CN108977370A - 一株降解苯酚类化合物的酵母菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株降解苯酚类化合物的酵母菌及其应用，该酵母菌为热带假丝酵母菌，分类命名为Candida tropicalis SDP‑1，于2018年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60417。本发明提供的菌株SDP‑1具有良好的耐盐能力和耐受重金属的能力，能够在高盐条件下降解高浓度的苯酚，能够降解邻苯二酚、对硝基酚、苯甲酸钠、邻苯二甲酸、3,5‑二硝基水杨酸、磺基水杨酸、间二硝基酚、2,4‑二硝基酚、甲苯和3,5‑二甲基苯酚等苯酚类化合物，通过固定化提高了微生物的活性和密度，缩短了降解时间，增强污染物的降解效果，通过固定化技术制备的SDP‑1小球既能降解含酚工业废水中的苯酚，也能降解含酚污染土壤中的苯酚。

Description

一株降解苯酚类化合物的酵母菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物学领域，涉及一株酵母菌，具体涉及一株降解苯酚类化合物的酵母菌及其应用。

背景技术

随着化学工业的发展，大量难降解的有毒有机物随工业废水的排放进入环境，这些物质能在自然环境中长期存在、积累和扩散，对动植物的生存及人类的健康造成不良影响。对废水和土壤中难降解有机物的控制是目前生态环境修复环节的重中之重。传统的去除污水中苯酚的方法主要有萃取法、吸附法、超声法、化学氧化法、光催化氧化法和电化学法等。其中，萃取法在污水处理领域使用较早，因此技术较为成熟。如萃取主要采用互不相溶的两种溶剂(或相溶性很小)，使溶剂充分接触(混匀)，使得溶质转移到另一种溶剂中去，经反复的萃取，可以实现大部分的溶质都转移出去，从而实现废水的净化，其方法简单易于实施，但与此同时存在着萃取剂的价格高昂，易于引入其他有机质，造成二次污染的风险。化学氧化法反应条件要求低、操作方便且反应时间短，但存在苯酚无法回收、氧化剂价格昂贵且无法重复使用的缺点，因此常用于苯酚含量低的废水处理中。光催化氧化法降解酚类物质是新兴的一种环境污染治理的技术，但是也存在能源利用效率和降解效率不成正比等问题。电化学法降解苯酚降解时间短，降解效率高，但耗电量大且对pH要求高，难在实际含酚废水处理中广泛应用，因此还需要进一步的研究。

在实际含酚污水治理中，污水的组成并不单一的只存在苯酚一种污染物，常常含有其他复杂的有机和无机物，物理和化学的方法大多只能针对一种污染物组成，对含有多种物质的实际污水常常无可奈何。生物法具有处理量大、设备简单、成本低、应用范围广和无二次污染等的优点，经微生物自身的代谢处理所得的终产物，大多为低毒和无毒的低碳产物，或为二氧化碳和水，几乎不会对环境造成危害，且应对不同组成的含酚废水有不同种类的微生物与之对应，因此生物法处理含酚废水已经逐渐成为一种广泛使用的含酚废水处理技术。

许多研究证实，微生物降解法在废水处理和土壤生物修复等领域具有广阔的开发应用前景。目前国内外很多学者已经从自然界分离出能够降解苯酚的高效微生物，添加到污染物处理系统中，能快速提供大量微生物，在高毒性苯酚污染物治理中有巨大的应用潜能。但是废水中含有的高浓度酚类化合物会对微生物的生长产生抑制作用，从而增加生物处理的难度，成为现阶段国内外含酚废水处理技术领域亟待解决的一个难题。而且游离微生物对污染环境的适应性差，而且很多含酚污水及土壤同时含有重金属、高盐碱等复杂环境，降解菌很难适应这样的极端环境，存活率较低。因此，筛选高效耐盐碱、广谱降解苯酚及其类似物的菌株,在工业废水及含酚土壤的生物修复治理上具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一株降解苯酚类化合物的酵母菌，能够耐受高盐与重金属，广谱降解苯酚及其类似物。

本发明的另一个目的是提供该酵母菌的应用，可用于降解含酚污水及土壤中的苯酚及其类似物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一株降解苯酚类化合物的酵母菌，属于热带假丝酵母菌，分类命名为Candida tropicalis SDP-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2018年7月13日，保藏编号为GDMCC 60417。

该菌株Candida tropicalis SDP-1是从海岸带污泥中富集分离得到，在PDA、ISP2、YEPD和NA培养基上生长状况均很良好，在上述四种生长状况较好的培养基上菌落呈奶白色、质地光滑、扁平微凸起，边缘完整，菌株在上述培养基中均不产生色素。在扫描电镜照片中可以观察到该菌株形态为卵圆形，可以看到菌株为出芽生殖，有假菌丝，具有典型的酵母菌属的形态特征，经ITS基因序列测序比对鉴定为热带假丝酵母，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

对菌株的生长特性研究发现菌株SDP-1能在15-45℃范围内生长，能够耐受pH范围为2.5-10.5，最大能够耐受12％的(w/v)的NaCl，菌株SDP-1对高浓度的Mn²⁺离子、Zn²⁺离子和Cr³⁺离子等重金属离子在苯酚降解过程中均有良好的抗性。菌株SDP-1在50mg/L的邻苯二酚、对硝基酚、苯甲酸钠、邻苯二甲酸、磺基水杨酸、间二硝基酚、2,4-二硝基酚、甲苯和3,5-二甲基苯酚中均能生长，降解谱广。

本发明还提供菌株Candida tropicalis SDP-1在含酚工业废水处理中的应用。

本发明提供的菌株SDP-1降解含酚工业废水的方法，包括以下步骤：

(1)将菌株Candida tropicalis SDP-1进行常规培养，离心分离，取离心物溶于无菌水中，得含有菌株SDP-1的菌悬液，菌体浓度为8.1×10⁷CFU/mL；常温下将灭菌的海藻酸钠与菌悬液混合，海藻酸钠的终浓度为2％-5％，充分搅拌后用5mL注射器将配制好的混合液滴入质量分数为2％-5％的氯化钙溶液中，放置于4℃环境中交联24小时，取出小球，用无菌水冲洗，制成固定化菌株SDP-1；

(2)以10％的接种量接种于含酚工业废水中，含酚浓度＜2100mg/L，于pH为8.0，35℃，200rpm震荡培养。

本发明还提供菌株Candida tropicalis SDP-1在含酚污染土壤修复中的应用。

本发明提供的菌株SDP-1修复含酚污染土壤的方法，包括以下步骤：

(1)将菌株Candida tropicalis SDP-1进行常规培养，离心分离，取离心物溶于无菌水中，得含有菌株SDP-1的菌悬液，菌体浓度为8.1×10⁷CFU/mL；常温下将灭菌的海藻酸钠与菌悬液混合，海藻酸钠的终浓度为2％-5％，充分搅拌后用5mL注射器将配制好的混合液滴入质量分数为2％-5％的氯化钙溶液中，放置于4℃环境中交联24小时，取出小球，用无菌水冲洗，制成固定化菌株SDP-1；

(2)取大田土壤，于121℃高温高压灭菌2小时，然后置于密闭的塑料罐内，每个塑料罐含灭菌土壤200g，分别向灭菌土壤中添加10％接种量的固定化菌株SDP-1，于pH为8.0，35℃，200rpm震荡培养。

优选的，所述菌株SDP-1的培养条件为：添加胰蛋白胨的无机盐培养基，温度25-35℃，pH为6.0-9.0，震荡转速为200rpm，其中无机盐培养基的组成为：KH₂P0₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.6g，NaCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄Cl 3.72g，微量元素1ml，ddH₂O 100ml，pH8.0。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供一株热带假丝酵母菌Candida tropicalis SDP-1，该菌株具有良好的耐盐能力和耐受重金属的能力，能够在高盐条件下降解高浓度的苯酚，同时对苯酚类化合物的降解是广谱的，它可以降解邻苯二酚、对硝基酚、苯甲酸钠、邻苯二甲酸、3,5-二硝基水杨酸、磺基水杨酸、间二硝基酚、2,4-二硝基酚、甲苯和3,5-二甲基苯酚等苯酚类化合物，降解谱广。

2、本发明通过固定化技术制备的SDP-1小球对1800mg/L浓度的苯酚52小时就能完全降解，当苯酚含量高达2100mg/L时，88小时内，固定化小球对苯酚降解率依然达到23.81％，通过固定化提高了微生物的活性和密度，缩短了降解时间，增强污染物的降解效果。

3、本发明提供的菌株SDP-1具有在实际含酚工业废水中降解苯酚的能力，为含酚工业废水处理提供经济可行的技术途径，同时该菌株具有降解高盐土壤中苯酚的能力，具有含酚土壤的生物修复治理的巨大潜力。

附图说明

图1是菌株SDP-1在PDA平板上培养7天的菌落形态照片；

图2是菌株SDP-1在PDA平板上培养7天的扫描电镜照片；

图3是基于ITS基因序列构建的菌株SDP-1系统发育树；

图4是接种量对菌株SDP-1苯酚降解效率的影响示意图；

图5是pH值对菌株SDP-1苯酚降解的影响示意图；

图6是盐浓度对菌株SDP-1苯酚降解的影响示意图；

图7是温度对菌株SDP-1苯酚降解的影响示意图；

图8是转速对菌株SDP-1苯酚降解的影响示意图；

图9是外加碳氮源对菌株SDP-1苯酚降的影响示意图；

图10是重金属离子对菌株SDP-1苯酚降解的影响示意图；

图11是固定化菌和游离菌对苯酚的降解性能的比较(F：游离菌；I：固定化菌)；

图12是高盐条件下固定化和游离菌的苯酚降解效果比较(F：游离菌；I：固定化菌)；

图13是菌株SDP-1处理对实际含酚工业废水中苯酚降解效果(F：游离菌；I：固定化菌)，其中A：高浓度；B：低浓度；

图14是菌株SDP-1处理对实际含酚工业废水中COD含量的影响示意图；

图15是菌株SDP-1处理对含酚土壤的降解修复效果(F：游离菌；I：固定化菌)，其中A：200mg/kg、B：500mg/kg、C：1000mg/kg。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1苯酚降解菌株SDP-1的分离筛选

称取5g活性污泥，加入到150ml的锥形瓶中，内含苯酚500mg/L、葡萄糖500mg/L以及3％浓度的NaCl的富集培养基50ml(KH₂P0₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.6g，NaCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄Cl 3.72g，微量元素1ml，ddH₂O 100ml，pH 8.0)，置于28℃、160rpm摇床上震荡培养。72小时后取5ml培养液加入上述培养基继续培养72小时，重复3次。取5ml菌株富集的培养液加入到150ml的锥形瓶中，内含500mg/L苯酚和300mg/L葡萄糖的富集培养基50mL，置于28℃、160rpm的摇床上震荡培养。培养72小时后取5mL上述培养液加入到内含700mg/L苯酚和200mg/L葡萄糖的富集培养基50mL中培养72小时。逐步增加苯酚的含量和削减葡萄糖含量，苯酚浓度梯度为500-1500mg/L，葡萄糖浓度梯度为300-0mg/L。采用平板涂布法进行菌株的筛选。平板选用含苯酚1200-2100mg/L的富集固体培养基平板，驯化完成的菌悬液取10mL置于灭过菌的离心管中，然后取出1mL加入另一个灭过菌的离心管中并加入9mL无菌水，充分混匀后再取出1mL，再加入一个灭过菌的离心管中，如此反复4次，得到1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4共五个梯度的菌悬液，然后各取200μL均匀涂布于平板上，每个梯度重复3次，放入28℃的培养箱让其生长1周。挑取能够在含苯酚的富集固体培养基上生长的单菌落通过四区划线的方式接种到LB固体平板上，通过反复的分离纯化得到纯化的菌株SDP-1。

实施例2苯酚降解菌株SDP-1的鉴定及其生长特性

将菌株分别接种在LB培养基、PDA培养基、NA培养基、ISP 2培养基、YEPD培养基上，放于28℃培养箱培养，每隔12小时观察菌株生长状况，并用扫描电镜进行菌体的形态学观察。酶法提取菌株的基因组DNA，用ITS序列引物对ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'PCR扩增ITS序列。PCR反应体系为：模板DNA2μL，10×buffer 5μL，MgCl₂(25mmol)3μL，dNTP(10mmol/L)1μL，引物各1μL，Taq酶(5u/μL)0.5μL，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果在NCBI网站上比对测序结果，然后用Mega 6.0软件进行序列比对及分析，最后用邻接法构建系统进化树并进行系统发育分析。

菌株在上述四种生长状况较好的培养基上菌落呈奶白色、质地光滑、扁平微凸起，边缘完整，菌株在上述培养基中均不产生色素(图1)。在电镜照片中可以观察到该菌株形态为卵圆形，可以看到菌株为出芽生殖，有假菌丝，具有典型的酵母菌属的形态特征(图2)。菌株SDP-1能够在15-45℃范围内生长，最适的生长温度范围为25-35℃，能够耐受的pH范围为2.5-10.5，最适pH范围为6.0-9.0，最大能够耐受12％的(w/v)的NaCl。

对菌株SDP-1的ITS序列进行扩增，其测序结果在NCBI的BLAST数据库进行序列的同源性比对，比对结果显示菌株SDP-1的ITS序列和热带假丝酵母同源性高达99％，同时在NCBI的BLAST数据库中获取同源性相近的菌株ITS序列信息，用MEGA 6.0软件通过领接法构建系统发育树，构建的系统发育树如图3所示，菌株SDP-1与热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)聚在一个分支上，亲缘关系最近，因此可以判断，菌株SDP-1属于热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)的一个菌株。命名为Candida tropicalis SDP-1。其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例3苯酚降解菌株SDP-1的降解特性

(1)接种量对苯酚降解的影响：在含酚浓度为1200mg/L的上述无机盐培养基中分别加入其体积百分比为1％、4％、8％、10％、12％、16％的菌株SDP-1悬浊液(OD₆₀₀为1.5)，摇床转速为160rpm，无机盐培养基的pH值全部调为8.0左右，温度为35℃，通过4-氨基安替比林法来测定苯酚的浓度。

(2)pH值对苯酚降解的影响：经过上述条件选取最佳接种量后，含酚1200mg/L的无机盐培养基用无菌的2mol/L的氢氧化钠溶液和1mol/L的稀盐酸溶液进行pH的调节，依次将样品的pH值调为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，摇床转速为160rpm，温度为35℃。

(3)氯化钠含量对苯酚降解的影响：经上述条件选取最佳接种量及pH值条件后，再在含酚无机盐培养基中分别加入质量百分比为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％的氯化钠，摇床转速为160rpm，温度为35℃。

(4)温度对苯酚降解的影响：通过上述实验选取最优氯化钠浓度、pH值及接种量条件，将含酚1200mg/L的无机盐培养基放在不同温度的震荡培养箱中震荡培养，温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，摇床转速为160rpm。

(5)转速对苯酚降解的影响：通过上述实验选取最优氯化钠浓度、pH值、接种量及温度条件，将含酚无机盐培养基置于转速不同的震荡培养箱培养，摇床转速分别为120rpm、160rpm、200rpm和240rpm。

(6)碳、氮源对苯酚降解的影响：经上述实验获得的最佳降解条件下，分别以0.5％的质量百分比向培养基中添加葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、酵母浸出粉、牛肉膏、胰蛋白胨、麦芽浸出粉、硝酸铵、酪蛋白水解物、尿素几种碳源或氮源，以不加碳源或氮源的样品作为对照，每隔4小时取样检测样品中的苯酚含量，直至样品中的苯酚降解完全。

(7)重金属离子对苯酚降解的影响：经以上实验获得的最佳降解条件下，向培养基中分别加入CrCl₃、MnCl₂、CuSO₄、PbSO₄、CdCl₂、ZnCl₂、HgCl₂等重金属盐，使得溶液中重金属盐离子浓度为5mmol/L。以不加重金属离子的样品作为对照，每组样品重复三次，每隔12小时取样检测样品中苯酚的含量，共检测36小时。

通过接种量、pH值、氯化钠含量、温度、转速等影响苯酚降解效率环境因子的单因素实验优化，对培养基外加碳氮源的实验分析，得到了菌株SDP-1的最佳降解条件。菌株SDP-1最适的苯酚降解条件为：最适接菌量为10％左右(OD₆₀₀＝1.8)(图4)、最适pH为8.0(图5)、无机盐培养基含氯化钠量为0％(图6)、最适温度为35℃(图7)，菌株培养震荡的转速为200rpm(图8)。向含酚无机盐培养基中添加葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等易利用的碳源会显著降低苯酚降解的速率，对照组需要32小时完全降解1200mg/L的苯酚，添加了葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的培养基降解所需时间分别延长了12小时、12小时和20小时。向培养基中添加胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸出粉、酪蛋白水解物会显著提升降解速率，只需要24小时就能完全降解1200mg/L的苯酚。胰蛋白胨的添加能显著提升了苯酚降解的效率，添加了胰蛋白胨的实验组较对照组，苯酚降解时间缩短了8个小时(图9)。在最佳的苯酚降解条件下，1200mg/L的苯酚在24小时内能完全被降解。当苯酚浓度提高时，完全降解所需要时间延长。当苯酚的浓度高达2100mg/L时，菌株SDP-1几乎无法再降解环境中的苯酚。这是由于苯酚浓度超过一定浓度后，就会对菌株SDP-1产生毒害作用，从而抑制菌株的生长代谢，继而使菌株SDP-1难以再降解环境中的苯酚。此外，菌株SDP-1对一些重金属离子有良好的抗性，在环境中含有5mmol/L的二价Mn离子、二价Zn离子和三价Cr离子时，对菌株SDP-1的苯酚降解效果影响较小(图10)。

实施例4苯酚降解菌株SDP-1对其他苯酚类化合物的降解

在无机盐培养基中分别添加终浓度为50mg/L的邻苯二酚、对硝基酚、苯甲酸钠、邻苯二甲酸、3,5-二硝基水杨酸、磺基水杨酸、间二硝基酚、2,4-二硝基酚、甲苯和3,5-二甲基苯酚作为唯一碳源，以实施例2获得的最佳接种量接种到含不同碳源的各无机盐培养基中，以不加碳源的无机盐培养基作为对照，放入振荡培养箱中振荡培养，每组样品重复三次，每隔12小时取样测OD₆₀₀值，与对照相比OD₆₀₀值如有较大提升证明能够利用该底物。

表1菌株SDP-1的降解底物谱

结果表明(表1)，菌株SDP-1除了对苯酚具有良好的降解效果，对其他苯环类化合物也能利用，菌株SDP-1对邻苯二酚、对硝基酚、苯甲酸钠、邻苯二甲酸、磺基水杨酸、间二硝基酚、2,4-二硝基酚、甲苯和3,5-二甲基苯酚均具有降解性。

实施例5苯酚降解菌株SDP-1的固定化及其对苯酚的降解性能

将灭菌的海藻酸钠按一定比例与菌悬液(菌体浓度为8.1×10⁷CFU/mL)混合，充分搅拌后用5mL注射器将混合液滴入氯化钙溶液中，放置于4℃环境中交联一段时间后使用。采用单因素变量分析确定最佳的海藻酸钠浓度、氯化钙浓度和交联时间。选用3％、5％两种盐浓度，胰蛋白胨-无机盐培养基中苯酚含量为1200mg/L，培养基pH值调为8.0左右，设置摇床转速200rpm，35℃暗培养，选用不接菌的固定化小球作为对照，每组重复三次，检测苯酚降解效果，每4小时取样检测苯酚含量。

从单因素实验获得固定菌株SDP-1的较佳条件为浓度2％-5％的海藻酸钠、浓度2％-5％的氯化钙、交联18-30小时，最佳条件为浓度3.0％的海藻酸钠、浓度3.0％的氯化钙和交联24小时，从而制备成固定化小球。以10％的接种量接种菌悬液的浓度为8.1×10⁷CFU/mL的菌株SDP-1和相同数量的固定化菌株于苯酚含量为300mg/L、500mg/L、900mg/L、1200mg/L、1500mg/L、1800mg/L和2100mg/L的胰蛋白胨-无机盐培养基中，比较固定化菌和游离菌的降解苯酚效率，发现随着苯酚浓度的提高，苯酚对菌株SDP-1的毒害作用也随之加大，而海藻酸钠小球对菌株SDP-1有良好的保护作用，苯酚完全降解所需要的时间也随之缩短，特别是在苯酚含量为1200mg/L至1800mg/L时，固定化小球缩短了降解时间，1800mg/L浓度的苯酚固定化小球需要52小时就能完全降解，当苯酚含量高达2100mg/L时，菌株几乎不能降解苯酚，但在固定化作用下，88小时内，苯酚降解率依然有23.81％，远高于游离菌的8.05％(图11)。

用固定化菌和游离菌对苯酚浓度为1200mg/L，含盐量为3％和5％的含酚培养基进行苯酚降解实验，以不接菌的固定化小球作为对照。如图11所示，在3％盐浓度和5％盐浓度条件下，固定化菌株均比游离菌株降解苯酚效率高。随着盐浓度的增高，苯酚完全降解时间随之延后，固定化对菌株SDP-1的保护作用也越发明显。3％盐浓度下，固定化菌株比游离菌完全降解1200mg/L浓度的苯酚时间缩短了4小时，只需要28小时；5％盐浓度下，固定化菌株比游离菌完全降解时间缩短12小时，只需要40小时就能完全降解(图12)。由此可以看出在高盐环境中，菌株SDP-1固定化能更好的降解含酚环境中的苯酚。

实施例6苯酚降解菌株SDP-1在实际含酚工业废水处理中的应用

采得两份焦化厂实际废水样品，经过检测高浓度含酚废水样品中苯酚含量为872mg/L，pH值为9.04；低浓度含酚废水样品中苯酚含量为383mg/L，pH为9.84。将高、低浓度含酚废水原液和高、低浓度废水经自来水稀释1倍后进行实际含酚废水降解研究，并通过苯酚降解完全后废水COD的检测来验证该菌株实际对含酚废水的处理效果。采用游离菌和固定化菌两种方式进行对比，以此探究固定化菌在实际含酚废水中的降解效果。

未经稀释的高浓度含酚废水中的苯酚无法被完全降解，接种游离菌的高浓度含酚废水中的苯酚含量几乎没有降低，接种固定化菌的高浓度含酚废水中的苯酚在降低了9.4％后也趋于平稳，无法继续降解。在低浓度含酚废水中，接种游离菌的废水需要28小时能完全降解383mg/L的苯酚，接种固定化菌的废水只需要20小时就能完全降解383mg/L的苯酚，固定化菌株能更快的降解含酚实际废水中的苯酚。在加入同等体积自来水的实际含酚废水中，固定化菌的降解效果也高于游离菌。如图13所示，经稀释一倍的高浓度含酚废水和低浓度含酚废水均能够被菌株SDP-1完全降解。在稀释过的高浓度含酚废水中，接种游离菌的废水需36小时完全降解苯酚，接种固定化菌的含酚废水需要28小时就能完全降解环境中的苯酚，固定化菌株较游离菌时间缩短了8小时；在稀释过的低浓度含酚废水中，接种游离菌的废水需16小时完全降解废水中的苯酚，接种固定化菌的含酚废水需要12小时就能完全降解环境中的苯酚，固定化菌株较游离菌时间缩短了4小时。

未经稀释的高浓度含酚废水初始COD值高达4705mg/L，经游离菌处理后，COD值依然高达4310.17mg/L；经固定化菌处理后，COD值为4057.5mg/L，COD值下降不是很明显。经自来水稀释一倍后的高浓度含酚废水，初始COD值为2492.83mg/L，经游离菌处理后，COD值降低到1378.67mg/L；经固定化菌处理后，COD值下降到1236.83mg/L。较初始COD值，经处理后的高浓度稀释废水COD值下降明显，经固定化菌处理的COD值下降值比游离菌更明显。在未经稀释的低浓度含酚废水中，其初始COD值为3132.17mg/L，经游离菌处理后，COD值下降到2118.5mg/L，降低了32.4％；经固定化菌处理后，COD值为1951.03mg/L，COD值下降了37.71％。经自来水稀释一倍后的低浓度含酚废水，初始COD值为1642.83mg/L，经游离菌处理后，COD值降低了29.3％；经固定化菌处理后，COD值下降到995.5mg/L。经固定化菌处理后的含酚废水COD值下降了39.4％，比游离菌更明显(图14)。说明菌株SDP-1及其固定化技术制备的小球具有处理实际含酚工业废水的良好潜力，具有较好的应用价值。

实施例7苯酚降解菌株SDP-1在含酚污染土壤中的降解修复应用

实验采用的土壤为实际田间种植土，经过2小时121℃高温高压灭菌后进行后续实验。在灭菌土中分别添加200mg/kg、500mg/kg和1000mg/kg三种不同终浓度的苯酚，得到含酚土壤，土壤含盐量也设置了不加盐和3％NaCl浓度两种情况。实验所采用的器材为密闭的塑料罐，每个塑料罐含灭菌含酚土壤200g，分别向含酚土壤中添加10％接种量的游离菌和经固定化的菌株SDP-1，保证土壤含水量为40％左右，每2天测土壤中苯酚含量，以添加苯酚而未接菌的灭菌土壤为对照，每组样品重复三次。

如图15A可以看到在含苯酚浓度为200mg/kg的含酚土壤中，土壤不含盐的情况下，游离菌和固定化菌都需要6天才能完全降解200mg/kg含酚土壤中的苯酚，降解效率相差不大；在土壤含盐量为3％时，固定化菌需要6天时间完全降解，而游离菌需要8天时间，在有盐胁迫条件下固定化菌比游离菌降解效果提升明显。如图15B可以看到在含苯酚浓度为500mg/kg的含酚土壤中，土壤不含盐的情况下，游离菌需要12天才能完全降解土壤中的苯酚，固定化菌则需要10天就能完全降解；在土壤含盐量为3％时，固定化菌需要12天时间完全降解苯酚，游离菌需要14天时间，在无盐胁迫和有盐胁迫条件下固定化菌降解效果均优于游离菌。如图15C可以看到在1000mg/kg的含酚土壤中，不加盐的情况下，固定化菌需要18天能就能完全降解土壤中的苯酚，而游离菌需要更长时间，需要26天才能降解完全；在土壤含盐量为3％时，固定化菌比游离菌缩短了8天时间完全降解土壤中的苯酚，随着土壤含酚量的提升，在无盐胁迫和有盐胁迫条件下固定化菌降解效果均优于游离菌。可见菌株SDP-1及其固定化技术制备的小球具有在高盐含酚土壤中降解苯酚的实际土壤修复应用价值。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一株降解苯酚类化合物的酵母菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 500

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)

<400> 1

gggttatgat tgcttattgc accacatgtg ttttttattg aacaaatttc tttggtggcg 60

ggagcaatcc taccgccaga ggttataact aaaccaaact ttttatttac agtcaaactt 120

gatttattat tacaatagtc aaaactttca acaacggatc tcttggttct cgcatcgatg 180

aagaacgcag cgaaatgcga tacgtaatat gaattgcaga tattcgtgaa tcatcgaatc 240

tttgaacgca cattgcgccc tttggtattc caaagggcat gcctgtttga gcgtcatttc 300

tccctcaaac ccccgggttt ggtgttgagc aatacgctag gtttgtttga aagaatttaa 360

cgtggaaact tattttaagc gacttaggtt tatccaaaaa cgcttatttt gctagtggcc 420

accacaattt atttcataac tttgacctca aatcaggtag gactacccgc tgaacttaag 480

catatcaata agcggaaggg 500

Claims (7)

1.一株降解苯酚类化合物的酵母菌，其特征在于，属于热带假丝酵母菌，分类命名为Candida tropicalis SDP-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2018年7月13日，保藏编号为GDMCC 60417。

2.权利要求1所述的菌株Candida tropicalis SDP-1在含酚工业废水处理中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，降解含酚工业废水的步骤如下：

(1)将菌株Candida tropicalis SDP-1进行常规培养，离心分离，取离心物溶于无菌水中，得含有菌株SDP-1的菌悬液，菌体浓度为8.1×10⁷CFU/mL；常温下将灭菌的海藻酸钠与菌悬液混合，海藻酸钠的终浓度为2％-5％，充分搅拌后用5mL注射器将配制好的混合液滴入质量分数为2％-5％的氯化钙溶液中，放置于4℃环境中交联24小时，取出小球，用无菌水冲洗，制成固定化菌株SDP-1；

(2)以10％的接种量接种于含酚工业废水中，含酚浓度＜2100mg/L，于pH为8.0，35℃，200rpm震荡培养。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌株SDP-1的培养条件为：添加胰蛋白胨的无机盐培养基，温度25-35℃，pH为6.0-9.0，震荡转速为200rpm，其中无机盐培养基的组成为：KH₂P0₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.6g，NaCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄Cl 3.72g，微量元素1ml，ddH₂O 100ml，pH 8.0。

5.权利要求1所述的菌株Candida tropicalis SDP-1在含酚污染土壤修复中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，修复含酚污染土壤的步骤如下：

(1)将菌株Candida tropicalis SDP-1进行常规培养，离心分离，取离心物溶于无菌水中，得含有菌株SDP-1的菌悬液，菌体浓度为8.1×10⁷CFU/mL；常温下将灭菌的海藻酸钠与菌悬液混合，海藻酸钠的终浓度为2％-5％，充分搅拌后用5mL注射器将配制好的混合液滴入质量分数为2％-5％的氯化钙溶液中，放置于4℃环境中交联24小时，取出小球，用无菌水冲洗，制成固定化菌株SDP-1；

(2)取大田土壤，于121℃高温高压灭菌2小时，然后置于密闭的塑料罐内，每个塑料罐含灭菌土壤200g，分别向灭菌土壤中添加10％接种量的固定化菌株SDP-1，于pH为8.0，35℃，200rpm震荡培养。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述菌株SDP-1的培养条件为：添加胰蛋白胨的无机盐培养基，温度25-35℃，pH为6.0-9.0，震荡转速为200rpm，其中无机盐培养基的组成为：KH₂P0₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.6g，NaCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄Cl 3.72g，微量元素1ml，ddH₂O 100ml，pH 8.0。