CN112300973A - 以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法 - Google Patents
以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种以苯丙氨酰‑tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法。所述方法通过将红球菌中苯丙氨酰‑tRNA合成酶α‑亚基关键位点的丙氨酸位点突变为甘氨酸形成苯丙氨酰‑tRNA合成酶基因突变体，苯丙氨酰‑tRNA合成酶突变体合成的tRNA可以将对氯苯丙氨酸组装进蛋白质，从而使蛋白质失去活性，导致菌体死亡，达到筛选的目的。以苯丙氨酰‑tRNA合成酶基因突变体作为红球菌基因编辑中的反向筛选标记可实现对编辑成功的菌株进行高效筛选。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，涉及一种以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法。
背景技术
红球菌隶属放线菌纲、放线菌目、诺卡式菌科、红球菌属，广泛分布在土壤、岩石、地下水、海底沉积物、昆虫内脏及动物粪便中。红球菌属菌株可以利用并降解多种形式的碳源，如糖类、烷烃类、多酚类物质，尤其对一些难降解的杂环类化合物具有较强的降解效果，例如农药、石油中复杂烷烃类物质及木质素。此外，由于红球菌中有许多特殊的酶及代谢途径，可以合成许多有价值的工业产品，例如丙烯酰胺及其他酰胺类化合物、生物表面活性剂和生物絮凝剂等(华苟根,郭坚华.红球菌属的分类及应用研究进展[D].2003；Kim D,ChoiK Y,Yoo M,et al.Biotechnological potential of Rhodococcus biodegradativepathways[J].Journal of microbiology and biotechnology,2018,28(7):1037-1051.)。红球菌可以利用木质素及木质素衍生物生产微生物油脂等一系列化学品，也可以利用糖类、烷烃类、多酚类等物质为原料炼制许多高附加值的化学品，以及应用于环境修复与保护等领域。
目前红球菌的应用及研究大部分停留在筛选一些性能特殊或活性高的菌株，使用野生菌株进行相关生产活动。例如，张玉秀等筛选获得了一株能够降解苯酚的红球菌并将其应用到焦化废水的处理中(张玉秀,蒙小俊,柴团耀.苯酚降解菌红球菌Rhodococcussp.P1的鉴定及其在焦化废水中的应用[J].微生物学报,2013,53(10):1117-1124.)；田雅洁等使用玫瑰红红球菌进行了废水中铵态氮的去除(田雅洁,曹煜成,胡晓娟,等.4种因子对玫瑰红红球菌XH2氨氮去除效果的影响[J].渔业科学进展,2018(2018年06):164-172.)。随着技术的进步，基于基因编辑技术的基因工程方法已广泛应用在生物技术的许多领域。但相对于其它微生物，如大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌等，红球菌缺少足够的基因编辑方法来满足其代谢工程改造的需要。
有效基因编辑方法的缺乏严重限制了红球菌的应用，目前仅有的少数针对红球菌的基因编辑通常是采用假阳性较高的筛选标记或仅采用一种抗生素作为筛选标记。使用假阳性较高的筛选标记增加了后期目标菌株筛选的工作量，而仅采用一种抗生素筛选标记则会造成基因编辑过程中抗性标记残留在细胞内，很难做到无痕编辑。例如，Hernández等人在之前的研究中仅采用一种抗生素标记对Rhodococcus opacus PD630中的atf2基因进行阻断，最后虽然达到了阻断效果，但残留了外源核苷酸片段在细胞内。外源核苷酸片段的残留不仅可能会影响细胞的性状，而且抗生素标记的残留还可能造成抗生素抗性基因的泄露，造成一定的生物安全(The atf2gene is involved in triacylglycerolbiosynthesis and accumulation in the oleaginous Rhodococcus opacus PD630[J].Applied microbiology and biotechnology,2013,97(5):2119-2130.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法。该方法通过将红球菌中苯丙氨酰-tRNA合成酶α-亚基关键位点的丙氨酸位点突变为甘氨酸，该苯丙氨酰-tRNA合成酶突变体合成的tRNA可以将对氯苯丙氨酸组装进蛋白质，从而使蛋白质失去活性，导致菌体死亡，达到筛选的目的。
实现本发明目的的技术方案如下：
本发明提供苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中的α-亚基关键丙氨酸突变为甘氨酸形成的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体在红球菌基因编辑中的应用。
本发明中，所述的基因编辑可以为基因的敲除、插入或替换。
本发明中，所述的红球菌属菌株选自Rhodococcus coprohilus，Rhodococcusbiphenylivorans，Rhodococcus hoagii，Rhodococcus equi，Rhodococcus fascians，Rhodococcus aetherivorans，Rhodococcus erythropolis，Rhodococcus globerulus，Rhodococcus rhodnii,Rhodococcus marinonascens，Rhodococcus opacus，Rhodococcuspercolatus，Rhodococcus rhodochrous，Rhodococcus ruber，Rhodococcus jostii，Rhodococcus zopfii，Rhodococcus pyridinivorans或Rhodococcus koreensis。
本发明中，所述的红球菌苯丙氨酰-tRNA合成酶的NCBI序列号为：GenBank:SQI28517.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AWZ25393.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AVP68842.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:CBH48531.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AMY55380.1，关键突变位点为A319G；或为GenBank:AKE90232.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AGT92887.1，关键突变位点为A320G；或为Genbank：AHK32253.1，关键突变位点为A329G；或为GenBank:AYA26669.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AXY52474.1，关键突变位点为A320G；或为Genbank：ABG92787.1，关键突变位点为A325G；或为Genbank：AHD20033.1，关键突变位点为A320G。
具体地，本发明提供利用传统同源重组打靶技术，以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法，包括以下步骤：
步骤1，将含有自身启动子序列的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和自杀型质粒连接，获得骨架质粒；
步骤2，通过定点突变技术，将骨架质粒中的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中的α-亚基关键丙氨酸突变为甘氨酸形成苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体，转入到大肠杆菌DH5α中，获得自杀质粒载体；
步骤3，将靶基因位点两端同源臂拼接后插入到自杀质粒载体上，获得含有同源臂的自杀型质粒，最后将含有同源臂的自杀型质粒转化到红球菌中，获得敲除靶基因的红球菌；或将靶基因位点两端同源臂和目标基因片段拼接后插入到自杀质粒载体上，获得含有同源臂和目标基因的自杀型质粒，最后将含有同源臂和目标基因的自杀型质粒转化到红球菌中，获得目标基因插入或替换的红球菌。
上述红球菌基因编辑方法中，步骤1中，所述的自杀型质粒为基因编辑领域中常规使用的质粒，可以为pk18mob质粒或pk19mob质粒。
上述红球菌基因编辑方法中，步骤3中，所述的靶基因位点两端同源臂为靶基因位点两侧大小为200-1500bp的核苷酸片段。
上述红球菌基因编辑方法中，步骤3中，将含有同源臂的或含有同源臂和目标基因的自杀型质粒转化到红球菌后，先通过抗生素筛选标记，获得阳性转化子，再通过对氯苯丙氨酸筛选标记，获得基因编辑成功的菌落。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明采用苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体特异识别对氯苯丙氨酸而致细胞致死性作为红球菌基因编辑中的反向筛选标记，特异性高，可实现编辑成功的菌株的高效筛选，该筛选标记适用于传统同源重组打靶技术。本发明的基因编辑方法可以实现对红球菌基因组的无痕编辑和精准编辑，能够实现对红球菌基因编辑过程的高效筛选，成功率为100％，一次基因编辑过程约为5-7天，为红球菌的基因编辑和代谢工程改造提供一种高效快速的方法。
附图说明
图1是以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的同源双交换红球菌基因编辑方法的流程示意图。
图2为粘糠酸环化异构酶基因敲除所使用质粒图谱。
图3为对粘糠酸环化异构酶基因敲除后PCR验证的阳性单菌落的琼脂糖凝胶电泳验证和测序结果。
图4为邻苯二酚2,3双加氧酶基因敲除所使用的质粒图谱。
图5为对邻苯二酚2,3双加氧酶基因敲除后PCR验证的琼脂糖凝胶电泳验证和测序结果图。
图6为原儿茶酸3,4双加氧酶基因敲除所用的质粒图谱。
图7为对原儿茶酸3,4双加氧酶基因敲除后PCR验证的琼脂糖凝胶电泳验证和测序结果图。
图3、5、7中，随机在第二轮反筛选后挑取阳性转化子并经PCR验证后的琼脂糖凝胶电泳图，条带位于5k bp左右的为野生型菌株，条带位于3k bp左右的为基因编辑成功后的菌株，通过琼脂糖凝胶电泳验证后的菌株经测序证明三个基因编辑实施案例成功率均为100％，测序结果中箭头所指的为基因编辑后的位点。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。本发明中，红球菌属菌株可以为Rhodococcus coprohilus，Rhodococcus biphenylivorans，Rhodococcus hoagii，Rhodococcus equi，Rhodococcus fascians，Rhodococcus aetherivorans，Rhodococcuserythropolis，Rhodococcus globerulus，Rhodococcus rhodnii,Rhodococcusmarinonascens，Rhodococcus opacus，Rhodococcus percolatus，Rhodococcusrhodochrous，Rhodococcus ruber，Rhodococcus jostii，Rhodococcus zopfii，Rhodococcus pyridinivorans和Rhodococcus koreensis。下述实施例中，以Rhodococcusopacus PD630为例。
实施例1.Rhodococcus opacus PD630中粘糠酸环化异构酶基因(GenBank:AHK33752.1)的删除
(1)pk18mob-pheS质粒的构建
提取R.opacus PD630基因组，并设计特异性引物将包含苯丙氨酰-tRNA合成酶基因(AHK32253.1)及其自身启动子的核苷酸片段进行克隆，其中上游引物为SEQ ID NO:1：TACCCGGGGATCCTCTAGATGCGGTCCTCGACAGCATCAGCG；下游引物为SEQ ID NO:2：AACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATTGCGCTACTCGCACGTCTGC，根据以下体系进行PCR反应：
| 5×Reaction buffer | 10.0μL |
| dNTPs(10mM) | 1.0μL |
| 上游引物SEQ ID NO:1(10μM) | 1.0μL |
| 下游引物SEQ ID NO:2(10μM) | 1.0μL |
| Rhodococcus opacus PD630基因组 | 1.0μL |
| Taq酶(5U/μL) | 1.0μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 35.0μL |
| 总体系 | 50μL |
反应体系照如下程序进行：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min。
使用组装试剂盒将含有自身启动子序列的野生型苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和pk18mob质粒进行连接。将连接液转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含50μg/mlKanamycin的LB固体培养基上，过夜培养挑取阳性单菌落并提取质粒，测序验证得到pk18mob-pheS质粒。
(2)苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体构建
使用反向PCR技术将构建好的野生型苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中编码329位丙氨酸的核苷酸突变为编码甘氨酸的核苷酸，其特异性引物：上游SEQ ID NO:3：GTACACCGGGTTCGGGTTCGGCATGGG；下游SEQ ID NO:4：CCCATGCCGAACCCGAACCCGGTGTAC，根据以下体系进行PCR反应：
反应体系照如下程序进行：95℃预变性3min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃终延伸5min。
将PCR体系经过限制性内切酶Dpn I酶切后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含50ng/ml Kanamycin的LB固体培养基上，过夜培养挑取阳性单菌落并提取质粒，测序验证获得含有反筛选标记的pk18mob-pheS*质粒。
(3)将靶基因位点两侧核苷酸片段插入pk18mob-pheS*质粒
通过上游引物SEQ ID NO:5：ACGAATTCGAGCTCGGTACCTACCCCAGCTTCTGCAGGGTG和下游引物SEQ ID NO:6：GTGCCATCGGGTGGTGTGCTCCCGGATCACTTTCTCTACGGGTGG进行PCR获得粘糠酸环化异构酶基因上游约1000bp核苷酸序列；通过上游引物SEQ ID NO7：CCACCCGTAGAGAAAGTGATCCGGGAGCACACCACCCGATGGCAC和下游引物SEQ ID NO:8：GCCTGCAGGTCGACTCTAGACACCCAGCTGGCCATCTGCG进行PCR获得粘糠酸环化异构酶基因下游约1000bp核苷酸序列。采用重叠PCR方法将两边核苷酸片段连接在一起，然后使用组装试剂盒将该连接好的核苷酸片段插入到pk18mob-pheS*质粒中，获得含有同源臂及pheS*片段的自杀质粒，质粒图谱如图2所示。
(4)敲除粘糠酸环化异构酶基因
使用电击转化法将步骤(3)中构建的基因编辑质粒载体转入到R.opacus PD630中并涂布于含有50μg/ml Kanamycin的LB固体培养基上，在30℃下培养48h长出阳性单菌落。将阳性菌接种于LB液体培养基中培养浑浊后涂布于含有15mM对氯苯丙氨酸的LB的固体培养基上培养48h后长出阳性单菌落。
(5)验证基因编辑结果
设计特异性上游引物SEQ ID NO:9：GAGTAGTGCTGTCCGATGCTCAGCAC；特异性下游引物SEQ ID NO:10：CGGTCAAGCTCTCGTTTCACGTACAG对步骤(4)中含有15mM对氯苯丙氨酸的LB的固体培养基上长出的阳性单菌落进行PCR验证，如图3所示，通过验证获得了粘糠酸环化异构酶基因成功敲除的菌株，本过程一次基因编辑最短时间为5天。
实施例2Rhodococcus opacus PD630中邻苯二酚2,3双加氧酶基因(GenBank:AHK27425.1)的删除
(1)pk18mob-pheS*质粒构建同实施例1中的步骤(1)和(2)。
(2)将邻苯二酚2,3双加氧酶基因位点两侧核苷酸片段插入pk18mob-pheS*反筛选质粒中
通过设计特异性引物：SEQ ID NO:11：ACGAATTCGAGCTCGGTACCGGCCAACGGCGTGAAGCCGGC；SEQ ID NO:12：CAGGCCCCCACACCGAGGACAACTCGACACGGGACGCACCGTCGAAAGGGAC；SEQID NO:13：GTCCCTTTCGACGGTGCGTCCCGTGTCGAGTTGTCCTCGGTGTGGGGGCCTG；SEQ ID NO:14：TGTCGAGGACCGCATCTAGAGAGCGGGACGACCTCCTGCTGCG，通过PCR及上述引物获得邻苯二酚2,3双加氧酶基因上游和下游各约1000bp的核苷酸片段。采用重叠PCR方法将两边核苷酸片段连接在一起，然后使用组装试剂盒将该连接好的核苷酸片段插入到pk18mob-pheS*质粒中，获得含有同源臂及pheS*片段的自杀质粒，质粒图谱如图4所示。
(3)删除邻苯二酚2,3双加氧酶基因
使用电击转化法将步骤(2)中构建的基因编辑质粒载体转入到R.opacus PD630中并涂布于含有50μg/ml Kanamycin的LB固体培养基上，并在30℃下培养48h长出阳性单菌落。将阳性菌接种于LB液体培养基中培养24h后涂布于含有15mM对氯苯丙氨酸的LB的固体培养基上培养48h后长出阳性单菌落。
(4)验证基因编辑结果
设计特异性引物SEQ ID NO:15：CTGCTCGATCCGATCCGCAAGG；SEQ ID NO:16：TGGAACAGCAGGAGACGCTGTGATG对步骤(3)长出的阳性单菌落进行PCR验证，经过对随机长出的阳性单菌落进行验证，如图5所示,。通过对阳性单菌落进行PCR和测序验证，基因成功编辑的概率为100％，基因编辑时间为5天。
实施例3Rhodococcus opacus PD630中原儿茶酸3,4双加氧酶基因(GenBank:AHK32653.1)的删除
(1)pk18mob-pheS*质粒构建同实施例1中的步骤(1)和(2)。
(2)将原儿茶酸3,4双加氧酶基因位点两侧核苷酸片段插入pk18mob-pheS*反筛选质粒中
通过设计特异性引物：SEQ ID NO:17：ACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGCCCGACCCCGAGGATGC；SEQ ID NO:18：GCGCGACACCTTTCTGGGTTGTGACCGAGGAAAAAGATCCTCACGTTCTCGATGTGAACAGTC；SEQ ID NO:19：GACTGTTCACATCGAGAACGTGAGGATCTTTTTCCTCGGTCACAACCCAGAAAGGTGTCGCGC；SEQ ID NO:20：GCCTGCAGGTCGACTCTAGAGCGCGACGGCTCCGCCGG，通过PCR及上述引物获得原儿茶酸3,4双加氧酶基因上游和下游各约1000bp的核苷酸片段。采用重叠PCR方法将原儿茶酸3,4双加氧酶基因上游和下游片段连接在一起，然后使用组装试剂盒将该连接好的核苷酸片段插入到pk18mob-pheS*质粒中，获得含有同源臂及pheS*片段的自杀质粒，质粒图谱如图6所示。
(3)敲除邻原儿茶酸3,4双加氧酶基因
使用电击转化法将步骤(2)中构建的基因编辑质粒载体转入到R.opacus PD630中并涂布于含有50ng/ml Kanamycin的LB固体培养基上，并在30℃下培养48h长出阳性单菌落。将阳性菌接种于LB液体培养基中培养24h后涂布于含有15mM对氯苯丙氨酸的LB的固体培养基上培养48h后长出阳性单菌落。
(4)验证基因编辑结果
设计特异性引物SEQ ID NO:21：GCCGCCCATGCCCTTGACCA；SEQ ID NO:22：GCCATCGCATCGGGGTGAAC对步骤(3)长出的阳性单菌落进行PCR验证，经过对随机长出的阳性单菌落进行PCR测序验证，结果如图7所示，基因编辑成功概率为100％，基因编辑时间为7天。
序列表
<110> 南京理工大学
<120> 以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法
<141> 2019-08-02
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (8)
1.苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中的α-亚基关键丙氨酸突变为甘氨酸形成的苯丙氨酰-tRN合成酶基因突变体在红球菌基因编辑中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因编辑为基因的敲除、插入或替换。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的红球菌属菌株选自Rhodococcuscoprohilus，Rhodococcus biphenylivorans，Rhodococcus hoagii，Rhodococcus equi，Rhodococcus fascians，Rhodococcus aetherivorans，Rhodococcus erythropolis，Rhodococcus globerulus，Rhodococcus rhodnii,Rhodococcus marinonascens，Rhodococcus opacus，Rhodococcus percolatus，Rhodococcus rhodochrous，Rhodococcusruber，Rhodococcus jostii，Rhodococcus zopfii，Rhodococcus pyridinivorans或Rhodococcus koreensis。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的红球菌苯丙氨酰-tRNA合成酶的NCBI序列号为：GenBank:SQI28517.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AWZ25393.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AVP68842.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:CBH48531.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AMY55380.1，关键突变位点为A319G；或为GenBank:AKE90232.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AGT92887.1，关键突变位点为A320G；或为Genbank：AHK32253.1，关键突变位点为A329G；或为GenBank:AYA26669.1，关键突变位点为A320G；或为GenBank:AXY52474.1，关键突变位点为A320G；或为Genbank：ABG92787.1，关键突变位点为A325G；或为Genbank：AHD20033.1，关键突变位点为A320G。
5.根据权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于，利用传统同源重组打靶技术，以苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的红球菌基因编辑方法，包括以下步骤：
步骤1，将含有自身启动子序列的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和自杀型质粒连接，获得骨架质粒；
步骤2，通过定点突变技术，将骨架质粒中的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中的α-亚基关键丙氨酸突变为甘氨酸形成苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体，转入到大肠杆菌DH5α中，获得自杀质粒载体；
步骤3，将靶基因位点两端同源臂拼接后插入到自杀质粒载体上，获得含有同源臂的自杀型质粒，最后将含有同源臂的自杀型质粒转化到红球菌中，获得敲除靶基因的红球菌；或将靶基因位点两端同源臂和目标基因片段拼接后插入到自杀质粒载体上，获得含有同源臂和目标基因的自杀型质粒，最后将含有同源臂和目标基因的自杀型质粒转化到红球菌中，获得目标基因插入或替换的红球菌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1中，所述的自杀型质粒为pk18mob质粒或pk19mob质粒。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3中，将含有同源臂的或含有同源臂和目标基因的自杀型质粒转化到红球菌后，先通过抗生素筛选标记，获得阳性转化子，再通过对氯苯丙氨酸筛选标记，获得基因编辑成功的菌落。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3中，所述的靶基因位点两端同源臂为靶基因位点两侧大小为200-1500bp的核苷酸片段。
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