CN102660560A - 人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗虫基因Cry1F-t及其应用。对Cry1F基因进行全面改造，得到如SEQ ID NO：1所示的Cry1F-t抗虫基因，在其前面加上AdhI增强子，放在含有强启动子35S的表达载体上，通过农杆菌介导的遗传转化方法将Cry1F-t基因转到玉米基因组中，得到含有Cry1F-t的转基因材料。实验证明本发明改造合成的Bt毒蛋白对玉米螟有显著的杀虫效果，Cry1F-t及其表达的目的蛋白能够在玉米中稳定高效表达，进而用于培育转Cry1F-t基因抗虫玉米。该Bt抗虫基因Cry1F-t也可以在提高其它农作物、果树或蔬菜等抗虫性中的得到应用，为解决玉米等植物生产中的虫害提供了一条有效途径。

Description

人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和生物防治领域，具体涉及一种人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t及其应用。

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringHansis)，为革兰氏阳性土壤杆菌。它在芽孢形成过程中产生称为δ-内毒素的杀虫伴胞晶体蛋白(控制合成这种蛋白质的基因在质粒上)，这些蛋白具有很高的杀虫活性。其作用原理为这种抗虫蛋白能被碱性肠液溶解，水解为更小的活性毒素片段-核心片段(Hofte and Whiteley，1989)。活性片段能抗蛋白酶的进一步水解，被激活的蛋白质结合在昆虫肠道上的刷状小泡上，引起穿孔从而影响渗透平衡，细胞膨胀并溶解，靶标生物停止取食并最后死亡。研究表明许多Bt蛋白，靶标害虫的肠道上皮细胞都具有高亲和性的结合位点(Hofte and Whiteley，1989)在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。研究证明，Bt晶体蛋白对人体、哺乳动物、鸟类、鱼类以及很多有益昆虫均无毒害作用，不污染环境，所以Bt制剂已作为一种无公害的天然微生物杀虫剂在农业、林业及环境卫生等方面应用了近50年。Bt晶体蛋白质必须被昆虫取食到才能发挥杀虫功能，但自然环境下Bt晶体蛋白质稳定性差，杀虫效果受天气影响大，太阳照后则易降解，也不能渗透到植物组织内部，易被雨水、露水冲刷掉，这些因素极大的限制了其发展应用。

1987年，比利时Vaeck等人首次获得转Bt杀虫蛋白抗虫烟草，获得的转基因烟草只能检测到微弱的抗虫性，其表达蛋白几乎检测不到，只占可溶性蛋白的0.001％。在我国，1992年，郭三堆等人采用植物优化密码子方法首先在国内人工合成全长1824bp的GFMCry1A杀虫基因，获得了中国第一代单价抗虫棉；丁群星等(1993)和王国英等(1995)分别用子房注射法和基因枪法将pB48.415质粒转入玉米愈伤组织中获得转基因植株，抗虫性测定表明其具有一定抗虫性；中国农业大学于1994年在国内外首次用子房注射的方法把抗虫基因Bt转入玉米并获得转基因植株；中国农业科学院周逢勇等在1998年将GFM杀虫基因构建到pMG6质粒上，导入到玉米中，后代检测表明Bt基因以孟德尔遗传方式遗传到下一代(LIU YJ等，2003)。当前，全世界已转化成26种以上Bt转基因植物，包括棉花、玉米、水稻等主要农作物。尽管转基因技术可打破生殖隔离，实现不同物种间的基因转移。但在某一物种内可高效表达的基因，被转化到另一物种后，表达量不一定高，也未必一定具有其本来的功能，尤其是对于差异较大的物种。其中，物种密码子偏好性是影响外源基因表达量的诸多因素之一。不同的物种往往具有不同的偏好密码子。分析这种偏好性，在转基因之前，对需要转化的目的基因进行密码子的重新设计或改造，对于提高外源基因在受体生物中的表达量具有重要作用。

1983年美国华盛顿大学宣布成功将卡那霉素抗性基因导入烟草细胞，以及同年4月美国威斯康星大学宣布成功将大豆基因转入向日葵共同标志着植物转基因技术的诞生。1986年，首批转基因植物(抗虫、抗除草剂)被批准进入田间试验。1989年哺乳动物抗体重链和轻链基因在烟草中成功表达并正确组装成有功能的抗体。1990年Gordon-Kamm首次报道用基因枪转化玉米悬浮细胞系获得了可育的转化体。随后，玉米转基因技术开始迅猛发展，大量转基因植物陆续研制开发成功。KozHal(1993)等培育出了抗虫转基因玉米，转基因植株能高水平表达CryIA(b)抗虫基因。张秀君(1999)等用基因枪法将两个含高赖氨酸蛋白质基因导入玉米的胚性愈伤组织。刘大文(2000)等将Zm13-Barnase基因转化玉米胚性愈伤组织，经过除草剂筛选得到阳性植株。Ishida(1996)等首次利用超双元载体建立了根癌农杆菌转化玉米自交系的幼胚，Frame(2002)等成功实现了根癌农杆菌利用普通的双元载体转化幼胚。张艳贞(2002)等对根癌农杆菌介导法将Bt杀虫基因导入优良玉米自交系进行了较为系统的研究，Huang(2005)、Frame(2006)和Lee(2007)等分别利用农杆菌成功转化了常规玉米自交系。

我国在转基因技术研究方面，已建立较成熟的玉米转基因技术体系。如中国农业大学在国内较早的开展了玉米遗传转化的工作，于1994在国内外首次用子房注射的方法把抗虫基因Bt转入玉米并获得转基因植株，以自主知识产权基因Bt为代表的抗虫玉米已展示了良好的开发前景。同时，在无选择标记、选择标记基因删除和目标基因产物定时降解、植物组织特异性优势表达等核心技术创新方面已具有较强的创新能力。目前已分离的抗虫基因很多，主要包括：①细菌来源的抗虫基因，主要是Bt毒蛋白基因(Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2、Cry3等)；②植物来源的蛋白酶抑制剂基因，特点在于抗虫谱广、来源于植物本身易于被公众接受；③细菌来源的营养杀虫蛋白(Vip1、Vip2、Vip3等)，广谱抗鳞翅目，特别是对小地老虎、粘虫和甜菜叶蛾具有较强作用。由于基因抗虫能力及昆虫耐受性的影响，转基因抗虫产品主要通过获得更多更有效的抗虫基因、改造已有基因、双抗植物体等途径获得。

玉米既是重要的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，当前玉米虫害(以玉米螟为主)严重，造成玉米大量减产，因此采取有效措施控制其危害对提高玉米产量、增加农民收入具有重要的意义。由于缺乏合适的抗虫品种，目前解决虫害的主要方法是在生长过程中喷施化学杀虫剂；但是化学杀虫剂同时杀死害虫及其天敌，造成生态不平衡和环境污染。通过转基因技术可以将Bt抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，降低农药的使用量，节省人力、物力及社会资源。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可在作物中稳定表达、且表达量高、抗虫效果好的人工合成抗虫基因Cry1F-t及其编码蛋白，并将其应用于载体、宿主细胞的转化构建等方面。

本发明的另一目的是将改造抗虫基因Cry1F-t转化玉米等其他植物，从而提高玉米等植物的抗虫性。通过转基因及常规育种手段，把抗虫基因Bt转入生产中普遍应用的骨干自交系中，为解决玉米等植物生产中的虫害提供一条有效途径。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

Cry1F-t基因是在野生型Cry1F基础上进行改造的，只留下部分缺失的N端1809bp的一段碱基序列(如SEQ ID NO：5所示)，并且在保持该段序列的氨基酸组成总体不变的情况下，用植物偏爱的密码子置换序列SEQID No.5相对应的密码子，排除DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列以及常用限制性酶切位点(SacI和XbaI)，然后通过置换密码子的方法进行改正消除，并在3端加上终止密码子TAG，获得一个改造的Cry1F-t基因序列(如SEQ ID NO：1所示)，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；另外，在改造的抗虫基因5端前面加上了AdhI的增强子序列SEQ ID No.3。然后确定并化学合成AdhI-Cry1F-t如序列表SEQ.ID NO：4所示的编码序列；根据基因功能分析的需要，进一步对合成的产物进行PCR克隆并测序，合成的基因装载在质粒载体pUC57上。

将本发明基因与原核表达载体可操作地连接，能够快速初步检测本发明合成的Bt抗虫基因Cry1F-t表达产物对玉米螟的毒性。将本发明基因与植物表达载体可操作地连接，将表达载体导入相应农杆菌中(LBA4404)，并通过农杆菌介导法进行玉米愈伤组织和幼胚的遗传转化，得到转人工合成Cry1F-t基因的玉米转化子，培育抗虫转基因玉米。也可以对其它农作物或者果树等进行遗传转化，使其具备抗虫活性。

本领域技术人员可以根据本发明公开的基因，以其转化玉米、棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。

本领域技术人员还可以将本发明基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产Bt蛋白，并将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。

本发明具有积极有益的效果：

本发明抗虫基因Cry1F-t序列与原始Cry1F序列比较，改造后的基因设计了缺失和DNA序列改变，并在基因的前面加上AdhI增强子，大大增强了其在植物中的表达。使用植物偏爱性密码子，减少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重复序列以及不明确的真核DNA序列内含子序列。对于改造后的Cry1F-t基因，与原始Cry1F基因序列相比，G+C含量为由37.65％提高到59.04％。Cry1F-t基因与原始DNA序列的同源性为69％。本发明抗虫基因Cry1F-t能在植物细胞中高效稳定的表达。

此人工改造合成的AdhI-Cry1F-t基因通过农杆菌介导、超声波处理和基因枪转化等手段导入玉米后，可以得到稳定遗传的抗虫的AdhI-Cry1F-t转化子。同时也可以把该Bt抗虫基因Cry1F-t转化到棉花、水稻、蔬菜等农作物中，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为含有增强子AdhI的新改造抗虫基因AdhI-Cry1F-t的合成及构建到质粒载体pUC57上的构建图谱：其中1：PUC57  XbaI/SacI双切，2：PUC57+AdhI-Cry1F-t  XbaI/SacI双切，3：DNA mark SM0331，4：PUCAdhI-Cry1F-t质粒；

图2为含有增强子AdhI的新改造抗虫基因AdhI-Cry1F-t的合成及构建到原核表达载体PET28b构建图谱：1：PET28b载体NdeI/HindIII双切，2：PET28b载体+AdhI-Cry1F-tNdeI/HindIII双切，3：DNA mark SM0331，4：PET AdhI-Cry1F-t质粒；

图3为含有增强子AdhI的新改造抗虫基因AdhI-Cry1F-t的合成及构建到植物表达载体pCAMBIA1300-Bar构建图谱：1：CPB载体XbaI/SacI双切，2：CPB载体+AdhI-Cry1F-tXbaI/SacI双切，3：DNA mark SM0331，4：CPBAdhI-Cry1F-t质粒；

图4为通过农杆菌介导法转化含有增强子AdhI的新改造抗虫基因AdhI-Cry1F-t转化流程及再生过程：A为浸染后的共培养；B为筛选培养；C为抗性愈伤组织；D为抗性愈伤的再生培养；E为抗性愈伤的分化培养；F为转基因植株的生根培养；G为转基因植株的移栽；H为温室里的转基因苗。

图5为T0代转化体目的基因Cry1F-t的PCR检测，M：DL2000plus其中CK1：阳性质粒对照，CK2：非转基因苗阴性对照，空白：双蒸水对照，1-6是Cry1F-t1到Cry1F-t6；

图6为T0代转化体目的蛋白Cry1F-t的检测图谱，CK1：未转基因苗阴性对照；1-6是Cry1F-t1到Cry1F-t6。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1Cry1F-t基因的设计与人工合成

Cry1F-t基因是在Bt基因Cry1F的原始核苷酸序列的基础之上，留下部分缺失的N端1809bp的一段碱基序列SEQ ID No.5，并且在保持保留序列氨基酸组成总体不变的情况下，采用植物基因的偏爱性密码子置换原始Bt的对应密码子，消除Bt基因中ATTTA、AATGAA等富含AT序列和不明确的内含子序列，并剔除基因中存在的大的反向重复序列和常用限制性内切酶识别位点序列，设计出目标合成的Bt基因的编码序列如序列表SEQ ID No.1所示。

含有增强子AdhI的新改造Bt抗虫基因AdhI-Cry1F-t(如序列表SEQ.ID NO：4所示)委托上海生物工程有限公司(2011年1月)合成。

所用试剂：上海生物工程有限公司。

具体方法步骤如下；

(1)用DNA work软件根据需要合成AdhI-Cry1F-t基因序列设计引物(寡核苷酸单链)58条，每条35-45bp，每条约33ug，约为10D。

(2)PCR连接引物为双链DNA，两轮PCR。

第一轮：反应体系

(所有试剂均由上海生物工程有限公司生产)

反应参数

95℃3min；94℃1min，55℃45S，72℃1min，20个循环；72℃延伸2min

第二轮：反应体系

(所有试剂均为上海生工生产)

反应参数

95℃3min；94℃1min，59℃45S，72℃1min，22个循环；2℃延伸3min

(3)1％琼脂糖凝胶电泳，有清晰的特异性条带，大小与预计相符。

(4)用凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。

(5)把PCR产物分别做克隆，提出质粒，酶切检测并测序。然后把得到正确质粒做模板设计全长PCR方案，进行PCR扩增就得到新改造的AdhI-Cry1F-t基因，基因全长2285bp。基因序列如序列表SEQ ID No.4所示。

(6)然后再次对AdhI-Cry1F-t基因全长PCR产物做克隆测序工作，克隆的基因装载在质粒载体pUC57，然后得到含有AdhI-Cry1F-t基因的质粒，命名为pUCAdhI-Cry1F-t载体。

实施例2含有增强子AdhI的新改造Bt抗虫基因AdhI-Cry1F-t在大肠杆菌细胞中的表达和表达产物的毒性检测

为快速检测新改造的Bt抗虫蛋白Cry1F-t对玉米螟的毒性情况，我们构建了AdhI-Cry1F-t基因的原核表达载体，对抗虫蛋白Cry1F-t毒性进行体外检测。

质粒pUCAdhI-Cry1F-t由上海生物工程公司提供，含有Cry1F-t基因。根据构建Cry1F-t基因原核表达载体的需要，在引物序列的5’端添加NdeI内切酶识别位点序列CATATG，3端添加HindIII内切酶识别位点序列AAGCTT。设计引物序列为：

上游引物F1：5-CATATGGGAAGGTGCAAGGATTGCTC-3

下游引物R1：5-AAGCTTCTATGTGGCAGTAACTGGGA-3

原核表达载体为Novgen公司的pET-28b，其启动子为T7 lac；所用表达菌株为BL21(DE3)，该菌株也适用于其它带T7 lac启动子的表达载体。载体构建方法流程如下：

第一步：PCR扩增AdhI-Cry1F-t基因，以pUCAdhI-Cry1F-t质粒为模板，以F1和R1为引物，5’端添加NdeI内切酶识别位点，3’端添加HindIII内切酶识别位点。用凝胶回收试剂盒回收纯化AdhI-Cry1F-t基因片段；

第二步：用限制性内切酶NdeI和HindIII酶切pET28b，凝胶回收试剂盒回收纯化5.3kb片段；

第三步：将两个纯化后的片段进行连接反应，构建所得原核表达质粒命名为pETAdhI-Cry1F-t，用限制性内切酶进行酶切鉴定，表明载体构建正确(见图2)；

第四步：用构建好的pETAdhI-Cry1F-t质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，并以转入无插入片断的表达载体质粒pET28b转化的BL21为对照菌株。

用含有pETAdhI-Cry1F-t的大肠杆菌BL21菌液经IPEG诱导后，提取Bt蛋白，以清水和含空载体pET28b大肠杆菌BL21菌液为对照，用玉米螟进行虫试，具体步骤如下：

①从平板上挑出单克隆接种在5ml含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；

②将过夜菌以1∶100的比例接种到5ml LB液体培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀达0.4-1；

③加入IPTG至终浓度为0.5mM，培养4小时；

④4000rpm离心10min，收集菌体；

⑤加入36ml裂解缓冲液(2mM Tris-HCl；0.2mM CaCl₂；PH＝8.0)，重新悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min；

⑥超声波破碎菌体(破碎参数：超声1秒，间隔2秒)，4000rpm离心10min，收集上清；

⑦将收集的上清加入到配置的玉米螟饲料中作为试验饲料。分别以含空载体pET28b大肠杆菌BL21菌液和清水的玉米螟饲料为对照，用玉米螟进行虫试：在每个试管中放入一条对应的饲料，并分别接入10头初孵未进食玉米螟，每个处理各接10个试管。放入温度26～28℃，相对湿度70％左右的环境中培养，进行毒性鉴定。试验结果表明：人工改造合成的Cry1F-t蛋白有较好的杀虫效果，玉米螟的死亡率达到91.67％，而且对玉米螟的生长有明显的抑制作用，活虫单只虫重仅有0.1531(见表1)。

表1Cry1F-t基因原核表达产物的毒性鉴定

实施例3植物转基因载体构建与农杆菌转化

第一步：用XbaI，SacI酶切T载体质粒pUCAdhI-Cry1F-t，用凝胶回收纯化试剂盒回收AdhI-Cry1F-t片段。

第二步：用XbaI，SacI酶切植物表达载体CPB，用凝胶回收纯化试剂盒回收酶切后的CPB片段。

第三步：纯化后的两片段进行连接反应，构建植物表达载体pCAMBIA1300-AdhI-Cry1F-t-Bar，酶进行酶切鉴定，表明载体构建正确(见图3)。

采用农杆菌介导的遗传转化方法(菌种LBA4404)进行玉米愈伤组织和幼胚的转化，将Cry1F-t基因玉米基因组中，经除草剂双丙氨膦筛选后获得转基因植株，经过筛选、再生、炼苗后进行转基因玉米的移栽(见图4)，转化植株长出7-8叶时，取叶片提取DNA，对目的基因Cry1F-t采用PCR技术初步检测外源基因(Cry1F-t)插入情况(见图5)。

引物序列：

Cry1F-t：5’-CCCCTACAACTGCCTCAACAAC-3’，

Cry1F-t：5’-TGGCGGTGATCAAGGCATCATC-3’，

目的片段大小：398bp退火温度58度，31个循环。

以Bt-Cry1F免疫诊断试纸条进行检测(购于北京真尼斯生物技术有限公司；货号：STX10301/0050)，结果表明目标蛋白在转基因玉米中得到高效表达(见图6)。

该载体含有Cry1F-t基因，为双价载体，可直接转化玉米，利用密码子优化原则改造合成的Cry1F-t基因，采用CaMV35S启动子，负责启动Cry1F-t基因表达，另外在基因的前面增加了AdhI增强子，负责增强Cry1F-t基因表达，。质粒pCAMBIA1300-35S-MCS-Bar(CPB)为山东大学提供，是在pCAMBIA1300质粒基础上构建的质粒含有一个目的基因插入盒(35S-多克隆酶切位点-Tnos)和一个来自吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar。择标记基因bar基因(bialaphos resistance gene)，长552bp，编码217个氨基酸。能使植物抵抗以L-Phosphiothricin(PPT，γ-羟基甲基亚膦基-α-酪氨酸，膦化麦黄酮)为活性成分的除草剂(De-Block等，1987；Wohlleben等，1988)，如除草剂Bialaphos(双丙氨膦)和Glufosinate(草丁膦)。bar基因是从合成Bialaphos的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中分离出来的(Wohlleben等，1988)，是S.Hygroscopicus避免自身产物Bialaphos毒害的保护基因，编码PPT乙酰转移酶(PAT)。PAT催化乙酰辅酶A的乙酰基转移到PPT的氨基上，形成乙酰PPT，而使PPT失活。

目前，也没有关于上述基因及其编码产物对人、畜及植物有不利影响的报道。因此，此改造的Bt抗虫基因Cry1F-t在提高转基因玉米抗虫性中能得到很好的应用。也可以应用与其它农作物、果树或蔬菜，如玉米、水稻、马铃薯、棉花等。

Claims (10)

1.一种人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种含有权利要求1或2所述人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t的原核表达载体。

4.一种增强权利要求1所述人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t表达的AdhI增强子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3。

5.一种含有权要求1所述增强子AdhI和权利要求1所述人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t的Bt抗虫基因AdhI-Cry1F-t，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.一种由权利要求1所述人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t编码的杀虫蛋白。

7.一种含有权利要求6所述杀虫蛋白的杀虫剂。

8.一种含有权利要求1或2所述人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t的植物表达载体。

9.一种由权利要求8所述植物表达载体转化的宿主细胞LBA4404。

10.权利要求1或2所述人工合成Bt抗虫基因Cry1F-t或权利要求7所述植物表达载体通过农杆菌介导方法进行玉米遗传转化的方法。

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