CN113913335B - 一种耐盐硝化复合菌剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐盐硝化复合菌剂及应用，属于微生物制剂及废水处理领域。一种硝化复合微生物菌剂，包括嗜碱嗜盐单胞菌MND‑5，菌株保藏号为GDMCC.No 61871；不动杆菌MND‑11，菌株保藏号为GDMCC.No 61872；威尼斯不动杆菌MND‑13，菌株保藏号为GDMCC.No 61873。本发明的硝化复合菌剂48h内对底物浓度100mg/L NH₄ ⁺‑N的去除率能达到为96.74％～100％，TN去除率能达到75.21～84.67％。这些结果表明，复合菌株在去除高盐度(盐度＞30)废水及海水养殖废水中的NH₄ ⁺‑N方面具有潜在的良好的应用前景。

Description

一种耐盐硝化复合菌剂及应用

技术领域

本发明属于微生物制剂及废水处理领域，涉及一种耐盐硝化复合菌剂及应用，尤其涉及一种硝化复合微生物菌剂、制备方法及其在去除海水养殖废水或高盐度废水的应用。

背景技术

当前，我国水产养殖业呈现出规模化、集约化的趋势。高密度的水产养殖增加了水产品产量，然而，水环境受到了明显的污染。水产养殖水污染物过多排放已成为限制我国水产养殖业可持续发展的一个关键问题(孙振中,刘金金,张玉平.上海市淡水养殖水体中氮、磷的分布研究[J].水产科学,2018,37(4):512-521；Gao M,Chang J,Li S,et al.Modelingnitrogen loading from a watershed consisting of cropland and livestock farmsin China using Manure-DNDC[J].Agriculture,Ecosystems&Environment,2014,185(1):88-98)。水产养殖过程中部分饲料在鱼类消化、吸收等代谢过程中转化为氨氮排泄到养殖环境，产生的残饲、粪便也会在微生物作用下矿化为氨，进而转化成亚硝酸盐氮、硝酸盐氮。余瑞兰等(余瑞兰,聂湘平,魏泰莉,等.分子氨和亚硝酸盐对鱼类的危害及其对策.中国水产科学,1999(03):74–78)研究表明，养殖废水中的NH₄ ⁺-N和NO₂ ^–-N对鱼类具有毒害作用。

在水产养殖废水处理技术中，微生物降解技术具有资源广泛、经济高效和环境友好等优点，已普遍应用于循环水养殖业(Wang L,Shao X,Xu M,et al.Bioremediation ofnitrogen-and phosphorus-polluted aquaculture sediment by utilizing combinedimmobilized effective microorganisms and sediment aeration technology[J].International Journal of Agricultural and Biological Engineering,2019,12(6):192-201；Ahmed M B,Zhou J L,Ngo H H,et al.Progress in the biological andchemical treatment technologies for emerging contaminant removal fromwastewater:A critical review[J].Journal of Hazardous Materials,2017,323(PartA):274-298)。影响微生物对污染物降解净化效果的关键因素有微生物数量、菌群种类和环境条件等。

复合菌剂通常是指两类乃至两类以上的菌种通过研究制备出的优性菌剂，不同的联合菌剂具有不同的性质，发挥不同的功能(吴岩,任相浩,寇莹莹,成宇.复合微生物菌剂处理高浓度氨氮废水的强化作用[J].科学技术与工程,2020,20(25):10544-10549)。复合菌剂被广泛应用于传统农业中农作物肥料、畜牧业中动物的饲料、家禽类的粪便、生产生活废水、工农加工业废水及高硫高盐的污染废水处理技术等(陈海升,曹刚,张迪,黄郑郑,莫测辉.复合菌株YH01+YH02强化SBR好氧反硝化脱氮及菌群结构分析[J].环境科学,2018,39(04):1773-1781)。研究发现脱氮复合菌群与单一菌株相比，适应性更强(Wang W,Cao L,Tan H,et al.Nitrogen removal from synthetic wastewater using single and mixedculture systems of denitrifying fungi,bacteria,and actinobacteria[J].AppliedMicrobiology&Biotechnology,2016,100(22):9699-9707；黄郑郑,曹刚,陈海升,等.异养硝化-好氧反硝化菌协同竞争对脱氮特性的影响[J].环境科学研究,2017,030(005):765-774)，负荷能力更高(全向春,岑艳,钱殷.2株好氧反硝化菌的筛选及其强化贫营养生物膜脱氮效果[J].环境科学,2013(07):2862-2868)，对于强化生物脱氮和实际处理含氮废水具有更强的优势。为此，人们开始探讨海水养殖废水的净化模式，发现与理化处理方式相比，复合微生物制剂因成本低廉、无毒、无副作用、无残留污染等优点而备受关注(陈祖峰,郑爱榕.海水养殖自身污染及污染负荷估算.厦门大学学报,2004,43(1):258-262；李来阳,谢卫兵.海水养殖废水处理技术研究进展.河北渔业,2009,185(5):46-50)。国内也相继开发了多种微生态制剂，然而其应用效果难以令人满意，究其原因主要是菌株成分复杂，缺乏针对性且难于适应如海水养殖废水等高盐寡营养废水处理(杨波,杨志恒,胡文容,等.亚硝化细菌处理氨氮废水研究.武汉理工大学学报,2007,29(3):63-66；孟睿,何连生,席北斗,等.芽孢杆菌与硝化细菌净化水产养殖废水的试验研究.环境科学与技术,2009,32(11):28-31)。

发明内容

本发明从红鳍东方鲀养殖池海水循环水系统(RAS)生物滤池毛刷生物滤料上筛选了3株硝化菌株进行配伍，研制高效耐盐(盐度＞30)硝化复合菌剂，并将复合菌剂用于处理海水养殖废水，探究了单一因素(温度，转速，C/N)对其硝化性能的影响，以期为硝化复合菌剂在海水养殖废水或高盐度废水处理中的应用提供参考。

一种硝化复合微生物菌剂，包括嗜碱嗜盐单胞菌Halomonas alkaliphile MND-5、不动杆菌Acinetobacter sp.MND-11和威尼斯不动杆菌Acinetobacter venetianus MND-13；

嗜碱嗜盐单胞菌Halomonas alkaliphile MND-5于2021年8月13日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC.No 61871；

不动杆菌Acinetobacter sp.MND-11于2021年8月30日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC.No 61872；

威尼斯不动杆菌Acinetobacter venetianus MND-13于2021年8月13日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC.No 61873。

进一步地，上述技术方案中，Acinetobacter venetianus MND-13、Halomonasalkaliphile MND-5和Acinetobacter sp.MND-11的复合比例为1～3：1～3：1～3。

进一步地，上述技术方案中，Acinetobacter venetianus MND-13、Halomonasalkaliphile MND-5和Acinetobacter sp.MND-11的复合比例为2:1:2。

一种硝化复合微生物菌剂高盐度废水脱氨氮的应用，所述高盐为盐度＞30。

进一步地，上述技术方案中，所述高盐含氮废水包括海水养殖废水。

进一步地，上述技术方案中，将复合比例为1～3：1～3：1～3的Halomonasalkaliphile MND-5、Acinetobacter sp.MND-11和Acinetobacter venetianus MND-13复合微生物菌剂接种到待处理高盐度废水中，通过将唯一碳源乙酸钠加入到以NH₄Cl为唯一氮源的培养基中，控制C/N为10～15，温度为20℃～30℃，摇速为120rpm～150rpm条件下，使复合微生物菌剂在废水中生长，即可完成对高盐含氨氮废水的脱氨氮处理。

本发明的硝化复合菌剂，温度为20℃～30℃，转速为120rpm～150rpm，C/N为10～15条件下，复合菌株48h内对底物浓度100mg/L NH₄ ⁺-N的去除率能达到为96.74％～100％，TN去除率能达到75.21％～84.67％。这些结果表明，复合菌株在去除高盐度(盐度＞30)废水及海水养殖废水中的NH₄ ⁺-N方面具有潜在的良好的应用前景。

附图说明

图1为菌株MND-5的菌落形态(A)和扫描电镜(D)、菌株MND-11的菌落形态(B)和扫描电镜(E)、菌株MND-13的菌落形态(C)和扫描电镜(F)。

图2为温度对复合菌株硝化性能影响及生长曲线。

图3为溶解氧(转速)对复合菌株硝化性能影响及生长曲线。

图4为C/N对复合菌株硝化性能影响及生长曲线。

具体实施方式

下述非限定性实施案例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1.实验材料

1.1菌株

实验用菌株筛选自大连天正养殖厂红鳍东方鲀养殖池循环水养殖系统核心水处理单元--生物滤池内毛刷填料表面生物膜。

1.2培养基

LB培养基(L^-1)：5g酵母浸粉，10g蛋白胨，30g氯化钠，固体培养基含20g琼脂。

NM培养基(L^-1)：0.3821g NH₄Cl，0.2g MgSO₄·7H₂O，1.0g K₂HPO₄，3.418g乙酸钠，30g NaCl溶解后调pH为7，再定容到1升加10ml微量元素溶液配制成1L NM培养基，固体培养含20g琼脂。

微量元素溶液(L^-1)：50g EDTA，2.2g ZnSO₄，5.5g CaCl₂，5.06g MnCl₂·4H₂O，5.0gFeSO₄·7H₂O，1.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，1.57gCuSO₄·5H₂O，1.61gCoCl₂·6H₂O。

2.实验方法

2.1细菌的富集培养

将生物滤池中毛刷样品经无菌水清洗后，利用灭菌刀片刮取生物膜，并用灭菌生理盐水梯度稀释10^-1-10^-7，然后均匀涂布于LB固体培养基上，30℃下培养24h。

2.2细菌的分离

挑取单克隆菌落接种于NM海水培养基中培养48h，然后将菌液在NM固体培养基上划线，30℃，培养3d。取培养好的菌液，采用平板划线法接种于NM固体培养基上，30℃，培养3d。经培养后在沿划线处长出菌落，此步骤反复多次纯化，直至获得纯化的单克隆菌株。

2.3细菌的纯化与保存

将纯化后的单克隆菌株，用接种环挑取单菌落以1000:1的比例接入NM液体培养基，30℃振荡培养3d后并用40％甘油于-80℃保存菌液。

2.4菌株硝化能力的测定

将实验分离纯化的硝化菌(13株，分别命名为MND-1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)接种于NM培养基液体培养基中，30℃避光振荡培养2d。取菌液50ml于8000rpm离心10min后用磷酸缓冲液重悬，调OD₆₀₀至1.0。以1％的接种量分别接种于装有50mL硝化培养液的西林瓶中，置于30℃、120rpm摇床恒温振荡培养48h。每隔12h测定培养液中OD₆₀₀和NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N、TN浓度，以判断菌株硝化能力，最终筛选出高效耐盐脱氮菌株MND-5、MND-11、MND-13。

2.5菌株的复配

正交实验设计如下表1：

表1正交试验设计

将筛选出的三株硝化菌在LB培养基中进行富集培养，然后离心，弃上清液，将菌体转移到灭菌的磷酸缓冲液中制成菌悬液，并将细菌浓度分别调到OD₆₀₀为1。按照正交试验设计比例配制复合菌悬液，按照1％(体积分数)的接种量接入含有50mL灭菌NM培养基的100mL西林瓶中，以NH₄Cl为唯一氮源，设置初始氮浓度为100mg·L^-1，除上述单一因素条件设置外，其余实验条件设置为唯一碳源为乙酸钠，30℃,150rpm摇床中培养48h，于12h，24h，48h测定氨氮废水中的NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N含量。每组实验均设置三个平行。

2.6单一因素对复合菌株硝化性能的影响

测定不同的因素(温度、摇速和C/N)对菌株复合菌株硝化性能的影响。温度实验：将复合菌株接种至NM培养基中，培养温度分别设置为20℃、30℃和40℃。摇速实验：菌株分别在90rpm、120rpm和150rpm摇速条件下培养。C/N实验：通过将不同浓度的乙酸钠加入到以NH₄Cl(NH₄Cl初始浓度为100mg·L^-1)为唯一氮源的培养基中，控制C/N为5、10、15。在单因素实验中，所有菌株都接种于盛有50mL NM培养基的100mL西林瓶中。除上述所需实验条件改变外，其余实验均在30℃、150rpm条件下培养24h，然后测试菌液的OD₆₀₀、TOC、NO₃ ^--N、NO₂ ^--N、NH₄ ⁺-N、TN等指标。

2.7数据处理及分析方法

OD₆₀₀通过紫外分光光度计(10s uv-vis,Thermo Fisher Genesys)测定。NH₄ ⁺-N测定用纳氏试剂比色法；NO₃ ^--N测定用紫外分光光度法；NO₂ ^--N测定用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定，所用仪器为752紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；TN通过TOC测定仪TN测定模块(TOC-L,Shimadzu)测定。

3结果与分析

3.1细菌筛选结果

根据菌落形态分析(图1)，本实验共分离纯化得到3株具有硝化功能的菌株，经鉴定后命名为Halomonas alkaliphile MND-5、Acinetobacter sp.MND-11、Acinetobactervenetianus MND-13。三株实验菌株均保存于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，嗜碱嗜盐单胞菌(Halomonas alkaliphile)MND-5的菌种保藏号为GDMCC.No 61871，保藏日期为2021年8月13日，分类命名为嗜碱嗜盐单胞菌(Halomonas alkaliphile)，菌株名称为MND-5，菌株测序如SEQ ID NO.1所示。不动杆菌(Acinetobacter sp.)MND-11的菌种保藏号为GDMCC.No 61872，保藏日期为2021年8月30日，分类命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，菌株名称为MND-11，菌株测序如SEQ IDNO.2所示。威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)MND-13的菌种保藏号为GDMCC.No61873，保藏日期为2021年8月13日，分类命名为威尼斯不动杆菌(Acinetobactervenetianus)，菌株名称为MND-13，菌株测序如SEQ ID NO.3所示。

3.2单菌株的生长情况及硝化性能

对所得3株菌株24h的生长情况、NH₄ ⁺-N和TN等去除率及NO₂ ^--N积累进行检测，结果如表2所示。由表2可知，实验所选用的三株菌均具有较强的氨氮去除能力，其中，MND-11和MND-13 24h NH₄ ⁺-N去除率分别为71.33％和72.35％。

表2单菌株24h时生长情况及硝化性能指标

注：表中NO₂ ^--N以浓度表示，单位mg·L^-1；NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N与TN以去除率表示。

3.3菌剂复配拮抗性测定

菌种间是否有拮抗作用也进行了研究。如表3所示，3株菌之间无抑菌圈产生，无明显拮抗作用发生。

表3三株菌种间的拮抗作用

Table 3 Antagonism among three strains

3.4正交实验结果

根据正交实验结果可知(表4)：最佳NH₄ ⁺-N去除处理组为复合菌剂比例为第四组复合菌剂MND-13、MND-5、MND-11为2:1:2的。该处理组处理初始NH₄ ⁺-N浓度为100mg·L^-1培养体系，48h TN去除率为84.1％，确定最佳硝化菌组合为A₂B₁C₂，为后续应用到海水养殖废水及高盐度废水脱氮处理提供良好的技术支持。

表4正交试验结果表

3.5单一因素对复合菌株硝化性能的影响

3.5.1温度对复合菌株硝化性能的影响

实验结果显示：菌株在40℃条件下生长缓慢，(图2A)；硝化能力方面，40℃条件下，24h和48h时NH₄ ⁺-N去除率分别为40％和90.32％，TN 48h去除率仅为52.67％(图2B和2C)。30℃和20℃时NH₄ ⁺-N和TN去除率均优于40℃条件，48h时NH₄ ⁺-N去除率分别为100％和96.74％(图2B)，TN去除率分别为82.07％和75.48％(图2C)。因此推测，复合菌株生长和硝化能力的最优条件范围是20℃～30℃。

3.5.2溶解氧对复合菌株硝化性能的影响

实验结果显示：在转速为90rpm(初始溶解氧浓度为5.6±0.1mg·L^-1)时，菌株生长速度缓慢(图3A)，24h时NH₄ ⁺-N和TN去除率分别为58.23％和40.11％(图3B和3C)。随着溶解氧浓度的增加，菌株生长更快。在120rpm(初始溶解氧浓度为7.0±0.18mg·L^-1)和150rpm(初始溶解氧浓度为7.5±0.39mg·L^-1)条件下，24h时NH₄ ⁺-N去除率分别为82.84％和94.3％，48h时NH₄ ⁺-N去除率均能达到100％(图3B)。TN在48h去除效率分别为77.86％和84.22％(图3C)。因此，复合菌株在转速120rpm～150rpm时，硝化能力表现最好，这表明其具有较高的DO耐受限度。

3.5.3 C/N对复合菌株硝化性能的影响

实验结果如图4所示：C/N为5时，菌株生长缓慢，48h时NH₄ ⁺-N和TN去除率分别为53.7％和39.89％(图4B和4C)。C/N为10和15条件下，48h时NH₄ ⁺-N去除速率分别为96.81和100％(图4B)，TN在48h去除效率分别为75.21％和84.67％(图4C)。因此C/N为10～15为复合菌株硝化能力最优的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连海洋大学

<120> 一种耐盐硝化复合菌剂及应用

<130> 2021

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1367

<212> DNA

<213> MND-5

<220>

<221> misc_feature

<222> (1052)..(1052)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1059)..(1059)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

ggggtagctt gctacccgct gacgagcggc ggacgggtga gtaatgcata ggaatctgcc 60

cgatagtggg ggataacctg gggaaaccca ggctaatacc gcatacgtcc tacgggagaa 120

agggggcttc ggctctcgct attggatgag cctatgtcgg attagctagt tggtgaggta 180

atggctcacc aaggcaacga tccgtagctg gtctgagagg atgatcagcc acatcgggac 240

tgagacacgg cccgaactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa 300

agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggccctc gggttgtaaa gcactttcag 360

cgaggaagaa cgcctagtgg ttaataccca ctaggaaaga catcactcgc agaagaagca 420

ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt aatcggaatt 480

actgggcgta aagcgcgcgt aggtggcttg ataagccggt tgtgaaagcc ccgggctcaa 540

cctgggaacg gcatccggaa ctgtcaagct agagtgcagg agaggaaggt agaattcccg 600

gtgtagcggt gaaatgcgta gagatcggga ggaataccag tggcgaaggc ggccttctgg 660

actgacactg acactgaggt gcgaaagcgt gggtagcaaa caggattaga taccctggta 720

gtccacgccg taaacgatgt cgaccagccg ttgggtgcct agcgcacttt gtggcgaagt 780

taacgcgata agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg 840

acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt 900

acctactctt gacatcctgc gaacttgtga gagatcactt ggtgccttcg ggaacgcaga 960

gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgtaa 1020

cgagcgcaac ccttgtcctt atttgccagc gngtaatgnc gggaactcta aggagactgc 1080

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gctacacacg tgctacaatg gccggtacaa agggttgcga gctcgcgaga gtcagctaat 1200

cccgaaaagc cggtctcagt ccggatcgga gtctgcaact cgactccgtg aagtcggaat 1260

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<211> 1404

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Claims (6)

1.一种硝化复合微生物菌剂，其特征在于，由嗜碱嗜盐单胞菌Halomonas alkaliphileMND-5、不动杆菌Acinetobacter sp.MND-11和威尼斯不动杆菌Acinetobacter venetianusMND-13组成；

嗜碱嗜盐单胞菌Halomonas alkaliphile MND-5于2021年8月13日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC.No 61871；

不动杆菌Acinetobacter sp.MND-11于2021年8月30日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC.No 61872；

威尼斯不动杆菌Acinetobacter venetianus MND-13于2021年8月13日，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏号为GDMCC.No 61873。

2.根据权利要求1所述的硝化复合微生物菌剂，其特征在于，Acinetobactervenetianus MND-13、Halomonas alkaliphile MND-5和Acinetobacter sp.MND-11的复合比例为1～3：1～3：1～3。

3.根据权利要求1所述的硝化复合微生物菌剂，其特征在于，Acinetobactervenetianus MND-13、Halomonas alkaliphile MND-5和Acinetobacter sp.MND-11的复合比例为2:1:2。

4.一种硝化复合微生物菌剂在高盐度废水脱氨氮中的应用，其特征在于，所述高盐为盐度＞30；

所述的硝化复合微生物菌剂为权利要求1-3任一项所述的硝化复合微生物菌剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述高盐含氮废水包括海水养殖废水。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将复合比例为1～3：1～3：1～3的Halomonas alkaliphile MND-5、Acinetobacter sp.MND-11和Acinetobacter venetianusMND-13复合微生物菌剂接种到待处理高盐度废水中，通过将唯一碳源乙酸钠加入到以NH₄Cl为唯一氮源的培养基中，控制C/N为10～15，温度为20℃～30℃，摇速为120rpm～150rpm条件下，使复合微生物菌剂在废水中生长，即可完成对高盐含氨氮废水的脱氨氮处理。

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