CN1287175A - 鉴定植物抗青枯病能力的水培接菌法 - Google Patents

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Abstract

本发明是鉴定植物抗青枯病能力的水培接菌法,它是对两个生物体的生长条件进行人工控制,使青枯菌在水中吸附到植株根系,通过伤口进入根部而繁殖并伤害植株。其包括具体准备工作:准备水培池;配备一批控制生物体生长的仪器;配备适合接菌植株幼苗;配备营养液,经活化青枯菌及温室等;其操作流程:往水培池注灭菌水→添加营养液→栽供接菌用幼苗→泵水增氧、控温→注入青枯菌→调查发病情况。本发明重复性好、准确性可靠性高、方法简单、容易操作、时间短、见效快、成本低。

Description

鉴定植物抗青枯病能力的水培接菌法
本发明是鉴定植物抗青枯病能力的水培接菌法，属植物保护鉴定技术。
青枯病属于郎氏假单孢菌(Ralstonia solanacearum)，是一种重要的土传植物维管束萎蔫病原细菌，全球分布十分广泛，特别以热带、亚热带地区发生最为严重，一些温带地区也有受害报道。我国南方及东南亚地区是世界上青枯病发生的重灾区，每年因此病损失近十亿美元。青枯菌的寄主范围很广，据报道茄科的番茄、烟草、辣椒、茄子、马铃薯以及生姜、甘薯、花生和木本植物的油橄榄、桑树、木麻黄等均是其寄主。美国学者Kelman(1951)首次系统报道了该病的发生、发展及其危害性。此后各国科学家都从各个学科开展了对该病的深入研究，经过半个多世纪的努力，人们对该病从病理学、生理学、遗传学、分子生物学、生物物理学以及预防科学方面有了深入和统一的认识，为防治青枯病的发生，提高作物产品的产量和质量有了科学的依据。在植物保护的实验研究中，青枯菌的接种技术(也称作感染方式)也经历了一个较长的研究过程。认识到青枯菌是一种土传病菌，人们首先通过根系感染使植株接触病菌，使其发病，观察其发病时间迟早和长短、伤害程度，以此评价植株对该病的抵抗能力(抗病性)。通常使用方法有菌液灌根(包括伤根和不伤根)法、浸根法。所使用的菌液浓度则根据作物的抗病力或不同实验目的，从1×106～1×108个菌/毫升不等；为了加快对植株的伤害，又研究出针刺叶脉(或叶腋)法，菌液浓度从1×106～1×107个菌/毫升不等；到目前为止，青枯菌的接菌感染技术不外乎上述三种。对方法的使用描述得较为详细的有美国的G.C.Somodi等发展的文章《Comparison ofInoculation Techniques for Screening Tomato Genotypes for Bacterial WiltResistance》(番茄不同基因型青枯病抗性筛选的接菌感染技术比较)(Proceedings of An International Conference Taiwan，28-31 October 1992Editors：G.L.Hartman and A.C.Hayward)(国际会议论文集台湾1992年10月28日～31日)以及王卉、任欣正发表的《青枯菌(Pseudomonas solanacearum)在番茄抗、感病品种根部的吸附、侵入和繁殖》。这三种方法一直沿用至今。作物抗青枯病育种工作者在实践中发现，三种方法都存在不够理想的地方。在自然界和生产实践中，病原菌是从植株根部侵入植物体内并由此引起发病的，根系结构、内在在物质以及它与病原菌的共扼关系，可能对病菌的入侵和繁殖有关系。针刺法仅是在植株的叶片或叶液部位注入病菌，使植株在该部位首先发病，此方法的严重不足之处，是它不能完全反映出植物的抗病特性，因此，这一方法多用于鉴定青枯菌致病能力和寄主范围的研究；在作物抗病育种的操作上，多采用菌液灌根、浸根法，它的特点是使植株能按照自然发生规律受到感染和发病。但是由于土壤中微生物种类有近百种，特别是有些土壤病原真菌其致病力远比青枯菌强得多，如番茄的立枯病、辣椒的疫病、烟草的黑茎病、茄子花生的枯萎病等，对试验结果干扰很大，如何减少其它病原菌的干扰一直是探讨的内容之一。土壤消毒、水旱轮作等都是有效途径，但其工作量大，准备时间长，实际操作时受到限制。加上土壤的物理性状很难一致，故重复性差。
本发明目的就是为了克服和解决现有鉴定植物抗青枯病能力的接菌技术方法存在针刺法不能完全反映出植物的抗病特性或菌液灌根、浸根法土壤病原真菌对试验结果干扰太大，而对土壤消毒、水旱轮作虽可减小干扰，而存在工作量大、时间长、实际操作困难、重复性差、鉴定准确性、可靠性差等的缺点和问题，研究发明一种能完全反映出自然发病客观实际，真正能体现作物对青枯病抗病特性而操作上又简单易行、试验条件容易控制、试验重复性好、鉴定准确性可靠性高的鉴定植物抗青枯病能力的水培接菌法。
本发明是通过下述技术方案来实现的：它是根据植物和青枯菌在一定的物质条件下能够在水中正常生长的特性，对两个生物体的生长条件进行人工控制，使青枯病在水中吸附到植株根系，通过伤口进入根部进而繁殖并伤害植株；其关键在于：(一)把青枯菌感染植物的接菌操作从在土壤里改为在水中；(二)两个生物体从培养、生长到发病的这个时段都受到人工控制，做到条件完全一致；其具体准备工作和技术操作流程如下：(1)准备工作如下：①准备一批盛水的容器——水培池，上面配有支撑植株生长的设施；②配备一批控制生物体生长的仪器如：水族箱水泵、控温仪(包括探头)、定时器等，如试验在冬季进行应配备发热丝；③一批适合接菌——4～8片真叶的植株幼苗，一般每个重复20株；④植物生长营养液，使用时则根据植物种类的不同进行选择和调整；⑤达到一定浓度经过活化的青枯菌；⑥环境条件可作人工控制的建筑物，如温室、大棚等；(2)技术操作流程如下：①往水培池注入单蒸馏水或经过灭菌处理的自来水；②添加MS营养液，最终浓度为10％，每10天左右补充1次营养液；③在支撑板的孔内栽上供接菌用的幼苗，使根系接触营养液至少4厘米；④小水泵开始以10～20分钟/每小时的泵水增氧，水温控制在27±1.5℃，室温28～32℃；⑤植株在上述条件下预培养3天，注入青枯菌，最终浓度为5×107～1×108个菌/毫升，可根据试验需要作调整；⑥植株在接菌5天后开始表现发病症状，再按常用方法调查发病情况至试验结束。试验结果表明不同作物品种水培法接种青枯菌后的发病情况与田间的菌液灌根、浸根法表现的抗病特性比较一致。如表1所示。
表1
作物种类 品种 田间抗性 10天后发病(％) 15天后发病率(％) 15天后发病率(％)
烟草   CO176 高抗     -     30     30
  NC82 感病     -     75     90
  91 中抗     -     10     45
  61 高抗     -     0     15
辣椒  4404 高抗     5     15     -
 4848 感病     55     100     -
 4556 中抗     35     55     -
 4844 高感     75     100     -
 4982 高抗     0     20     -
番茄  金丰 感病     -     40     75
 粤农 中抗     -     14     43
 抗青 高抗     -     5     10
本发明的实用性在于：(1)采用能够使供试植株感病的接菌浓度(1×106～1×108个细菌/毫升)，以及青枯菌增殖的培养方法；(2)采用植株最容易感病的物候期——幼苗4～8片真叶期，实验条件能满足植物生长和发病的要求；(3)所使用的一切仪器、设备、用具、药物、试剂，都可以在市场上买得到，而且价钱便宜。比如，做一个容积为140×90×10cm(水深5cm时水的容积为83升)的水培养池(包括有120个盛放植株的圆孔的盖板)，所用的泡沫板和木板，仅需100元；水族箱小水泵50元/个，控温仪200元/个，定时器60～120元/个，发热丝20元/池，植物营养液约需200元/套(可用多次)，定植杯(插在盖板孔内支撑植株生长的有孔塑料杯)12元/池·120个，培养青枯菌的用具一般从事植保工作的单位都已具备，如无菌操作间或超静工作台，30±2℃恒温培养箱，培养皿或试管，灭菌设备如手提式高压灭菌锅，检测菌液浓度的分光光度计，比浊管等，再配上照明和控制室温设备(如果需要的话)。这样，总的费用仅需1500元(植保用具除外)。
本发明与现有技术相比具有如下的优点和有益效果(1)应用本发明方法实施植物抗青枯病鉴定，由于对水质作了严格控制，避免了其它有害微生物的干扰，实验准确性可靠性高。它克服了土壤接菌时容易发生的其它病菌引起发病对实验准确性的影响，特别对较大规模的试验更是如此；(2)本发明的方法纠正了针刺接菌法未能完全体现植物抗病特性的不足，让植株能在模拟自然环境条件下，在与病菌的共同生活与抗争中表现出应有的反应机制；(3)本发明方法是在可以人工控制的情况下进行的，实验重复性好；同时时间大大缩短，并全年可多次进行重复试验。以上这些优点和有益效果可以从以下实验数据得到证明：①植物根系在水中生长必须有充足的氧气。根据规定，水中饱和溶氧量28℃时为7.75毫克/升，29℃时为7.64毫克/升。实验中，探头位置为入水深约30毫米时探得：通气8分钟／小时水中溶氧量为6.80～6.98毫克/升，通气15分钟/小时为6.97～7.27毫克/升。每小时通气10～20分钟能满足植物在水中生长的要求；②分别将4～6片真叶的番茄、烟草、辣椒幼苗移栽于MS水培液中，15天后调查株高净增长量&#60培养15天后实际高度一培养前高度(10株平均值)&#62：番茄为9.7厘米，烟草为3.8厘米，辣椒为6.1厘米，分别是土壤中生长为对照的110、95.8和101％，属于正常；③液体培养的青枯菌对植物有强致病力，番茄的发病率分别为99.11％和91.24％，烟草为69.45％和69.20％，辣椒为84.45％和87.50％(4次重复平均)；④如表1所示的试验结果表明，不同作物品种水培法接种青枯菌后的发病情况与田间表现的抗性比较一致。青枯病发病率试验表明，应用本发明方法完全能够正确反映植物对青枯病的抗病特性，本发明方法更能反映事实的本质，它的准确性可靠性高、效果好、方法简单、见效快、成本低。
本发明的实施方式比较简单，只要按上面说明书所述的技术方案——具体的准确工作和技术操作流程进行逐步操作，便能较好地实施本发明：①其实施过程中，其设备及材料均可在市场选购选用，例如：水族箱水泵可选SUBMERGED LIQUID FILTER，13W；控温仪(包括探头)可选上海医用仪表厂生产的WMZK-01型温度指示控温仪；定时器可选广东佛山伟力公司生产的GB-60型间歇开关电器；植物生长营养液可选用的有很多，如N6(Nitch-6尼许培养基)、B5(Burger-5伯格培养基)、Hoagland(霍格兰营养液)、Moore(摩尔营养液)或以MS(Murasige&Skoog)营养液为基础，按不同植物需要作适当调整配料；无菌操作间的灭菌设备可选用上海医用核子仪器厂生产的YXQ·SG41·280A型；检测菌液浓度的分光度计可选用上海化学分析仪器厂生产的光波长650纳米的7210型；②发明人经过多年的研究和大量试验，按照说明书所述的技术操作流程步骤进行操作已有很多成功的实施例。如表1所示是其实施试验结果之一。试验证明了本发明的先进性、准确性高、可靠性高、方法简单、见效快、成本低。

Claims (1)

1、一种鉴定植物抗青枯病能力的水培接菌法，其特征在于：它是根据植物和青枯菌在一定的物质条件下能够在水中正常生长的特性，对两个生物体的生长条件进行人工控制，使青枯病在水中吸附到植株根系，通过伤口进入根部进而繁殖并伤害植株；其关键在于：(一)把青枯菌感染植物的接菌操作从在土壤里改为在水中；(二)两个生物体从培养、生长到发病的这个时段都受到人工控制，做到条件完全一致；其具体准备工作和技术操作流程如下：(1)准备工作如下：①准备一批盛水的容器——水培池，上面配有支撑植株生长的设施；②配备一批控制生物体生长的仪器如：水族箱水泵、控温仪、定时器等，如试验在冬季进行应配备发热丝；③一批适合接菌——4～8片真叶的植株幼苗，一般每个重复20株；④植物生长营养液，使用时则根据植物种类的不同进行选择和调整；⑤达到一定浓度经过活化的青枯菌；⑥环境条件可作人工控制的建筑物，如温室、大棚等；(2)技术操作流程如下：①往水培池注入单蒸馏水或经过灭菌处理的自来水；②添加MS营养液，最终浓度为10％，每10天左右补充1次营养液；③在支撑板的孔内栽上供接菌用的幼苗，使根系接触营养液至少4厘米；④小水泵开始以10～20分钟/每小时的泵水增氧，水温控制在27±1.5℃，室温28～32℃；⑤植株在上述条件下预培养3天，注入青枯菌，最终浓度为5×107～1×108个菌/毫升，可根据试验需要作调整；⑥植株在接菌5天后开始表现发病症状，再按常用方法调查发病情况至试验结束。
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