CN103805611A - 卷果涩芥抗冷关键基因MsCBF序列及其克隆和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学、植物基因工程技术及作物遗传育种领域。本发明以卷果涩芥为材料，利用PCR技术克隆其抗冷性关键基因——CBF转录因子基因MsCBF，进行测序、鉴定和表达特性分析。利用该基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因植物。MsCBF基因的组成型表达提高了转基因植物对低温的耐受性。本发明发掘卷果涩芥潜在的抗冷基因资源，在农作物抗性育种领域具有巨大的潜在应用价值和经济效益。

Description

卷果涩芥抗冷关键基因MsCBF序列及其克隆和应用

技术领域

本发明属于分子生物学、植物基因工程技术及作物遗传育种领域。具体涉及一个来自于新疆短命植物卷果涩芥的抗冷性关键基因MsCBF的克隆、鉴定、表达分析及其植物表达载体的构建，以及该基因在植物抗冷性基因工程中的应用。

背景技术

低温是严重限制植物分布及影响植物生长的逆境因子之一，近年来由于全球性的气候异常逐年加剧，低温冷害对农业生产造成的损失也呈上升趋势，因此提高抗冷性已成为作物遗传育种的重要目标之一。已有的植物抗冷性分子机制研究表明，CBF(C-repeat binding factor，C重复基序结合因子)转录因子在植物抗冷过程中起重要调控作用。

许多植物可以通过冷驯化(cold acclimation，即一段时间处于零上低温)获得抵抗零下低温(freezing)的能力(Thomashow MF，Plant cold acclimation：freezing tolerance genes and regulatory mechanisms.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1999，50：571-599)。经过冷驯化植物体内产生一系列生理生化变化，如积累抗冻物质可溶性糖和脯氨酸等，从而提高植物的抗冻能力。近10年来，研究者们对植物冷驯化的分子机制进行了深入和广泛的研究，并取得了显著进展。研究表明冷驯化过程涉及大量基因的诱导表达，从低温信号的感知到抗冻能力的提高，植物有着错综复杂的调控网络，这其中起关键调控作用的“ICE-CBF-COR通路”在植物中普遍存在，是目前研究最为详细的抗冷信号通路。

低温可诱导植物中1000多个基因表达，其中170多个基因编码转录因子。据推测，在低温的条件下所有这些转录因子协同作用重建转录组。但是，与其它转录系统一样，某种转录因子起着调节枢纽的作用从而控制大量基因的表达，CBF转录因子在冷驯化中就是这样一个调节枢纽(Thomashow MF，Molecular basis of plant cold acclimation：Insights gained from studying the CBF cold response pathway.PlantPhysiology，2010，154(2)：571-577)。

CBF是一类植物所特有的转录因子，可识别COR(cold related)基因启动子区的CRT/DRE(C-repeat/Dehydration Responsive Element)元件(Stockinger EJ，et al.Arabidopsis thaliana CBF1 encodes anAP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatoryelement that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit.Proceedings of the NationalAcademy of Science of the USA，1997，94(3)：1035-1040)其基因家族现有CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、CBF5和CBF6等多个小基因家族。CBF转录因子对于低温和渗透胁迫相关的多个基因起着分子开关作用(Thomashow MF，So what’s new in the field of plant cold acclimation？Lot！.Plant Physiology January，2001，125(1)：89-93)。CBF基因受低温和干旱诱导表达后，其DNA结合域的AP2(apetala2)基序就会与其靶基因的CRT/DRE元件特异性结合，进一步激活下游与低温、干旱、高盐相关的基因表达，从而提高植物耐受非生物胁迫尤其是耐受低温胁迫的能力(Liu Q，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought and lowtemperature responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.The Plant Cell，1998，10：1391-1406；Gilmour S J，et al.Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators asan early step in cold-induced COR gene expression.The Plant Journal，1998，16(4)：433-442)。

CBF基因最初从拟南芥中克隆获得，此后陆续发现大麦、黑麦、小麦、番茄、油菜、玉米、甜樱桃、巴西橡胶树等多种植物中都具有CBF基因，与拟南芥CBF氨基酸序列具有较高同源性，同时低温条件下的作用途径也相似。这些结果表明，在高等植物中，与低温感应和耐受相关的CBF信号途径广泛存在。CBF转录因子被证实具有抗寒潜力后，已被相继转入拟南芥、烟草、西红柿、水稻、玉米、草莓等多种植物中，转基因植株抗寒能力均有不同程度提高，并且其中几例CBF的转入还提高了转基因植株的抗旱及抗盐能力。(Hsieh TH，et al.T1 Tomato plants ectopically expressing Arabidopsis CBF1 show enhancedresistance to water deficit stress.Plant Physiology，2002，130(2)：618-626；Ito Y，Katsura K，et al.Functionalanalysis of rice DREB1/CBF-type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenicrice.Plant & Cell Physiology，2006，47(1)：141-153；Al-Abed D，et al.Genetic engineering of maize with theArabidopsis DREB1A/CBF3 gene using split-seed explants.Crop Science，2007，47：2309-2402；金万梅，等.冷诱导转录因子CBF1转化草莓及其抗寒性鉴定.西北植物学报，2007，27(2)：223-227；郭惠明，等.棉花CBF基因的克隆及转基因烟草的抗寒性分析.作物学报，2011，37(2)：286-293；Gilmour SJ，et al.Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changesassociated with cold acclimation.Plant Physiology，2000，124：1854-1865)。

卷果涩芥(Malcolmia scorpioides)是分布于新疆北部干旱荒漠区的十字花科早春短命植物，它能够在早春低温下萌发，利用早春雨雪水进行生长，在4～6月迅速完成生活周期，以逃避夏季的高温干旱。短命植物能够耐受新疆旱春的较低温度而萌发生长，其对于低温的耐受机制具有特殊性。本发明首次从卷果涩芥中克隆获得了其低温响应途径的关键调控基因MsCBF并转入拟南芥，转基因植株低温抗性得到了提高，这为利用基因工程技术进行抗性育种提供了一定的依据。

发明内容

本发明将提供一个来自于卷果涩芥的CBF转录因子MsCBF的基因序列，以及该基因的克隆方法，并利用该基因构建植物表达载体，通过遗传转化方法使受体植物抗冷性明显提高，最终获得具有较高抗冷性的优良农作物品系。

本发明首先从卷果涩芥中克隆获得抗冷关键基因，其序列为SEQ ID NO.1。该基因编码一个属于CBF基因家族的转录因子，命名为MsCBF，其DNA结合域可与靶基因的CRT/DRE元件特异性结合，进一步激活下游与低温、干旱、高盐相关的基因表达，从而提高植物耐受非生物胁迫尤其是耐受低温胁迫的能力。

本发明转录因子基因MsCBF所编码的蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

上述CBF转录因子基因是通过以下方法得到的：

对拟南芥及与拟南芥CBF基因同源性较高的5种植物CBF基因进行同源性分析，根据这6种同源性序列比对设计CBF兼并引物，引物序列为SEQ ID NO.2。CTAB法提取卷果涩芥幼苗基因组DNA，从卷果涩芥幼苗基因组DNA中利用PCR技术克隆获得MsCBF基因全长序列。

构建带有强启动子CaMV35S的MsCBF基因的表达载体，该载体为pCAMBIA2300-MsCBF，将其转化到农杆菌Gv3101中，利用花序浸染法(floral dipping)将其转入模式植物拟南芥中，对经PCR检测阳性的转化株系进行抗冷性相关生理指标的测定，结果表明转基因植株的低温抗性明显提高。

本发明有明显的应用效果：

本发明克隆获得了卷果涩芥MsCBF基因全长序列，该基因属于CBF转录因子家族，具有AP2基序，该基序可与一系列胁迫相关基因的CRT/DRE元件特异性结合，从而启动植物耐受低温、干旱等逆境的抗性反应。进一步的表达定量分析表明，该基因受到昼夜节律的调控，受低温、ABA、NaCl和干旱胁迫(PEG)的诱导表达，是卷果涩芥抗性反应的关键调控基因。我们将其全长片段连接35S强启动子，然后转化野生型拟南芥植株，抗冷性生理指标的检测结果表明，组成型表达卷果涩芥MsCBF基因的拟南芥植株抗冷性明显提高。以上结果均表明，将卷果涩芥MsCBF基因通过基因工程技术转入农作物可提高其抗冷性，是一个抗性育种的优良候选基因。

附图说明

图1显示的是从卷果涩芥幼苗基因组DNA中PCR扩增获得MsCBF3基因片段，泳道1为PCR产物，泳道2为阴性对照，M为标准分子量marker。

图2显示的是利用荧光定量PCR技术分析MsCBF基因在卷果涩芥中的表达特性：一天24小时中MsCBF基因表达随昼夜节律而变化。

图3显示的是利用荧光定量PCR技术分析MsCBF基因在卷果涩芥中的表达特性：从0点开始进行4℃低温处理。

图4显示的是利用荧光定量PCR技术分析MsCBF基因在卷果涩芥中的表达特性：从12点开始进行4℃低温处理。

图5显示的是利用荧光定量PCR技术分析MsCBF基因在卷果涩芥中的表达特性：从0点开始进行ABA，NaCl，PEG6000处理。

图6显示的是4℃低温处理后转MsCBF基因拟南芥和野生型拟南芥的POD活性的变化。

图7显示的是4℃低温处理后转MsCBF基因拟南芥和野生型拟南芥的MDA含量的变化。

图8显示的是4℃低温处理后转MsCBF基因拟南芥和野生型拟南芥的脯氨酸含量的变化。

具体实施方式

下面结合本实验具体实施例和实验数据对本发明进行进一步阐述，但不限制本发明。

下列实施例中所用的实验材料和来源包括：

大肠杆菌感受态细胞DH5a购自天根公司，pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司，质粒pCAMBIA2300、大肠杆菌DH5a及农杆菌菌株Gv3101均由本实验室保存。

下述实施例中常规操作如无说明则参照《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔；黄培堂等译.分子克隆实验指南[M].科学出版社，2002年8月，第三版)或相关试剂生产厂商的操作手册进行。

实施例1：卷果涩芥抗冷关键基因MsCBF基因的克隆

1、材料培养

卷果涩芥种子采自新疆新疆阜康北沙窝附近。种子表面灭菌后参照樊从照(樊丛照，赵惠新，高兴旺，李群.两种短命植物种子萌发特性和幼苗生理的研究[J].种子2010，29(4)：33-37.)所用的方法对种皮进行针刺处理以打破休眠，于1/2MS培养基中25℃，16h光照/8h黑暗培养，萌发后继续培养4周左右。

2、提取基因组DNA

取卷果涩芥幼苗叶片，以CTAB法提取总DNA，以琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，以分光光度计法测定DNA含量。

3、MsCBF基因的克隆

通过NCBI搜索到26种植物CBF基因序列，并对这些序列进行同源性分析。由于卷果涩芥属于十字花科植物，选取同为十字花科的模式植物拟南芥CBF基因序列以及与拟南芥同源性较高的5种植物：黄瓜(Cucumis sativus)，小拟南芥(Olimarabidopsis pumila)，马蔺(Iris lactea var.Chinensis)，萝卜(Raphanus sativus)及结球白菜(Brassica rapa subsp.Pekinensis)的CBF基因序列进行同源分析。在CBF基因编码区的起始端和末端设计简并引物。根据选取的六种植物CBF基因的同源序列的对比设计一对引物(SEQ ID NO.3)：5‘-ATGAA(C)CTCAG(T)TTTCT(A)G(A)CG(CT)TTT(C)TC-3’和5‘-T(C)TAA(G)TAACTCCAA(G)AGG(C)GAC(T)AT(C)G-3’。

PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2μL；引物各1μL；dNTP(2.5mM)0.4μL；Taq酶(5U/mL)0.3μL；卷果涩芥基因组总DNA1μL；ddH₂O14.3μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸40s，共扩增30个循环，再72℃延伸10min。

经1％琼脂糖电泳检测，扩增产物为一条约650bp的片段(见图1)。按常规方法对该片段进行克隆和测序，最终获得如SEQ ID NO.1所示的MsCBF序列。

实施例2：卷果涩芥MsCBF基因序列分析

卷果涩芥MsCBF基因克隆片段经测序分析，其长度为647bp，与拟南芥CBF3基因同源性为84.99％，在140bp-244bp左右处存在AP2保守结构域。将其基酸序列与GeneBank中登记的一些已知物种CBF基因氨基酸序列进行同源性对比结果，结果表明克隆得到的卷果涩芥MsCBF基因氨基酸序列与荠菜CBF氨基酸序列同源性最高，达88％。

实施例3：卷果涩芥MsCBF基因的表达特性分析

1、材料处理

(1)昼夜节律处理：25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养一个月左右的卷果涩芥幼苗，分别于0点，4点，8点，12点，16点，20点取材。

(2)低温诱导处理：25℃，16h光照/8h黑暗条件下培养一个月左右的卷果涩芥幼苗，于0点或12点开始对卷果涩芥幼苗进行4℃低温处理，对处理0h，2h，4h，6h，8h，10h的幼苗进行取材。

(3)ABA，NaCl，PEG6000处理：25℃，16光照-8黑暗条件下培养一个月左右的卷果涩芥幼苗，于0点开始进行处理。以100μMABA，2％NaCl，10％PEG6000分别处理幼苗，于2h和7h时进行取材。

2、总RNA的提取

卷果涩芥幼苗总RNA提取参照天根总RNA提取试剂盒操作步骤，并进行浓度和纯度测定。

3、反转录

以提取的RNA为模板，按照北京康为世纪生物科技有限公司的Super RT Kit cDNA第一链合成试剂盒操作说明书进行互补DNA(cDNA)第一条链的合成，反应结束后70℃水浴终止反应。

4、荧光定量PCR

根据卷果涩芥MsCBF基因序列SEQ ID NO.4，在3端相对较低的保守区设计定量PCR引物一对(SEQ ID NO.4)：5’-CTATCGTGACGGCGGAACAGA-3’和5’-TCATCTCCGTCACCGTCGTAA-3’；同时设计内参基因EF1α引物一对(SEQ ID NO.5)：5′-ACACCTCCTTCACGATTT-3’和5′-TCTTCTTGCTTTCACCCT-3’。

利用上述引物对卷果涩芥幼苗cDNA进行荧光定量PCR，所使用的PCR仪为7500型实时荧光定量PCR仪。SYBR Green I实时定量PCR25μL反应体系：SYBR Mix，12.5μL；引物各1μL；RNase-FreeWater，9.5μL。三步法荧光定量PCR扩增程序：95℃ 5min；95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s共45个循环。

5、数据分析与结果

采用2^-ΔΔCt数据处理方法进行相对定量分析。

(1)常温下昼夜节律对卷果涩芥MsCBF3基因表达的影响

结果如图2所示，卷果涩芥幼苗CBF3基因在0点时刻具有最低的表达量，且在0点至8点这段时间其表达量均很低，在8点时MsCBF表达水平开始升高，12点时刻其表达量达到峰值，随后开始下降，于16点接近本底水平，说明我们克隆获得的卷果涩芥MsCBF3基因在常温下具有受昼夜节律调控的表达特性，这与与Harmer等人(Harmer SL，et al.Orchestrated transcription of key pathways in Arabidopsisby the circadian clock.Science，2000，290：2110-2113.)对拟南芥CBF基因昼夜节律表达的研究结果类似，说明CBF转录因子的这一表达特性可能具有普遍性。

(2)低温处理诱导卷果涩芥MsCBF3基因表达情况

0点和12点开始低温处理诱导表达的结果分别如图3和图4所示，卷果涩芥幼苗于0点时刻开始进行4℃低温处理，在处理后的第4个小时具有表达高峰，随后表达水平逐渐降低。于12点时刻开始进行4℃低温处理，在处理后的第8个小时具有表达高峰，随后表达水平逐渐降低，且12点开始对卷果涩芥幼苗进行低温处理，其诱导水平比0点开始对卷果涩芥幼苗进行低温处理的诱导水平更高。结果表明卷果涩芥MsCBF3受低温诱导表达，且在12点开始的低温诱导表达水平明显高于在0点开始的低温诱导表达水平，这一结果说明卷果涩芥MsCBF3基因受到昼夜节律和低温的共同调节。以上结果与拟南芥CBF基因的研究结果类似(Seo E，et al.Crosstalk between cold response and s owering in Arabidopsis ismediated through the flowering-time gene SOC1 and its upstream negative regulator FLC Plant Cell，2009，21：3185-3197.)，说明MsCBF3在卷果涩芥的低温抗性响应途径中具有重要调控作用。

(3)ABA，NaCl，PEG6000诱导MsCBF3基因表达情况

结果如图5所示。MsCBF基因在ABA，NaCl，PEG6000诱导下表达水平均大幅度提高。证明MsCBF基因受到ABA，NaCl，PEG6000的诱导表达且诱导特性略有差异。这一结果表明卷果涩芥MsCBF基因不仅仅是其低温抗性途径的关键调控基因，可能还对其干旱、高盐的抗性途径有调控作用，提示其在低温、干旱、高盐多种逆境中提高作物抗性的应用潜力。

实施例4：农杆菌介导的植物转化

1、植物表达载体构建：

将回收纯化的目的基因片段MsCBF与双酶切后线性化的pCAMBIA2300表达载体片段连接，阳性菌落经PCR及酶切鉴定，证实该基因已正确插入载体，且位于该载体上的强启动子CaMV35S后。构建好的表达载体命名为pCAMBIA2300-MsCBF。

2、花序浸染法(floral dipping)转化野生型(Columbia)拟南芥：

将上述构建好的表达载体pCAMBIA2300-MsCBF利用冻融法转入农杆菌Gv3101中，PCR检测获得阳性农杆菌重组转化子。

(1)经鉴定含有pCAMBIA2300-MsCBF的农杆菌菌种挑取单菌落，接种于YEB液体培养基中，28℃，200rpm避光振荡培养过夜，至OD₆₀₀为1.2左右。5000rmp离心30min收集菌体，用转化介质(蒸馏水配制，含5％蔗糖，200μL/L silwit-77，pH＝5.7)悬浮液体至OD₆₀₀为0.8左右。

(2)野生型拟南芥萌发后生长至首次抽苔，剪去初生苔，当多数次生苔长满花苞，即将开花前(浸染前将少数已经开放的花朵和角果摘除)即可用于转化。将拟南芥花序浸没到上述转化介质中2min，用塑料薄膜套袋，暗处放置24h后取掉薄膜，按正常条件继续培养，3周后可陆续收获T₀代种子。

(3)T₀代种子在卡那抗性培养基上萌发后经筛选获得阳性幼苗，种植后收集获得T₁代转基因种子，T₁代种子在卡那抗性培养基中再次进行筛选，挑选阳性幼苗种植，最终获得T₂代种子。种植T₂代阳性株系，提取幼苗基因组DNA，经PCR及RT-PCR检测，证实卷果涩芥MsCBF基因已转入拟南芥并获得组成型表达。

实施例5：转基因拟南芥抗冷性生理指标测定

转MsCBF3基因性拟南芥与对照野生型拟南芥在25℃，16h光照/8h黑暗条件下于培养基中生长一个月左右，对其进行4℃低温处理，于处理0h，2h，4h，6h，8h，10h时取材，对幼苗进行抗冷性相关生理生化指标分析。

1、愈创木酚法检测过氧化物酶(peroxidase，POD)活性

植物材料置于研钵中，加入提取液(0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液)研磨，匀浆4000r/min4℃离心10min，上清液即酶的粗提取液。酶活性测定时，4mL反应混合液(磷酸缓冲液2mL，酶液1mL，0.05mol/L愈创木酚1mL)和1mL2％H₂O₂加入试管中立即摇匀并迅速于470nm波长下用紫外/可见分光光度计比色，记录吸光度值，以后每30s记录1次，记录4min。根据POD酶活性公式进行活性计算：

公式中ΔOD为初速度阶段的吸光度差，比色波长470nm；Δt为ΔOD对应的时间(min)；V1为提取酶液总体积(mL)；V2为测定时取用的提取酶液体积(mL)；W为植物样品鲜重(g)；0.01为以吸光度值变化0.01为一个酶活性单位(U)。

检测结果如图6所示。结果表明，随着低温处理时间的增加，野生型拟南芥和转基因拟南芥的POD活性均逐渐增加，4h时达到第一个峰值，随后活性下降，8h时其活性降至最低后开始上升，在10h时其活性达最大峰值。同时，在低温处理后，转MsCBF基因拟南芥幼苗的POD活性总体高于野生型拟南芥幼苗中的POD活性。过氧化物酶是植物细胞内重要的保护酶，可以清除植物体内由于胁迫伤害形成的过多的氧自由基，使植物的伤害减少。该指标测定结果表明，MsCBF基因的转入提高了野生型拟南芥的抗冷性。

2、TBA法检测丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量

参照李合生的方法(李合生.植物生理生化实验指导[M].北京：高等教育出版社2002：164-185.)，略有改动。植物材料加入2mL预冷的磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH7.8)，冰浴研磨成匀浆，用缓冲液定容至5mL，4500rpm，4℃，离心10min，上清液即为MDA提取液，测量提取液的体积(V)。吸2mL的提取液(V2)于刻度试管中(空白为2mL缓冲液)，加入3mL0.5％的TBA溶液，将试管放入沸水浴中煮沸10min，取出放入冰浴中。4500rpm，4℃，离心10min，取上清液并量其体积(V1)。上清液分别于532nm和600nm波长下测定吸光度值。结果用下列公式计算： $\mathrm{MDA}\left({\mathrm{nmol}\×g}^{-1}\right)=6.452\×(A532-A600)\×\frac{V1\×V}{V2\×W},$ 式中，V1为反应液总量(mL)；V2为反应液中的提取液数量(mL)；V为提取液总量(mL)；W为植物样品总量(g)。

检测结果如图7所示。结果表明，随着低温处理时间的增加，野生型拟南芥和转基因拟南芥中MDA的含量均呈现增加的趋势，野生型拟南芥MDA的含量在6h时的含量达到峰值并开始下降，而转基因拟南芥MDA的含量在8h达到峰值然后开始下降。由此可见转基因拟南芥MDA峰值比野生型拟南芥MDA峰值的出现延后2h，说明野生型拟南芥受到低温的伤害更早。同时，可以看出总体上转基因拟南芥比野生型拟南芥MDA含量低。丙二醛(MDA)是由于植物衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或者器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切的关系。该指标测定结果进一步表明，MsCBF基因的组成型表达减少了低温对膜脂的伤害，提高了野生型拟南芥的抗冷性。

3、酸性茚三酮法检测脯氨酸含量：

此方法参照职明星的方法(职明星，李秀菊.脯氮酸测定方法的改进[J].植物生理学通讯2005(3)：355-357.)，略有改动。

(1)脯氨酸标准曲线的制作：配制脯氨酸浓度分别为1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL及6μg/mL的标准溶液母液，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，沸水浴中加热30min。冷却后各试管准确加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。以吸光度值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式。

(3)样品中脯氨酸含量的测定：称取一定质量的样品，加入5mL3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，冷却后过滤，滤液即为脯氨酸的提取液。取2mL提取液于加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮试剂，沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4mL甲苯，摇荡30s，静置片刻，取上层液，3000rpm，离心5min。吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液，以甲苯为空白对照，在分光光度计520nm波长处比色，根据吸光度值带入回归方程求得样品脯氨酸含量。

检测结果如图8所示。结果表明，野生型拟南芥中的脯氨酸在6h时含量达到最大值，随后随着时间的增加脯氨酸的含量开始降低。转MsCBF3基因拟南芥脯氨酸在8h时含量达到最大，随后随着时间增加脯氨酸含量开始下降。转基因拟南芥脯氨酸含量的峰比野生型拟南芥脯氨酸含量的峰值延后2h证明转基因拟南芥能够耐受低温更加持久。在低温、干旱、盐渍等逆境胁迫条件下，植物体内的脯氨酸大量积累。积累的脯氨酸除了作为植物细胞质内的渗透调节物质外，还在稳定生物大分子结构，降低细胞酸性，解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，可作为抗寒育种的生理指标。该指标测定结果进一步表明，MsCBF基因的组成型表达提高了野生型拟南芥的抗冷性。

本发明涉及的序列分别如下：

SEQ ID NO.1：MsCBF3基因序列

1    ATGAACTCAT TTTCTGCTTT TTCTGAGATG TTTGGCTCGG AATACGAGTCTCCGGTTTCT

61   TCCCCAGGCG GCGATTATAG TCCGACGCTG GCGTCTAGCT GTCCCAAGAAACCAGCGGGT

121  CGTAAGAAGT TTCGTGAGAC TCGTCACCCG ATTTACAGAG GAGTTCGTCGGAGAAACTCT

181  GGTAAGTGGG TGTGTGAGGT GAGAGAACCA AACAAGAAAT CAAGAATTTGGCTCGGAACT

241  TTCCCAACCG CCGAGATGGC AGCTCGTGCT CACGACGTTG CCGCCATAGCCCTCCGTGGC

301  AGATCCACCT GCCTCAATTT CGCTGACTCG GCTTGGCGGC TACGAATCCCAGAGTCAACT

361  TGCGCTAAAG ATATACAGAA GGCGGCTGCT GAAGCCGCGG AAGCTTTTCGAGATGAGATG

421  TGTGATACGA CGACGGATCA TGATTTAGAT CTGGAAGAGA CGATTGTAGAAGCTATCGTG

481  ACGGCGGAAC AGAGCAATGG GTTTTACATG GACGAGGAGG ACATGTTCGGCATGCCGAGG

541  TTAATGGCTA ATATGGCCGA AGGGATGCTT TTGCCGCTGC CGTCCGTACAATGGAATCAC

601  AATTACGACG GTGACGGAGA TGATGACGTA TCCCTTTGGA GTTATTA

SEQ ID NO.2：MsCBF3基因的氨基酸序列

1    M N S F S A F S E M F G S E Y E S P V S

21   S P G G D Y S P T L A S S C P K K P A G

41   R K K F R E T R H P I Y R G V R R R N S

61   G K W V C E V R E P N K K S R I W L G T

81   F P T A E M A A R A H D V A A I A L R G

101  R S T C L N F A D S A W R L R I P E S T

121  C A K D I Q K A A A E A A E A F R D E M

141  C D T T T D H D L D L E E T I V E A I V

161  T A E Q S N G F Y M D E E D M F G M P R

181  L M A N M A E G M L L P L P S V Q W N H

201  N Y D G D G D D D V S L W S Y

SEQ ID NO.3：从卷果涩芥中扩增MsCBF3基因的一对简并引物序列

上游引物：5‘-ATGAA(C)CTCAG(T)TTTCT(A)G(A)CG(CT)TTT(C)TC-3’

下游引物：5‘-T(C)TAA(G)TAACTCCAA(G)AGG(C)GAC(T)AT(C)G-3’

SEQ ID NO.4：根据卷果涩芥中MsCBF3基因3’端保守区设计的一对引物序列，用于荧光定量PCR检测该基因的表达情况。

上游引物：5’-CTATCGTGACGGCGGAACAGA-3’

下游引物：5’-TCATCTCCGTCACCGTCGTAA-3’

SEQ ID NO.5：根据EF1α基因保守区设计的一对引物序列，荧光定量PCR检测卷果涩芥基因表达情况时，作内参基因的引物用。

上游引物：5′-ACACCTCCTTCACGATTT-3’

下游引物：5′-TCTTCTTGCTTTCACCCT-3’。

Claims (5)

1.从新疆短命植物卷果涩芥(Malcolmia scorpioides)中克隆获得的一个抗冷关键基因MsCBF，其特征在于具有如下核苷酸序列： 

1    ATGAACTCATTTTCTGCTTTTTCTGAGATGTTTGGCTCGGAATACGAGTCTCCGGTTTCT 

61   TCCCCAGGCGGCGATTATAGTCCGACGCTGGCGTCTAGCTGTCCCAAGAAACCAGCGGGT 

121  CGTAAGAAGTTTCGTGAGACTCGTCACCCGATTTACAGAGGAGTTCGTCGGAGAAACTCT 

181  GGTAAGTGGGTGTGTGAGGTGAGAGAACCAAACAAGAAATCAAGAATTTGGCTCGGAACT 

241  TTCCCAACCGCCGAGATGGCAGCTCGTGCTCACGACGTTGCCGCCATAGCCCTCCGTGGC 

301  AGATCCACCTGCCTCAATTTCGCTGACTCGGCTTGGCGGCTACGAATCCCAGAGTCAACT 

361  TGCGCTAAAGATATACAGAAGGCGGCTGCTGAAGCCGCGGAAGCTTTTCGAGATGAGATG 

421  TGTGATACGACGACGGATCATGATTTAGATCTGGAAGAGACGATTGTAGAAGCTATCGTG 

481  ACGGCGGAACAGAGCAATGGGTTTTACATGGACGAGGAGGACATGTTCGGCATGCCGAGG 

541  TTAATGGCTAATATGGCCGAAGGGATGCTTTTGCCGCTGCCGTCCGTACAATGGAATCAC 

601  AATTACGACGGTGACGGAGATGATGACGTATCCCTTTGGAGTTATTA 。

2.根据权利要求1所述基因所编码的蛋白，其特征在于具有如下氨基酸序列： 

1    M N S F S A F S E M F G S E Y E S P V S 

21   S P G G D Y S P T L A S S C P K K P A G 

41   R K K F R E T R H P I Y R G V R R R N S 

61   G K W V C E V R E P N K K S R I W L G T 

81   F P T A E M A A R A H D V A A I A L R G 

101  R S T C L N F A D S A W R L R I P E S T 

121  C A K D I Q K A A A E A A E A F R D E M 

141  C D T T T D H D L D L E E T I V E A I V 

161  T A E Q S N G F Y M D E E D M F G M P R 

181  L M A N M A E G M L L P L P S V Q W N H 

201  N Y D G D G D D D V S L W S Y 。

3.一种构建的植物表达载体：pCAMBIA2300-MsCBF，其特征在于包含权利要求1所述基因MsCBF。 

4.根据权利要求1所述的基因MsCBF的应用，其特征在于该基因在植物中表达能够有效提高植物抗冷性。 

5.根据权利要求1所述的基因MsCBF的应用，其特征在于该基因在模式植物拟南芥中表达能够有效提高拟南芥的抗冷性。 

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