CN102719559B - 筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片及其应用。本发明提供的鉴定或辅助鉴定鳄梨日斑类病毒属类病毒的探针组，由5条探针组成，所述5条探针的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-5。还提供了筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针组固定在片基表面得到的基因芯片。本发明的实验证明，本发明采用生物信息学方法对鳄梨日斑类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该组的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明的筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片可用于鳄梨日斑类病毒属类病毒的检疫鉴定。

Description

筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片及其应用

技术领域

本发明涉及生物信息学及生物检疫鉴定技术领域，尤其涉及筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片及其应用。

背景技术

鳄梨日斑类病毒属类病毒（Avsunviroid）属于鳄梨日斑类病毒科（Avsunviroidae），目前只包括鳄梨日斑类病毒（Avocado sunblotch viroid,ASBVd）一个种。该类病毒侵染鳄梨（Persea Americana），在果实上引起黄色、白色或粉红色的斑纹，有时水果上能形成下陷的火山口状病斑，病斑可为黄色、绿色和深红色，受害果实不能上市，造成经济损失。该类病毒是2007年发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中的检疫性有害生物，需要依法对其寄主植物及其产品进行检疫。

随着国内外植物及其产品贸易的增加，该属出现“新”类病毒的频率越来越高，这种“新”主要表现在：（1）发现该属内新的类病毒种；（2）发现鳄梨日斑类病毒新的寄主植物；（3）类病毒种间可能的变异；这3种情况都会导致该属内出现新的具有检疫风险性的类病毒。对于这些潜在的新类病毒需要建立广谱性筛查技术，以便达到快速（一次反应可检测同一样品中该属的所有类病毒）、广谱（不会因为变异等出现漏检）筛查的目的。而现有的技术如生物学测定、正反向聚丙烯酰胺凝胶电泳及RT-PCR等通量低，一次只能检测样品中的一种类病毒，而且属于特异性检测，无法对变异大且变异位点多的类病毒进行检测。为了解决这些问题，国内外研究人员开展了广普性高通量筛查技术的研究。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定鳄梨日斑类病毒属类病毒的探针组。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定鳄梨日斑类病毒属类病毒的探针组，由探针1-探针5共5条探针组成，所述探针1-探针5的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-5。

上述探针中，所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒。

本发明的另一个目的是提供一种筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的基因芯片。

本发明提供的筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的基因芯片，为将上述的探针组固定在片基表面得到的基因芯片。

在上述基因芯片中，所述片基为醛基化玻璃片基，在本发明的实施例中采用的是博奥生物有限公司晶

微阵列基片,产品目录号：420022。

在上述基因芯片中，所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒。

本发明的第三个目的是提供一种筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的基因芯片。

上述试剂盒还包括所述试剂盒还包括用于扩增所述鳄梨日斑类病毒属类病毒的cDNA的引物对，所述引物对具体由序列表中序列6和序列表中序列7所示的DNA分子组成；所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒。

上述探针组、上述基因芯片或上述试剂盒在如下1）-4）中的应用，也是本发明保护的范围：

1）鉴定或辅助鉴定鳄梨日斑类病毒属类病毒；

2）制备鉴定或辅助鉴定鳄梨日斑类病毒属类病毒产品；

3）鉴定或辅助鉴定待测植物感染鳄梨日斑类病毒属类病毒；

4）制备鉴定或辅助鉴定待测植物感染鳄梨日斑类病毒属类病毒产品。

上述应用中，所述待测植物为鳄梨；所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒。

本发明的第四个目的是提供一种筛查或辅助筛查待测植物感染鳄梨日斑类病毒属类病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物；

2）将步骤1）得到的标记后产物与上述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；

3）将步骤2）得到的杂交后芯片扫描，

若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600且信噪比不小于3.0，则待测植物感染或候选感染鳄梨日斑类病毒属类病毒。

上述方法中，步骤1）中，所述标记为以所述cDNA为模板，以上述的试剂盒中的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标记，得到标记后产物；

步骤2）中，所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为12h；

在所述步骤2）后和步骤3）前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；

所述至少一条所述探针为上述探针组中的任意一条；

所述待测植物为鳄梨，所述组织为叶片；

所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒。

本发明的实验证明，本发明提供的筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒芯片中的探针具有鳄梨日斑类病毒属类病毒水平上的兼容性，所需的样品量少，一般仅需0.1g。另外数据的分析与计算机图像处理软件相结合，达到分析结果能够直观化、可视化。本发明采用生物信息学方法对鳄梨日斑类病毒属类病毒的核苷酸序列进行分析，设计了该属的兼容性探针，标准类病毒样品验证结果证明探针效果良好。本发明的鳄梨日斑类病毒属类病毒芯片可用于鳄梨日斑类病毒属类病毒的检疫鉴定。

附图说明

图1为鳄梨日斑类病毒属类病毒筛查芯片探针点阵示意图（6×5）

图2为鳄梨日斑类病毒属类病毒筛查芯片检测结果

图3为应用鳄梨日斑类病毒样品验证属筛查芯片的灵敏度结果

图4为PCR灵敏度检测结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片的制备

1、属级高兼容性寡核苷酸探针的设计

从美国国立生物技术信息中心（NCBI）及国际病毒学分类委员会(ICTV)数据库下载类病毒属全基因组及核酸序列；去除90%以上长度与其它序列有95%相似度的核酸序列；以5个碱基作为间隔，连续提取所有40mer的核酸序列；以40%≤GC含量≤60%、单个碱基含量≤50%、连续重复碱基数目≤4，且无大于6个碱基的发卡结构为标准对核酸序列进行筛选，并在NCBI数据库中进行同源性比较以保证所获得探针的特异性。

根据上述原则设计了鳄梨日斑类病毒属类病毒的5条探针（探针1-探针5），其核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1-5所示。

可以人工合成上述5条探针。

2、芯片的制备

将上述1得到的5条探针分别用点样缓冲液（博奥生物有限公司晶

芯片点样液,产品目录号：440010）溶解，浓度为50μM，每条探针横向重复3点点在醛基化玻璃片基芯片（博奥生物有限公司晶

微阵列基片,产品目录号：420022）上，每点约0.25nL，点直径约180μm，点间距为300μm，点样均匀度的标准方差为15％。将芯片点有探针的一面在65℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离为3cm，在空气中室温自然干燥，在进行一次水合。将点有探针的一面向上，放在紫外交联仪中250mJ交联。将芯片放在42℃预热，0.5％SDS清洗10min。将芯片转移到42℃预热蒸馏水中清洗2min。把芯片放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心1min，以去除芯片表面的液体，获得筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片。

筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片如图1所示，图1中1-5为鳄梨日斑类病毒属类病毒筛查芯片探针1-5（分别对应序列1-5），Hex为芯片固定阳性质控，PC为杂交阳性质控，NC为杂交阴性质控。

实施例2、筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片的应用

一、筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片检测样品

1、用于检测的样品总RNA提取

1）取感染鳄梨日斑类病毒的鳄梨叶片（鳄梨日斑类病毒拉丁名Avocado sunblotchviroid，购自American type culture collection简称ATCC,PV-663）0.1g，用液氮研磨成粉末状后，按照纳米磁珠植物病毒RNA提取试剂盒（武汉哇哇噻纳技术开发有限公司，产品目录号：EX1011）说明进行样品总RNA提取，-20℃保存备用。

2、样品标记与杂交

将上述得到的总RNA反转录得到cDNA。

PCR扩增，即在0.2mL的反应管中加入cDNA产物2μL、上游引物0.5μL（终浓度为0.5mmol/L）、下游引物0.5μL（终浓度为0.5mmoL/L）、dNTP Mix（10mmol/L）0.5μL、Taq酶（5U/μL）0.5μL、PCR缓冲液（10×）2μL及DEPC-H₂O 14μL，然后按照PCR反应程序进行扩增。

上游引物：5’-AGTTCACTCGTCTTCAATCTC-3’（序列6）；

下游引物：5’-CTGAAGAGACGAAGTGATCAA-3’（序列7）；

其PCR反应程序为：94℃5min;94℃30s、53℃30s、72℃30s;共30个循环;72℃延伸8min，得到PCR产物。

Klenow酶标记体系为25μL，即在0.2mL的PCR反应管中加入PCR产物5μL，9N随机引物（invitrogen，Cat.No.48190-011）（100μmol/L）2μL及H₂O 12μL，95℃变性3min，冰浴5min。然后向反应管中加入10×Klenow酶缓冲液2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，cy3-dCTP 0.5μL（Amersham,Cat.No.PA 53021终浓度为5nmol/L），klenow酶（5U/μL）1μL。37℃反应1.5h，70℃变性5min，冰浴5min，得到标记样品。

杂交：体系为16μL，包括2.4μL SSC（终浓度3×）、0.32μLSDS（终浓度0.2％）、4μL甲酰胺（终浓度25%）、1.6μL Denhardt’s（Ameresco，Cat.No.E717，终浓度5×）和标记样品7.68μL。95℃变性3min，冰浴5min，瞬时离心。将杂交液加到芯片上，盖玻片盖好，42℃水浴杂交过夜（12h），得到杂交后的芯片（鳄梨日斑类病毒）。

3、洗涤、扫描

清洗体系及程序如下：

先将洗液I、II放在微波炉中预热到42℃，转移到清洗盒中。杂交结束后，将杂交后的芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面向上，放在水平摇床上缓慢清洗。芯片清洗后，放在50mL锥形离心管中，2000rpm离心1min，除去芯片表面的液体，得到待检测芯片（鳄梨日斑类病毒）。

将上述待检测芯片（鳄梨日斑类病毒）置于扫描仪中进行扫描分析；PMT设为900，获得各点荧光强度及背景强度等数据。

使用博奥生物公司LuxScan 3.0芯片扫描仪从芯片中提取数据，探针的信号值为探针前景值的中位值减去背景值的中位值。信噪比为图像对应点内所有信号值中位值与背景值中位值的比值。

若至少一条所述探针的信号值≥600且信噪比≥3，判为阳性（为鳄梨日斑类病毒属类病毒感染）；探针的信号值＜600且信噪比＜2，判为阴性（不为鳄梨日斑类病毒属类病毒感染）；其余情况判为可疑，需重复验证。

鳄梨日斑类病毒的检测结果如图2所示，其探针排列与图1相同，探针1、2、4所在位置的信号值分别为4918、2567、5291，均大于600；信噪比分别为6、5、9，均大于3；所以探针1、2、4判为阳性，说明本发明可以检测鳄梨日斑类病毒属类病毒的鳄梨日斑类病毒。

上述芯片的固定阳性质控、杂交阳性质控及杂交阴性质控表现良好，标准样品杂交信号强，说明设计的探针及建立的芯片筛查程序具有良好的工作效果。

二、筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的芯片与PCR检测灵敏度比较

准确称取0.1g感染鳄梨日斑类病毒的鳄梨叶片，提取总RNA，分别用于鳄梨日斑类病毒属类病毒筛查芯片检测和PCR检测，两者所用的RNA均进行10¹、10²和10³倍梯度稀释。

芯片检测的方法同上述的一，结果如图3所示，图3的探针排列与图1相同，其中A：10¹稀释；B：10²稀释；C：10³稀释。A中探针1、2、4所在位置的信号值分别为2318、1250、1866，均大于600；信噪比分别为6、4、5，均大于3；所以探针1、2、4判为阳性。B中探针1所在位置的信号值为1072，大于600；信噪比为3；可以判定探针1为阳性。C无信号。因此，鳄梨日斑类病毒属类病毒筛查芯片可检测到待检对象的最高稀释倍数为10²。

PCR检测的引物为

上游引物：5’-AGTTCACTCGTCTTCAATCTC-3’；

下游引物：5’-CTGAAGAGACGAAGTGATCAA-3’。

PCR检测的结果如图4所示，1：10¹稀释；2：10²稀释；3：10³稀释；4：空白对照；M：Marker DL2000，可以看出，10¹和10²稀释模板均得到247bp的产物（鳄梨日斑类病毒的Genbank号NC_001410的第1-247位核苷酸），待检对象的最高稀释倍数为10²。

因此，鳄梨日斑类病毒属类病毒筛查芯片检测灵敏度与PCR方法灵敏度相当。

Claims (9)

1.一种鉴定或辅助鉴定鳄梨日斑类病毒属类病毒的探针组，由探针1-探针5共5条探针组成，所述探针1-探针5的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-5。

2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于：所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒。

3.一种筛查鳄梨日斑类病毒属类病毒的基因芯片，为将权利要求1或2所述的探针组固定在片基表面得到的基因芯片。

4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于：所述片基为醛基化玻璃片基；所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒。

5.一种筛查鳄梨日斑类病毒的试剂盒，包括权利要求3或4所述的基因芯片。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增所述鳄梨日斑类病毒属类病毒的cDNA的引物对，所述引物对具体由序列表中序列6和序列表中序列7所示的DNA分子组成；所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒。

7.权利要求1或2所述探针组、权利要求3或4所述的基因芯片、权利要求5或6所述的试剂盒在如下1）-4）中的应用：

1）鉴定或辅助鉴定鳄梨日斑类病毒属类病毒；

2）制备鉴定或辅助鉴定鳄梨日斑类病毒属类病毒产品；

3）鉴定或辅助鉴定待测植物感染鳄梨日斑类病毒属类病毒；

4）制备鉴定或辅助鉴定待测植物感染鳄梨日斑类病毒属类病毒产品；

所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒；所述待测植物为鳄梨。

8.一种筛查或辅助筛查待测植物感染鳄梨日斑类病毒属类病毒的方法，包括如下步骤：

1）将待测植物的组织的cDNA进行标记，得到标记后产物；

2）将步骤1）得到的标记后产物与权利要求3或4所述的基因芯片进行杂交，得到杂交后芯片；

3）将步骤2）得到的杂交后芯片扫描，

若所述基因芯片上的至少一条所述探针的信号绝对值不小于600且信噪比不小于3.0，则待测植物感染或候选感染鳄梨日斑类病毒属类病毒；

所述待测植物为鳄梨，所述组织为叶片；

所述鳄梨日斑类病毒属类病毒为鳄梨日斑类病毒。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

步骤1）中，所述标记为以所述cDNA为模板，以权利要求6所述的试剂盒中的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物，再将所述PCR产物进行Klenow酶标记，得到标记后产物；

步骤2）中，所述杂交的温度为42℃，所述杂交的时间为12h；

在所述步骤2）后和步骤3）前还包括将所述杂交后芯片进行洗涤的步骤；

所述至少一条所述探针为权利要求1或2所述探针组中的任意一条。

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