CN106434845B - 一种百合组培苗枯萎病抗性的快速鉴定方法 - Google Patents

一种百合组培苗枯萎病抗性的快速鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种百合组培苗枯萎病抗性的快速鉴定方法。该方法包括接种孢子悬浮液的准备、供试百合组培苗的准备、接种、病情调查与分级。本发明直接采用组培苗水培接种鉴定，其水培液含大量元素、微量元素、铁盐、有机物，在水培液中加入尖孢镰刀菌百合专化型孢子悬浮液，与百合植株喷雾接种相比，避免了环境温度和湿度对鉴定结果的影响，提高鉴定结果的准确性，接种时易于操作，组培苗在室内进行抗病性筛选条件较易控制，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力。

Description

一种百合组培苗枯萎病抗性的快速鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及百合组培苗枯萎病抗性快速鉴定方法。
背景技术
百合(Lilium spp.)被誉为“球根花卉之王”，是世界五大鲜切花之一。据统计，2009年全球种球生产面积为35,749公顷,其中荷兰种植面积为23,561公顷，占66％，英国种植面积为5,400公顷，占15％，中国种植面积为4,680公顷，占13％。全球百合种球的贸易额已达20多亿美元，年贸易量达25亿粒以上。据农业部的统计数据，2013年百合鲜切花销售额达42.95亿元，位居鲜切花销售额的首位，具有重要的经济价值。
尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lilii)是引起百合枯萎病的土传真菌，全世界百合种植区域均有被其感染和危害。云南作为我国重要的百合优质鲜切花产区，枯萎病时有爆发，轻者导致产量损失20-30％，严重时可造成百合绝收，且污染种植土壤，极大影响云南百合花卉产业的可持续发展。镰刀菌是一种在许多作物上引起严重病害的土传真菌，很难进行有效控制。因此选育和利用抗病品种成为主要的防治措施，对百合品种资源、杂交亲本及杂交后代进行抗病性快速鉴定，可加速百合抗病品种选育的进程。
近年来，百合枯萎病的相关研究开展的较多，针对抗性鉴定通常采用鳞片接种法、百合植株喷雾接种法，鳞片接种法主要措施是：将百合鳞片包埋(接种)于混合有尖孢镰刀菌百合专化型的土壤中培育，调查鳞片的发病情况，从而鉴定出百合种质资源材料或品种的抗性。该方法存在接种土壤准备时间长，且无法确定接种的浓度,调查时间长需要到60d之后才能调查等不足。百合植株喷雾接种的主要措施是配制一定浓度的孢子悬浮液，然后接种于百合植株上并调查植株的发病情况，从而鉴定出百合种质资源材料或品质的抗性，该方法存在所需的百合植株较多，温湿度不好控制，需配备一定的植物生长箱或接种温室等不足。因此，目前还缺乏快速抗性鉴定的较好方法。
发明内容
为解决上述缺乏百合枯萎病快速鉴定的技术问题,本发明提供一种百合组培苗枯萎病抗性的快速鉴定方法。
本发明提供一种百合组培苗枯萎病抗性的快速鉴定方法：包括以下步骤：
(1)接种孢子悬浮液的准备：将尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysproumf.sp.lilii)菌种用PSA培养基培养7～10d后，取尖孢镰刀菌百合专化型菌种用无菌水配成尖孢镰刀菌百合专化型菌种孢子为1.0×106个/ml的接种孢子悬浮液；
(2)供试百合组培苗的准备：将供试的百合组培苗切根后置于盛有百合组培苗水培液的水培瓶中待接种，每个水培瓶装入20ml百合组培苗水培液，每个水培瓶放置10株切根的百合组培苗；所述百合组培苗水培液由大量元素母液10ml、微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机母液10ml混合后，再加去离子水稀释至1L然后灭菌而成；
所述大量元素母液的配制：称取NH4NO3165g、KNO3190g、CaCl2·2H2O 44g、MgSO4·7H2O 37g、KH2PO417g，加去离子水定容至1L，备用；
所述微量元素母液的配制：称取H3BO30.62g、MnSO4·H2O 2.23g、ZnSO4·7H2O0.86g、KI 0.83g、Na2MoO4·2H2O 0.025g、CuSO4·5H2O 0.0025g、CoCl2·6H2O 0.0025g，加去离子水定容至1L，备用；
所述铁盐母液的配制：称取FeSO4·7H2O 2.78g、EDTA 3.73g，加去离子水定容至1L，备用；
所述有机母液的配制：称取肌醇10g、甘氨酸0.2g、烟酸0.05g、硫胺素0.01g、吡哆醇0.05g，加去离子水定容至1L，备用；
(3)取步骤(1)所述的接种孢子悬浮液加入步骤(2)所述的水培瓶中，每个水培瓶加入2ml接种孢子悬浮液，每品种设3个重复，每重复接种30株切根的百合组培苗；以清水为对照，接种后，将水培瓶放入25℃玻璃温室中日常管理；
(4)按如下0-4级病情分级标准进行发病程度分级，病情分级标准：0级：无病；1级：1～2片叶片叶缘卷曲萎蔫；2级：3-4片叶片卷曲萎蔫；3级：4-6片叶片卷曲萎蔫；4级：叶片全部萎蔫或死亡。
(5)病情调查：接种后7d、14d、21d调查发病情况，记录发病率及病情指数；抗性以高抗、中抗、中感、高感表示，按每个种质或每个品种的供试百合组培苗的平均病情指数划分百合种质或百合品种对病菌的抗性等级，平均病情指数≤20.0的为高抗，病情指数为20.1～50.0的为中抗，病情指数为50.1～80.0的为中感，病情指数≥80.1的为高感；
平均病情指数＝三个重复的病情指数的平均数；
病情指数按下列公式计算：
Figure BDA0001118391850000031
其中：代表数值为：病情分级标准的级数。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明直接采用组培苗水培接种鉴定，与百合植株喷雾接种相比，避免了环境温度和湿度对鉴定结果的影响，提高鉴定结果的准确性；本发明将孢子悬浮液加入水培液中的方法，使得接种时易于操作；组培苗在室内进行抗病性筛选条件较易控制，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力。本发明方法鉴定周期为30d，现有的鳞片法鉴定周期为80d，百合植株喷雾接种鉴定周期为35d(但存在如上所述易受环境温度和湿度对鉴定结果准确性的影响)。
本发明为鉴定百合资源、杂交亲本、杂交后代对百合枯萎病的抗性提供了简单易行的方法，为加速百合抗病品种的选育奠定了较好的技术基础，具有重要的实践意义和应用前景。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是ITS引物的上游引物ITS1的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是ITS引物的下游引物ITS4的碱基序列。
具体实施方式
实施例中所用的尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysproum f.sp.lilii)菌种为申请人分离鉴定保存的菌种，具体分离方法为：取发病植株病健交界处的组织，将组织切为0.2cm2大小的小块，用0.1％的升汞消毒1min，再用无菌水清洗三次后接种于PSA培养基上，待菌长出后镜检，初步从形态确定其为尖孢镰刀菌(形态确定依据《百合枯萎病病原鉴定与ITS序列分析》(作者杨秀梅)，西南农业学报，2010年6月，1914-1916。)，再用琼胶稀释平板法纯化培养，之后用ITS引物扩增后经Genbank BLAST比对后进一步鉴定为尖孢镰刀菌百合专化型。所述ITS引物由上游引物ITS1和下游引物ITS4组成，所述上游引物ITS1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物ITS4的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
ITS引物扩增的25μL反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，2.5mmol·L-1dNTP 2.5μL，20pmol/μL引物ITS10.5μL，20pmol/μL引物ITS4 0.5μL，5U/TaqDNA聚合酶0.5μL，20ng模板DNA 1μL，ddH2O 17.5μL。反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min，35个循环后72℃延伸10min。所述尖孢镰刀菌百合专化型(Fusariumoxysproum f.sp.lilii)菌种已在2010年6月(页码1914-1916)的西南农业学报《百合枯萎病病原鉴定与ITS序列分析》(作者杨秀梅)公开，申请人保证自本专利申请日起20年内向公众发放所述的生物材料尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysproum f.sp.lilii)菌种。实施例中无特殊说明的为常规方法。
实施例
(1)接种孢子悬浮液的准备：
将灭菌后的PSA培养基倒在平板上，再将尖孢镰刀菌百合专化型(Fusariumoxysproum f.sp.lilii)菌种接种在平板上用PSA培养基培养7d后，取尖孢镰刀菌百合专化型菌种用无菌水配制成尖孢镰刀菌百合专化型菌种孢子为1.0×106个/ml的接种孢子悬浮液；
所述PSA培养基即马铃薯蔗糖琼胶培养基，其制备方法：将洗净后去皮的马铃薯200g切碎，加水1000ml煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯，在滤液中加水补足至1000ml，然后加蔗糖20g和琼胶20g，于103.4kPa，121℃条件下灭菌15mim后即得PSA培养基。
(2)供试百合组培苗的准备：
供试的百合品种为东方系列百合、亚州系列百合、OT系列百合、LA系列百合、野生百合等几大系列的百合品种供44份材料，详见表1。所有供试的品种均采用组培生根苗，将供试的百合组培苗切根后置于盛有百合组培苗水培液的水培瓶中待接种，每个水培瓶装入20ml百合组培苗水培液，每个水培瓶放置10株切根的百合组培苗；所述百合组培苗水培液由大量元素母液10ml、微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机母液10ml混合后，再加去离子水稀释至1L然后于103.4kPa，121℃条件下灭菌15mim而成；
所述大量元素母液的配制：称取NH4NO3165g、KNO3190g、CaCl2·2H2O 44g、MgSO4·7H2O 37g、KH2PO417g，加去离子水定容至1L，备用；
所述微量元素母液的配制：称取H3BO30.62g、MnSO4·H2O 2.23g、ZnSO4·7H2O0.86g、KI 0.83g、Na2MoO4·2H2O 0.025g、CuSO4·5H2O 0.0025g、CoCl2·6H2O 0.0025g，加去离子水定容至1L，备用；
所述铁盐母液的配制：称取FeSO4·7H2O 2.78g、EDTA 3.73g，加去离子水定容至1L，备用；
所述有机母液的配制：称取肌醇10g、甘氨酸0.2g、烟酸0.05g、硫胺素0.01g、吡哆醇0.05g，加去离子水定容至1L，备用；
(3)取步骤(1)配制好的接种孢子悬浮液加入步骤(2)所述的水培瓶中，每个水培瓶加入2ml所述接种孢子悬浮液，每品种设3个重复，每重复接种30株切根的百合组培苗；以清水为对照，接种后，将水培瓶放入25℃玻璃温室中日常管理；
(4)按如下0-4级病情分级标准进行发病程度调查，病情分级标准：0级：无病；1级：1～2片叶片叶缘卷曲萎蔫；2级：3-4片叶片卷曲萎蔫；3级：4-6片叶片卷曲萎蔫；4级：叶片全部萎蔫或死亡。
(5)病情调查：接种后7d、14d、21d调查发病情况，记录发病率及病情指数；抗性以高抗(HR)、中抗(MR)、中感(MS)、高感(HS)表示，按每个品种的供试百合组培苗的平均病情指数划分百合品种对尖孢镰刀菌百合专化型病菌的抗性等级，平均病情指数≤20.0的为高抗，平均病情指数为20.1～50.0的为中抗，平均病情指数为50.1～80.0的为中感，平均病情指数≥80.1的为高感。
病情指数按下列公式计算：
Figure BDA0001118391850000051
代表数值是指：病情分级标准的级数即0级—4级。
平均病情指数＝三个重复的病情指数的平均数。
鉴定的百合品种病情指数见表1。
表1中所列的百合材料均为市售，可通过http://www.lilycompany.nl/en购买。
表1百合种质资源对尖孢镰刀菌百合专化型病菌的抗性鉴定结果
Figure BDA0001118391850000061
Figure BDA0001118391850000071
注：表1中O：东方百合；A：亚洲百合；OT:OT系列百合；LA：LA系列百合；S：植物学种。
上述实施例直接采用组培苗在室内水培接种鉴定，对大量百合资源或品种的抗性筛选而言，其操作容易，且抗性筛选条件较易控制，避免了环境温度和湿度对鉴定结果的影响，提高鉴定结果的准确性，鉴定周期为30d，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力，为鉴定百合资源、杂交亲本、杂交后代对百合枯萎病的抗性提供了简单易行的方法，为加速百合抗病品种的选育奠定了较好的技术基础。
<110> 云南省农业科学院花卉研究所
<120> 一种百合组培苗枯萎病抗性的快速鉴定方法
<130> /
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITS引物的上游引物ITS1
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITS引物的下游引物ITS4
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (1)

1.一种百合组培苗枯萎病抗性的快速鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)接种孢子悬浮液的准备：将尖孢镰刀菌百合专化型(Fusarium oxysproumf.sp.lilii)菌种用PSA培养基培养7～10d后，取尖孢镰刀菌百合专化型菌种用无菌水配成尖孢镰刀菌百合专化型菌种孢子为1.0×106个/ml的接种孢子悬浮液；
(2)供试百合组培苗的准备：将供试的百合组培苗切根后置于盛有百合组培苗水培液的水培瓶中待接种，每个水培瓶装入20ml百合组培苗水培液，每个水培瓶放置10株切根的百合组培苗；所述百合组培苗水培液由大量元素母液10ml、微量元素母液10ml、铁盐母液10ml、有机母液10ml混合后，再加去离子水稀释至1L然后灭菌而成；
所述大量元素母液的配制：称取NH4NO3 165g、KNO3 190g、CaCl2·2H2O 44g、MgSO4·7H2O37g、KH2PO4 17g，加去离子水定容至1L，备用；
所述微量元素母液的配制：称取H3BO3 0.62g、MnSO4·H2O 2.23g、ZnSO4·7H2O 0.86g、KI 0.83g、Na2MoO4·2H2O 0.025g、CuSO4·5H2O 0.0025g、CoCl2·6H2O 0.0025g，加去离子水定容至1L，备用；
所述铁盐母液的配制：称取FeSO4·7H2O 2.78g、EDTA 3.73g，加去离子水定容至1L，备用；
所述有机母液的配制：称取肌醇10g、甘氨酸0.2g、烟酸0.05g、硫胺素0.01g、吡哆醇0.05g，加去离子水定容至1L，备用；
(3)取步骤(1)所述的接种孢子悬浮液加入步骤(2)所述的水培瓶中，每个水培瓶加入2ml接种孢子悬浮液，每品种设3个重复，每重复接种30株切根的百合组培苗；以清水为对照，接种后，将水培瓶放入25℃玻璃温室中日常管理；
(4)按如下0-4级病情分级标准进行发病程度分级，病情分级标准：0级：无病；1级：1～2片叶片叶缘卷曲萎蔫；2级：3-4片叶片卷曲萎蔫；3级：4-6片叶片卷曲萎蔫；4级：叶片全部萎蔫或死亡；
(5)病情调查：接种后7d、14d、21d调查发病情况，记录发病率及病情指数；抗性以高抗、中抗、中感、高感表示，按每个种质或每个品种的供试百合组培苗的平均病情指数划分百合种质或百合品种对病菌的抗性等级，平均病情指数≤20.0的为高抗，病情指数为20.1～50.0的为中抗，病情指数为50.1～80.0的为中感，病情指数≥80.1的为高感；
平均病情指数＝三个重复的病情指数的平均数；
病情指数按下列公式计算：
Figure FDA0001118391840000021
其中：代表数值为：病情分级标准的级数。
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