CN101255400B - 一种增强土著根瘤菌固氮能力的生物源激活剂 - Google Patents
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Abstract
一种增强土著根瘤菌固氮能力的生物源激活剂，其采用以下方法制成：(1)哈茨木霉菌株T216母种斜面培养；(2)发酵罐发酵；(3)发酵完成后，发酵液用氢氧化钠溶液调pH为7-8，闷罐过夜，灭菌纱布真空过滤，得滤液，密封包装。在豆科作物播种前，将本发明之生物源激活剂按20-30％(体积比)添加入浸种液浸泡种子4-6小时，或在豆科作物幼苗移栽时，用清水稀释4-5倍的生物源激活剂浸根半小时，作物生长期间，能诱导土著根瘤菌结瘤固氮能力显著增强。
Description
技术领域
本发明涉及一种根瘤菌固氮能力生物源激活剂，尤其是涉及一种利用木霉菌及其代谢产物增强土著根瘤菌固氮能力的生物源激活剂。
背景技术
在根瘤菌-豆科作物这一共生固氮体系中，共生固氮作用是一个由双方有关基因共同参与、协同作用并自主调节的复杂过程，影响和决定根瘤菌共生固氮效率的因素包括土壤生态环境、寄主植物和根瘤菌自身遗传特性等3个方面。就根瘤菌而言，土著根瘤菌的数量、根瘤菌耐酸性(前人用荧光抗体法研究发现，随着土壤酸化程度的不断增加，根瘤菌结瘤受抑制的程度加大，但不同根瘤菌菌株耐酸性有所不同)、有效性(固氮效能)为最主要影响因子。前人研究表明，经过有效性选择的好的根瘤菌品系，固氮量可以达到每年每公顷200-300公斤氮素，但无效菌株(如大多数野生的土著菌株)，仅仅只能提供30公斤/公顷的氮素，甚至更少，固氮功效相差十倍以上。因此人们尝试辅助于人工接种高效根瘤菌，以达到获得高共生固氮效能的目的。这也是目前国内外将如何提高该体系共生固氮效率的研究重点大都放在根瘤菌的遗传基因的改造上的重要原因。虽然近年来已通过自然选育或基因工程技术获得了不少具有高效固氮能力的菌株，并在人工控制的条件下证明它们能够使豆科作物显著增产。但由于人工接种的菌株在成为结瘤占优势的菌株之前，在土壤中需要一个长时间的积累过程(有试验证明为4年)。而且，根瘤菌在土壤中的繁殖速度，也决定了其竞争结瘤的效率，通常人工接种的根瘤菌在土壤中的繁殖速度比培养基上慢很多。前人实验表明，根瘤菌主要从植物根毛表皮细胞侵入，而植物新生根毛在4-5h即丧失受感态，这对于在土壤中代时达3-5d的慢生型根瘤菌的侵染显然是不利的，由此也造成了土著根瘤菌在竞争结瘤方面往往较人工接种的菌株占有优势，这是根瘤菌在土壤中的“位置效应”。由于人工接种高效固氮菌株与土著根瘤菌的竞争结瘤问题一直未得到很好解决，阻碍了这些高效固氮菌株田间应用效果的发挥。
还有研究指出，土壤中普遍存在大量的土著根瘤菌，但土著根瘤菌绝大部分存在着侵染力强，固氮活性低的弱点，在竞争结瘤上，却又常占优势。因此，如何将具有数量优势的土著根瘤菌结瘤力强、固氮力低这一生物学特性改变为结瘤力与固氮力均强的特性，成为人们追求的共生固氮效果最大化的重要目标和研发方向。
发明内容
本发明针对豆科作物栽培中，人工接种的根瘤菌剂侵染力、结瘤率较低，而土著根瘤菌结瘤率虽强但固氮能力低的缺陷，提供一种增强土著根瘤菌固氮能力的生物源激活剂。
本发明之生物源激活剂采用以下所述方法制成：
(1)将哈茨木霉菌株(Trichoderma harzianum)T216(已于2007年9月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC №：M207141)接种到装有150mL液体培养基的三角瓶中，于27±1℃下转速为150转/分，培养60小时，作为发酵种子用；
液体培养基组分为：可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO·7H2O 0.5g，CaCO3 0.25g，(NH4)2SO4 2g，水1000mL，PH自然，经115℃灭菌15-20分钟；
(2)发酵罐发酵：将第(1)步所得木霉菌种子培养液按10％(V/V)的接种量接入发酵罐进行发酵培养，发酵控制参数为：
温度控制，分为两个阶段，发酵第一阶段，即菌体培养阶段0-72小时，26-28℃；发酵第二阶段，即代谢产物生产阶段72-100小时，23-25℃；
通气量(V/V)：0-20小时：1∶0.6；20-40小时：1∶0.8；40-80小时：1∶1.2，80小时以后：1∶0.6；搅拌速度：250-300rpm；
初始pH值控制为6.5-6.8，前24小时维持在初始值；
发酵罐培养基组分：1.5-2.0％麦麸汁液，0.5-1.0％葡萄糖，2.0-3.0％玉米粉，1.0-2.0％酵母膏，0.1-0.5％CaCO3，0.01-0.03％MgSO4，0.5-0.8％磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，pH值为6.5-6.8，余量为水；通入蒸气达121℃在位灭菌30分钟；所述百分比均为重量百分比；
(3)发酵完成后，发酵液用氢氧化钠溶液调pH＝7-8(优选7.5)闷罐过夜，灭菌纱布真空过滤，得滤液，密封包装，即成。
本发明的有益效果：在豆科作物播种前，将本发明之生物源激活剂按20-30％(体积比)添加入浸种液浸泡种子4-6小时，或在豆科作物幼苗移栽时，用清水稀释4-5倍的生物源激活剂浸根半小时，作物生长期间，能诱导土著根瘤菌结瘤固氮能力显著增强。
例如，试验表明，本发明之生物源激活剂可以显著提高豇豆、花生等供试作物的根瘤数量、根瘤鲜干重和固氮活性以及提高作物产量、改善产品品质等。经本发明之生物源激活剂处理后的土著根瘤菌所结根瘤中的豆血红蛋白的含量达0.40μmol/plant，提高量高达57.14％；含铁量提高了1.16倍；处理后的土著根瘤菌所结根瘤固氮酶活性比对照固氮酶活性提高了61.01％。而且可促进土著根瘤菌对豆科作物根部的亲和力和侵染力，促使宿主中心组织加快分化形成根瘤组织，使宿主比对照提早3天结瘤，根瘤提前5天具有固氮活性；
附图说明
图1为本发明混合接种试验根瘤类菌体DNA的AFLP指纹图谱
图中：0：Marker，1-3：单独接种出发土著根瘤菌所结根瘤中类菌体DNA图谱，4-5：单独接种经T216激活剂处理的土著根瘤菌所结根瘤中类菌体DNA图谱，6-48：二者混合接种根瘤菌所结根瘤中类菌体DNA图谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1制备实施例
(1)哈茨木霉菌株(Trichoderma harzianum)T216母种斜面培养：采用试管PDA斜面培养基培养；
(2)木霉菌种子摇瓶培养，培养基配方：可溶性淀粉30g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 0.25g，(NH4)2SO4 2g，水1000mL，pH6.9，分装入500mL三角瓶中，装液量为200mL，经115℃灭菌20分钟，在无菌条件下将母种转入摇瓶，于27±1℃下转速为150转/分，培养60小时，得到种子，备用；发酵罐发酵，按10％(V/V)的接种量接入发酵罐，进行控制发酵，发酵控制参数为：温度控制，分为两个阶段，发酵第一阶段菌体培养阶段0-72小时，26-28℃，发酵第二阶段代谢产物生产72-100小时，23-25℃；通气量(V/V)：0-20小时：1∶0.6；20-40小时：1∶0.8；40-80小时：1∶1.2，80小时以后：1∶0.6；搅拌速度：250-300rpm；初始pH值控制为6.5-6.8，前24小时维持在初始值；(3)发酵醪用氢氧化钠溶液调pH为7.5，闷罐过夜，灭菌纱布真空过滤，得滤液，密封包装，即成。
实施例2应用实施例①
应用实施例产品(以下称“T216激活剂”)进行田间试验(该试验是在长沙市马坡岭湖南省蔬菜研究所实验农场进行)，将T216激活剂按20％(V/V)添加到浸种液浸泡豇豆种子4小时，然后采用常规方法播种，管理。试验结果如表1所示。
表1T216激活剂不同处理菌株在豇豆上显瘤能力
| 菌株处理 | 根瘤原基(个/株) | 接种-现瘤(d) | 现瘤-固氮(d) |
| T216激活剂清水(对照) | 101.668.7 | 912 | 1015 |
(注：表中数据为有50％豇豆根系出现根瘤或固氮能力的天数，不为平均数)
由表1可以看出，经T216激活剂处理后，根瘤菌对豇豆根部的亲和力和侵染力都强于对照清水处理的，使寄主较多地形成结瘤原基(比对照增加了47.89％)，并促进寄主提前显瘤，较对照提早5d具有固氮活性。
表2T216激活剂不同处理根瘤菌对豇豆结瘤的影响
| 菌株处理 | 根瘤数(个/株) | 根瘤直径(mm) | 根瘤干重(g/株) |
| T216激活剂清水(对照) | 105.173.4 | 5.543.72 | 0.2710.185 |
(注：表中数据均为20株的平均值)
表2所示试验结果表明，T216激活剂处理土著根瘤菌后，可促进根瘤菌对寄主豇豆的识别、侵染，使寄主较多、较大地形成根瘤，并提前进入固氮期；经处理豆科作物所结根瘤数为对照的1.54倍，根瘤干重是对照的1.44倍。
表3对豇豆根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性影响
| 菌株处理 | 豆血红蛋白含量(μmol/plant) | 固氮酶活性(nmol/g·h) | 根瘤含铁量(mg/kg) |
| T216激活剂清水(对照) | 0.370.24 | 19921205 | 402.59346.28 |
由表3可知，经T216处理的土著根瘤菌所结根瘤中豆血红蛋白含量提高1.54倍，含铁量提高1.16倍，固氮酶活性提高1.65倍。
表4：对豇豆田间产量的影响
| 处理 | 前期产量 | 后期产量 |
| 06-04 06-10 06-14 06-18 06-27 07-04 总计 增产(％) | 07-12 07-15 07-18 总计 增产(％) | |
| T216处理赤霉素处理CK处理 | 6.60 17.97 48.15 36.75 50.07 22.50 182.04 12.255.10 25.35 52.05 32.25 43.83 14.30 172.88 6.604.50 26.67 43.50 36.45 38.76 12.30 162.17 - | 34.71 15.77 13.65 64.13 16.8132.76 14.04 14.31 61.11 11.3128.80 14.55 11.55 54.90 - |
由表4可知，经T216激活剂处理的土著根瘤菌接种，其产量前期增产12.5％，后期增产16.81％。
实施例3应用实施例②
将T216激活剂与水按1∶5(体积比)的比例稀释，对花生种子浸种6小时。供试花生品种为珍珠豆型品种花120。试验地为已经多年水改旱、上年春夏种植花生后冬闲的水稻田。花生平垄分厢(宽度200cm)栽培，5月30日播种，行株距30×20cm，每兜播2粒种子，采用本土盖籽。在播种前5d，每公顷一次性基施尿素和氯化钾各75kg，过磷酸钙525kg。小区面积20m，3次重复，随机区组排列。田间调查和室内考种按花生试验调查的标准进行。成熟收获时调查成苗情况、根瘤数并考种。实验结果如下表5、表6所示。
收获时经T216激活剂浸种处理的比对照增产24.3％，每株根瘤数增加11.4％，明显刺激了土著根瘤菌结瘤能力，使花生果实颗粒大小均匀，饱果数提高8％左右，花生品质得到改善。豆血红蛋白和固氮酶活性显著提高。
表5：生物源T216激活剂对花生经济性状与结瘤能力的影响
| 处理 | 株高(cm) | 分枝数(枝) | 总果数(个) | 饱果数(个) | 饱果率(％) | 根瘤数(个) | 产量(kg/ha) | 比CK±(％) |
| 激活剂赤霉素清水对照 | 33.035.234.0 | 6.96.66.2 | 16.313.7514.05 | 9.459.458.75 | 59.9868.7362.28 | 332286294 | 3462.82945.72785.8 | 24.35.75- |
表6：对花生根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性影响
| 处理 | 豆血红蛋白含量(μmol/plant) | 固氮酶活性(nmol/g·h) | 根瘤含铁量(mg/kg) |
| T216激活剂赤霉素清水处理 | 0.860.590.62 | 163813541379 | 463.74356.53378.24 |
实施例4生物源T216激活剂对土著根瘤菌生物学特性的影响
(1)土著根瘤菌获得
采集田间自然条件下生长的初花期豇豆植株，摘取其上的新鲜、饱满、个大的根瘤，用自来水冲洗干净后，放入75％酒精浸泡1min，灭菌水冲洗3次后，再放于0.1％氯化汞溶液中表面消毒5min，灭菌水冲洗数次后，将根瘤放到灭过菌的并装有少量灭菌生理盐水(1升水中加8.5克氯化钠)的研钵中，用玻璃棒压碎根瘤；用接种环沾取根瘤液汁在含有刚果红的Y.E.M.培养基的平板上划线，把培养皿放在28℃下培养，然后沿着划线观察是否出现典型的根瘤菌菌落，并对菌落进行纯化培养、鉴定。
所用Y.E.M.培养基的成分为磷酸氢二钾0.5克；硫酸镁0.2克；氯化钠0.1克；甘露醇10克；酵母浸出液0.3克；蒸馏水900毫升。固体培养基加入17克琼脂。
(2)将T216激活剂按10％比例加入Y.E.M.培养基，设加入同量无菌水作对照，观察出发菌株与经处理的菌株的生物学差异。实验确定，经T216激活剂处理的土著根瘤细菌一是能加快根瘤菌的分裂，增强根瘤菌的生长、繁殖速率，二是其耐酸性得到了显著增强。三是其抗逆性得到增强，与出发菌株相比，经T216激活剂处理的根瘤菌大多表现出对抗生素、各类染料、盐碱及高温较强的耐受性。四是其代谢能力发生一些变化，在对碳源利用方面，各菌株表现较为一致。对碳源能利用的范围都较广泛，基本上没有选择性，不仅能利用己糖、五碳糖、三碳糖，而且能利用乳糖等双糖。对氮源的利用方面表现也较为一致，均能利用α-鸟氨酸、半胱氨酸、谷氨酸；几乎均不能利用丙氨酸和甘氨酸，而对赖氨酸利用能力较差；对天冬氨酸的利用则表现出差异性。
将经T216激活剂处理的土著根瘤菌与加入同量无菌水到液体培养基的土著根瘤菌，保温摇瓶培养48小时，混合接种到灭菌土的盆栽豇豆，待其长出根瘤，随机挑取根瘤，提取其DNA，通过AFLP分子指纹技术测定两种根瘤菌竞争结瘤的能力。结果表明(参见附图1)，与T216激活剂处理的根瘤菌AFLP谱带相同的根瘤数26个，占总瘤数的61.67％，而与出发土著根瘤菌AFLP谱带相同的根瘤数则为16个，占总瘤数的38.33％。经T216激活剂处理的根瘤菌竞争结瘤能力为对照的1.53倍，且经T216激活剂处理后的土著根瘤菌所结根瘤也多为有效根瘤。
Claims (1)
1.一种增强土著根瘤菌固氮能力的生物源激活剂，其特征在于，采用以下方法制成：
(1)将保藏编号为CCTCC №：M207141的哈茨木霉菌株(Trichodermaharzianum)T216母种斜面培养：采用试管PDA斜面培养基培养；
(2)木霉菌种子摇瓶培养，培养基配方：可溶性淀粉30g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 0.25g，(NH4)2SO4 2g，水1000mL，pH6.9，分装入500mL三角瓶中，装液量为200mL，经115℃灭菌20分钟，在无菌条件下将母种转入摇瓶，于27±1℃下转速为150转/分，培养60小时，得到种子，备用；发酵罐发酵，按10％(V/V)的接种量接入发酵罐，进行控制发酵，发酵控制参数为：温度控制，分为两个阶段，发酵第一阶段菌体培养阶段0-72小时，26-28℃，发酵第二阶段代谢产物生产72-100小时，23-25℃；通气量(V/V)：0-20小时：1∶0.6；20-40小时：1∶0.8；40-80小时：1∶1.2，80小时以后：1∶0.6；搅拌速度：250-300rpm；初始pH值控制为6.5-6.8，前24小时维持在初始值；
(3)发酵醪用氢氧化钠溶液调pH为7.5，闷罐过夜，灭菌纱布真空过滤，得滤液，密封包装，即成。
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