CN109880761A - 一种用于处理高盐废水的复合菌种 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于处理高盐废水的复合菌种，具体地，所述方法包括向特定微生物内转入嗜盐相关基因，本发明获得的嗜盐细菌加入到深度生化池后，深度生化池中本底污泥中的微生物生活并未收到影响，本发明提供的嗜盐细菌对高盐、高氯、高碱污水具有耐受性和降解性，并且对可生化性较差的污水具有处理功能，单菌性能稳定，通过基因改造使得其性能可传代，尤其适用于有深度污水处理需求的工业场景。

Description

一种用于处理高盐废水的复合菌种

技术领域

本发明涉及污水处理领域，特别地涉及一种用于处理高盐废水的复合菌种。

背景技术

近年来，随着我国工业产业蓬勃发展，工业污水排放量迅速提高，随着化学合成工艺的多样化发展，工业污水中新增了大部分高盐、高氯污水，这些污水毒性较大，对微生物生长有抑制或毒害作用，大量标污水的排放势必会对周边环境和受纳水体产生污染，危及周边海域，从而对人类生活和生产造成严重威胁和影响。

生物强化技术属于生物处理技术，生物强化技术是指在生物处理体系中投加具有特定功能的微生物来改善原有处理体系的处理效果，投加后的微生物可以来源于原有的处理体系。

国内外研究者已把这项技术应用于工业废水、地表水及地下水中难降解有毒有害物质的治理或用于改善废水处理效果，可显著提高微生物活性，提高高盐污水处理效率。

但在生物强化技术使用过程中，如何充分发挥微生物的潜力，改善难降解有机物的处理效果，如何抑制高盐高氯污水对于微生物的细胞毒性，是这一技术在工业生产中亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于处理高盐废水的复合菌种。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种用于处理高盐废水的复合菌种，所述复合菌种包括芽孢杆菌、硝化细菌、链球菌、军团菌、梭菌、蓝藻、假单胞菌、反硝化细菌、硫化细菌及放线菌。

优选地，所述复合菌种按百分比包括芽孢杆菌83.3％、硝化细菌5％、链球菌1％、军团菌1％、梭菌1％、蓝藻1％、假单胞菌2.5％、反硝化细菌3.5％、硫化细菌1.2％及放线菌0.5％。

进一步地，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。

进一步地，所述芽孢杆菌的获得具体步骤为：

步骤一、获得高盐环境中总嗜盐基因；

步骤二、构建嗜盐基因文库；

步骤三、初步筛选获得潜在嗜盐基因；

步骤四、将初步筛选获得的潜在嗜盐基因转入枯草芽孢杆菌；

步骤五、获得转基因枯草芽孢杆菌，评估转基因枯草芽孢杆菌的耐盐能力。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌基因组中包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3的任一条序列。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌基因组中包括如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。

进一步地，所述复合菌种对高盐、高氯、高碱污水具有耐受性和降解性。

进一步地，所述微生物复合菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂内活菌计数不低于2.8×10⁷cfu/mL。

进一步地，所述微生物复合菌剂为干粉菌剂，所述干粉菌剂内活菌计数不低于1.2×10⁸cfu/g。

进一步地，所述复合菌剂为胶囊，所述胶囊内活菌计数不低于5×10⁹cfu每胶囊。

本发明具有以下有益效果：本发明获得转基因枯草芽孢杆菌加入到深度生化池后，深度生化池中本底污泥中的微生物生活并未收到影响，经过1个月的中试试验，证实本发明提供的转基因枯草芽孢杆菌对高盐、高氯、高碱污水具有耐受性和降解性，并且对上述可生化性较差的污水具有处理功能，单菌性能稳定，通过基因改造使得其性能可传代，尤其适用于有深度污水处理需求的工业场景。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述，以下试剂或菌剂若无特殊说明，均为市售试剂或菌剂。

实施例1：复合菌种的制备

所述复合菌种包括芽孢杆菌、硝化细菌、链球菌、军团菌、梭菌、蓝藻、假单胞菌、反硝化细菌、硫化细菌及放线菌，优选地，所述复合菌种按百分比包括芽孢杆菌83.3％、硝化细菌5％、链球菌1％、军团菌1％、梭菌1％、蓝藻1％、假单胞菌2.5％、反硝化细菌3.5％、硫化细菌1.2％及放线菌0.5％，更优选地，所述芽孢杆菌为转基因芽孢杆菌，所述复合菌剂可以制备成液体菌剂、干粉菌剂、胶囊等类型，制备成液体菌剂时，所述液体菌剂内活菌计数不低于2.8×10⁷cfu/mL；制备成干粉菌剂时，所述干粉菌剂内活菌计数不低于1.2×10⁸cfu/g；制备成胶囊时，所述胶囊内活菌计数不低于5×10⁹cfu每胶囊。

实施例2：总嗜盐基因的获得

盐碱湖是自然界高盐碱环境，大多为内陆湖泊，可以形成较封闭的微生物生态环境，盐碱湖微生物群落包含藻类、蓝细菌、好氧细菌、厌氧细菌、兼性好氧细菌、古菌等，古菌是盐碱湖微生物群落的重要组成成分，它们适应高盐碱环境，大多属于化能有机营养类型，由于嗜盐古菌具有区别于其他微生物的渗透压、细胞膜离子分布、嗜盐程度、贫养等特性，在常规条件下很难培养，正是由于古菌具备上述理化性质上的特异性，其有区别于常规微生物的代谢途径，具备应用于工业产业中的潜力，故本发明采用非培养技术探究盐碱湖内包括古菌在内的微生物遗传多样性，获取微生物，特别是古菌的嗜盐相关基因。

样品采集自中国，艾丁湖，样品种类包括湖周泥土、湖面盐壳、水样、湖底泥，采集样品后于0℃保藏。艾丁湖年降水量不到20毫米，年平均气温14℃，极端高温达48℃，地表温度超过80℃。

将上述湖周泥土、湖面盐壳、水样、湖底泥样品混合，取25g混合样品与50mL缓冲液混合加入透析袋，透析12h去除样品中的盐离子，拖延后采取冻融法裂解细胞并提取微生物总DNA，纯化DNA样品。

实施例3：构建嗜盐基因文库

将纯化获得的DNA进行测序并利用大肠杆菌表达系统(E.coli DH5a)构建盐湖嗜盐基因文库，随机打断基因组DNA至100bp、150bp、200bp、250bp、500bp、1.0kb、1.5kb、2.5kb的片段，将DNA片段与接头连接之后PCR扩增100bp、150bp、200bp、250bp、500bp序列并上机测序获得短序列文库，1.0kb和1.5kb大片段文库采用Cre-Lox建库技术构建，在DNA大片段两端连接LoxP接头后再进行环化、测序；按照基因组构建步骤分别构建插入片段为250bp，500bp，1.0kb，1.5kb的片段插入文库，基因组测序委托南京金斯瑞公司通过SOLEXA测序平台完成。将上述插入外源基因的大肠杆菌接种至不同盐浓度的LB培养基进行耐盐测试，盐胁迫浓度为15％-20％(NaCl浓度按1％递增)和20％-30％(NaCl浓度按2％递增)，于35℃培养一周，挑取盐浓度25％时生长旺盛的菌落进行纯培养(划线培养，盐浓度为0.25g/L的LB培养基)，挑取20个长势旺盛的克隆进行测序，用通用引物T7F和pYES2R，古菌特异性引物25F和915R分别测序鉴定插入片段长度及具体序列，将所得到的序列去除载体后，获得嗜盐基因SAL1、SAL2、SAL3、SAL4、SAL5、SAL6，经BLAST比对，SAL1、SAL5、SAL6与嗜盐古菌超氧化物歧化酶编码基因具有同源性，选择SAL1、SAL5、SAL6基因对环境适应性较强的芽孢杆菌进行基因改造。

实施例4：将嗜盐基因转入枯草芽孢杆菌中

对SAL1、SAL5、SAL6进行密码子改造，使其适应枯草芽孢杆菌编码系统，获得改造后的基因SAL1c核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，SAL5c核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，SAL6c核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述SAL1c、SAL5c、SAL6c的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的序列5’端还连接有NcoI酶切位点，3’端还连接有SwaI酶切位点。将合成的SAL1c、SAL5c、SAL6c核苷酸序列分别连入克隆载体pGEM-T(购自Promega)上，操作步骤按载体说明书进行，得到重组克隆载体pGEM-SALc1、pGEM-SALc5、pGEM-SALc6(载体结构：Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；AQEX为AQE1-10核苷酸序列；MCS为多克隆位点)。

取枯草芽孢杆菌感受态细胞(市售)，将重组克隆载体pGEM-SALc1、pGEM-SALc5、pGEM-SALc6分别用热激方法转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，热激条件参考分子克隆。挑取白色菌落，培养后提取质粒，经酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pGEM-SALc1、pGEM-SALc5、pGEM-SALc6中分别对应的插入所述SAL1c、SAL5c、SAL6c核苷酸序列。

实施例5：转基因枯草芽孢杆菌的耐盐能力测试

将上述插入外源基因的枯草芽孢杆菌分别接种至NaCl浓度为28％的LB液体培养基，于30℃培养5天，观察其生长情况，并测定培养基中的盐含量，测定结果如表1所示：

表1液体培养基中随天数变动的NaCl浓度测定结果

结果表明，转入SAL1c核苷酸序列的枯草芽孢杆菌没有除盐效果，虽然耐受28％的高盐培养基，长势旺盛，但是在代谢过程中，无法参与高盐的代谢；转入SAL5c核苷酸序列的枯草芽孢杆菌长势旺盛，并且在生长后期有较强的盐离子代谢能力，可以满足高盐废水的处理条件；转入SAL6c核苷酸序列的枯草芽孢杆菌在生长初期具有较强的盐代谢能力，但是其长势不够旺盛，在生长后期明显观察到高盐对其生长发育起到了抑制作用。

实施例6：转基因枯草芽孢杆菌高盐废水处理功能中试

中试工艺采用混合活性污泥法，中试设备包括水泵、营养液供应设备、深度生化池、三级沉淀池、回收设备；水流方向为二沉池出水通过水泵进入深度生化池，深度生化池出水进入三级沉淀池，回收设备回收三级沉淀池污泥后与转基因枯草芽孢杆菌混合回流入深度生化池，所述二沉池入水口接高盐高碱废水，二沉池出水各生化指标为：COD≈120mg/L，NH3-N≈25mg/L，盐离子浓度≈0.28mg/L，pH＝8.9，温度35℃，深度生化池规格为10m×15m×7.8m，深度生化池中含有本地污泥，检测不加入菌种时三级沉淀池出水各生化指标为：COD≈89mg/L，NH₃-N≈23mg/L，盐离子浓度≈0.257mg/L，pH＝8.5，温度32℃，检测周期为一个月。

初始向深度生化池中加入菌种，加入量为1kg菌种干粉，溶于1L营养液，共同加入深度生化池进行驯化，溶解氧保持在2.4mg/L，运行两周后，取水样检测转基因枯草芽孢杆菌的是否定殖，检测结果发现，深度生化池中水样中的枯草芽孢杆菌≈1.6×10⁵CFU/mL，本地污泥中枯草芽孢杆菌≈2.3×10⁸CFU/mL，结果表明转基因枯草芽孢杆菌定殖良好，污泥生长状态佳，加入外源菌后，污泥未出现排异反应，证明转基因枯草芽孢杆菌可以与其他细菌共生，再运行两周后，检测三级沉淀池出水各生化指标为：COD≈55mg/L，NH₃-N≈9.25mg/L，盐离子浓度≈0.117mg/L，pH＝7.5，温度32℃，总检测周期为一个月。

通过上述中试结果可知，本发明获得转基因枯草芽孢杆菌加入到深度生化池后，深度生化池中本底污泥中的微生物生活并未收到影响，经过1个月的中试试验，证实本发明提供的转基因枯草芽孢杆菌对高盐、高氯、高碱污水具有耐受性和降解性，并且对上述可生化性较差的污水具有处理功能，单菌性能稳定，通过基因改造使得其性能可传代，尤其适用于有深度污水处理需求的工业场景。

实施例7：检测复合菌种对高盐高碱污水的降解能力

中试及二沉池出水各生化指标同实施例6，检测复合菌种对高盐高碱污水的降解能力，初始向深度生化池中加入复合菌种，加入量为500g菌种干粉，前一周溶解氧保持在3mg/L，运行三周，溶解氧保持在2.3mg/L，检测三级沉淀池出水各生化指标为：COD≈49mg/L，NH₃-N≈7.33mg/L，盐离子浓度≈0.158mg/L，pH＝6.8，温度30℃，总检测周期为一个月。

通过上述中试结果可知，本发明获得复合菌种加入到深度生化池后，经过1个月的中试试验，证明复合菌种对高盐、高氯、高碱污水具有耐受性和降解性，并且对上述可生化性较差的污水具有处理功能，复合菌种除盐效果略差于转基因枯草芽孢杆菌的单菌种，但降氨氮能力优于单菌，尤其适用于有高氨氮、高盐、高碱污水处理需求的工业场景。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 宜兴国际环保城科技发展有限公司

<120> 一种用于处理高盐废水的复合菌种

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1280

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<223> SALc1

<400> 1

gaaaacggaa ttgtttaccg tccgattaag gtgggactcg gactgtctcg ggccaccgta 60

ttcgattcag gcagcctttg atccgatgaa tcctatgtga cacagtgcaa tttaacctgt 120

taaaaggaga tctcaagcat gccctttttc cggacttaga cgatcagata cctacaccat 180

cgaaatttac gagactgtgc cgggccagga ataagcggtt ggaaggcaac ctagtatgcc 240

attcacgtgg gattaaacga cagtcgctac agaacgatct gcttgccaga atagaggctc 300

gcgggggtta cgcacttcct tcaccacaac gtttcctgga gtggatgcag gggagagatg 360

aaggtgtatg cccacacggc gaggtatgat gacagattga gatggtgtgc gtctagtggg 420

tactgcgagt ggattgaaat ctgcacgtcg cgccgtcagt aaatataaca cagacgacca 480

ttgacttccg aagtcacttg caggagttcc tcctcatatg ctcctcgacc agaggtgaga 540

cccaggtctc cttgtttcct ggacgtgcac atcagccgtg gtacaacatt cacgtacatt 600

gtccttctgt gatgccgtcc attctaatgg cctagccact cctcacgcac gacgtgggct 660

tagtttacgt gactggccta aaccgacact tgactaatca gctcgcaata acccacttca 720

gaacaatgcg gcaggagaat acacggaagg atcgatggtg tgcacgatac ttatccctaa 780

cccacgataa ggccacgcta caagttgcga tgccggggat ggggtttgcc tttgtccacc 840

aatatctatt gagccaacaa tctctgtatc agaggaatgc gtcagtctta tcacaaacct 900

ccagatgata gtgttaccaa gtggtctgaa caaggaagtt taatccacac tcgaacgaac 960

tcgttcctct gctgatctct tagctaattg ggctgattct tgcagtagtt gaatataacg 1020

tgcgcaatgc gcggcacagg atattaccga cttcgctact ccatttttta gaaccggcga 1080

cacgccaatg ccgatcgggg tggagagaaa gacatatccg gagggctggc gctgtgcccg 1140

cgttagggcg tagtccctaa ttctcctgag cctattccgc atcacacgca tcgactgcaa 1200

attgatttca gacggcagga caatcagagt aatcagcctc gcaatttcgt cctattgtct 1260

aagccaggtg atagaggtga 1280

<210> 2

<211> 1379

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<223> SALc5

<400> 2

gcccgacaaa cttccgatgc tgatccccgg atagcctcgc taaggcgctt gggatcaagt 60

gttagtcgac acgtgcgggg tcgaacctcc aacgtctcct gtcttaacgc cggtagcccc 120

cacgaatgta gtatccttgg ctgttccctg aggacgggga gctatgccat gcctcacgtg 180

attatttaat taacatcatt ttggtcgttt gggtgaaagg ctcactgcag gaacttgatc 240

acctagaata atggcataat gggccgcttt cgtatatccg gtaaccgtcc ttaaaacatc 300

ccttccttta ggcacgttag agctagacgc gatttttagc cagatgacct atctaccacc 360

gcctccgtaa cagggggcag cgaacagacc acccaccgtt aaaatgtgtc tcccgacgaa 420

agtcaaacag aacagttgga agtgacgacg gacgctccat gttcgacgtt gttaaatggc 480

tttctaagtt ggtcgtctgc tctgtcgact acatcctaca ggatcacttt taacagatgc 540

cgcatcctag tcaatgttta gctgcctaga agggcaaccg tcacaaggat atcgcgttct 600

gctgtaggcc cacagctcca aactataaat tactgcccgg catgggaggg agaaagcgca 660

aagtgccaaa ccaacgtttt tggcgagccc accaatatca ggaggagtag ctaagcggac 720

gtggggagac cgcgctatca ctagcttcgg ccatggatgt ctcatataga actggccctc 780

gcgccgcgct cgctttagtc tagctgagta gtgttcaacg tgcgggtcca aagatagaca 840

acttctgagt ccgtagttga ccgtacattc catagtagca cctcctgagc agcattcgga 900

gtaattacta gccatgatga agagcgatca ggtcgagctc aaggttataa aaatcaccga 960

cgtcgtgcaa aaatgccccg aaactccgct caatgggggt gccttgaagc gaaagcgcga 1020

gtccgttttg tctccctgca ttattgggtt ttgttacctc gccatcgcag catgtatacg 1080

ggagaatata aaccgtaaat atctgcatag aagcaacccg gacgaagatt gctgagccag 1140

actgttttgc agggtcttat ctggctaatc tgaaattgta accagcgtac caccattgcg 1200

aggtttcagt ggctcattac tactaaggat tcacgtatct gaacttagcg cttggccaac 1260

cttggcgttt tctgatcatg tgactctctt cttttcaggc ttaagggact tcgcacgggg 1320

aagtcacgca acgcattacg ccatcacagg atttggcata gaaaggttct catgcacaa 1379

<210> 3

<211> 1306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<223> SALc6

<400> 3

ccgtctctct ggcgccccac taagcaaagc gtcattaggc tgctaaatgt ttagtgccta 60

tgggatctct tgagcccgtg gaacaaaaat tttacataaa gaccaaccca ccaatctagc 120

taatatacac actagatgtc gggccattcc aatgtcaggt tacaaccacc ccggtaaatg 180

ggtaatactt cccacgcgca gctagatccg gcatttgccc ataatcaaaa gaggtgcgct 240

ttattccctt caggacttcc aaagaggctc gcgggtcctg aactcctaat cctgtatagt 300

cctcaagctg cagtctagat aacgtaagga ctcggcaaaa tcgggtagga aatttagcgt 360

ttcagcatgt atgtagtcgc gccgtttata caagacagcc aagacgctcc ttccgcgcct 420

attaaaggac gctagctaca tcgctggctt aatgtttggc ggatggaaaa ctacttagct 480

tataggaggc tcaattacaa atctattcga tacgatgggc tttttagtgc agccaggctg 540

gtcctcgcag gctgaaactt aatcagtctt tgttctcagg cgcctgccgg aacccaatgg 600

tctcagtccc gtagaaatga cggaggtgtg atgttaatca ggagcatcga ggtcttgagg 660

accaggtcgg gtcttgttat tagatgaaat gctaactaag cgtacacggc actgggtacc 720

cgcgtccttt tagcgggatc tctccctgca gccctccaag tggacttata agagtggcct 780

ctgttatcgt ctgatggcat atgaccagac ggttacagga tatgcggctg agacacgacg 840

ctctctagtt atatatttga cgagcgaatg cgtgttacac cactagtcgt aacactcccc 900

gcactatagc gagtaattga ttgtcctcga gcgaggtaag taaggatggc ctagcaaccg 960

agaagcatct gggcaaagtt ggaacaaata gtagaacaac aacatattat tgctactgat 1020

aaagaacttt gtgccgattc actccctctg gacagagtta atccctctgg ggaagcccaa 1080

atcattatta tgcccaacgg tcctgatgta acttcgcggt gtgaggtgtg gtagtaacca 1140

ggtaatgcca cgcgcgtcta aaatcctctc cgatcgaagc gaggagccgt acagtactga 1200

gatctcacat tcacggagat caaacctagt gagctccacc attcaccgta gaatgtgcgt 1260

ccatgactcc gctgttctta gttgtccggg tgttgcttga gagtat 1306

Claims (10)

1.一种用于处理高盐废水的复合菌种，其特征在于，所述复合菌种包括芽孢杆菌、硝化细菌、链球菌、军团菌、梭菌、蓝藻、假单胞菌、反硝化细菌、硫化细菌及放线菌。

2.根据权利要求1所述复合菌种，其特征在于，所述复合菌种按百分比包括芽孢杆菌83.3％、硝化细菌5％、链球菌1％、军团菌1％、梭菌1％、蓝藻1％、假单胞菌2.5％、反硝化细菌3.5％、硫化细菌1.2％及放线菌0.5％。

3.根据权利要求1所述复合菌种，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。

4.根据权利要求1所述复合菌种，其特征在于，所述芽孢杆菌的获得具体步骤为：

步骤一、获得高盐环境中总嗜盐基因；

步骤二、构建嗜盐基因文库；

步骤三、初步筛选获得潜在嗜盐基因；

步骤四、将初步筛选获得的潜在嗜盐基因转入枯草芽孢杆菌；

步骤五、获得转基因枯草芽孢杆菌，评估转基因枯草芽孢杆菌的耐盐能力。

5.根据权利要求1所述复合菌种，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌基因组中包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的任一条序列。

6.根据权利要求5所述复合菌种，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌基因组中包括如SEQID NO:3所示核苷酸序列。

7.根据权利要求1-6任一所述复合菌种，其特征在于，所述复合菌种对高盐、高氯、高碱污水具有耐受性和降解性。

8.根据权利要求7所述复合菌种，其特征在于，所述复合菌剂为液体菌剂，所述液体菌剂内活菌计数不低于2.8×10⁷cfu/mL。

9.根据权利要求7所述复合菌种，其特征在于，所述复合菌剂为干粉菌剂，所述干粉菌剂内活菌计数不低于1.2×10⁸cfu/g。

10.根据权利要求7所述复合菌种，其特征在于，所述复合菌剂为胶囊，所述胶囊内活菌计数不低于5×10⁹cfu每胶囊。