CN118186140A - 一种基于实时定量pcr对小麦品种抗旱性进行鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于鉴定检测领域，具体涉及一种基于实时定量PCR对小麦品种抗旱性进行鉴定的方法。本发明通过对小麦品种在苗期生长过程中进行干旱胁迫，同时设置对照组，提取小麦植株的总RNA，并对其中TaNF‑YA9基因表达量进行检测，获得表达量抗旱指数DIE；利用DIE表达量抗旱指数对小麦进行抗旱性能评价。本发明可实现对小麦抗旱性的快速准确鉴定，为小麦抗旱性筛选提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于鉴定检测领域，具体涉及一种基于实时定量PCR对小麦品种抗旱性进行鉴定的方法。
背景技术
小麦是我国主要粮食作物，其生产量及品质受干旱影响显著。小麦抗旱性表现是由自身的遗传效应和环境因素共同制约的，作物在不同生长发育阶段对生物和非生物因素的敏感性不同，现有的抗旱性研究方法存在局限性，往往无法提供一个直接且准确的小麦抗旱性评价。目前，小麦抗旱性鉴定的方法有很多，主要包括田间鉴定法、人工模拟鉴定法、生理指标法、分子生物学鉴定法等。其中田间鉴定法是在不同的生长发育时期对作物生长形态进行鉴定，但也存在着环境因素(天气变化、土壤异质性等)、耗时耗力、收集处理数据复杂等多方面的制约；人工模拟鉴定法是指在人为控制条件下如温室、气候箱或实验室的环境中通过设置干旱条件来考察小麦的生长发育、生理过程或者产量结果，此方法无法完全复制自然环境中的干旱情况，且空间成本高，往往只能处理有限数量的样本影响到实验结果的普遍性和代表性；生理生化指标鉴定是指通过测量植物的生理和生化反应来评估其抗旱性，包括叶绿素含量、脯氨酸积累、抗氧化酶活性等，但是，这些理化指标的测定可能受到生长环境和生育阶段的影响，同时也可能因试剂使用和操作差异引入误差；而分子生物学鉴定法主要通过分子标记构建遗传图谱来定位小麦的抗旱基因，但抗旱性是由多个基因控制的复杂性状，尽管近些年研究了许多抗旱性QTL，但标记的多态性频率很低，单一QTL对表型的影响较小，且上位性效应难以评估，这使得基于分子标记的辅助选择需要进一步研究。因此，迫切需要开发新技术、发现新的标记物来解决这些问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种基于实时定量PCR对小麦品种抗旱性进行鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)选择待鉴定的小麦品种，将其播种于铺有培养基质的育苗盆内，待小麦植株的生长至3叶期进行干旱胁迫处理，同时设置对照组；
(2)干旱胁迫处理后，提取小麦植株第一展开叶片的总RNA；
(3)采用实时定量PCR对提取的总RNA中TaNF-YA9基因表达量进行检测，获得干旱胁迫TaNF-YA9的表达量以及对照组TaNF-YA9表达量；
(4)计算小麦表达量抗旱指数DIE，依据以下公式：表达量抗旱系数DCE＝干旱胁迫TaNF-YA9表达量÷对照组TaNF-YA9表达量DIE＝(表达量抗旱系数DCE×干旱胁迫TaNF-YA9的表达量)÷所有小麦品种干旱胁迫表达量的平均数；
(5)依据DIE对小麦品种抗旱能力进行评价，其中DIE≥1.3为极抗旱，DIE为1.10～1.29为强抗旱；DIE为0.91～1.10为中等抗旱；DIE为0.70～0.90为弱抗；DIE≤0.70为极弱抗旱。
进一步的，步骤(1)中所述干旱胁迫处理时间为10天。
更进一步的，所述干旱胁迫是控制育苗盘中培养基质的含水量低于18％。
进一步的，采用Trizol试剂提取小麦植株顶部叶片的总RNA。
进一步的，采用实时荧光定量PCR对提取的总RNA中TaNF-YA9基因表达量进行检测。
进一步的，所述实时荧光定量PCR进行检测时，所采用的反应体系每25μl中包括以下组分：12.5μl KOD FX PCR缓冲液、5μl dNTPs、每10pmol正引物和反向引物各0.75μl、2.5μl模板cDNA、3μl ddH2O和0.5μl KOD FX。
进一步的，将提取的总RNA合成第一链cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。
本发明具有以下有益效果：
(1)简便性：本方法通过单一的荧光定量PCR技术实现对小麦抗旱性的鉴定，无需结合其他性状或指标进行分析，简化了鉴定流程。
(2)准确性：本发明通过TaNF-YA9基因表达水平确定的抗旱指数(DIE)与各小麦品种的产量抗旱指数(DIp)之间展示了极显著的正相关性，与当前广泛使用的田间鉴定法的结果相吻合。
(3)广泛的适用范围：本发明的鉴定方法适用于小麦品种多种类型，包括冬性、弱(半)冬性和春性的抗旱性鉴定，具备广泛的应用潜力。
(4)高效率：可在小麦苗期就进行抗旱性鉴定，大幅提高了鉴定效率。基于TaNF-YA9基因的荧光定量PCR抗旱性检测方法，为小麦抗旱性的鉴定提供了一种高效、先进的技术手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明实施例1中表达量抗旱指数DIE和产量抗旱指数DIP的相关性曲线图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所用的34个小麦品种均为市场购买所得。
实施例1
选择市场上广泛应用的34个小麦品种进行抗旱性检测(表1)，具体包括以下步骤：
1、将采购的小麦种子于铺有培养基质的育苗盘中种植，待其长到三叶期时进行干旱胁迫处理，控制培养基质含水量低于18，同时设置正常浇水的对照组；
2、干旱胁迫处理7—9天，提取小麦植株对照组和处理组的顶部叶片的总RNA。使用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA，然后使用Nanodrop分光光度计检测产量和纯度。
3、TaNF-YA9为差异表达基因，分别对该基因进行表达量检测，具体步骤为：
使用PrimerScript RT Master Mix(TaKaRa，中国)从总RNA合成第一链cDNA，并在7500Real-Time PCR System(Applied Biosystems,USA)下使用试剂(PowerUP SYBRGreenMaster Mix)对TaNF-YA9进行实时定量PCR，PCR反应体积为25μl，含12.5μl KOD FX PCR缓冲液、5μl dNTPs、每10pmol正引物和反向引物各0.75μl、2.5μl l模板cDNA、3μl ddH2O和0.5μl KOD FX，内参基因为Ta-alpha-tubulin。
4、计算小麦表达量抗旱指数DIE，依据以下公式：
表达量抗旱系数DCE＝干旱胁迫TaNF-YA9表达量÷对照组TaNF-YA9表达量
DIE＝(表达量抗旱系数DCE×干旱胁迫TaNF-YA9的表达量)÷所有小麦品种干旱胁迫表达量的平均数；
5、依据DIE对34个小麦品种进行抗旱能力评价，其中DIE≥1.3为极抗旱(HR)，DIE为1.10～1.29为强抗旱(R)；DIE为0.91～1.10为中等抗旱(MR)；DIE为0.70～0.90为弱抗(S)；DIE≤0.70为极弱抗旱(HS)。
针对上述34个小麦品种进行抗旱性检测结果如表1所示。
表134个小麦品种抗寒性检测结果
利用Microsoft Excel 2019建立表达量抗旱指数DIE与产量抗旱指数DIP之间的线性方程(图1)，达到极相关(R＝0.92,p<0.01)。该方法可以在小麦苗期快速、准确地鉴定抗旱性，无需等待成熟收获，提高了抗旱性鉴定效率。
本发明抗旱评价指标针对小麦的苗期，鉴定结果精准、效率高，从播种到鉴定结束仅需15—20天，1年内可完成多次鉴定。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种基于实时定量PCR对小麦品种抗旱性进行鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择待鉴定的小麦品种，将其播种于铺有培养基质的育苗盆内，待小麦植株的生长至3叶期进行干旱胁迫处理，同时设置对照组；
(2)干旱胁迫处理后，提取小麦植株第一展开叶片的总RNA；
(3)采用实时定量PCR对提取的总RNA中TaNF-YA9基因表达量进行检测，获得干旱胁迫TaNF-YA9的表达量以及对照组TaNF-YA9表达量；
(4)计算小麦表达量抗旱指数DIE，依据以下公式：表达量抗旱系数DCE＝干旱胁迫TaNF-YA9表达量÷对照组TaNF-YA9表达量DIE＝(表达量抗旱系数DCE×干旱胁迫TaNF-YA9的表达量)÷所有小麦品种干旱胁迫表达量的平均数；
(5)依据DIE对小麦品种抗旱能力进行评价，其中DIE≥1.3为极抗旱，DIE为1.10～1.29为强抗旱；DIE为0.91～1.10为中等抗旱；DIE为0.70～0.90为弱抗；DIE≤0.70为极弱抗旱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述干旱胁迫处理时间为10天。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述干旱胁迫是控制育苗盘中培养基质的含水量低于18％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用Trizol试剂提取小麦植株顶部叶片的总RNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用实时荧光定量PCR对提取的总RNA中TaNF-YA9基因表达量进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR进行检测时，所采用的反应体系每25μl中包括以下组分：12.5μlKOD FX PCR缓冲液、5μldNTPs、每10pmol正引物和反向引物各0.75μl、2.5μl模板cDNA、3μlddH2O和0.5μlKOD FX。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将提取的总RNA合成第一链cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测。
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