CN112430605B - 大豆内参基因及其检测引物与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了大豆内参基因及其检测引物与应用，其是一组用于分析大豆单叶和复叶中，基因近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应的内参基因，包括适用于分析单叶和复叶中上述三种条件的GmGAPDHa和GmRAB5C，适用于分析单叶和复叶中基因近日节律表达的GmGAPDHb、GmH3.3和GmPIP7a。上述内参基因为分析大豆单叶和复叶中，基因近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应相关研究结果的稳定性及可靠性提供有利支持，尤其是填补了大豆近日节律研究中内参基因的空白。

Description

大豆内参基因及其检测引物与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及大豆内参基因及其检测引物与应用，特别是适用于分析单叶和复叶中，基因近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应的内参基因GmGAPDHa和GmRAB5C；适用于分析单叶和复叶中基因近日节律表达的GmGAPDHb、GmH3.3和GmPIP7a。
背景技术
目前有很多方法可用于检测基因表达，其中Northern Blot不利于精准量化和高通量的检测基因表达；DNA芯片可以实现高通量检测基因表达，但芯片对较微弱的基因表达差异灵敏度不足，且特异性存在缺陷。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是目前用于检测基因表达差异手段中较灵敏的方法，并且可以通过引物的特异性确保检测单个基因或特定剪接形式的表达差异。但qRT-PCR通常需要一个组成型、稳定表达的基因作为内参基因，用于降低实验操作产生的误差，从而实现比较不同样品间基因相对表达量的差异。因此，内参基因的选择对于qRT-PCR技术至关重要。
在拟南芥和水稻等相关研究中发现，多个常用内参基因的表达具有节律性，不适合分析基因近日节律和昼夜节律表达，已有研究中利用qRT-PCR分析恒定条件下基因节律性表达时，使用了大豆中Actin、TUBA、TUBB和UBQ的同源基因作为内参基因。已有报道中，研究人员使用GmActin同源基因作为内参，在持续光照条件下检测大豆单叶中GmLUX同源基因节律性表达；使用GmTUBA作为内参基因，在持续光照或持续黑暗条件下分析复叶中GmFT4节律性表达；使用GmTUBB作为内参基因，在持续光照或持续黑暗条件下分析复叶中GmCOL1a和GmCOL1b的节律性表达；使用GmUBQ作为内参基因，在持续光照或持续黑暗条件下检测了大豆单叶中GmLCL和GmTOC1同源基因的节律性表达。
大豆是典型的短日照植物，充足的水分供给对于大豆的产量至关重要，尤其是在花期和灌浆期，干旱会导致大豆减产30％-80％。生物钟调控关键农艺性状和胁迫耐受性，已有研究表明拟南芥生物钟核心组分LHY调控ABA合成相关基因的表达。已有部分研究在不同光周期条件下和干旱条件下筛选用于基因表达分析的内参基因，大豆ELF1B同源基因在各个发育时期和昼夜不同时间点稳定表达，大豆中ELF1B另一同源基因在多种胁迫条件下表达稳定，在ABA处理后不同器官中中稳定表达。有研究通过在长日照和短日照条件下对6个大豆品种的分析，发现GmActin11在不同的组织和光周期条件下表达稳定。有研究分析对干旱敏感的大豆BR16材料在一天中不同时间点内参基因的表达，发现GmFYVE和GmNUDIX表达稳定。
总之，目前用于大豆生物钟调控基因表达分析的内参基因缺少系统地研究，尤其缺少能够同时应用于不同器官中基因近日节律和干旱响应相关表达的内参基因筛选。因此，筛选适用于分析大豆单叶和复叶中，基因近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应的内参基因的具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供适用于分析大豆单叶和复叶中，基因近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应的内参基因。
本发明的另一目的是提供上述内参基因的检测引物与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于与大豆近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应相关基因相对表达量分析的内参基因，所述内参基因选自GmGAPDHa、GmRAB5C、GmGAPDHb、GmH3.3或GmPIP7a，优选GmGAPDHa或GmRAB5C。
第二方面，本发明提供所述内参基因的检测引物。
GmGAPDHa(基因ID：Glyma04g36870)引物序列：
SEQ ID NO:1：正向引物：5’-CCTCTTGTGGAGGAGGATGGAG-3’；
SEQ ID NO:2：反向引物：5’-CCACCGAAACGTCATTACTGG-3’。
GmRAB5C(基因ID：Glyma18g05120)引物序列：
SEQ ID NO:3：正向引物：5’-GAACTGTATTTGCACTCCCCAAC-3’；
SEQ ID NO:4：反向引物：5’-GACACAAACTACACGTCCAAAGG-3’。
GmGAPDHb(基因ID：Glyma06g18110)引物序列：
SEQ ID NO:5：正向引物：5’-CGAGTGGGGATACAGCTCAC-3’；
SEQ ID NO:6：反向引物：5’-ATCGCAGCTAAACATAAACATACGG-3’。
GmH3.3(基因ID：Glyma18g01870)引物序列：
SEQ ID NO:7：正向引物：5’-CCATGACTGTGTCTTCTTCCTTTCAG-3’；
SEQ ID NO:8：反向引物：5’-CTCCCGATAAGAACAAGGCAAAGC-3’。
GmPIP7a(基因ID：Glyma02g42220)引物序列：
SEQ ID NO:9：正向引物：5’-GGACCTTTCATTGGTGCTGCA-3’；
SEQ ID NO:10：反向引物：5’-CTTGATGAAATGAAACCGAAACCCAG-3’。
第三方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供所述内参基因、所述内参基因的检测引物或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在与大豆近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应相关基因的相对表达量分析中的应用。
前述的应用，基因相对表达量的分析方法为实时荧光定量PCR法。
第五方面，本发明提供一种与大豆近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应相关基因的实时荧光定量PCR检测方法，所述方法中使用GmGAPDHa、GmRAB5C、GmGAPDHb、GmH3.3或GmPIP7a(优选GmGAPDHa或GmRAB5C)作为内参基因。
实时荧光定量PCR的反应体系如下：
试剂 20μl体系
2×SYBR混合液 10μl
Forward Primer(10μM) 0.5-2μl
Reverse Primer(10μM) 0.5-2μl
cDNA(10ng/μl) 0.1-1μl
ddH<sub>2</sub>O 补齐至20μl
PCR反应程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，40个循环。
本发明中，所述与大豆近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应相关基因包括但不限于GmDREB5。
本发明提供一组用于分析大豆单叶和复叶中，基因近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应的内参基因，包括适用于分析单叶和复叶中上述三种条件的GmGAPDHa和GmRAB5C，适用于分析单叶和复叶中基因近日节律表达的GmGAPDHb、GmH3.3和GmPIP7a。上述内参基因为分析大豆单叶和复叶中，基因近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应相关研究结果的稳定性及可靠性提供有利支持，尤其是填补了大豆近日节律研究中内参基因的空白。
附图说明
图1为本发明实施例1中新筛选的候选内参基因在大豆单叶(Unifoliate leaf)和复叶(Trifoliate leaf)中表达分析，大豆WS82材料在25℃、12小时光照/12小时黑暗条件下培养14天，转移至25℃、持续光照条件下，从ZT24至ZT72每间隔3小时取材一次，利用qRT-PCR检测候选内参基因的表达。A～I分别对应不同的内参基因。
图2为本发明实施例1中文献已报道内参基因在大豆单叶和复叶中表达分析，大豆WS82材料在25℃、12小时光照/12小时黑暗条件下培养14天，转移至25℃、持续光照条件下，从ZT24至ZT72每间隔3小时取材一次，利用qRT-PCR检测内参基因的表达。A～I分别对应不同的内参基因。
图3为本发明实施例1中利用NormFinder软件评估候选基因组内和组间的表达差异。(A)单叶和复叶16个时间点样品中候选内参基因qRT-PCR扩增Cq(cyclequantification)值汇总。(B)使用Normfinder分析所有样品中候选内参基因的Stabilityvalue；Stability value越小代表基因表达越稳定。
图4为本发明实施例2中昼夜节律条件下干旱胁迫的大豆内参基因筛选。(A-B)大豆WS82在12-h L/12-h D，25℃条件生长至V1期，对照(Control)保持水分充足，干旱胁迫(Drought)限制浇水；ZT24-48每3h取材一次，单叶和复叶中候选内参基因表达分析。(A)对照和干旱胁迫样品中候选内参基因表达水平(Cq值)分析；(B)使用Normfinder分析候选内参基因在对照和干旱胁迫条件下Stability value。(C)对实施例1中恒定条件取材和实施例2中昼夜节律及干旱胁迫取材中候选内参基因表达水平(Cq值)汇总分析。(D)使用Normfinder分析(C)中候选内参基因的Stability value。
图5为本发明实施例3中在对照(Control)和干旱胁迫(Drought)条件下，分别以GmGAPDHa(A)、GmRAB5C(B)、GmGAPDHb(C)、GmH3.3(D)、GmPIP7a(E)或GmUBQ(F)作为内参基因，分析胁迫响应基因GmDREB5相对表达的结果。
图6为本发明实施例3中对qRT-PCR中GmGAPDHa(A)、GmRAB5C(B)、GmGAPDHb(C)、GmH3.3(D)和GmPIP7a(E)扩增产物熔解曲线的分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 用于检测大豆内源节律表达基因的内参基因的筛选
为了筛选用于分析大豆生物钟调控基因节律性表达的最适内参，使用Genevestigator(www.genevestigator.com)数据库进行大豆内参基因的初步筛选。在未设定目标基因的情况下，分别利用大豆RNA-seq和芯片数据库，选取不同表达水平推荐的前20个内参基因，结合恒定条件下大豆单叶时间进程取材的RNA-seq数据，以及在不同组织器官和发育时期的RNA-seq数据，筛选在大豆根、茎、子叶、单叶和复叶中表达差异较小，在大豆幼苗、营养生长和生殖生长等不同发育阶段表达较稳定的候选内参基因。初步选定了8个候选内参基因：GmGAPDHa、GmUBC4、GmGAPDHb、Gmβ-Actin、GmH3.3、GmTUBB、GmPIP7a和GmELF1B。
将大豆WS82种子萌发后，在25℃、12小时光照/12小时黑暗条件下培养14天，转移至25℃、持续光照条件下，从ZT24至ZT72每间隔3小时取材一次(ZT是指Zeitgeber time)，分别提取单叶和复叶的RNA。使用超微量紫外分光光度计进行定量，每个20μl反转录体系中加入3ng RNA，尽可能保证样品间均一化。利用qRT-PCR检测候选内参基因的表达水平，当荧光信号达到阈值时的PCR循环数为Cq(cycle quantification)值，Cq值与基因表达量为反比例关系。qRT-PCR结果表明，新筛选的候选内参基因GmGAPDHa、GmGAPDHb、GmH3.3、GmPIP7a和GmRAB5C在温度和光照恒定的条件下表达基本稳定，在大豆单叶和复叶两个器官中表达水平相似(图1和图2)。
实时荧光定量PCR的反应体系如下：
试剂 20μl体系
2×SYBR混合液 10μl
Forward Primer(10μM) 0.5-2μl
Reverse Primer(10μM) 0.5-2μl
cDNA(10ng/μl) 0.1-1μl
ddH<sub>2</sub>O 补齐至20μl
实时荧光定量PCR反应程序为：
Figure BDA0002824318730000051
NormFinder软件可通过评估候选基因组内和组间的表达差异计算StabilityValue，Stability Value越小表明该基因的表达相对更稳定。为了进一步确认最适合的内参基因，将单叶和复叶两个组的数据利用NormFinder分析候选内参基因在不同时间点连续取材的样品中表达稳定性。结果表明GmGAPDHa表达最为稳定，GmUBC4、GmGAPDHb、Gmβ-Actin、GmH3.3、GmTUBB、GmPIP7a和GmELF1B表达相对较稳定；而GmTMA7a和GmUBQ表达最不稳定(图3)。
以上实验结果表明，如果不比较单叶和复叶间基因内源节律性表达差异，除GmUBQ以外的上述其余候选内参基因均可使用；如果比较器官间表达差异，则GmGAPDHa在所有候选基因中表达最稳定，表达量处于中部偏高水平，适用范围较广。此外，新筛选到的GmGAPDHb、GmH3.3、GmPIP7a和GmRAB5C等基因也可用于分析不同器官间基因内源节律性表达。
实施例2 Gm GAPDHa适用于昼夜节律和干旱胁迫相关基因表达分析
将实施例1中的内参基因，在短日照条件、长时间干旱条件生长的大豆单叶和复叶中，分析其节律性表达。大豆WS82材料在12小时光照/12小时黑暗，25℃条件下培养，种子萌发5天后，对照组保持水分充足，实验组通过停止浇水进行干旱胁迫，处理10天后ZT1开始每3h取材一次。利用qRT-PCR分别对大豆单叶和复叶中候选内参基因的表达进行检测。
实验结果表明，新筛选的内参基因GmGAPDHa、GmRAB5C和GmPIP7a在水分充足的短日照条件和干旱胁迫条件下表达均比较稳定。而GmUBC4在非干旱条件下，夜间表达上调；干旱条件下GmUBC4表达被抑制。GmGAPDHb在非干旱条件下，夜间表达上调；干旱条件下白天表达上调。GmTMA7a在干旱条件下表达上调，而GmH3.3干旱条件下表达下调。已报道干旱条件下表达稳定的GmFYVE和GmNUDIX表达稳定，在持续干旱处理的复叶中表达较稳定；而其它几个用于光周期分析的内参基因中，GmTUBB在干旱条件下的夜间表达略微下调，相对比较稳定；而其它内参基因在干旱条件下表达波动较大。
我们将上述实验数据分为干旱和非干旱两组数据，每组中为8个时间点的样品，使用NormFinder软件对候选内参基因Stability Value进行分析。结果表明在干旱条件下的复叶中，相对而言，GmTMA7a、GmIPP2、GmELF1B和GmUBC4是表达最不稳定的一类内参基因；而GmGAPDHa、GmFYVE、GmUKN1、GmNUDIX、GmTUBB、GmRAB5C和GmPIP7a属于较为稳定的内参基因，其中GmGAPDHa表达稳定性最好。
上述内参基因在单叶中的表达分析结果表明，多数内参基因在干旱条件下波动较大，尤其在干旱条件下的夜间多个基因表达下调，可能是由于长时间干旱处理有先对单叶造成较大的损伤。相比较而言，在恒定环境的叶片器官、干旱条件的复叶中表达稳定地GmGAPDHa和GmRAB5C表达依然比较稳定；而GmPIP7a在干旱的夜间表达波动较大。在干旱条件的复叶中表达并不算稳定的GmUBC4在单叶中表达较稳定，GmGAPDHb和GmIPP2在干旱的单叶中表达较不稳定。其它候选内参基因中，GmH3.3在单叶中表达较稳定，已报道干旱胁迫下稳定的GmFYVE和GmNUDIX依然较稳定表达。Stability Value分析结果表明，上述内参基因在干旱条件下的单叶中，表达最稳定的是GmH3.3，其次是GmGAPDHa、GmUBC4、GmNUDIX、GmFYVE、GmIPP2和GmRAB5C；其余基因表达均不稳定。
综合单叶和复叶的结果，在短日照条件和长时间干旱胁迫环境中，分析基因节律性表达所用内参需要谨慎选择，需要选取表达无明显节律、且不响应干旱胁迫的看家基因。GmELF1B、GmUBC4、GmTUBA、GmTUBB、GmUKN1、GmActin11和GmUBQ等可能不是优先选择的内参基因，它们的表达在至少一种环境条件或不同叶片中不稳定。研究表明新的内参基因GmGAPDHa和GmRAB5C以及已报道的内参基因GmNUDIX和GmFYVE在短日照、干旱条件下不同叶片中表达较稳定，其中GmGAPDHa表达更为稳定。GmGAPDHa的表达水平高于GmNUDIX和GmFYVE，在干旱条件下对靶基因昼夜节律性表达差异分析有更精准需求时，可根据靶基因的表达水平选取三者中更为接近的内参基因。
综上，本发明通过基因表达数据库分析筛选候选内参基因，在恒定环境条件、短日照条件及干旱胁迫条件下，对大豆单叶和时间进程取材的样品中，新筛选的和已报道的候选内参基因表达分析，发现新筛选的GmGAPDHa和GmRAB5C在上述不同环境和叶片类型中表达较为稳定，其中GmGAPDHa表达最为稳定。GmGAPDHa和GmRAB5C在表达量上有一定差异，GmRAB5C表达量较低，在选择内参基因时可根据目标基因选取表达水平更为接近的内参基因。本发明推荐优先使用GmGAPDHa作为分析目标基因内源节律性表达、昼夜节律性表达以及干旱胁迫条件下表达的内参基因(图4)。
实施例3 干旱胁迫响应基因GmDREB5表达的检测
将GmGAPDHa、GmRAB5C、GmGAPDHb、GmH3.3和GmPIP7a实际用于qRT-PCR检测干旱胁迫响应基因GmDREB5表达，已知干旱胁迫诱导GmDREB5表达，图5为使用GmGAPDHa、GmRAB5C、GmGAPDHb、GmH3.3、GmPIP7a或GmUBQ作为内参基因，利用qRT-PCR检测干旱和非干旱条件下，大豆GmDREB5的节律性表达(GmDREB5基因ID：Glyma12g33020；正向引物：5’-TCTGCATGGTTCAATGCTATTCCT-3’；反向引物：5’-AGGAATGTGTGATTGGCAAAGAAG-3’)。
实验结果表明，在非干旱胁迫条件下，以GmGAPDHa、GmRAB5C、GmGAPDHb、GmH3.3或GmPIP7a作为内参基因，分析GmDREB5相对表达的结果较为一致：在非干旱条件下GmDREB5的表达水平很低；在干旱条件下，GmDREB5的表达水平上调，呈现明显节律性，表达峰值在傍晚。而使用GmUBQ作为内参，不能准确检测GmDREB5的节律性表达(图5)。上述结果以进一步证明新筛选的5个内参基因稳定性好，精密度高，有利于提高目标基因定量检测的精度。
进一步地，对GmGAPDHa、GmRAB5C、GmGAPDHb、GmH3.3和GmPIP7a检测引物进行了优化，通过Primer-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析确定最终使用的引物序列具有较高特异性，通过对qRT-PCR扩增产物溶解曲线的分析也表明扩增产物较特异(图6)。熔解曲线分析程序如下：
反应步骤 温度 时间
1 95℃ 15s
2 60℃ 1min
3 95℃ 15s
4 60℃ 15s
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 河南大学
<120> 大豆内参基因及其检测引物与应用
<130> KHP201118710.1
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcttgtgg aggaggatgg ag 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaccgaaac gtcattactg g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaactgtatt tgcactcccc aac 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagtgggga tacagctcac 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcgcagcta aacataaaca tacgg 25
<210> 7
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<212> DNA
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<400> 7
ccatgactgt gtcttcttcc tttcag 26
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<211> 24
<212> DNA
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<211> 21
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ggacctttca ttggtgctgc a 21
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cttgatgaaa tgaaaccgaa acccag 26

Claims (6)

1.内参基因GmGAPDHa或GmRAB5C、其检测引物或含有所述检测引物的试剂盒在与大豆近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应相关基因的相对表达量分析中的应用；
内参基因GmGAPDHa、GmRAB5C的检测引物分别如SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:3-4所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，基因相对表达量的分析方法为实时荧光定量PCR法。
3.与大豆近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应相关基因的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述方法中使用GmGAPDHa、GmRAB5C作为内参基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应体系为：2×SYBR混合液10 μL ，10 μM正向引物0.5-2 μL ，10 μM反向引物0.5-2 μL ，10 ng/μL cDNA 0.1-1 μL ，ddH2O补齐至20 μL ；
PCR反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，正向引物和反向引物按等摩尔比混合。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述与大豆近日节律表达、昼夜节律表达和干旱胁迫响应相关基因为GmDREB5。
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