杀虫活性（表示没有该N端肽基片段，该蛋白质不具有杀虫活性），或该N端的肽基片段可以将eHIP的杀虫活性提高使之超过没有该N端的肽基片段的eHIP，或该N端的肽基片段可以使该eHIP比没有N端的肽基片段的eHIP更加稳定。在这个实施方案的方面，该肽基片段包括氨基酸序列，该氨基酸序列对于Bt Cry蛋白质典型地是异源的（即，并非衍生自Bt Cry蛋白质）。在这个实施方案的另一个方面，该N端的肽基片段包括至少9个氨基酸。在这个实施方案的又另一个方面，该肽基片段包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、70、80、90或100个氨基酸。在这个实施方案的另一个方面，该肽基片段包括大于100个氨基酸。在这个实施方案的又另一个方面，该N端的肽基片段包括氨基酸序列YDGRQQHRG（SEQ ID NO:133）或TSNGRQCAGIRP（SEQ ID NO:134）。在这个实施方案的又另一个方面，该N端的肽基片段包括氨基酸序列，该氨基酸序列是选自下组：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、以及SEQ ID NO:132。
在又另一个实施方案中，使用针对多种鞘翅目昆虫具有活性的第一Cry蛋白质的多个可变区和保守区块联合针对鳞翅目昆虫具有活性的第二Cry蛋白质的可变区和保守区块来制造本发明的eHIP。具有鞘翅目昆虫活性的Cry蛋白质包括但不限于Cry3、Cry7、Cry8、以及Cry34/Cry35。鳞翅目昆虫活性的Cry蛋白质包括但不限于Cry1以及Cry9。在这个实施方案的方面，该第一Cry蛋白质是Cry3A，而该第二Cry蛋白质是Cry1A。在另一方面，该Cry3A蛋白质可以用经修饰的Cry3A（例如没有限制，在美国专利5,659,123中所披露的Cry3A055蛋白质，该专利通过引用并入在此）替换。在这个实施方案的又另一个方面，该Cry3A蛋白质是Cry3Aa，而该Cry1A蛋白质是Cry1Aa或Cry1Ab。在这个实施方案的另一方面，该Cry3Aa是选自下组并且具有标出的Genbank登录号：Cry3Aa1(M22472)、Cry3Aa2(J02978)、Cry3Aa3(Y00420)、Cry3Aa4(M30503)、Cry3Aa5(M37207)、Cry3Aa6(U10985)、Cry3Aa7(AJ237900)、Cry3Aa8(AAS79487)、Cry3Aa9(AAW05659)、Cry3Aa10(AAU29411)、以及Cry3Aa11(AY882576)。在这个实施方案的另一方面，该Cry1Aa是选自下组并且具有标出的Genbank登录号：Cry1Aa1(M11250)、Cry1Aa2(M10917)、Cry1Aa3(D00348)、Cry1Aa4(X13535)、Cry1Aa5(D17518)、Cry1Aa6(U43605)、Cry1Aa7(AF081790)、Cry1Aa8(I26149)、Cry1Aa9(AB026261)、Cry1Aa10(AF154676)、Cry1Aa11(Y09663)、Cry1Aa12(AF384211)、Cry1Aa13(AF510713)、Cry1Aa14(AY197341)、以及Cry1Aa15(DQ062690)。在这个实施方案的又另一方面，该Cry1Ab是选自下组并且具有标出的Genbank登录号：Cry1Ab1(M13898)、Cry1Ab2(M12661)、Cry1Ab3(M15271)、Cry1Ab4(D00117)、Cry1Ab5(X04698)、Cry1Ab6(M37263)、Cry1Ab7(X13233)、Cry1Ab8(M16463)、Cry1Ab9(X54939)、Cry1Ab10(A29125)、Cry1Ab11(I12419)、Cry1Ab12(AF059670)、Cry1Ab13(AF254640)、Cry1Ab14(U94191)、Cry1Ab15(AF358861),Cry1Ab16(AF37560)、Cry1Ab17(AAT46415)、Cry1Ab18(AAQ88259)、Cry1Ab19(AY847289)、Cry1Ab20(DQ241675)、Cry1Ab21(EF683163)、以及Cry1Ab22(ABW87320)。在这个实施方案的又另一方面，该第一Cry蛋白质包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自下组：SEQID NO:68、SEQ ID NO:70、以及SEQ ID NO:135，而该第二Cry蛋白质包括在SEQ ID NO:72给出的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涵盖了本发明的eHIP，该eHIP包括在该第一Cry蛋白质的N端区域与该第二Cry蛋白质的C端区域之间的至少一个交换位置，该交换位置位于保守区块3、可变区4、或保守区块4之中。在这个实施方案的一方面，在保守区块3之中的交换位置位于直接跟随着氨基酸，该氨基酸对应于SEQ ID NO:70的Ser451、Phe454、或Leu468。在这个实施方案的另一方面，该交换位置位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着SEQ ID NO:70的Ser451、Phe454、或Leu468，或者SEQ ID NO:68的Ser450、Phe453、或Leu467；或者SEQ ID NO:135的Ser497、Phe100、Leu114。在根据本发明的某些Cry3A/Cry1Ab eHIP实施方案或经修改的Cry3A/Cry1Ab eHIP实施方案中的交换位置在图2上标明，图2标明了百分比同一性。
在另一个实施方案中，本发明的eHIP包括在来自第一Bt Cry蛋白质的氨基酸序列与来自该第二Bt Cry蛋白质的氨基酸序列之间的至少两个交换位置。在这个实施方案的一方面，在Cry3A或经修饰的Cry3A与Cry1Ab或Cry1Aa之间的交换位置是位于保守区块2之中，该保守区块2直接跟随着与SEQ ID NO:70的Asp232相对应的氨基酸；并且在Cry1Ab与Cry3A或经修饰的Cry3A之间的第二交换位置是位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着与SEQ ID NO:72的Leu476相对应的氨基酸。在这个实施方案的另一方面，在Cry3A或经修饰的Cry3A与Cry1Ab或Cry1Aa之间的交换位置是位于保守区块2之中，该保守区块2直接跟随着SEQ ID NO:70的Asp232、或SEQ ID NO:68的Asp231、或SEQ ID NO:135的Asp278；并且在Cry1Ab与Cry3A或经修饰的Cry3A之间的第二交换位置是位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着SEQ ID NO:72的Leu476。
在这个实施方案的又另一方面，在Cry3A或经修饰的Cry3A与Cry1Ab之间的第一交换位置是位于保守区块3之中，该保守区3直接跟随着与SEQID NO:70的Leu468相对应的氨基酸，并且在Cry1Ab与Cry3A或经修饰的Cry3A之间的第二交换位置是位于保守区块4之中，该保守区4直接跟随着与SEQ ID NO:72的Ile527相对应的氨基酸。在这个实施方案的另一方面，在Cry3A或经修饰的Cry3Aa与Cry1Ab之间的第一交换位置是位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着SEQ ID NO:70的Leu468、或SEQ ID NO:68的Leu467、或SEQ ID NO:135的Leu114，并且在Cry1Ab与Cry3A或经修饰的Cry3A之间的第二交换位置是位于保守区块4之中，该保守区块4直接跟随着SEQ ID NO:72的Ile527。在这个实施方案的另一个方面，该eHIP包括SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明涵盖了eHIP，其中该第一Cry蛋白质是Cry3A或经修饰的Cry3A，并且该第二Cry蛋白质是Cry1Aa或Cry1Ab，并且其中该eHIP包括与SEQ OD NO:64具有至少80%同一性的氨基酸序列。在另一实施方案中，该eHIP包括氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:64具有至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性。本发明的某些eHIP实施方案与SEQ ID NO:64的比对示于图2中，图2标明了百分比同一性。
在另一个实施方案中，本发明涵盖了eHIP，其中该第一Cry蛋白质是Cry3A或经修饰的Cry3A，并且该第二Cry蛋白质是Cry1Aa或Cry1Ab，并且其中该eHIP包括与SEQ OD NO:70具有至少75%同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该eHIP包括氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:70具有至少76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性。本发明的某些eHIP实施方案与SEQ ID NO:70的比对示于图1中，图1标明了百分比同一性。
在另一个实施方案中，本发明涵盖了eHIP，该eHIP在保守区块2中在Cry3A或经修饰的Cry3A与Cry1Aa或Cry1Ab之间具有第一交换位置，并且在保守区块3中在Cry1Aa或Cry1Ab与Cry3A或经修饰的Cry3A之间具有第二交换位置，并且其中该eHIP包括与SEQ OD NO:64具有至少56%同一性的氨基酸序列。在这个实施方案的一方面，该eHIP与SEQ OD NO:64具有至少60、70、或80%的同一性。在这个实施方案的另一方面，该eHIP与SEQ ID NO:64具有至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性。
在另一个实施方案中，本发明涵盖了eHIP，该eHIP包括氨基酸序列，该氨基酸序列是选自下组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQID NO:62;SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159以及SEQ ID NO:160。
在一个实施方案中，本发明的eHIP具有针对其他虫害的活性，这些虫害包括但不限于北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、马铃薯甲虫、和/或欧洲玉米螟。
在另一个实施方式中，本发明涵盖了核酸分子，该核酸分子含有对本发明的eHIP进行编码的核苷酸序列。在这个实施方案的方面，该核酸分子包括核苷酸序列，该核苷酸序列是选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQID NO:33、SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154以及SEQ ID NO:158。制造对eHIP进行编码的核酸分子的方法的具体的示范性传授内容可以发现于实例1至41中。本领域的普通技术人员应当认识到可以对由本发明所涵盖的制造多种eHIP的示范性方法进行改变。
本发明进一步涵盖了包含这些核酸分子的表达盒、以及包含本发明的表达盒的重组载体以及转基因的非人的宿主细胞，例如细菌细胞或植物细胞。
本发明还涵盖了包含本发明的核酸的重组载体。在此类载体中，这些核酸优选地包含于表达盒中，这些表达盒包含用于在能够表达这些核苷酸序列的宿主细胞中表达核苷酸序列的调节元件。此类调节元件通常包含启动子和终止信号并且优选地还包括一些元件，这些元件允许由本发明的核酸所编码的多肽的有效的翻译。包含核酸的载体可以在特定的宿主细胞中复制（优选是作为染色体外的分子）并因此可用来再这些宿主细胞中扩增本发明的核酸。在一个实施方案中，此外载体的宿主细胞是微生物，例如细菌，特别是苏芸金芽胞杆菌或大肠杆菌。在另一个实施方案中，此外重组载体的宿主细胞是内生植物或附生植物。在另一个实施方案中，此类载体是病毒载体并被用于在特定的宿主细胞（例如昆虫细胞或植物细胞）中复制核苷酸序列。重组载体也用于将本发明的核苷酸序列转化到宿主细胞中，由此这些核苷酸序列被稳定整合至一种转基因宿主的DNA中。在一个实施方案中，该转基因宿主是植物，例如玉米植物。
本发明的eHIP当在生物测定中进行针对虫害的测验时具有昆虫控制活性。在一个实施方案中，本发明的eHIP对鞘翅目昆虫或鳞翅目昆虫或二者是具有活性的。在这个实施方案的一方面，本发明的eHIP对西方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫和/或马铃薯甲虫是具有活性的。在这个实施方案的另一个方面，本发明的eHIP对欧洲玉米螟具是活性的。本发明的eHIP的昆虫控制特性进一步展示在实例43、45、以及46中。
本发明还涵盖了一种组合物，该组合物包含有效的昆虫控制量的根据本发明的eHIP。
在另一个实施方案中，本发明涵盖了产生针对昆虫具有活性的eHIP的方法，包括：(a)获得包含基因的宿主细胞，该基因本身包含与本发明的核酸分子可操作地连接的异源启动子序列；以及(b)使该转基因宿主细胞生长，其方式为以此表达对昆虫具有活性的eHIP。
在另一个实施方案中，本发明涵盖了产生抵抗昆虫的转基因植物的方法，包括将本发明的核酸分子引入该转基因植物中，其中该核酸分子造成eHIP在该转基因植物中以有效控制昆虫的量进行表达。在这个实施方案的一方面，这些昆虫是鞘翅目昆虫或鳞翅目昆虫。在这个实施方案的一方面，这些鞘翅目昆虫是西方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫和/或马铃薯甲虫。在这个实施方案的另一方面，这些鳞翅目昆虫是欧洲玉米螟。
在又另一个实施方案中，本发明涵盖了控制昆虫的方法，包括将有效量的本发明的eHIP递送给昆虫。在这个实施方案的一方面，这些昆虫是鞘翅目昆虫或鳞翅目昆虫。在这个实施方案的一方面，这些鞘翅目昆虫是西方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫和/或马铃薯甲虫。在这个实施方案的又另一方面，这些鳞翅目昆虫是欧洲玉米螟。典型地，该eHIP通过口服递送给昆虫。在一方面，该eHIP通过转基因植物进行口服递送，该转基因植物包含表达了本发明的eHIP的核酸序列。
本发明进一步涵盖了控制昆虫的方法，其中该转基因植物进一步包含对第二杀虫成分进行编码的第二核酸分子或多组核酸分子。此类第二核酸的实例是那些编码了Bt Cry蛋白质的核酸、那些编码了营养期杀虫蛋白质的核酸（分别披露于美国专利5,849,870以及5,877,012中，均通过引用并入在此）、或那些针对非蛋白质成分的生产的途径进行编码的核酸。
本发明还涵盖了制造工程化的杂合杀虫蛋白质（eHIP）的方法，包括：(a)获得第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质；(b)获得不同于该第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质的第二Bt Cry蛋白质；(c)将该第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质的多个完整或部分的可变区以及保守区块与该第二Bt Cry蛋白质的多个完整或部分的可变区以及保守区块相组合以制造具有针对至少西方玉米根虫活性的eHIP；以及可任选地(d)在eHIP的N端插入肽基片段或在eHIP的C端插入Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域，或二者皆有，其中该N端的肽基片段或该C端的原毒素区域或这二者均对eHIP赋予了活性或将该eHIP的杀虫活性提高或使该eHIP比没有该肽基片段或原毒素尾部区域或二者的eHIP更加稳定。
在另一个实施方案中，本发明涵盖了制造工程化的杂合杀虫蛋白质（eHIP）的方法，包括：(a)获得对第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质进行编码的第一核酸以及对不同于该第一Bt Cry蛋白质或经修饰的BtCry蛋白质的第二Cry蛋白质进行编码的第二核酸；(b)从该第一以及第二核酸中分离出核苷酸序列，该核苷酸序列编码了该第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质以及该第二Bt Cry蛋白质的多个完整或部分的可变区以及保守区块；(c)将步骤(b)中得到的这些分离的核酸以制造对蛋白质进行编码的新的杂合核酸的方式连接在一起，并且可任选地将编码肽基片段的核酸与所述杂合核酸的5'端相融合从而导致5'延伸或将编码Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域的核酸与所述杂合核酸的3'端相融合从而导致3'延伸，或二者并举；(d)将具有或不具有5'或3'延伸中的或二者皆有的杂合核酸插入表达盒中；(e)将该表达盒转化至宿主细胞中，得到所述产生eHIP的宿主细胞；以及(f)针对至少西方玉米根虫的eHIP进行生物测定，得到针对西方玉米根虫的杀虫活性。
在本发明的方法的另外的实施方案中，该第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质是Cry3A或经修饰的Cry3A，并且该第二Bt Cry蛋白质是Cry1Aa或Cry1Ab。
在本发明的方法的另一个实施方案中，该N端肽基片段包括9个氨基酸。在这个实施方案的一方面，该N端的肽基片段包括氨基酸序列YDGRQQHRG（SEQ ID NO:132）或氨基酸序列TSNGRQCAGIRP（SEQ IDNO:133）。在这个实施方案的另一方面，该N端的肽基片段是选自下组：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQID NO:130、SEQ ID NO:131、以及SEQ ID NO:132。
在本发明的方法的另一个实施方案中，该原毒素尾部区域来自Cry1Aa或Cry1Ab。在这个实施方案的一方面，该原毒素尾部区域包含至少38个氨基酸。在本发明的另一方面，该原毒素尾部区域包括对应于SEQ ID NO:72的氨基酸611至648的氨基酸序列。在这个实施方案的又另一个方面，该原毒素尾部区域包括SEQ ID NO:72的氨基酸611至648。
制造本发明的杂合核酸以及eHIP的方法的具体示范性的传授内容可以发现于实例1至41中。
在另外的实施方案中，通过将随机突变结合至已知的技术（如体外重组或DNA改组）中，可对本发明的核苷酸序列（特别是对肽基片段进行编码的序列）、原毒素尾、和/或保守区块2、3、以及4进行进一步修饰。这项技术说明于Stemmer et al.,Nature370:389-391(1994)以及美国专利5,605,793中，二者均通过引用并入在此。核苷酸序列的数以百万计的突变体拷贝是基于本发明的最初的核苷酸序列而产生的，并且对具有经改善的特性（例如提高的杀虫活性、增强的稳定性、或不同的特异性）或靶害虫的范围的变异体进行回收。该方法涵盖了从包含本发明的核苷酸序列的模板双链多核苷酸形成诱变的双链多核苷酸，其中该模板双链多核苷酸已经被剪切成具有希望的大小的多个双链随机片段；并且包括以下步骤：将一个或多个单链或双链的寡核苷酸添加至得到的双链随机片段的群体中，其中所述的寡核苷酸包含针对该双链模板多核苷酸的具有同一性的区域以及具有异质性的区域；使得到的双链随机片段与寡核苷酸的混合物变性成单链片段；在导致所述单链片段在所述同一性的区域进行退火以形成多个退火片段对的条件下用聚合酶对得到的多个单链片段的群体进行孵育，所述同一性的区域足以使片段对中的一员引导另一个成员进行复制，由此形成诱变的双链多核苷酸；并且将第二和第三个步骤再重复至少两个循环，其中在另一个循环的第二个步骤中得到的混合物包括来自前面的循环的第三个步骤的经诱变的双链多核苷酸，并且该另外的循环形成了另外的经诱变的双链多核苷酸。在一个优选的实施方案中，在多个双链随机片段的群体中的一个单一种类的双链随机片段的浓度按总DNA的重量计小于1%。在另一个优选的实施方案中，该模板双链多核苷酸包含至少约100个种类的多核苷酸。在另一个优选的实施方案中，该双链随机片段的大小是从约5bp至5kb。在另一个优选的实施方案中，该方法的第四个步骤包括将第二和第三个步骤重复至少10个循环。
作为生物性昆虫控制剂，这些eHIP是通过在能够表达这些核酸的异源宿主细胞中对这些核酸进行表达而生产的。在一个实施方案中，制造了包含本发明的核酸的苏芸金芽孢杆菌细胞。此类修饰涵盖了存在的调节元件的突变或缺失，因此导致该核酸的表达改变，或加入了控制该核酸表达的新的调节元件。在另一个实施方案中，通过插入至染色体中或通过引入包含这些核酸的染色体外复制的分子而将一种或多种核酸的多个额外的拷贝加至苏金芸芽孢杆菌细胞中。
在另一个实施方案中，将本发明的核酸中的至少一个插入适当的表达盒中（包含启动子以及终止信号）。该核酸的表达是组成型的，或使用响应于各种类型的起始转录的刺激的诱导型启动子。在另一实施方案中，其中表达了eHIP的细胞是微生物，如病毒、细菌或真菌。在又另一个实施方案中，病毒（如杆状病毒）在其基因组中包含本发明的核酸并且在感染了适当的真核细胞（适宜于病毒复制以及该核酸的表达）之后表达了大量相应的杀虫蛋白质。将由此产生的杀虫蛋白质作为杀虫剂来使用。可替代地，被工程化以包含该核酸的杆状病毒被用来体内感染昆虫并通过该杀虫毒素的表达或通过病毒感染与该杀虫毒素的表达的组合而将其杀死。
细菌细胞也是用于表达本发明的核酸的宿主。在实施方案中，使用了能够在植物组织内生活并复制的非致病的共生细菌（所谓的内生植物），或能够定居在叶际或根际的非致病的共生细菌（所谓的附生植物）。此类细菌包括以下属的细菌：农杆菌属（Agrobacterium）、产碱菌属(Alcaligenes)、固氮螺菌属(Azospirillum),固氮菌属(Azotobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒形杆菌属(Clavibacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flavobacter)、克雷白氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、Serratia(沙雷氏菌属)，链霉菌属(Streptomyces)、以及黄单胞菌属(Xanthomonas)。共生的真菌（例如木霉属(Trichoderma)以及胶枝霉属(Gliocladium)）也是为了相同目的表达本发明的核酸的可能的宿主。
这些基因操作技术对于不同的可供使用的宿主而言是特异性的并且在本领域中是已知的。例如，表达载体pKK223-3以及pKK223-2可以用来在大肠杆菌中（转录融合或翻译融合中）在tac或trc启动子之后表达异源基因。为了表达对多个ORF进行编码的操纵子，最简单的操作是在转录融合中将该操纵子插至载体（如pKK223-3）中，允许对该异源基因的同族核糖体结合位点进行利用。在革兰氏阳性的物种（如芽孢杆菌属）中的过量表达技术在本领域中也是已知的，并且可在本发明的背景中使用（Quax et al.In:Industrial Microorganisms:Basic and Applied Molecular Genetics,Eds.Baltzet al.,American Society for Microbiology,Washington(1993)）。用于过量表达的替代性系统依赖（例如）酵母载体，并包括毕赤酵母属、酵母属、以及克鲁维酵母属的使用（Sreekrishna,In:Industrial microorganisms:basic and appliedmolecular genetics,Baltz,Hegeman,and Skatrud eds.,American Society forMicrobiology,Washington(1993)；Dequin&Barre,Biotechnology L2:173-177(1994)；van den Berg et al.,Biotechnology8:135-139(1990)）。
在一种实施方案中，本发明的这些eHIP的至少一种表达于较高级的生物（如植物）中。在这种情况中，表达了有效量的eHIP的转基因植物保护其自身远离虫害。当昆虫开始摄取这种转基因植物时，它也摄入了该已表达的eHIP。这将妨碍昆虫对植物组织进行进一步咬食或者甚至可以伤害或杀死昆虫。将本发明的核酸插入表达盒中，然后该核酸可以被稳定地整合在该植物的基因组中。在另一个实施方案中，该核酸包含在非致病的自我复制的病毒中。根据本发明所转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于：玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣（chicory）、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋(asparagus)、洋葱、大蒜、胡椒（pepper）、芹菜、小南瓜（squash）、大南瓜（pumpkin）、大麻、西葫芦(zucchini)、苹果、梨、榅桲(quince)、甜瓜(melon)、李子（plum）、樱桃、桃、油桃(nectarine)、杏、草莓、葡萄、覆盆子(raspberry)、黑莓、菠萝、鳄梨(avocado)、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥属，以及木本植物，如针叶树(coniferous)以及落叶树(deciduous)。
一旦将所希望的核酸转化至特定的植物物种中，它可以在那个物种中进行增殖或者使用传统的育种技术将其移至同一物种的其他品种中（特别是包括商品化的品种）。
本发明的一种核酸被优选地表达于转基因植物中，因此引起相应的eHIP在该转基因植物中的生物合成。通过这种方式，产生了具有增强抵抗昆虫（特别是玉米根虫）的转基因植物。为了其在转基因植物中的表达，本发明的这些核酸可需要其他的修饰和优化。尽管在许多情况中来自微生物有机体的基因可以在植物中以高水平被表达，没有修饰，但在转基因植物中的低表达可能是由于具有在植物中不优先的密码子的微生物核酸所造成的。在本领域中已知的是，所有生物体具有针对密码子使用的特定偏爱，并且可以对在本发明中所说明的这些核酸的密码子进行变化以符合植物的偏爱，同时保持由此所编码的氨基酸。此外，从以下编码序列最好地达到了在植物中的高表达：具有至少约35%的GC含量，优选地大于约45%、更优选地大于约50%，并且最优选地大于约60%。具有低GC含量的微生物核酸可能在植物中表达欠佳，这是由于存在可使信息不稳定的ATTTA基序，以及可能引起不适当的聚腺苷酸化作用的AATAAA基序。尽管优选的基因序列可以被适当地表达于单子叶和双子叶的植物物种之中，可以对序列进行修饰以解释单子叶植物或双子叶植物的特定的密码子偏爱和GC含量偏爱，因为这些偏爱已经被证明是不同的（Murray et al.Nucl.Acids Res.17:477-498(1989)）。此外，针对可能引起信息缩短的非法剪接位点（illegitimate splice site）的存在对这些核酸筛选。使用熟知的位点定向诱变、PCR、以及合成基因的构建，使用说明于公开的专利申请EP0 385 962、EP0 359 472、以及WO93/07278中的方法，对在这些核酸之内所有需要做出的变化（如以上所说明的那些变化）进行改变。
在本发明的一个实施方案中，一种eHIP编码序列和/或一种亲本Bt Cry蛋白质编码序列是根据在美国专利5,625,136（通过引用结合在此）中所披露的操作进行制造的。在这个操作中，使用了玉米偏爱的密码子，即对玉米中的氨基酸进行最频繁地编码的单一密码子。针对一种特定的氨基酸的玉米偏爱的密码子可源自（例如）来自玉米的已知基因序列。针对来自玉米植物的28个基因的玉米密码子使用发现于Murray et al.,Nucleic Acids Research17:477-498(1989)中，其披露内容通过引用并入在此。
按照这种方式，为了在任何植物中进行表达可以对这些核苷酸序列进行优化。认识到的是该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用合成的或部分优化的序列。
为了有效的翻译起始，与起始的甲硫氨酸相邻的序列可能需要修饰。例如，它们可以通过包含已知在植物中有效的序列而被修饰。Joshi已经提出了针对植物的一种合适的共有序列（NAR15:6643-6653(1987)），并且Clonetech提出了又一个共有翻译起始子（1993/1994目录，210页）。这些共有序列适宜于本发明的核酸一起使用。将这些序列加至包含核酸的构建体中，达到ATG并且包括ATG（而未对第二个氨基酸进行修饰），或者可替代地达到ATG后的GTC并且包括ATG后的GTC（具有修饰该转基因的第二个氨基酸的可能性）。
在转基因植物中这些核酸的表达是由在植物中发挥作用的启动子所推动的。启动子的选择将依赖表达的时间和空间需要而变化，并且还依赖目标种而变化。因此，本发明的核酸在叶、柄（stalk）或茎（stem）、穗、花序（例如穗状花序、圆锥花序、穗轴、等等）、根、和/或籽苗中的表达是优选的。然而在许多情况中，寻求针对多于一种类型虫害的保护，并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。尽管已经显示来自双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，对理想的双子叶植物的启动子进行选择用于在双子叶植物中的表达，并且对单子叶植物的启动子进行选择用于在单子叶植物中的表达。然而，对所选择的启动子的来源并没有限制，它们在推动核酸在所希望的细胞中的表达中是操作的，这就足够了。
在一个实施方案中，使用了被组成型表达的启动子，包括肌动蛋白质或泛素或cmp启动子或CaMV35S以及19S启动子。本发明的核酸也可以在用化学方法进行调节的启动子的调节下得到表达。这使得eHIP仅在用诱导的化学品对作物处理时被合成。用于基因表达的化学诱导的优选的技术详述于公开申请EP0332104（授予Ciba-Geigy）以及美国专利5,614,395中。用于化学诱导的一种优选的启动子是烟草PR-1a启动子。
在另一个实施方案中，可使用一类创伤可诱导的启动子。已经说明了数量众多的在创伤部位并且还在植物病原菌感染的部位进行表达的启动子。理想的是，这种启动子在感染的部位应该仅有局部活性，并且按照这种方式这些eHIP仅在需要合成这些eHIP的细胞中积累以杀死入侵的虫害。优选的这类启动子包括由Stanford et al.Mol.Gen.Genet.215:200-208(1989)、Xu et al.Plant Molec.Biol.22:573-588(1993)、Logemann et al.Plant Cell1:151-158(1989)、Rohrmeier&Lehle,Plant Molec.Biol.22:783-792(1993)、Firek et al.Plant Molec.Biol.22:129-142(1993)、以及Warner et al.Plant J.3:191-201(1993)所说明的启动子。
用于在植物（特别是玉米）中表达对eHIP进行编码的基因的组织特异性的或组织优选的启动子是那些直接在根、髓、叶或花粉（特别是根）中表达的启动子。此类启动子（例如从PEPC或trpA中分离的启动子）披露于美国专利号5,625,136中、或MTL，披露于美国专利号5,466,785中。这两个美国专利均以全文通过引用并入在此。
另外的实施方案是以创伤可诱导的方式或病原体感染可诱导的方式表达核酸的转基因植物。
除了启动子外，使用本发明的eHIP基因，各种转录终止子可供在杂合核酸构建中使用。转录终止子负责在该转基因及其正确的聚腺苷酸化之外的转录的终止。适当的转录终止子是那些已知在植物中发挥作用的转录终止子，包括CaMV35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶（NOS）终止子、豌豆rbcS E9终止子、以及本领域中已知的其他启动子。这些启动子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。任何已知在植物中发挥功能的可供使用的终止子均可以在本发明的背景中使用。
可以将数量众多的其他序列加入本发明中所说明的表达盒中。这些序列包括已经显示出增强表达的序列，如内含子序列（例如，来自Adhl和bronzel）以及病毒的前导序列（例如，来自TMV、MCMV、以及AMV）。
本发明的核酸在植物中针对不同的细胞定位的靶向表达可能是更优选的。在某些情况中，在胞质溶胶中的定位可能是令人希望的，而在其他情况中，在某个亚细胞器中的定位可能是优选的。使用本领域内熟知的技术进行对转基因进行编码的酶类的亚细胞定位。典型地，处理了对来自已知的细胞器靶向的基因产物的靶肽进行编码的DNA并将其融合在该核酸的上游。许多此类靶序列对于叶绿体是已知的并且它们在异源的构建体中的功能已经得到证明。还将本发明的核酸的表达靶向至宿主细胞的内质网或液泡。实现这个目的的技术在本领域中是熟知的。
适宜于植物转化的载体说明于在本说明书的其他地方。对于农杆菌介导的转化而言，这些二元载体或携带至少一个T-DNA边界序列的载体是适宜的，而对于直接的基因转移而言，任何一种载体是适宜的并且仅包含所感兴趣的构建体的线性DNA可能是优选的。在直接的基因转移的情况中，可以使用以单以DNA种类的转化或共转化（Schocher et al.Biotechnology4:1093-1096(1986)）。对于直接的基因转移和农杆菌介导的转移而言，通常（但不是必须的）用可提供对抗生素（卡那霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤）或除草剂（basta）抵抗的选择性的标记进行转化。包含本发明的eHIP基因的植物转化载体还可以包含提供转基因植物的阳性选择的基因（例如磷酸甘露糖异构酶；PMI），如在美国专利5,767,378以及5,994,629中所披露，通过应用结合在此。然而，选择性标记的选择对本发明不是至关重要的。
在另一个实施方案中，本发明的核酸被直接转化进入质体基因组中。质体转化的一个主要优点是质体普遍能够表达细菌的基因而无需实质性密码子优化，并且质体能够在单一启动子的控制下表达多个开放阅读框。质体转化技术被集中说明于美国专利号5,451,513、5,545,817、以及5,545,818中，在PCT申请号WO95/16783中，以及在McBride et al.(1994)Proc.Nati.Acad.Sci.USA91,7301-7305中。叶绿体转化的基本技术涉及将位于选择性标记侧翼的经克隆的质体DNA的区域与感兴趣的基因一起引入至适宜的靶组织中，例如使用生物射弹或原生质体转化（例如，氯化钙或PEG介导的转化）。这些1至1.5kb的侧翼区（被命名为靶序列）促进了带有质体基因组的同源重组，并因此允许该原质体系的特定区域的替代或修饰。最初，赋予大观霉素和/或链霉素抵抗的叶绿体16S rRNA以及rps12基因中的点突变被用作转化用的选择性标记物（Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.,and Maliga,P.(1990)Proc.Nati.Acad.Sci.USA87,8526-8530;Staub,J.M.,and Maliga,P.(1992)PlantCell4,39-45）。这以对靶叶的大约每100次轰击一次的频率产生了稳定的同质转化体。在这些标记之间克隆位点的存在允许创造出一种用于引入外源基因的质体靶向载体（Staub,J.M.,and Maliga,P.(1993)EMBO J.12,601-606）。转化效率的实质性增加是通过用一种显性的选择性标记物（对大观霉素-cletoxifying酶氨基糖
3'-腺苷转移酶进行编码的细菌aadA基因）替换隐性的rRNA或r蛋白质抗生素抵抗的基因而获得的（Svab,Z.,and Maliga,P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,913-917）。以前，已经将这种标记物成功地用于绿藻类质体的基因组的高频率转化中（Goldschmidt-Clermont,M.(1991)Nucl.Acids Res.19:4083-4089）。对质体转化有用的其他的选择性标记物在本领域内是已知的并且涵盖于本发明的范围之内。典型地，在转化之后需要大约15至20个细胞分裂周期以达到同质体的状态。质体表达（其中基因是通过同源重组被插入至在每个植物细胞中存在的环状质体基因组的数千拷贝中的所有拷贝中）利用了超过对核进行表达的基因的巨大的拷贝数的优势，以允许能够容易超过总的可溶性植物蛋白质的10%的表达水平。在一个优选的实施方案中，将本发明的核酸插入至质体靶向的载体中并且转化至所希望的植物宿主的质体基因组中。获得了包含本发明的核酸的对质体基因组同型的植物，并且这些植物优选地能够对该核酸进行高表达。
本发明的eHIP可以与其他杀虫成分（例如Bt Cry蛋白质）组合使用以增加害虫的靶范围。此外，本发明的eHIP与经修饰的Cry3A毒素、Bt Cry蛋白质、或其他CRW活性成分（如RNAi）相组合进行使用（它们具有不同的作用方式或靶向昆虫肠道中一种不同的受体）对于预防和/或控制玉米根虫抵抗而言具有特定的功用。其他的杀虫成分包括但不限于凝集素、α-淀粉酶、过氧化物酶、以及胆固醇氧化酶。Vip基因（如在美国专利号5,889,174中所披露并且通过引用并入在此）在与本发明的eHIP的组合中也是有用的。
多于一种的杀虫成分在同一个转基因植物中的共表达可以通过制造一种单一的重组载体（在一种所谓的分子堆积（molecular stack）中包含多于一种的杀虫成分的编码序列）并用遗传学方法对一种植物进行工程化以便在该转基因植物中包含并表达所有的杀虫成分而实现。此类分子堆积还可以通过使用微型染色体进行制造，如在（例如）美国专利7,235,716中所说明。可替代地，包含对一种第一杀虫成分进行编码的一种核酸的一种转基因植物可以用对一种第二杀虫成分等等进行编码的一种不同的核酸进行再转化。可替代地，一种植物（亲本1）可以用遗传学方法进行工程化用于本发明的基因的表达。一种第二植物（亲本2）可以用遗传学方法进行工程化用于一种补充性昆虫控制成分的表达。通过将亲本1与亲本2杂交，获得了表达被引入至亲本1和亲本2中的所有基因的子代植物。
本发明的转基因种子还可以用一种杀虫的种子包衣进行处理，如在美国专利号5,849,320以及5,876,739中所说明，通过引用并入在此。其中本发明的杀虫种子包衣与转基因的种子针对同一种靶昆虫是具有活性的，该组合(i)在用于增强本发明的一种eHIP针对靶昆虫的活性的方法中以及(ii)在用于通过提供针对该靶昆虫的一种第二作用机制而阻止本发明的一种eHIP抵抗的形成的一个方法中是有用的。因此，本发明提供了增强针对或防止在一种靶昆虫（例如，玉米根虫）中抵抗性形成的活力的一种方法，包括将一种杀虫的种子包衣施用至包含本发明的一种或多种eHIP中的一种转基因种子。
即使其中该杀虫的种子包衣针对一种不同的昆虫是具有活性的，该杀虫的种子包衣可用于扩展昆虫控制的范围，例如通过将一种具有针对鳞翅目昆虫活性的杀虫的种子包衣加入本发明的转基因种子（具有针对鞘翅目昆虫活性）中，经包被的转基因种子产生了对鳞翅目以及鞘翅目虫害的控制。
本发明还包括以下方面：
1.工程化的杂合杀虫蛋白质，包括来自第一苏芸金芽胞杆菌（Bt）Cry蛋白质的氨基酸序列，该氨基酸序列包括所述第一Cry蛋白质的完整或部分的可变区以及保守区块，这些可变区和保守区块与来自不同于所述第一BtCry蛋白质的第二Bt Cry蛋白质的氨基酸序列相融合，该第二Bt Cry蛋白质的氨基酸序列包括所述第二Cry蛋白质的完整或部分的可变区以及保守区块，并且该杀虫蛋白质可任选地包括：
(a)位于C端的Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域；或者
(b)N端的肽基片段；或者
(c)(a)和(b)二者，
其中所述工程化的杂合杀虫蛋白质具有至少针对西方玉米根虫的活性。
2.工程化的杂合杀虫蛋白质，包括第一苏芸金芽胞杆菌（Bt）Cry蛋白质的N端区域，该N端区域与不同于所述第一Bt Cry蛋白质的第二Bt Cry的C端区域相融合，其中在该第一与第二Bt Cry蛋白质之间的至少一个交换位置是位于保守区块2、保守区块3、可变区4或保守区块4之中，并且该杀虫蛋白质可任选地包括：
(a)位于C端的Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域；或者
(b)N端的肽基片段；或者
(c)(a)和(b)二者，
其中所述工程化的杂合杀虫蛋白质具有至少针对西方玉米根虫的杀虫活性。
3.如项1或2所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，包括从N端至C端的与所述第二Bt Cry蛋白质的保守区块3的C端部分、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6相融合的所述第一Bt Cry蛋白质的可变区1或可变区1的C端部分、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3，以及保守区块3的N端部分。
4.如项1或2所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，包括在来自所述第一Bt Cry蛋白质的氨基酸序列与来自所述第二Bt Cry蛋白质的氨基酸序列之间的至少两个交换位置。
5.如项4所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中第一交换位置是位于保守区块2之中并且第二交换位置是位于保守区块3之中。
6.如项4所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中第一交换位置是位于保守区块3之中并且第二交换位置是位于保守区块4之中。
7.如项1至6中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，包括在C端的Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域。
8.如项7所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中该原毒素尾部区域是来自针对鳞翅目昆虫具有活性的Bt Cry蛋白质。
9.如项8所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中该Bt Cry蛋白质是Cry1A。
10.如项9所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中该Cry1A是Cry1Aa或Cry1Ab。
11.如项10所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中Cry1Ab原毒素尾部区域包括至少38个氨基酸。
12.如项11所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中Cry1Ab原毒素尾部区域包括与SEQ ID NO:72的氨基酸611至648相对应的氨基酸序列。
13.如项12所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中Cry1Ab原毒素尾部区域包括SEQ ID NO:72的氨基酸611至648。
14.如项1至13中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，包括N端的肽基片段，其中所述肽基片段包括至少9个氨基酸。
15.如项14所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中所述肽基片段包括氨基酸序列YDGRQQHRG（SEQ ID NO:132）或氨基酸序列TSNGRQCAGIRP（SEQ ID NO:133）。
16.如项1至15中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中该N端的肽基片段是选自下组：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、以及SEQ ID NO:132。
17.如项1至16中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中所述肽基片段赋予了杀虫活性、将杀虫活性提高、或者与没有该N端的肽基片段的工程化的杂合杀虫蛋白质相比稳定了该工程化的杂合杀虫蛋白质。
18.如项1至17中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中所述第一Bt Cry蛋白质具有针对鞘翅目昆虫的活性并且其中所述第二Bt Cry蛋白质具有针对鳞翅目昆虫的活性。
19.如项18所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中所述第一Bt Cry蛋白质是Cry3并且其中所述第二Bt Cry蛋白质是Cry1。
20.如项19所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中所述Cry3是Cry3A或经修饰的Cry3A并且所述Cry1是Cry1A。
21.如项20所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中所述Cry3A或经修饰的Cry3A是Cry3Aa或经修饰的Cry3Aa并且其中所述Cry1A是Cry1Aa或Cry1Ab。
22.如项21所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中所述Cry3Aa包括SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:135，或者所述经修饰的Cry3A包括SEQ ID NO:70，并且其中所述的Cry1Ab包括SEQ ID NO:72。
23.如项19至22中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中在Cry3或经修饰的Cry3与Cry1之间的交换位置是位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着与SEQ ID NO:70的Ser450、Phe454、或Leu468相对应的氨基酸。
24.如项23所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中在Cry3Aa或经修饰的Cry3Aa与Cry1Ab之间的交换位置是位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着SEQ ID NO:70的Ser450、Phe454、或Leu468。
25.如项19至22中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中在Cry3或经修饰的Cry3与Cry1之间的第一交换位置是位于保守区块2之中，该保守区块2直接跟随着与SEQ ID NO:70的Asp232相对应的氨基酸，并且其中在Cry1与Cry3或经修饰的Cry3之间的第二交换位置是位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着与SEQ ID NO:72的Leu476相对应的氨基酸。
26.如项25所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中在Cry3Aa或经修饰的Cry3Aa与Cry1Ab之间的第一交换位置是位于保守区块2之中，该保守区块2直接跟随着SEQ ID NO:70的Asp232，并且其中在Cry1Ab与Cry3Aa或经修饰的Cry3Aa之间的第二交换位置是位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着SEQ ID NO:72的Leu476。
27.如项19至22中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中在Cry3或经修饰的Cry3与Cry1之间的第一交换位置是位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着与SEQ ID NO:70的Leu468相对应的氨基酸，并且其中在Cry1与Cry3或经修饰的Cry3之间的第二交换位置是位于保守区块4之中，该保守区块4直接跟随着与SEQ ID NO:72的Ile527相对应的氨基酸。
28.如项27所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中在Cry3Aa或经修饰的Cry3Aa与Cry1Ab之间的第一交换位置是位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着SEQ ID NO:70的Leu468，并且其中在Cry1Ab与Cry3Aa或经修饰的Cry3Aa之间的第二交换位置是位于保守区块4之中，该保守区块4直接跟随着SEQ ID NO:72的Ile527。
29.如项19所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中该第一Cry蛋白质是Cry3A或经修饰的Cry3A，并且该第二Cry蛋白质是Cry1Aa或Cry1Ab，并且其中该工程化的杀虫蛋白质包括与SEQ OD NO:64具有至少80%同一性的氨基酸序列。
30.如项1至29中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，包括选自下组的氨基酸序列，其构成为：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:159、以及SEQ ID NO:160。
31.如项1至30中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其中所述杀虫蛋白质针对北方玉米根虫或墨西哥玉米根虫是具有活性的。
32.对如项1至31中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质进行编码的核酸分子。
33.如项32所述的核酸分子，包括选自下组的核苷酸序列，该组的构成为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:61;SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、以及SEQ ID NO:158。
34.表达盒，包括异源的启动子序列，该启动子序列可操作地连接至如项32或33所述的核酸分子上。
35.重组载体，包括如项34所述的表达盒。
36.转基因宿主细胞，包括如项34所述的表达盒。
37.如项36所述的转基因宿主细胞，它是细菌的细胞。
38.如项36所述的转基因宿主细胞，它是植物细胞。
39.转基因植物，包括如项38所述的转基因植物细胞。
40.如项39所述的转基因植物，其中所述植物是玉米植物。
41.来自由项39或40所述的转基因植物的转基因种子。
42.组合物，包括控制昆虫的有效量的如项1至31中任何一项所述的杀虫蛋白质。
43.产生针对昆虫具有活性的工程化的杂合杀虫蛋白质的方法，包括：
(a)获得如项36所述的转基因宿主细胞；并且
(b)在允许该宿主表达针对昆虫具有活性的工程化的杂合杀虫蛋白质的条件下生长该转基因宿主细胞。
44.产生抵抗昆虫的转基因植物的方法，包括将如项32或33所述的核酸分子引入所述转基因植物之中，其中使工程化的杂合杀虫蛋白质以控制昆虫的有效量表达于该转基因植物中。
45.如项44所述的方法，其中所述昆虫是鞘翅目昆虫或鳞翅目昆虫或二者皆有。
46.如项45所述的方法，其中所述鞘翅目昆虫是西方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、或马铃薯甲虫。
47.如项45所述的方法，其中所述鳞翅目昆虫是欧洲玉米螟。
48.控制昆虫的方法，包括对这些昆虫递送有效量的如项1至31中任何一项所述的毒素。
49.如项48所述的方法，其中所述昆虫是鞘翅目昆虫或鳞翅目昆虫或二者皆有。
50.如项49所述的方法，其中所述鞘翅目昆虫是西方玉米根虫、北方玉米根虫、墨西哥玉米根虫、或马铃薯甲虫。
51.如项49所述的方法，其中所述鳞翅目昆虫是欧洲玉米螟。
52.制造工程化的杂合杀虫蛋白质（eHIP）的方法，包括：
(a)获得第一苏芸金芽胞杆菌（Bt）Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质；
(b)获得不同于该第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Cry蛋白质的第二Bt Cry蛋白质；
(c)将所述第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质的完整或部分的可变区以及保守区块与所述第二Bt Cry蛋白质的完整或部分的可变区以及保守区块相组合以制造出具有针对至少西方玉米根虫的活性的eHIP；并且可任选地
(d)在所述eHIP的N端插入肽基片段或者在所述eHIP的C端插入Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域，或者二者皆有，其中所述N端的肽基片段或所述C端的原毒素区域或这二者均对该eHIP赋予了活性，或者提高了该eHIP的杀虫活性或者使该eHIP比没有该肽基片段或原毒素尾部区域或这二者的eHIP更加稳定。
53.制造工程化的杂合杀虫蛋白质（eHIP）的方法，包括：
(a)获得对第一苏芸金芽胞杆菌（Bt）Cry蛋白质或经修饰的BtCry蛋白质进行编码的第一核酸以及对不同于该第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质的第二Bt Cry蛋白质进行编码的第二核酸；
(b)从所述第一以及第二核酸中分离出核苷酸序列，该核苷酸序列编码所述第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质以及所述第二Bt Cry蛋白质的完整或部分的可变区以及保守区块；
(c)将步骤(b)的这些所产生的分离的核酸连接在一起，其方式为制成编码蛋白质的新的杂合的核酸，并且可任选地将编码肽基片段的核酸与所述杂合核酸的5'端相融合导致5'延伸，或者将对Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域进行编码的核酸与所述杂合核酸的3'端相融合导致3'延伸，或者二者并举；
(d)将具有或不具有5'或3'延伸中的一种或二种的杂合核酸插入表达盒中；
(e)将该表达盒转化至宿主细胞中，致使所述宿主细胞生产eHIP；并且
(f)对针对至少西方玉米根虫的eHIP进行生物测定，该eHIP产生针对西方玉米根虫的杀虫活性。
54.如项52或53中任何一项所述的方法，其中所述第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Bt Cry蛋白质是Cry3A或经修饰的Cry3A并且所述第二Bt Cry蛋白质是Cry1Aa或Cry1Ab。
55.如项52至54中任何一项所述的方法，其中所述N端的肽基片段包括至少9个氨基酸。
56.如项55所述的方法，其中所述N端的肽基片段包括氨基酸序列YDGRQQHRG（SEQ ID NO:132）或氨基酸序列TSNGRQCAGIRP（SEQ IDNO:133）。
57.如项55中所述的方法，其中所述N端的肽基片段是选自下组：SEQID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、以及SEQ ID NO:132。
58.如项52至57中任何一项所述的方法，其中所述原毒素尾部区域是来自Cry1Aa或Cry1Ab。
59.如项58所述的方法，其中所述原毒素尾部区域包括至少38个氨基酸。
60.如项59所述的方法，其中所述原毒素尾部区域包括与SEQ ID NO:72的氨基酸611至648相对应的氨基酸序列。
61.如项60所述的方法，其中所述原毒素尾部区域包括SEQ ID NO:72的氨基酸611至648。
实例
通过提到以下的详述的实例对本发明进行进一步说明。提供这些实例仅为了例证的目的，而不旨在进行限制，除非另外指明。这里所使用的标准的重组DNA以及分子克隆技术在本领域内是熟知的，并且由J.Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d Ed.,Cold Spring Harbor,NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press(2001)；T.J.Silhavy,M.L.Berman,and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1984)以及Ausubel,F.M.et al.,Current Protocols inMolecular Biology,New York,John Wiley以及Sons Inc.,(1988),Reiter,et al.,Methods in Arabidopsis Research,World Scientific Press(1992)，以及Schultz etal.,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers(1998)进行说明。
实例1.亲代的编码序列
玉米优化的cry3Aa、cry1Ab、cry1Ba、以及cry1Fa编码序列（在此分别被命名为mocry3Aa、mocry1Ab、mocry1Ba、以及mocry1Fa）根据披露于美国专利5,625,136中的操作得以制造，该专利其全文通过引用并入在此。
根据美国专利7,030,295（通过引用并入在此），通过对mocry3A编码序列进行修饰通过将编码了一种组织蛋白质酶G蛋白质酶识别位点的核苷酸序列插至结构域I中而制造了cry3A055（SEQ ID NO:67）（它编码一种Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:68））。
以下序列在杂合核酸以及它们所编码的蛋白质的构建中使用并且在以下的实例中进行了说明：mocry3Aa（SEQ ID NO:67），它编码了在SEQ ID NO:68中给出的蛋白质；cry3A055（SEQ ID NO:69），它编码了在SEQ ID NO:70中给出的蛋白质；mocry1Ab（SEQ ID NO:71），它编码了在SEQ ID NO:72中给出的蛋白质；mocry1Ba（SEQ ID NO:73），它编码了在SEQ ID NO:74中给出的蛋白质；mocry1Fa（SEQ ID NO:75），它编码了在SEQ ID NO:76中给出的蛋白质；cry8Aa（SEQ ID NO:77），它编码了在SEQ ID NO:78中给出的蛋白质；cry1Ac（SEQ ID NO:79），它编码了在SEQ ID NO:80中给出的蛋白质；以及cry1Ia（SEQ ID NO:81），它编码了在SEQ ID NO:82中给出的蛋白质。
实例2.使用PCR构建杂合核酸
聚合酶链式反应（PCR）是核酸序列的一种重复性、酶促、引导的合成。这种操作是熟知的并且经常被本领域的普通技术人员所使用（参见Mullis,美国专利号4,683,195、4,683,202、以及4,800,159；Saiki,Randall K.,StephenScharf,Fred Faloona,Kary B.Mullis,Glenn T.Horn,Henry A.Erlich,NormanArnheim[1985]"Enzymatic Amplification of.beta.-Globin Genomic Sequencesand Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia,"Science230:1350-1354.）。PCR基于一种感兴趣的DNA片段的酶促扩增，该DNA片段的侧翼是与靶序列的相反链进行杂交的两种寡核苷酸引物。这两种引物用指向彼此的3'端确定方向。模板的热变性的重复性循环，这些引物对其互补序列的退火，以及用DNA聚合酶对已退火的引物进行延伸导致了由PCR引物的5'端所限定的区段的扩增。因为每个引物的延伸产物可以充当另一个引物的模板，每个循环基本上将在之前的循环中所产生的DNA片段的量加倍。这导致了特定靶片段的指数型累积，在几小时中高达几百万倍。通过使用一种热稳定的DNA聚合酶（如Taq聚合酶，它分离自嗜热菌水生栖热菌），该扩增过程可以是完全自动化的。
使用在表1中示出的多个示范性引物的各种组合构建了在以下实例中所说明的嵌合的编码序列。在实验中所使用的PCR反应混合物以及PCR热循环实验方案分别在表2以及表3中列出。在接下来的每个实例中，按名字和“SEQ ID NO:”来称呼这些PCR引物，并且这些PCR反应混合物以及PCR热循环实验方案是按它们对应的编号来称呼。普通技术人员应当认识到，可以使用其他的PCR引物和PCR反应条件来构建本发明的嵌合的编码序列，并且列出在本发明中所使用的示范性引物以及PCR条件并不意味着以任何方式进行限制。
表1.用于构建对eHIP进行编码的编码序列的引物
表2.PCR的反应混合物。
表3.PCR的热循环特性表
表4示出具有各自的可变区和保守区块的Cry3A055、Cry1Ab、以及Cry3A的三个结构域之间的关系。示出了每种蛋白质在结构域、保守区块以及可变区中所包含的氨基酸。
表4
实例3.2OL-8a的构建
使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C3-3A-6（SEQ ID NO:84）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的N端部分的第一核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。这个PCR反应通过删除SEQ ID NO:69（cry3A055）的核苷酸28而引入了点突变（它在cry3A055阅读框中引起了移码），并在得到的扩增子的5’端删除了BamHI位点以及Kozak序列（Kozak,M.,1986.Cell44:283-92）。
使用引物C3-1Ab-3（SEQ ID NO:85）以及1Ab-6-Sac（SEQ ID NO:86）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry1Ab蛋白质（SEQID NO:72）的C端部分的第二核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。
通过使用以上所说明的第一与第二核酸作为模板并用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及1Ab-6-Sac（SEQ ID NO:86）在重叠PCR反应中将二者连接起来（Horton et al.,1989.Gene77:61-68），该PCR反应使用了PCR反应混合物2以及热循环特性表1，除此之外使用45至65℃的梯度作为退火温度。
将得到的扩增子作为平末端片段与用SmaI切割的pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen,Carlsbad,CA）相连接以形成质粒p2OL8a/CR2.1。然后，将来自p2OL8a/CR2.1的BamHI-SacI片段与pET21a（EMD Biosciences,Inc.,SanDiego,CA）进行连接（它是用BamHI-SacI进行切割），并被转化至大肠杆菌中。来自p2OL8a/CR2.1的BamHI-SacI片段包含衍生自该pCR2.1-TOPO载体的40个核苷酸，这些核苷酸与来自第一PCR反应的异读框（out offrame）扩增子相邻。将这个BamHI-SacI片段与pET21a进行连接而创造出以T7标签的起始密码子（ATG）起始并且以插入的DNA的SacI位点结束的开放阅读框。这个开放阅读框被命名为2OL-8a（SEQ ID NO:1）并对2OL-8a嵌合的杀虫蛋白质（SEQ ID NO:2）进行编码。因此，该2OL-8a嵌合的杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MASMTGGQQMGRGSTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:126））、一种Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至468（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及一种Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及该Cry1Ab原毒素尾部区域的38个氨基酸。
对该肽基片段的氨基酸1至14进行编码的核苷酸衍生自pET21a载体的T7标签以及BamHI切割位点。对该肽基片段的氨基酸15至26进行编码的核苷酸衍生自pCR2.1-TOPO载体。并且对该肽基片段的氨基酸27至35进行编码的核苷酸衍生自cry3A055，这些核苷酸与cry3A055编码序列的剩余部分是在框外。
实例4.FR8a的构建
通过只在2OL-8a（参见实例3）中的N端BamHI位点的下游替代Kozak序列（ACC）以及起始密码子（ATG）构建了FR8a编码序列。此外，破坏在2OL-8a中的EcoRI位点以便帮助FR8a将来的定向（vectoring）。使用PCR反应进行所有这些改变，该反应使用2OL-8a作模板并用引物：8a-atg-delRI（SEQ ID NO:87）以及C2-3A-4（SEQ ID NO:88），使用PCR反应混合物2以及热循环特性表2。
将得到的扩增子与pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen）相连接。然后，将来自克隆的PCR产物的BamHI-PpuMI片段与来自2OL8a/pCR2.1（参加实例3）的PpuMI-NcoI片段以及来自2OL8a/pCR2.1的NcoI-BamHI片段相连接以创造出对FR8a嵌合的杀虫蛋白质（SEQ ID NO:4）进行编码的FR8a（SEQ ID NO:3）。因此，该FR8a嵌合的杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至468（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及该Cry1Ab原毒素尾部区域的38个氨基酸。
如在表5中所示FR8a eHIP针对西方玉米根虫是非常有活性的。因此，从2OL-8a eHIP中去除来自N端的肽基片段的T7氨基酸序列对杀虫活性没有负面影响。
将额外的34个氨基酸添加至FR8a的N端以创造出eHIP（被命名为FR8a+34(SEQ ID NO:160)），具有56个氨基酸的N端的肽基片段（SEQ IDNO:131）。这种56个氨基酸的N端的肽基片段对FR8a针对西方玉米根虫活性没有负面作用（见表5）。
实例5.FRGC的构建
为了确定组织蛋白质酶G蛋白质酶识别位点对于包含Cry3A055的N端片段的杂合蛋白质的杀虫活性是否是必需的，从FR8a杂合蛋白质（实例4）中制造了消除组织蛋白质酶G的构建体。使用标准的分子生物学技术将来自包含FR8a（SEQ ID NO:3）的质粒的第一MluI-PpuMI核酸片段与来自包含mocry3Aa（SEQ ID NO:67）的质粒的第二PpuMI/MluI核酸片段相连接以创造出FRCG（也被命名为FR8a-catg）（SEQ ID NO:5），它对FRCG杂合蛋白质（SEQ ID NO:6）进行编码。因此，该FRCG嵌合的杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A蛋白质（SEQID NO:68）的氨基酸10至467（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及一种Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及该Cry1Ab原毒素尾部区域的38个氨基酸。
该FRCG蛋白质与FR8a蛋白质一样针对西方玉米根虫是有活性的（见表5），提示组织蛋白质酶G位点对于一种eHIP的杀虫活性而言不是所要求的。
实例6.FR8a-9F的构建
使用引物（反向）（SEQ ID NO:89）以及FR8a-OL-1（SEQ ID NO:90）以及PCR反应混合物2以及热循环特性表2，将第一大约323bp的核酸片段从一种包含FR8a（SEQ ID NO:3）的质粒中进行PCR扩增。使用引物FR8a-OL-2（SEQ ID NO:91）以及C1-3A-2（SEQ ID NO:92）以及PCR反应混合物2以及热循环特性表2，将第二大约470bp的核酸片段从包含FR8a的质粒中进行PCR扩增。通过使用两种得到的扩增子作为模板使用引物5'FR8a（SEQ ID NO:93）以及C1-3A-2（SEQ ID NO:92）在重叠PCR反应中将两种扩增子相连接，该反应使用PCR反应混合物2以及热循环特性表2来扩增FR8a-9F的5’端。将重叠PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen）（被命名为5'FR-9F/pCR2.1）中。然后，将5'FR-9F/pCR2.1的BamHI/PpuMI片段与FR8a的PpuMI/BamHI片段相连接以创造出对FR8a-9F嵌合蛋白质（SEQ ID NO:8）进行编码的FR8a-9F（SEQ ID NO:7）。因此，该FR8a-9F嵌合的杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRP（SEQ ID NO:129））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至468（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及该Cry1Ab原毒素尾部区域的38个氨基酸。
与FR8a eHIP相比，FR8a-9F eHIP具有稍低的针对西方玉米根虫活性（见表5），提示SEQ ID NO:127的肽基片段的C端9个氨基酸在对FR8a赋予完全的杀虫活性中发挥作用。
实例7.FR-9F-catg的构建
创造出FR-9F-catg编码序列以便将异读框cry3A055衍生的FR8a的核苷酸放回框内并消除组织蛋白质酶G蛋白质酶识别位点。将5'FR-9F/pCR2.1（见实例6）的BamHI/PpuMI片段与FRCG（见实例5）的PpuMI/BamHI片段相连接而创造出FR-9F-catg编码序列（SEQ ID NO:9），它对FR-9F-catg嵌合蛋白质（SEQ ID NO:10）进行编码。因此，该FR-9F-catg嵌合的蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRP（SEQID NO:129））、Cry3Aa蛋白质（SEQ ID NO:68）的氨基酸1至467（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及该Cry1Ab原毒素尾部区域的38个氨基酸。
FR8a-9F-catg eHIP提供了与FR8a相同水平的针对西方玉米根虫活性（见表5），确认eHIP可以从经修饰的Cry3A或天然Cry3序列制得。
实例8.FR8a-12aa的构建
在FR8a（SEQ ID NO:4）中所包含的对该肽基片段的氨基酸2至13进行编码的核苷酸用PCR去除。使用引物5’FR8a-12aa（SEQ ID NO:94）以及C1-3A-2（SEQ ID NO:90）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将片段从包含FR8a（SEQ ID NO:3）的质粒中进行PCR扩增。将得到的扩增子克隆至pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中。然后，将来自该pCR2.1-TOPO克隆的BamHI/PpuMI片段与来自包含FR8a的质粒的PpuMI/BamHI片段相连接以创造出FR8a-12aa(SEQ ID NO:11)，它对FR8a-12aa嵌合杀虫蛋白质（SEQ ID NO:12）进行编码。因此，该FR8a-12aa嵌合的杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MYDGRQQHRG（SEQ ID NO:128））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至468（它包括可变区1、保守区块10、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及该Cry1Ab原毒素尾部区域的38个氨基酸。
FR8a-12aa eHIP提供了与FR8a具有相同水平的针对西方玉米根虫活性（见表5），提示SEQ ID NO:127的肽基片段的N端的12个氨基酸对于FR8a的完全杀虫活性不是所必需的。
实例9.Wr-9mut的构建
使用引物5’FR8a-12aa（SEQ ID NO:94）以及C1-3A-2（SEQ ID NO:92）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表2，将核酸片段从FR8a/pCR2.1（实例2）中进行PCR扩增。将得到的扩增子克隆进入pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中。然后，将BamHI/PpuMI片段与FR8a（SEQ ID NO:3）的PpuMI/BamHI片段相连接以创造出Wr-9mut（SEQ ID NO:13），它对WR-9mut蛋白质（SEQID NO:14）进行编码，该蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MYDGRQQHRG（SEQ ID NO:128））、以及Cry3A055蛋白质（SEQ IDNO:70）的氨基酸10至598。因此，WR-9mut蛋白质是具有本发明的N端的肽基片段的Cry3A055。
该WR-9mut蛋白质对西方玉米根虫是没有活性的。因此，将N端的肽基片段加至非杂合的经修饰的Cry3a中破坏了杀虫活性。这提示在FR8a的Cry1Ab C端部分与对FR8a赋予了完全杀虫活性的N端的肽基片段之间可能存在某种相互作用。
实例10.FRD3的构建
使用引物C2-3A-3(SEQ ID NO:95)以及3'1Ab-dm3(SEQ ID NO:96)以及PCR反应混合物2以及热循环特性表2，从包含FR8a（SEQ ID NO:3）的质粒中通过PCR扩增片段而制造了这个编码序列的3'端。将得到的扩增子克隆进入pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中。将克隆的扩增子的364bp ApaI/SacI片段（被命名为3'FRD3/pCR2.1）与FR8a的SacI/ApaI片段相连接以创造出对FRD3嵌合蛋白质（SEQ ID NO:16）进行编码的FRD3（SEQ ID NO:15）。该FRD3嵌合的杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至468（它包括完整可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至610（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）。因此，该FRD3嵌合杀虫蛋白质是FR8a嵌合杀虫蛋白质的变异体，其中Cry Ab原毒素尾的38个氨基酸区域被删除。
FRD3eHIP提供了与FR8a具有相同水平的活力的针对西方玉米根虫活性（见表5），提示FR8a的38个氨基酸原毒素尾部区域对于完全的杀虫活性不是所必需的。
实例11.FR-12-cg-dm3的构建
将来自包含FR8a-12（见实例8）的质粒的3082bp SacI/PpuMI片段、FRCG（见实例5）的721bp PpuMI/MluI片段、以及FRD3（见实例10）的923bp MluI/SacI片段相组合而创造出对FR-12-cg-dm3嵌合蛋白质（SEQ IDNO:18）进行编码的FR-12-cg-dm3编码序列（SEQ ID NO:17）。该FR-12-cg-dm3嵌合蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MYDGRQQHRG（SEQ ID NO:129））、Cry3Aa蛋白质（SEQ ID NO:68(70)）的氨基酸10至467（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQID NO:72）的氨基酸477至610（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）。因此，该FR-12-cg-dm3嵌合蛋白质是FR8a的变体，其中该肽基片段的12个N端氨基酸、组织蛋白质酶G蛋白质酶识别位点、以及Cry1Ab原毒素尾的38个氨基酸区域被删除。
该FR-12-cg-dm3eHIP不像FR8a（见表5）一样针对西方玉米根虫具有活性，提示在FR8a的C端部分与N端的肽基片段之间的某种相互作用对于完全杀虫活性而言是所要求的。
实例12.9F-cg-del6的构建
使用引物5’FR-del6（SEQ ID NO:97）以及C1-3A-2（SEQ ID NO:92）以及PCR反应混合物3以及热循环特性表3，从包含FR-9F-catg（见实例7）的质粒中通过PCR扩增片段而制造了这个编码序列的5'端。将得到的扩增子克隆进入pCR2.1-TOPO中。然后，将215bp BamHI/PpuMI片段与FR-9F-catg的4668bp PpuMI/BamHI片段相连接以创造出FR-9F-cg-del6（SEQ ID NO:19），它对FR-9F-cg-del6嵌合蛋白质（SEQ ID NO:20）进行编码。FR-9F-cg-del6嵌合的蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MCAGIRP（SEQ ID NO:130））、Cry3A蛋白质（SEQ ID NO:68）的氨基酸1至467（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及Cry1Ab原毒素尾部区域的38个氨基酸。因此，该FR-9F-cg-del6嵌合蛋白质是FR8a-9F-catg的变异体，其中肽基片段的氨基酸2至7被缺失。
FR-9F-cg-del6对西方玉米根虫没有活性，提示N端的肽基片段需要SEQID NO:127的C端的9个氨基酸中的至少7个氨基酸以便具有针对西方玉米根虫的活性。
实例13.FR-cg-dm3的构建
将FRCG（实例5）的3839bp MluI/SacI片段与FRD3（实例10）的923bpMluI/SacI片段相连接以创造出FR-cg-dm3（SEQ ID NO:21），它对FR-cg-dm蛋白质（SEQ ID NO:22）进行编码。该FR-cg-dm3嵌合杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A蛋白质（SEQ ID NO:68）的氨基酸10至467（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至610（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）。
FRD3eHIP提供了与FR8a具有相同水平的针对西方玉米根虫的活性（见表5），确认FR8a的组织蛋白质酶G位点以及原毒素尾部区域对于针对西方玉米根虫的完全的杀虫活性而言不是所要求的。
实例14.9F-cg-dm3的构建
将来自包含FR-9F-cg（见实例7）的质粒的MluI/SacI片段与来自包含FRD3（见实例10）的923bp MluI/SacI片段相连接以创造出9F-cg-dm3（SEQID NO:23），它对9F-cg-dm3蛋白质（SEQ ID NO:24）进行编码。该9F-cg-dm3蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRP（SEQ ID NO:129））、Cry3A蛋白质（SEQ ID NO:68）的氨基酸1至467（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至610（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）。
该9F-cg-dm3eHIP提供了相同水平的针对西方玉米根虫的活性（见表5），证实当该eHIP的结构域I由经修饰的Cry3A(Cry3A055)可变区以及保守区块或Cry3A可变区以及保守区块组成（be comprised of）时该肽基片段的C端的9个氨基酸会赋予活性。
实例15.B8a的构建
使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C3-3A-8（SEQ ID NO:99）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表(profile)1，将编码了Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的N端部分的核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。使用引物C3-1Ab-7（SEQ ID NO:100）以及1Ab-6-Sac（SEQ ID NO:86）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将包含可变区4至6的、编码了Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的C端部分的核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。得到的扩增子被命名为2OL-8b。
使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C2-3A-4（SEQ ID NO:88）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的N端部分的核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物1B-5（SEQ ID NO:101）以及1B-10（SEQ ID NO:102）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry1Ba蛋白质（SEQ ID NO:74）的C端部分的核酸片段从包含mocry1Ba（SEQ ID NO:73）的质粒中进行PCR扩增。
然后，在重叠PCR反应中使用两种以上所说明的PCR产物作为模板，该反应使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及1B-10（SEQ ID NO:102），使用PCR反应混合物1以及热循环特性表2。得到的扩增子被命名为B10。
接下来，使用2OL-8b（见以上）作为模板以及引物5’3A-1-bam（SEQ IDNO:83）与3A-22（SEQ ID NO:103）在以下PCR条件下对cry3A055（SEQID NO:69）的核酸片段进行PCR扩增：混合物1，热循环特性表：94℃–45秒、50℃-70℃梯度–45秒、72℃-90秒，30个循环。使用B10（见以上）作为模板以及引物1B-7（SEQ ID NO:104）与1B-10（SEQ ID NO:102）使用PCR反应混合物1以及热循环特性表2（除了使用了60℃的退火温度）对另一个核酸片段进行PCR扩增。然后，在重叠PCR反应中使用两种得到的PCR产物作为模板，该反应使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及1B-10（SEQ ID NO:102），使用以下PCR反应条件：混合物2，热循环特性表：94℃–30秒、40℃-60℃梯度–30秒、72℃–60秒，30个循环。
将得到的PCR产物与pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen）相连接，并将其命名为B10/pCR2.1。然后，将来自B8a/pCR2.1的BamHi-SacI片段与pET21a（Novagen）相连接（它是用BamHi/SacI进行切割）以创造出B8a编码序列（SEQ ID NO:25），它对B8a杂合毒素（SEQ ID NO:26）进行编码。该B8a杂合蛋白质从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至468、以及Cry1Ba蛋白质（SEQ ID NO:74）的氨基酸505至656。
实例16.5*B8a的构建
将来自包含2OL-8a（见实例3）的质粒的BamHI-XbaI片段与来自包含B8a（见实例15）的XbaI-SacI片段相连接以创造出5*B8a（SEQ ID NO:27），它对5*B8a嵌合蛋白质（SEQ ID NO:28）进行编码。该5*B8a蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至467、以及Cry1Ba蛋白质（SEQ ID NO:74）的氨基酸505至656。因此，该5*B8a嵌合蛋白质是已经添加了N端的肽基片段的B8a杂合蛋白质。
实例17.V3A的构建
使用3个片段一起作模板对这个基因进行PCR扩增：使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C2-3A-4（SEQ ID NO:88）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将该第一片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行扩增；使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及C3-1Ab-2（SEQ ID NO:105）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将该第二片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行扩增；使用引物C3-3A-5（SEQ ID NO:106）以及3A-12-sac（SEQ ID NO:107）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将该第三个片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行扩增。然后，在重叠PCR反应中使用这3种PCR产物作为模板，该反应使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及3A-12（SEQ ID NO:107），使用PCR反应混合物1以及热循环特性表1，产生出v3A编码序列（SEQID NO:29），它对V3A杂合蛋白质（SEQ ID NO:30）进行编码。该V3A杂合蛋白质从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至226（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2的N端的33个氨基酸）、Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸237至474（它包括保守区块2的C端的33个氨基酸、可变区3、以及保守区块3的N端的20个氨基酸）、以及Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸467至598（它包括保守区块3的C端的28个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、以及保守区块5）。
该V3A eHIP包括两个交换位置。在Cry3A055与Cry1Ab之间的第一交换位置位于保守区块2之中，并且该在Cry1Ab与Cry3A055之间的第二交换位置位于保守区块3之中。因此，V3A是Cry3A055的变异体，其中所有的可变区3中已经被Cry1Ab蛋白质的可变区域3所替换。该V3A eHIP不像FR8a一样针对玉米根虫具有活性，提示在保守区块3、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5和/或可变区6中具有Cry1Ab序列对于FR8a的完全杀虫活性而言是重要的。
将v3A编码序列与pCR2.1-TOPO载体相连接并接着使用BamHI/SacI片段将该v3A编码序列亚克隆进入pET21a中。由pET21a载体所表达的V3A蛋白质在N端具有T7标签。将这个蛋白质命名为T7-V3A。
实例18.V4F的构建
使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C3-3A-6（SEQ ID NO:84）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry3A055的可变区1至3的第一核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物C3-1Ab-3（SEQ ID NO:85）以及C3-3A-10（SEQ ID NO:108）以及PCR反应混合物4以及热循环特性表1，将编码了Cry1Ab的可变区4的第二核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物C4-3A-9（SEQ ID NO:109）以及3A-12-sac（SEQ ID NO:107）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry3A055的可变区5至6的第三种核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。
在重叠PCR反应中将所有三种PCR扩增子组合并用作模板，该反应使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及3A-12（SEQ ID NO:107），使用以下PCR反应条件：混合物1以及热循环特性表：94℃–30秒、50℃-70℃梯度–30秒、72℃–20秒，20个循环。将得到的扩增子（被命名为v4F编码序列（SEQ ID NO:31），它对V4F杂合毒素（SEQ ID NO:32）进行编码）克隆至pCR2.1-TOPO载体中并将其命名为v4F/pCR2.1。该V4F杂合蛋白质从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至468、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至520（包括可变区4）、以及Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸512至598。
该V4F蛋白质具有两个交换位置。在Cry3A055与Cry1Ab之间的第一交换位置位于保守区块3之中，并且该在Cry1Ab与Cry3A055之间的第二交换位置位于保守区块4之中。因此，V4F是Cry3A055的变异体，其中可变区4中的所有已经被Cry1Ab蛋白质的可变区域4所替换。该V4F杂合蛋白质没有针对西方玉米根虫的活性，提示在FR8a的C端部分的Cry1Ab序列有助于FR8a的杀虫活性。
将v4F/pCR2.1的BamHI-SacI片段亚克隆至pET21中。由得到的质粒所表达的蛋白质被命名为T7-V4F。
实例19.5*V4F的构建
将来自包含FR8a（见实例4）的质粒的BamHI-XbaI片段以及来自V4F/pCR2.1（见实例18）的XbaI-SacI片段与用BamHI-SacI切割的pET21相连接以形成5*V4F/pET21。5*V4F编码序列（SEQ ID NO:33）对5*V4F嵌合蛋白质（SEQ ID NO:34）进行编码。该5*V4F嵌合杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至491、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸501至520（包括可变区4）、以及Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸512至598。
该5*V4F eHIP是具有所添加的N端的肽基片段（SEQ ID NO:127）的V4F杂合蛋白质。该5*V4F eHIP提供了针对西方玉米根虫的杀虫活性，尽管与FR8a不在相同水平。因此，N端对V4F赋予了杀虫活性，证实在FR8a的C端部分与N段的肽基片段之间可能存在某种有贡献的相互作用。
由5*V4F/pET21质粒所表达的蛋白质被命名为T7-5*V4F，并且对于5*V4F肽基片段具有T7标签N端。
实例20.2OL-7的构建
使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C1-3A-2（SEQ ID NO:92）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry3A055的可变区1的核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物C1-1Ab-1（SEQ ID NO:110）以及1Ab-6-sac（SEQ ID NO:86）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry1Ab的可变区2至6的核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。
然后，在重叠PCR反应中使用得到的两种扩增子作为模板，该反应使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及1Ab-6-sac（SEQ ID NO:86），使用PCR反应混合物2以及热循环特性表2以创造出2OL-7编码序列（SEQ IDNO:35），它对2OL-7杂合蛋白质（SEQ ID NO:36）进行编码。该2OL-7杂合蛋白质从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至156（它包括可变区1、保守区块1的N端的14个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸167至648（它包括保守区块1的C端的15个氨基酸、可变区2、保守区块2、可变区3、保守区块3、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及Cry1Ab原毒素尾的38个氨基酸。因此，2OL-7是Cry1Ab蛋白质的变异体，其中可变区1被来自Cry3A055蛋白质的可变区1所替换。
将2OL-7编码序列克隆至pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中并接着使用BamHI/SacI将其移至pET21a中，它被命名为2OL-7/pET21a。在2OL-7/pET21a中的编码序列被命名为T7-2OL-7（SEQ ID NO:37）。由2OL-7/pET21a载体所表达的蛋白质被命名为T7-2OL-7（SEQ ID NO:38）。
实例21.5*2OL-7的构建
将FR8a（见实例4）的BamHI/XbaI片段、2OL-7（见实例20）的PpuMI/SacI片段、以及pET21a的BamHI/SacI片段相连接以产生5*2OL-7/pET21a。5*2OL-7编码序列（SEQ ID NO:39）对5*2OL-7嵌合蛋白质（SEQ ID NO:40）进行编码。该5*2OL-7蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至156、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸167至643。因此，5*2OL-7杂合蛋白质是具有添加的N端的肽基片段的2OL-7杂合蛋白质。
实例22.2OL-10的构建
使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C2-3A-4（SEQ ID NO:88）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry3A055的N端部分的核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及1Ab-6-sac（SEQ ID NO:86）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry1Ab蛋白质的C端部分的核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。然后，在重叠PCR反应中使用这两种生成的PCR产物作为模板，该反应使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及1Ab-6-sac（SEQ ID NO:86），使用以下PCR反应条件：混合物2，热循环特性表：94℃–30秒、45℃-65℃梯度–30秒、72℃–30秒，20个循环，产生2OL-10编码序列（SEQ ID NO:41），它对2OL-10杂合蛋白质（SEQ ID NO:42）进行编码。该2OL-10杂合蛋白质从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至232、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸243至648。因此，2OL-10杂合蛋白质基本上是Cry3A055蛋白质的结构域I以及Cry1Ab蛋白质的结构域II和III。
将2OL-10编码序列克隆进入pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中并接着使用BamHI/SacI将其移至pET21a。由2OL-10/pET21a所表达的蛋白质被命名为T7-2OL-10。
实例23.5*2OL-10的构建
将来自包含FR8a（见实例4）的质粒的BamHI-XbaI片段以及来自2OL-10/pCR2.1（见实例22）的XbaI-SacI片段与用BamHI-SacI切割的pET21相连接以形成5*2OL-10/pET21。5*2OL-10编码序列（SEQ ID NO:43）对5*2OL-10嵌合蛋白质（SEQ ID NO:44）进行编码。该5*2OL-10蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至232、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸243至648。因此，5*2OL-10嵌合蛋白质是具有添加的N端的肽基片段的2OL-10杂合蛋白质。
实例24.2OL-12A的构建
使用引物5’1Ab-bam（SEQ ID NO:98）以及C3-1Ab-2（SEQ ID NO:105）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry1Ab蛋白质的N端部分的第一核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物C3-3A-5（SEQ ID NO:106）以及3A-12-sac（SEQ ID NO:107）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry3A055的C端部分的第二核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。
通过使用以上所说明的第一和第二核酸片段作为模板使用引物5’1Ab-bam（SEQ ID NO:98）以及3A-12-sac（SEQ ID NO:107）在重叠PCR反应中将两个片段连接起来，该反应使用混合物1以及热循环特性表1以创造出2OL-12A编码序列（SEQ ID NO:45），它对2OL-12A eHIP（SEQ ID NO:46）进行编码。
该2OL-12A蛋白质从N端至C端包括Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸1至476、以及Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸469至598。
2OL-12A eHIP没有针对西方玉米根虫的活性，但针对欧洲玉米螟是有活性的（见表6）。这证明了可以使用具有鳞翅目昆虫活性以及鞘翅目昆虫活性的Cry蛋白质对eHIP进行构建，无需针对鳞翅目昆虫物种活性的损失。
将2OL-12A编码序列克隆至pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中，并接着用BamHI/SacI将其移至pET21a。由2OL-12A/pET21a载体所表达的蛋白质被命名为T7-2OL-12A。
实例25.2OL-13的构建
产生了如下的四种核酸片段：使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C1-3A-2（SEQ ID NO:92）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将片段1从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行扩增；使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及C3-1Ab-2（SEQ ID NO:105）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将片段2从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行扩增；使用引物C3-1Ab-3（SEQ ID NO:85）以及C4-3A-10（SEQID NO:108）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将片段3从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行扩增；使用引物C4-3A-9（SEQ IDNO:109）以及3A-12-sac（SEQ ID NO:107）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将片段4从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行扩增。
然后，在重叠PCR反应中使用所有四种片段作为模板，该反应使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及3A-12-sac（SEQ ID NO:107），使用PCR反应混合物1以及热循环特性表1以创造出2OL-13编码序列（SEQ IDNO:47），它对2OL-13杂合毒素（SEQ ID NO:48）进行编码。该2OL-13蛋白质从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至159、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸170至522、以及Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸515至598。因此，该2OL-13杂合毒素是由以下部分组成：来自Cry3A055蛋白质的V1以及CB1的N端部分；来自Cry1Ab蛋白质的CB1的C端部分、V2、CB2、V3、CB3、以及V4；以及来自Cry3A055蛋白质的CB4、V5、以及CB5。
将2OL-13编码序列克隆进入pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中然后使用BamHI/SacI将其移至pET21a中。由2OL-13/pET21a载体所表达的蛋白质被命名为T7-2OL-13。
实例26.2OL-20的构建
将来自包含mocry3A（SEQ ID NO:67）的质粒的BamHI/NspI片段、来自包含2OL-8A（SEQ ID NO:1）的NspI/HindIII片段、以及来自pET21a的HindIII/BamHI片段相连接以制造2OL-20/pET21a。
实例27.V5&6的构建
使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C4-3A-10（SEQ ID NO:108）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry3A055的N端部分的核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物C4-3A-9（SEQ ID NO:109）以及1Ab-6-sac（SEQ ID NO:86）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry1Ab的C端部分的核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。
然后，在重叠PCR反应中使用这两种PCR产物作为模板，该反应使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及1Ab-6-sac（SEQ ID NO:86），使用PCR反应混合物1以及热循环特性表2以创造出V5&6编码序列（SEQ IDNO:49），它对V5&6杂合毒素（SEQ ID NO:50）进行编码。该V5&6蛋白质从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至524（它包括V1、CB1、V2、CB2、V3、CB3、V4、以及CB4）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸533至648（V5、CB5、以及V6）、以及Cry1Ab原毒素尾部区域的38个氨基酸。
将V5&6编码序列克隆进入pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中接着用BamHI/SacI将其移至pET21中。由V5&6/pET21a所表达的蛋白质被命名为T7-V5&6。
实例28.5*V5&6的构建
将FR8a（见实例4）的BamHI/XbaI片段、V5&6（见实例27）的XbaI/SacI片段、以及pET21a的BamHI/SacI片段相连接以形成5*V5&6/pET21。5*V5&6编码序列（SEQ ID NO:51）对5*V5&6嵌合蛋白质（SEQ ID NO:52）进行编码。该5*V5&6嵌合杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至524（它包括V1、CB1、V2、CB2、V3、CB3、V4、以及CB4）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸533至648（它包括V5、CB5、以及V6）、以及Cry1Ab原毒素尾部区域的38个氨基酸。因此，5*V5&6嵌合杀虫蛋白质是具有添加的N端的肽基片段的V5&6杂合蛋白质。
实例29.88A-dm3的构建
使用引物5’8Aa-dm3（SEQ ID NO:111）以及3’8Aa-dm3（SEQ ID NO:112）以及PCR反应混合物2以及热循环特性表2，将编码了Cry8Aa蛋白质（SEQ ID NO:78）的C端部分的核酸片段从包含cry8Aa（SEQ ID NO:77）的质粒中进行PCR扩增。将得到的扩增子克隆至pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中并将其命名为88A-dm3/pCR2.1。
将来自88A-dm3/pCR2.1的MluI/SacI片段与来自包含FR8a（见实例4）的质粒的SacI/MluI片段相连接以创造出88A-dm3编码序列（SEQ ID NO:53），它对88A-dm3杂合蛋白质（SEQ ID NO:54）进行编码。该88A-dm3蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至468、以及Cry8Aa蛋白质（SEQ ID NO:78）的氨基酸532至664。
也使用BamHI/SacI限制酶切消化以及连接作用将88A-dm3编码序列转化至pET21a中。由88A-dm3/pET21a所表达的蛋白质被命名为T7-88A-dm3。
实例30.FR(1Fa)的构建
使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及tant-OL-2（SEQ ID NO:113）以及PCR反应混合物3以及热循环特性表3，将编码了FR8a（见实例3）的N端部分的核酸片段从包含FR8a（SEQ ID NO:1）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物tant-OL-1（SEQ ID NO:114）以及tant-3’sac（SEQ ID NO:115）以及PCR反应混合物3以及热循环特性表3，将编码了Cry1Fa蛋白质（SEQID NO:76）的C端部分的核酸片段从包含mocry1Fa（SEQ ID NO:75）的质粒中进行PCR扩增。
然后，在一个重叠PCR反应中使用这两种PCR产物作为模板，该反应使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及tant-3’sac（SEQ ID NO:115），使用PCR反应混合物3以及热循环特性表3。将得到的PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中。然后，将来自包含FR8a的质粒的BamHI/MluI片段、来自pCR2.1中的重叠PCR产物的MluI/SacI片段、以及pET21a的BamHI/SacI片段相连接以创造出FR(1Fa)/pET21a。FR(1Fa)编码序列（SEQID NO:55）对FR(1Fa)嵌合蛋白质（SEQ ID NO:56）进行编码。该FR(1Fa)蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至468、以及Cry1Fa蛋白质（SEQ ID NO:76）的氨基酸470至649。
实例31.FR(1Ac)的构建
使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及1Ac-OL-2（SEQ ID NO:116）以及PCR反应混合物3以及热循环特性表3，将FR8a结构域I&II从包含FR8a（SEQ ID NO:1）的质粒中进行PCR扩增。使用引物1Ac-OL-1（SEQ IDNO:117）以及1Ac-3’sac（SEQ ID NO:118）以及PCR反应混合物3以及热循环特性表3，将Cry1Ac（SEQ ID NO:80）的结构域III从包含cry1Ac（SEQID NO:79）的质粒中进行PCR扩增。
在重叠PCR反应中将这2种PCR产物作为模板来使用，该反应使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及1Ac-3’sac（SEQ ID NO:118），使用以下条件：混合物3以及热循环特性表：94℃–30秒、68℃–30秒、68℃–30秒，20个循环。将重叠的PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中。将来自包含FR8a的质粒的BamHI/MluI片段、来自pCR2.1中的重叠PCR产物的MluI/SacI片段、以及pET21a的BamHI/SacI片段相连接以创造出FR(1Ac)/pET21a。该FR(1Fc)蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至468、以及Cry1Ac蛋白质（SEQ IDNO:80）的氨基酸477至608。
实例32.FR(1Ia)的构建
使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及1Ia-OL-2（SEQ ID NO:119）以及PCR反应混合物3以及热循环特性表3，将编码了FR8a结构域I和结构域II的核苷酸片段从包含FR8a（SEQ ID NO:3）的质粒中进行PCR扩增。使用引物1Ia-OL-1（SEQ ID NO:120）以及1Ia-3’sac（SEQ ID NO:121）以及PCR反应混合物3以及热循环特性表3，将编码了Cry1Ia蛋白质（SEQ IDNO:82）的结构域III的第二核苷酸片段从包含cry1Ia（SEQ ID NO:81）的质粒中进行PCR扩增。在重叠PCR反应中将这两种PCR产物作为模板来使用，该反应使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及1Ia-3’sac（SEQ ID NO:121）以及混合物3和热循环特性表：94℃–30秒、68℃–45秒，20个循环。将重叠的PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中。将来自包含FR8a的质粒的BamHI/MluI片段、来自pCR2.1中的重叠PCR产物的MluI/SacI片段、以及pET21a的BamHI/SacI片段相连接以创造出FR(1Ia)/pET21a。该FR(1Ia)蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至468、以及Cry1Ia蛋白质（SEQ ID NO:82）的氨基酸513至719。
实例33.Dm2-3A的构建
使用引物C2-3A-3（SEQ ID NO:95）以及FR-1Ab-2（SEQ ID NO:122）以及PCR反应混合物3以及热循环特性表2，将这个编码序列的5’端的部分从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。使用引物FR1Ab-1（SEQ ID NO:123）以及1Ab-6-sac（SEQ ID NO:86）以及PCR反应混合物3以及热循环特性表2，将编码了Cry1Ab结构域III的核苷酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。然后，在重叠PCR反应中使用这两种PCR产物作为模板，该反应使用引物C2-3A-3（SEQID NO:95）和1Ab-6-sac（SEQ ID NO:86）以及PCR反应混合物3和热循环特性表2。将得到的扩增子克隆至pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中。将FR8aBamHI/MluI、以及在pCR2.1-TOPO AflIII中的以上PCR产物FR8a AflIII/SacI连接形成pET21a BamHI/SacI。然后，将整个编码序列（BamHI/SacI）移至1454中。该DM2-3A嵌合的杀虫蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG（SEQ ID NO:127））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸10至451（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的7个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸460至648（它包括保守区块3的C端的41个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）。因此，DM2-3A eHIP在Cry3A055与Cry1Ab之间具有交换接点，该交换接点位于保守区块3之中，该保守区块3直接跟随着Ser451，它是结构域II结构域III接点的上游。DM2-3A具有针对西方玉米根虫的杀虫活性，但该活性小于8AF和FR8a eHIP的活性，如在表5中所示。
实例34.T7-8AF的构建
使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及C3-3A-6（SEQ ID NO:84）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的N端部分的核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物C3-1Ab-3（SEQ ID NO:85）以及1Ab-6-Sac（SEQ ID NO:86）以及PCR反应混合物1以及热循环特性表1，将编码了Cry1Ab蛋白质（SEQID NO:72）的C端部分的核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。
接下来，在重叠PCR反应中使用两种以上说明的PCR产物作为模板，该反应使用引物5’3A-1-bam（SEQ ID NO:83）以及1Ab-6-Sac（SEQ ID NO:86），使用PCR反应混合物2以及热循环特性表1。
将得到的扩增子作为平末端片段与用SmaI切割的pCR2.1-TOPO载体（Invitrogen,Carlsbad,CA）相连接以形成质粒p8AF/CR2.1。然后，将来自p8AF/CR2.1的BamHI-SacI片段与pET21a（EMD Biosciences,Inc.,San Diego,CA）相连接（该pET21a用BamHI-SacI进行切割），并被转化至大肠杆菌中。该开放阅读框被命名为T7-8AF(SEQ ID NO:144)并对T7-8AF杂合蛋白质（SEQ ID NO:145）进行编码。该T7-8AF杂合蛋白质从N端至C端包括肽基片段（包含氨基酸序列MASMTGGQQMGRGS（SEQ ID NO:126的氨基酸1至14））、Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至468（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及该Cry1Ab原毒素尾的38个氨基酸区域。该T7-8AF杂合蛋白质针对西方玉米根虫具有很小的活性或没有活性。
实例35.8AF的构建
将来自质粒p8AF/CR2.1（见实例34）的BamHI-SacI片段与包含组成型Cry1Ac启动子的质粒相连接（它是用BamHI-SacI进行切割），该启动子已经对由Schnepf等人（1985.J.Biol.Chem.260:6264-6272）所述的启动子进行了修饰，将存在于Schnepf等人的启动子中的固有的ATG起始密码子修正为ATC密码子，并且被转化至大肠杆菌之中。该开放阅读框被命名为T7-8AF（SEQ ID NO:63）并对8AF eHIP（SEQ ID NO:64）进行编码。8AFeHIP与FR8a eHIP相似，但并不包含该可任选的N端的肽基片段。8AF eHIP从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至468（它包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的24个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸477至648（它包括保守区块3的C端的24个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、以及可变区6）、以及Cry1Ab原毒素尾的38个氨基酸的区域。因此，8AF eHIP在Cry3A055与Cry1Ab之间具有交换接点，该接点位于保守区块3中，该保守区块3直接跟随着SEQ ID NO:70的Leu468，它是结构域II结构域III接点的下游。8AF eHIP针对玉米根虫具有高度的活性。
实例36.-catG8AF的构建。
制造了没有组织蛋白质酶G（Cat G）位点的构建体来确定在8AF eHIP的结构域I中的Cat G位点对根虫的活性是否是必需的。将来自包含moCry3A（SEQ ID NO:67）的质粒的1359bp BamHI/SalI片段与来自包含20L-8a（SEQ ID NO:1）的质粒的3483bp BamHI/SalI片段相连接以创造出–catG8AF（SEQ ID NO:146），它对–catG8AF eHIP（SEQ ID NO:147）进行编码。
-catG8AF eHIP针对西方玉米根虫具有非常强的活性，证明在8AF eHIP中的组织蛋白质酶G蛋白质酶识别位点对于杀虫活性而言不是所要求的。
实例37.8AFdm3的构建
在实例35中说明的8AF eHIP在位于结构域II/III接点的CB3下游中具有位于Cry3A055与Cry1Ab之间的交换点，导致8AF eHIP的结构域III具有Cry3A055的结构域III的小N端区域并且结构域III的剩余部分是Cry1Ab结构域III序列。为了确定Cry3A055的结构域III的小的N端区域对于8AF中的杀虫活性是否是所要求的，制造了另一个构建体，该构建体在Cry3A055与Cry1Ab之间具有交换，该交换位于CB3中准确地说是在结构域II结构域III的接点。
使用引物CMS96（SEQ ID NO:138）以及CMS97（SEQ ID NO:139）以及PCR反应混合物5以及热循环特性表5，将编码了部分的Cry3A055的结构域I和结构域II的核苷酸片段从包含FR8a（SEQ ID NO:3）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物CMS98（SEQ ID NO:140）以及CMS99（SEQ ID NO:141）以及PCR反应混合物5以及热循环特性表5，将编码了moCry1Ab的结构域III的核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。
在重叠PCR反应中使用这两种得到的扩增子作为模板，该反应使用引物CMS96（SEQ ID NO:138）以及CMS98（SEQ ID NO:140），使用PCR反应混合物5以及热循环特性表6。将得到的扩增子克隆至pCR4 Blunt（Invitrogen,Carlsbad,CA）中。将所克隆的扩增子的1633bp StuI/SacI片段（被命名为pCR4Blunt-OLWrdm3）、以及包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒的大约3089bp StuI/SacI片段相组合以创造出8AFdm3（SEQ ID NO:148），它对8AFdm3杂合蛋白质（SEQ ID NO:149）进行编码。
8AFdm3杂合蛋白质从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至454，该蛋白质包括结构域I和结构域II，这两个结构域包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的10个氨基酸、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸463至610，该蛋白质包括全部的结构域III，从而包括保守区块3的C端的38个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5以及可变区6。
因此，8AFdm3蛋白质在直接跟随着SEQ ID NO:70的Phe454之后具有位于Cry3A055与Cry1Ab之间的交换接点，该接点是处于结构域II结构域III接点上。8AFdm3蛋白质不具有针对西方玉米根虫的活性。这提示Cry3A055或Cry3A（因为它们在这个区域具有相同的序列）的CB3的24个氨基酸N端区域对于8AF eHIP的活性是必需的。
实例38.8AFlongdm3的构建
为了确定在Cry3A或Cry3A005与Cry1Ab之间CB3中的交换接点的位置对与根虫活性是否是至关重要的，制造了构建体，其中将该交换接点置于直接跟随着Cry3A055蛋白质的氨基酸519之后的CB4中。
使用引物CMS96（SEQ ID NO:138）以及CMS101（SEQ ID NO:143）以及PCR反应混合物5以及热循环特性表5，将编码了Cry3A055的结构域I的一部分以及结构域II全部以及结构域III的一部分的核酸片段从包含cry3A055（SEQ ID NO:69）的质粒中进行PCR扩增。
使用引物CMS98（SEQ ID NO:140）以及CMS100（SEQ ID NO:142）以及PCR反应混合物5以及热循环特性表5，将编码了Cry1Ab的结构域III的一部分的核酸片段从包含mocry1Ab（SEQ ID NO:71）的质粒中进行PCR扩增。
在一个重叠PCR反应中使用这两种得到的扩增子作为模板，该反应使用引物CMS96（SEQ ID NO:138）以及CMS98（SEQ ID NO:140），使用PCR反应混合物5以及热循环特性表6。将得到的扩增子克隆至pCR4Blunt（Invitrogen,Carlsbad,CA）中。将所克隆的扩增子的大约460bp SalI/SacI片段（被命名为pCR4Blunt-OL8AFlongdm3）、以及包含8AFdm3（SEQ ID NO:147）的质粒的大约4265bp SalI/SacI片段相组合以创造出8AFlongdm3（SEQID NO:150），它对8AFlongdm3杂合蛋白质（SEQ ID NO:151）进行编码。
8AFlongdm3杂合蛋白质从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ IDNO:70）的氨基酸1至519（它包括结构域I和结构域II，这两个结构域包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、保守区块3、可变区4、以及保守区块4的N端的6个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQID NO:72）的氨基酸528至610（它包括结构域III的C端区域，包括保守区块4的C端的4个氨基酸、可变区5、保守区块5、以及可变区6）。
因此，8AFlongdm3蛋白质在Cry3A055与Cry1Ab之间具有交换接点，该接点位于保守区块4之中，该保守区块4直接跟随着SEQ ID NO:70的Ile519。8AFlongdm3杂合蛋白质不具有针对西方玉米根虫的活性。这提示Cry3A-Cry1A eHIP的玉米根虫活性的关键区域在于在与CB3的氨基酸6至CB4的氨基酸7相对应的那些氨基酸之间的区域。
实例39.cap8AFdm3的构建
将来自包含8AFdm3（SEQ ID NO:148）的质粒的大约1363bpBamHI/SalI片段与来自包含FR8a（SEQ ID NO:3）的质粒的大约3362bpBamHI/SalI片段相连接以创造出cap8AFdm3（SEQ ID NO:152），它对cap8AFdm3eHIP（SEQ ID NO:153）进行编码。
cap8AFdm3蛋白质具有一些针对西方玉米根虫的活性，如在表5中所指示。在8AFdm3杂合蛋白质（它没有杀虫性）与cap8AFdm3eHIP之间的唯一的不同是存在N端的肽基片段（SEQ ID NO:127）。因此，将肽基片段加至无活性的杂合Cry蛋白质中创造出具有根虫活性的工程化的杂合杀虫蛋白质。
实例40.8AFdm3T的构建
将来自包含8AFdm3（SEQ ID NO:148）的质粒的大约4654bp PmlI/SacI片段与来自包含FR8a（SEQ ID NO:3）的质粒的大约190bp PmlI/SacI片段相连接以创造出8AFdm3T（SEQ ID NO:1540），它对8AFdm3T eHIP（SEQ IDNO:155）进行编码。8AFdm3T eHIP从N端至C端包括Cry3A055蛋白质（SEQ ID NO:70）的氨基酸1至454（它包括结构域I和结构域II，这两个结构域包括可变区1、保守区块1、可变区2、保守区块2、可变区3、以及保守区块3的N端的10个氨基酸）、以及Cry1Ab蛋白质（SEQ ID NO:72）的氨基酸463至610（它包括全部的结构域III，包括保守区块3的C端的38个氨基酸、可变区4、保守区块4、可变区5、保守区块5、可变区6）、以及Cry1Ab原毒素尾的38个氨基酸的区域。
在8AFdm3杂合蛋白质与8AFdm3T eHIP之间的唯一的不同是添加了38个氨基酸Cry1Ab原毒素尾部区域，这指示加入原毒素尾部区域加可以将无活性的杂合Cry蛋白质变成活性eHIP。
实例41.8AFlongdm3T的构建
将来自包含8AFlongdm3（SEQ ID NO:150）的质粒的大约4693bpPmlI/SacI片段与来自包含FR8a（SEQ ID NO:3）的质粒的大约190bpPmlI/SacI片段相连接以创造出8AFlongdm3T（SEQ ID NO:156），它对8AFlongdmT杂合Cry蛋白质（SEQ ID NO:157）进行编码。
在8AFlongdm3杂合Cry蛋白质与8AFlongdm3T杂合Cry蛋白质（它对西方玉米根虫没有活性）之间的唯一的不同是添加了38个氨基酸Cry1Ab原毒素尾部区域，这指示该原毒素区域本身不足以对8AFlongdm3杂合Cry蛋白质赋予杀虫活性。这指示除了原毒素尾部区域和/或N端的肽基片段之外多个可变区与保守区块的组合也可能是创造出某些eHIP所必需的。
实例42.cap8AFdm3T的构建
将来自包含cap8AFdm3（SEQ ID NO:152）的质粒的大约4693bpPmlI/SacI片段与来自包含FR8A（SEQ ID NO:3）的质粒的大约190bpPmlI/SacI片段相连接以创造出cap8AFdm3T（SEQ ID NO:158），它对cap8AFdm3T eHIP（SEQ ID NO:159）进行编码。
cap8AFdm3T蛋白质具有增加的针对西方玉米根虫活性，该活性超过了cap8AFdm3eHIP，如在表5中所指示。在cap8AFdm3eHIP（它具有一些针对玉米根虫杀虫的活性）与cap8AFdm3T eHIP之间的唯一的不同是存在来自Cry1Ab的38个氨基酸原毒素尾部区域。因此，可以通过添加N端的肽基片段以及原毒素尾部区域来制造一些杂合Cry蛋白质。
实例43.测试杂合蛋白质的杀虫活性
西方玉米根虫
在实验室生物测定法中对在以上所说明的实例中所产生的杂合蛋白质针对玉米根虫的杀虫活性进行测试。使用饮食掺入方法进行生物测定。将表达这些蛋白质之一的大肠杆菌克隆进行过夜生长。对500μl过夜培养物进行超声处理并确定有待测试的蛋白质的量值。然后，将蛋白质溶液同500μl融化的人造食物相混合，该人造食物与在Marrone等人（1985,J.of EconomicEntomology78:290-293）中所说明的食物相似。食物凝固之后，在培养皿中对其进行分配，并将20只新生的玉米根虫置于这些食物上。将培养皿保持在大约30℃。6天之后记录死亡率。
生物测定的结果示于表5中。栏1指出了杂合Cry蛋白质、工程化的杂合杀虫蛋白质以及嵌合杀虫蛋白质的名称。栏2指出了西方玉米根虫活性的相对水平（“-“=<40%死亡率；“+”=40-49%死亡率；“++”=50-59%死亡率；“+++”=60-80%死亡率；以及“++++”=>80%死亡率）。栏3指出了由蛋白质印迹法所检测的适当的蛋白质的相对水平。栏4指出了肽基片段的存在（“-”=没有肽基片段；#1=SEQ ID NO:126；#2=SEQ ID NO:127；#3=SEQ ID NO:128；#4=SEQ ID NO:129；#5=SEQ ID NO:130；#6=SEQ IDNO:131；#7=SEQ ID NO:132）。栏5至7示出了可变区（V1-V6）、保守区块（C1-C5）、以及相关的结构域（结构域I至III）的多个组合和排列，这些可变区、保守区块以及相关的结构域来自第一Bt Cry蛋白质或经修饰的Cry蛋白质以及不同于该第一Cry蛋白质或经修饰的Cry蛋白质的第二BtCry蛋白质，它们组成了对西方玉米根虫没有活性的核心杂合蛋白质以及具有针对玉米根虫活性的eHIP。栏8指出了在原毒素尾部区域（若存在的话）中的氨基酸的数目以及衍生出该尾部的Cry蛋白质（“1Ab-38”=来自Cry1Ab原毒素尾部的38个氨基酸；“1Ba-18”=来自Cry1Ba原毒素尾部的18个氨基酸）。
表5.西方玉米根虫生物测定的结果
针对几种昆虫物种对嵌合杀虫蛋白质2OL-8a和FR8a、以及2OL-12AeHIP进行测试以确定活性谱。所测试的昆虫包括西方玉米根虫（WCR）、北方玉米根虫（NCR）、南方玉米根虫（SCR）、马铃薯甲虫（CPB）、以及欧洲玉米螟（ECB）。这些测定的结果示于表6中。“+”指示杀虫活性。_“-”指示没有活性。”2OL-8a与FR8a CIP针对WCR、NCR、以及CPB是有活性的。2OL-12A eHIP针对ECB具有令人惊讶的活性。
表6.CIP的活性谱
实例44.将编码eHIP的基因插至至植物中
选择对杀虫蛋白质FR8a、FRCG以及FRD3进行编码的基因用于转化至玉米植物中。将包含FR8a或FRCG或FRD3的编码序列的表达盒转移至针对农杆菌介导的玉米转化的适宜的载体中。对于这个实例，在转化实验中使用了以下载体：12207（图3）、12161（图4）、12208（图5）、12274（图6）、12473（图7）以及12474（图8）。
未成熟的玉米胚的转化基本上如在Negrotto et al.,2000,Plant CellReports19:798-803中所说明进行。对于这个实例，所有的培养基组分基本上如在以上Negrotto等人所说明。然而，可以对本领域内已知的各种培养基组分进行替代。
将用于转化的基因克隆至适宜于玉米转化的载体中。在这个实例中所使用的载体包含用于转基因品系的的选择的磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因（Negrotto等人，上述）。
简言之，使包含植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)生长在YEP（酵母提取物(5g/L)、蛋白质胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH6.8）固体培养基上，在28℃生长2至4天。将大约0.8X109个农杆菌重悬于补充有100μM As的LS-inf培养基中（Negrotto等人，上述）。在这个培养基中对细菌进行预诱导30至60分钟。
将来自A188或其他适宜的基因型的未成熟胚从8至12天大的穗中切除至液体LS-inf+100μM As中。用新鲜的感染培养基对这些胚进行漂洗。然后添加农杆菌溶液，并将这些胚漩涡30秒并允许其与细菌一起沉降5分钟。然后，将这些胚的盾片侧向上转移至LSA培养基中并在黑暗中培养两至三天。随后，将每培养皿20至25之间的胚转移至补充有头孢噻肟（250mg/l）以及硝酸银（1.6mg/l）的LSDc培养基中并在黑暗中28℃下培养10天。
将产生胚性愈伤组织的未成熟的胚转移至LSD1M0.5S培养基中。在大约3周采用的传代培养的步骤在这种培养基上对培养物进行选择，持续大约6周。将存活的愈伤组织转移至补充有甘露糖的Reg1培养基中。接着，在光照中（16小时光照/8小时黑暗控制）培养之后，将绿色组织转移至没有生长调节物的Reg2培养基，并孵育大约1至2周。将这些小植株转移至包含Reg3培养基的Magenta GA-7boxes(Magenta Corp,Chicago Ill.)中并使其在光照中生长。大约2至3周之后，通过PCR测试了植物pmi基因和FR8a或FRCG基因的存在。将来自PCR测定的阳性植物转移至温室中并测试其针对玉米根虫的抵抗性。
实例45.转基因玉米植物针对玉米根虫效能的分析：根切除生物测定法
典型地，当将玉米植物从Magenta GA-7盒子移植至土壤中时对其进行采样。这使得从适度无菌的环境（相对于土壤条件）中对根进行采样。采样包括：切下一小块根（大约2至4cm长）并将其置于小培养皿中的浓化的phytagar（phytagar，12g；蔗糖，9g；MS盐，3ml；MS维生素，3ml；制霉菌素（25mg/ml），3ml；头孢噻肟（50mg/ml），7ml；金霉素（50mg/ml），7ml；链霉素（50mg/ml），7ml；dH2O，600ml）中。阴性对照是来自同一个转化实验的对FR8a或FRCG基因呈PCR阴性的转基因植物，或者来自生长于人工气候室中的非转基因植物（与试验植物具有相似的大小）。
在植物生长在土壤中之后也对根进行采样。如果对来自土壤的根采样，用水对根块进行洗涤以除去土壤残渣，将根块浸没至制霉菌素溶液（5mg/ml）中，从浸液中移除，用纸巾吸干，并且将其置于以上所述的phytagar皿中。
通过将大约10条第一龄幼虫置于每个phytagar皿的盖子的内表面上并接着在暴露的根块上方对盖子进行紧紧地重新密封而将根样品与西方玉米根虫一起孵育。使用细尖的画笔对幼虫进行处理。在孵育了所有的皿之后，将这些皿的底盘在室温下置于黑暗中直至数据收集。
在根孵育后大约2至4天，收集了数据。计算出幼虫的死亡百分比以及根的可见损伤等级。通过观察由根虫幼虫所造成的根块中的摄食缺口（FH）的数目来对摄食损伤打分，并将摄食损伤评定为高、中、低、或无，并且分别给予类别3、2、或1的数值（其中类别1包括损伤等级无和/或低）。类别1的植物典型地具有0-FH至2-FH；类别2的植物具有3至4-FH；以及类别3的植物具有>5-FH。具有类别1损伤等级的根样品被认为是优异的表现者，类别2：一般的表现者，并且类别3：不好的表现者。选择类别1的植物用于在温室和田地中进一步试验。
表7中的结果显示表达FR8a和FRCG eHIP的使根免受由西方玉米根虫所造成的摄食损伤的植物。表达嵌合的杀虫蛋白质的大多数的项（event）被认为是类别1的植物，而不表达嵌合的杀虫蛋白质的对照植物处于类别3中。对FRD3eHIP进行表达的植物提供了西方玉米根虫的可比较水平的控制。
表7.表达FR8a和FRCG的转基因植物针对WCR的效能
实例46.转基因玉米植物在田地中针对玉米根虫效能的分析
在田地中对使用以上说明的根切除生物测定法所识别的一些阳性植物进行评估。将来自每个项的十八株植物从试验点移去并且针对这些根的损伤对它们进行评价。使用爱荷华州0至3线性根损伤标度（Oleson,J.D.et al.,2005.J.Econ Entomol.98(1):1-8）对根损伤进行评定，其中0.00=无摄食损伤（能够给出的最低等级）；1.00=结节（根的环圈）或一整个结节的等效物，被吃回到（eaten back）茎的大约11/2英寸内（在第七个结节上的土壤线）；2.00=被吃掉的两个完整的结节；3.00=被吃掉的三个或更多个结节（能够给出的最高等级）；在多个被吃掉的完整的结节之间的损伤作为失去的结节的百分率被指出，即1.50=11/2被吃掉的结节，0.25=被吃掉的结节的1/4，等等。
针对西方和北方玉米根虫的田间试验结果显示在表8中，并且针对墨西哥玉米根虫的田间试验结果显示在表9中。与针对西方、北方以及墨西哥玉米根虫的标准商业化学杀虫剂相比，所有表达FR8a嵌合的杀虫蛋白质的转基因玉米表现得更好。
表8.西方和北方玉米根虫的田间试验的结果
| 项 | 质粒 | 根的等级 |
| 1 | 12161(ubi:FR8a) | 0.08 |
| 2 | 12161 | 0.05 |
| 3 | 12161 | 0.09 |
| 4 | 12161 | 0.04 |
| 5 | 12274(cmp:FR8a) | 0.04 |
| 6 | 12274 | 0.08 |
| 7 | 12274 | 0.05 |
| 化学品 | 0.15 | |
| 阴性检验 | 0.87 |
表9.墨西哥玉米根虫的田间试验的结果
| 项 | 质粒 | 根的等级 |
| 1 | 12161(ubi:FR8a) | 0.04 |
| 5 | 12274(cmp:FR8a) | 0.22 |
| 6 | 12274 | 0.05 |
| 化学品 | 0.15 | |
| 阴性检验 | 1.04 |
Claims (43)
1.工程化的杂合杀虫蛋白质，其从N端到C端的方向包括第一苏芸金芽胞杆菌（Bt）Cry蛋白质的N端区域，该N端区域与不同于所述第一Bt Cry蛋白质的第二Bt Cry蛋白质的C端区域相融合，其中所述第一Bt Cry蛋白质是Cry1Ab蛋白质且第二Bt Cry蛋白质是Cry3A蛋白质，其中在第一和第二BtCry蛋白质之间的交换位置位于保守区块3之中且任选地包含：
(a)位于C端的Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域；或者
(b)N端的肽基片段；或者
(c)(a)和(b)二者，
其中所述工程化的杂合杀虫蛋白质包含与SEQ ID NO:46具有至少80%同一性的氨基酸序列，且具有针对欧洲玉米螟的活性。
2.如权利要求1所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于其包括在C端的Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域。
3.如权利要求2所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于该原毒素尾部区域是来自针对鳞翅目昆虫具有活性的Bt Cry蛋白质的区域。
4.如权利要求3所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于该BtCry蛋白质是Cry1A。
5.如权利要求4所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于该Cry1A是Cry1Aa或Cry1Ab。
6.如权利要求5所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于Cry1Ab原毒素尾部区域包括38个氨基酸。
7.如权利要求6所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于Cry1Ab原毒素尾部区域包括与SEQ ID NO:72的氨基酸611至648相对应的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于Cry1Ab原毒素尾部区域包括SEQ ID NO:72的氨基酸611至648。
9.如权利要求1所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于其包括在N端的肽基片段，其中所述肽基片段包括9个氨基酸。
10.如权利要求9所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于所述肽基片段包括氨基酸序列YDGRQQHRG（SEQ ID NO:132）或氨基酸序列TSNGRQCAGIRP（SEQ ID NO:133）。
11.如权利要求10所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于该肽基片段选自下组：SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、和SEQ ID NO:132。
12.对如权利要求1至11中任何一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质进行编码的分离的核酸分子。
13.如权利要求12所述的分离的核酸分子，包括SEQ ID NO:45的核酸序列。
14.表达盒，包括异源的启动子序列，该启动子序列可操作地连接至如权利要求12所述的核酸分子上。
15.重组载体，包括如权利要求14所述的表达盒，其用于确保如权利要求1-11中任一项所述的杂合杀虫蛋白质的表达或产生。
16.转基因宿主细胞，包括如权利要求14所述的表达盒，其用于确保如权利要求1-11中任一项所述的杂合杀虫蛋白质的表达或产生。
17.如权利要求16所述的转基因宿主细胞，它是细菌的细胞。
18.如权利要求16所述的转基因宿主细胞，它是植物细胞。
19.转基因植物，包括如权利要求14所述的表达盒，其中所述植物产生如权利要求1-11中任一项所述的杂合杀虫蛋白质。
20.如权利要求19所述的转基因植物，其中所述植物是玉米植物。
21.来自权利要求19所述的转基因植物的种子，其中所述转基因种子包含权利要求12或13的核酸分子。
22.来自由权利要求20所述的转基因玉米植物的种子，其中所述转基因种子包含权利要求12或13的核酸分子。
23.抗欧洲玉米螟的转基因植物，其包括：
a)核酸分子，其包含编码SEQ ID No:46的工程化的杂合杀虫蛋白质的核苷酸序列；或者
b)核酸分子，其包含SEQ ID No:45的核苷酸序列，
其特征在于所述植物产生如权利要求1-11中任一项所述的杂合杀虫蛋白质。
24.对于控制欧洲玉米螟有用的杀虫组合物，包括如权利要求1-11中任一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质以及传统添加物质。
25.产生如权利要求1-11中任一项所述的针对欧洲玉米螟具有活性的工程化的杂合杀虫蛋白质的方法，包括：
(a)获得如权利要求16所述的转基因宿主细胞；和
(b)在允许该宿主确保表达针对欧洲玉米螟具有活性的工程化的杂合杀虫蛋白质的条件下生长该转基因宿主细胞。
26.产生抗昆虫的转基因植物的方法，包括以如权利要求14所述的表达盒转化植物细胞；和从转化的植物细胞再生转基因植物，其中使编码根据权利要求1的工程化的杂合杀虫蛋白质的核酸以控制昆虫的有效量表达于该转基因植物中。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述昆虫是鳞翅目昆虫。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述鳞翅目昆虫是欧洲玉米螟。
29.控制昆虫的方法，包括以效量的如权利要求1所述的工程化的杂合杀虫蛋白质处理所述昆虫。
30.制造如权利要求1-11中任一项的工程化的杂合杀虫蛋白质的方法，包括：
(a)获得编码Cry1Ab蛋白质的第一核酸；
(b)获得编码Cry3A蛋白质的第二核酸；
(c)以5’至3’的方向将编码Cry1Ab蛋白质的N端区域的第一核酸的5’部分融合至编码Cry3A蛋白质的C端区域的第二核酸的3’部分，其中在Cry1Ab蛋白质和Cry3A蛋白质之间的交换位置位于保守区块3以形成杂合核酸，所述杂合核酸编码工程化的杂合杀虫蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ IDNO:46具有至少80%同一性的氨基酸序列且具有针对欧洲玉米螟的活性；和任选地向杂合核酸的5’端融合编码肽基片段的核苷酸序列，导致5’延伸，或向杂合核酸的3’端融合编码Bt Cry蛋白质的原毒素尾部区域的核苷酸序列，导致3’延伸，或二者皆有；
(d)将所述具有或不具有所述5’延伸或所述3’延伸中之一或两者的的杂合核酸插入表达盒；
(e)将所述表达盒转化入宿主细胞，导致所述宿主细胞产生工程化的杂合杀虫蛋白质。
31.如权利要求1-11中任一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，所述Cry3A蛋白质是Cry3Aa或经修饰的Cry3Aa。
32.如权利要求1-11中任一项所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于所述交换位置位于保守区块3中，其紧随SEQ ID NO:72的氨基酸Leu476序列。
33.如权利要求31所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其特征在于所述交换位置位于保守区块3中，其紧随对应于SEQ ID No:72的Leu476的氨基酸。
34.如权利要求32所述的工程化的杂合杀虫蛋白质，其包含SEQ IDNO:46。
35.核酸分子，其编码如权利要求31所述的工程化的杂合杀虫蛋白质。
36.如权利要求35所述的核酸分子，其包含SEQ ID No:45的核苷酸序列。
37.表达盒，其包含异源启动子序列，所述序列可操作地连接至如权利要求35所述的核酸分子。
38.重组载体，其包含如权利要求37所述的表达盒，其用于确保如权利要求1-11中任一项所述的杂合杀虫蛋白质的表达或产生。
39.转基因宿主细胞，其包含如权利要求37的表达盒，其用于确保如权利要求1-11中任一项所述的杂合杀虫蛋白质的表达或产生。
40.如权利要求39所述的转基因宿主细胞，它是细菌细胞。
41.如权利要求39所述的转基因宿主细胞，它是植物细胞。
42.转基因植物，其包含如权利要求37所述的表达盒，其中所述植物产生如权利要求1-11中任一项所述的杂合杀虫蛋白质。
43.转基因种子，其来自如权利要求42所述的转基因植物，其中所述转基因种子包含如权利要求35或权利要求36所述的核酸分子。
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