CN107466863A - 一种北京花楸组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及了一种北京花楸的组织培养快速繁殖育苗方法，本方法是由无菌苗获得：鲜嫩带芽茎段经过处理接于初始培养基上进行培养，得到脱毒带芽茎段；增殖培养：将脱毒带芽茎段接于含有MS+1.25mg/L 6‑BA+0.25mg/L NAA+0.25mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5～7g/L琼脂粉的增殖培养基上进行培养，得到继代苗；生根培养：将继代苗转入含有MS+1.25mg/L IBA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5～7g/L琼脂的生根培养基上培养，得到生根苗；炼苗和移栽：将盛根苗移至温室中进行炼苗，炼苗后进行移栽。采用本发明方法，可使北京花楸增殖效率提高至26.5，生根率达93.3％，炼苗成活率100％，利于北京花揪量化生产。

Description

一种北京花楸组织培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种木本植物组织培养繁殖方法，尤其涉及一种北京花楸组织培养快 速繁殖的方法，属木本植物组织培养育苗技术领域。

背景技术

[0002] 北京花楸(Sorbus discolor)是我国蔷薇科(Rosaceae)花楸属（Sorbus L.)植物 中的特有乔木树种之一，其叶色随季节多变、果白色或黄色，抗逆性强，不仅极具园林观赏 价值和药用价值(辛宝英，2013;李法曾等，2016)，而且是花楸属种质创新的重要亲本(汤薇 等，2016)。由于北京花楸实生育苗，后代变异较大;扦插无性繁殖时成生根率低，大量繁殖 较为困难，致使推广应用受很大影响，组织培养育苗技术是解决该树种快繁难题的关键。

[0003] 近年来，基于花楸属植物难繁但市场有较大需求，一些学者对花楸属或同科异属 的其他物种开展了较多的组织培养工作。相关研究表明，核心培养基多以MS培养基为主，激 素以6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)为主，辅以吲哚乙酸（IBA)、萘乙酸(NAA)等。目前，仅部分研究 成效较好，如百花花楸(或称为花楸树，S · pohuashanensi s)，其增殖系数为4 · 5，生根率80 % (白卉等，2007);詹立平等（2012)针对西伯利亚花楸(S. sibirica)也进行了组培快繁的研 究，其丛生芽诱导率和增殖倍数分别为100%和13.6±2.3,其最佳生根率为82.6%，但以上 研究树种不同，其二者采用的组培方法体系各异。北京花楸的生物学特性和繁殖特性均不 同于同属的其它树种，如花楸树(王爱芝等，2005;郭艳茹等，2007)、西伯利亚花楸(高英凯 等，2016)、天山花楸（S.tianshania)(冯怀章等，2011)、水榆花楸（S.alnifolia)(常苹， 2013)，以及引进的同属一些列欧洲、美洲花楸（sorbus sp.)等（韩焱，2005;陈士刚等， 2010;王丹等，2012)，也与引种美洲异属同科的腺肋花楸属灌木树种不同，如黑果腺肋花楸 (AroniaXprunifolia)、红果腺肋花楸(A.arbutifolia)等（王晓明等，2007;高晔华等， 2013)。因此，上述与北京花楸亲缘关系或近或远的物种及品种，虽然其具有了初步的组织 培养快繁技术体系，但是均无法将上述技术方法直接应用于北京花楸。

[0004] 可能由于北京花楸繁殖较难等技术难题，目前仅辛宝英（2013)初步对北京花楸 “微型繁殖技术”进行了开拓性的有益探索，但其研究表明，采用相关技术，最理想状况下侧 芽诱导率仅为76.41 %、生根率仅为86.71 %，而且繁殖系数不清、缺乏炼苗相关技术;另外， 在其处理外植体的过程中，自来水冲洗过程仅IOmin，时间过短，冲洗不彻底，且使用HgCl2 进行消毒，不仅易引起无菌苗褐化，而且易给试验人员造成健康危害、给环境造成污染。北 京花楸的快繁研究工作还仅为初步的，尚未从实验室走向生产。

[0005] 因此，十分必要研发一种北京花楸的高效组织培养育苗技术方法，促进北京花楸 的工厂化、规模化快速生产，提高推广应用面积，获得更大的社会、经济和生态效益。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种高效、安全的北京花楸组 织培养方法，步骤如下：

[0007] (1)无菌苗获得:鲜嫩带芽茎段经过处理和杀菌处理，接于初始培养基上培养30d， 所述初始培养基配方为MS+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉；

[0008] (2)增殖培养:将脱毒带芽茎段接种于增殖培养基中进行增殖培养，得到继代苗， 所述增殖培养基为:MS+1.25mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.25mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼 脂；

[0009] (3)生根培养:将继代苗逐一转入生根培养基中进行生根培养，得到生根苗，所述 生根培养基为MS+1.25mg/L IBA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂；

[0010] 作为一种优选的实施方案，所述无菌苗获得的方法是:于春季3月中旬，剪取北京 花楸新抽生的顶部带芽茎段，去尘后，首先用洗衣粉清洗外植体表面，然后用细流水冲洗外 植体20〜24h，随后将其置于超净工作台上，采用75 %酒精处理35s，再用5 %次氯酸钠处理 9min进行脱毒灭菌，无菌水漂洗3次，最后将其切成0.7〜1.5cm带芽茎段，接入初始培养基 中培养30d。

[0011] 作为一种优选的实施方案，所述增殖培养基PH值为5.8，所述生根培养基PH值为 5 · 8〇

[0012] 作为一种优选的实施方案，所述增殖培养的时间是35d，所述生根培养的时间是 35d〇

[0013] 作为一种优选的实施方案，所述组织培养快繁方法的培养条件是：白天温度为25 ±2°C，夜间18±2°C，光照时长16h，光照强度为3000〜5000LX。

[0014] 作为一种优选的实施方案，所述组织培养方法还包括炼苗，所述炼苗:将生根苗移 至温室中封口炼苗，5d后去除无菌盖，继续炼苗3d，维持室内湿度50 %以上，温度25〜30 °C， 而后继续炼苗15d，所述15d的前5d湿度不低于50%，温度维持在15〜30°C。

[0015] 作为一种优选的实施方案，所述组织培养方法还包括移栽。所述移栽:清水冲洗成 活的幼苗根系，洗去根部培养基，然后将其移栽至经0.5%高锰酸钾消毒的轻基质容器内， 所述轻基质包括草炭、珍珠岩与蛭石，所述轻基质中草炭、珍珠岩与蛭石的比例是6:1:1。

[0016] 本发明的有益效果:首先，利用环境友好型消毒剂次氯酸钠进行外植体消毒，克服 外植体褐化问题;其次，改良培养基并调节激素种类和浓度，提高繁殖效率;最后，制定简单 易行的炼苗、移栽方案，省略了常规方法中的壮苗培养步骤，提高了繁殖效率，移栽成活率 达100%。通过本技术体系的逐步攻关，系统建立了北京花楸的专有组织培养快繁技术方 法，打通了北京花楸从田间走向实验室、再走向田间过程中的系列难关;利于北京花楸的工 厂化、规模化快速生产及推广。

附图说明

[0017] 图1是北京花揪芽分化示意图；

[0018] 图2是北京花揪增殖培养示意图；

[0019] 图3是北京花揪生根培养示意图；

[0020] 图4是北京花揪炼苗示意图。

具体实施方式

[0021] 下面将结合本发明的具体实施例与附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描 述，显然，所描述实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。

[0022] 一种北京花楸组织培养方法，步骤如下：

[0023] ⑴无菌苗获得

[0024] 于春季3月中旬，剪取北京花楸新抽生的顶部带芽茎段，去尘后，首先用洗衣粉清 洗外植体表面，然后用细流水冲洗外植体20〜24h，随后将其置于超净工作台上，采用75% 酒精处理35s，再用5 %次氯酸钠处理9min进行脱毒灭菌，无菌水漂洗3次，最后将其切成0.7 〜1.5cm带芽茎段，置于初始培养基中培养，初始培养基配方为MS+30g/L蔗糖+6.5g/lJ京脂 粉，培养时间是30d。北京花楸培养结果参照图1。

[0025] (2)增殖培养基的选择

[0026] 将培养的无菌外植体接种到增殖培养基上(见表1)进行扩繁，35d后调查各组试验 增殖情况。

[0027] 试验方法:将选取的无菌苗茎段分成16组，设计为一个三因素四水平的正交试验， 基础培养基为添加30g//L蔗糖+7g/L琼脂的MS培养基，PH值为5.8，每组30个茎段，将试验对 象接种于不同培养基中进行培养。统一光照培养条件：白天25 ± 2°C，夜间18 ± 2°C，光照时 长16h，光照强度为3000〜5000LX，培养天数是35d，得到各组出芽数数据，试验结果见表1。

[0028] 表1北京花楸增殖培养基组成成分及生长情况

[0029]

[0030]

[0031] 利用SPSS19.0对平均出芽数和平均有效出芽数(芽高

进行主题间效应进 行检验，结果分别见表2和表3。结果分析表明，激素6-BA、NAA和IBA均对平均出芽数量产生 影响，但仅激素IBA对平均有效出芽数(芽高

产生影响。

[0032] 表2平均出芽数主体间效应的检验

[0033]

[0034] a .R方=.946(调整 R方=.866)

[0035] 表3平均有效出芽数(芽高主体间效应的检验

[0036]

[0037] a .R方=.805(调整 R方=.512)

[0038] 结论：以平均出芽数量不低于15个、芽高多0.7cm的平均有效出芽数不低于4为统 计指标，通过对比表1发现，2号培养基平均出芽数量远高于其他培养基上的出芽数量，苗高 均一化程度较其他组高、且高度不低于0.7cm的新出芽数量相较于其他组仍较多；同时，在 正交分析中，可以得出每个因素的最佳水平，即6-BA最佳浓度为1.25mg/L，NAA最佳浓度为 0.25mg/L，IBA最佳浓度为0.25mg/L。2号培养基符合上述条件，

[0039] 因此，2号培养基为最佳增殖培养基，增殖培养基为:MS+1 ·25mg/L 6-BA+0·25mg/L ΝΑΑ+0.25mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。北京花楸增殖培养情况参照图2。

[0040] (3)生根培养基的选择

[0041] 试验方法:将所述健壮试管丛生苗茎段分成9组，设计三因素四水平正交试验，基 本培养基为添加30g/L蔗糖+7g/L琼脂的MS培养基，PH值为5.8。统一培养条件为：白天25 ± 2 °C，夜间18±2°C，光照时长16h，光照强度为3000〜5000LX，培养天数是35d。北京花楸生根 培养基组成成分及生长情况见表4。

[0042] 表4北京花楸生根培养基组成成分及生长情况

[0043]

[0044] 结论:通过表4试验结果可以看出，在有6-BA存在的情况下，北京花楸均没有生根， 在不添加6-BA时，北京花楸可以生根，因此，6-BA对北京花楸生根具有抑制作用，因此在后 续试验中不添加6-BA。由表4中编号1、2、3的三组数据可以看出，随着IBA浓度升高，北京花 楸的生根率及其平均生根条数增加。

[0045] 为探索北京花楸在生根培养阶段的IBA最适浓度，设计开展了 IBA梯度试验，见表 5。并利用SPSSl 9.0进行分析，见表6。

[0046] 表5北京花楸生根培养基IBA梯度试验

[0047]

[0048] 表6激素IBA与生根率、平均生根数的相关分析

[0049]

[0050] **.在.01水平(双侧)上显著相关。

[0051] 结论:通过表5和表6分析可以看出，激素IBA与生根率、平均生根数量呈正相关关 系，生根率与平均生根数量达到显著正相关。北京花楸生根率及其平均生根条数随着IBA浓 度的提高而增加，而且在IBA达到1.25mg/L时，其生根率达到最高，为81.25 %，此时平均生 根条数为2.94条；当IBA浓度自1.25mg/L继续增加时，北京花楸的生根率及其平均生根条数 均呈现下降趋势。

[0052] 为探索北京花楸在生根培养阶段的NAA最适浓度，设计开展了北京花楸生根培养 基NAA梯度试验，见表7。并利用SPSSl 9.0进行分析，见表8。

[0053] 表7北京花楸生根培养基NAA梯度试验

[0054]

[0055] 表8激素NAA与生根率、平均生根数的相关分析

[0056]

[0057] 由表7和表8分析表明，将IBA浓度固定在1.25mg/L，同时加入不同浓度的NAA，北京 花楸的生根率和生根条数出现不一致变化现象。其中平均生根数量与激素NAA浓度呈现正 相关关系，但激素NAA浓度与生根率呈现负相关关系，但二者均为达到显著水平。激素NAA浓 度为0.05时，此时生根率最高，为63 % ;平均生根数也最多，为2.58条，激素NAAO. 05mg/L应 该为北京花楸生根培养的最佳添加浓度。

[0058] 激素浓度以1.25mg/L IBA+0.05mg/L NAA开展北京花楸生根重复试验，设置三次 重复，每次重复50个茎段，生根数量分别为46、47和47根，生根率分别为92 %、94%和94%， 其平均生根率达到93.3%。

[0059] 因此，北京花楸的最适生根培养基为:MS+1.25mg/L IBA+0.05mg/LNAA+30g/L蔗糖 +7g/L琼脂。平均生根率可达93 %以上。北京花楸生根培养情况参照图3。

[0060] 综上所述，可以得出北京花楸完整的组织培养配方为：

[0061] 增殖培养:MS+1.25mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.25mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/U京 月旨，ΡΗ=5·8。

[0062] 生根培养:MS+1.25mg/L IBA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，ΡΗ=5·8。

[0063] ⑷炼苗移栽

[0064] 将生根苗移至温室中封口炼苗，5d后去除无菌盖，继续炼苗3d，维持室内湿度50 % 以上，温度25〜30°C，继续炼苗15d，每天观测光照及温湿度情况，而且15d的前5d湿度不低 于50%，温度维持在15〜30°C;15d后可以进行正常培养，炼苗成活率达100%。炼苗时间共 计23d，炼苗成活率100%，北京花楸移栽成活情况参照图4。

[0065] 最后用清水冲洗掉幼苗根部的培养基，将其移栽至经0.5%高锰酸钾消毒的轻基 质容器内，轻基质包括草炭、珍珠岩与蛭石，所述轻基质中草炭、珍珠岩与蛭石的比例是6: 1:1，移栽成活率达100 %。

[0066]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1. 一种北京花楸组织培养方法，其特征在于： (1) 无菌苗获得:鲜嫩带芽茎段经过处理和杀菌，接至初始培养基上进行培养，所述初 始培养基配方为MS+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉； (2) 增殖培养:将消毒后的带芽茎段接至增殖培养基中进行增殖培养，得到继代苗，所 述增殖培养基为:MS+1.25mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.25mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂； (3) 生根培养:将继代苗逐一转入生根培养基中进行生根培养，得到生根苗，所述生根 培养基为MS+1.25mg/L IBA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉。

2. 如权利要求1所述的一种北京花楸组织培养方法，其特征在于，所述无菌苗获得方法 是:于春季3月中旬，剪取北京花楸新抽生的顶部带芽茎段，去尘后，首先用洗衣粉清洗外植 体表面，然后用细流水冲洗外植体20〜24h，随后将其置于超净工作台上，采用75%酒精处 理35s，再用5%次氯酸钠处理9min进行脱毒灭菌，无菌水漂洗3次，最后将其切成0.7〜 1.5cm带芽茎段，接入初始培养基中培养30d。

3. 根据权利要求1或2任意一项所述的一种北京花楸组织培养方法，其特征在于，所述 增殖培养基PH值为5.8，所述生根培养基PH值为5.8。

4. 根据权利要求3所述的一种北京花楸的组织培养快繁方法，其特征在于，所述增殖培 养的时间是35d，所述生根培养的时间是35d。

5. 根据权利要求4所述的一种北京花楸组织培养方法，其特征在于，所述组织培养快繁 方法的培养条件是温度白天2 5 ± 2 °C、夜间18 ± 2 °C，光照时长16 h，光照强度为3 0 0 0〜 5000LX。

6. 根据权利要求1所述的一种北京花楸组织培养方法，其特征在于，所述组织培养方法 还包括炼苗，所述炼苗:将生根苗移至温室中封口炼苗，5d后去除无菌盖，继续炼苗3d，维持 室内湿度50%以上，温度25〜30°C，而后继续炼苗15d，所述15d的前5d湿度不低于50%，温 度维持在15〜30°C。

7. 根据权利要求6所述的一种北京花楸组织培养方法，其特征在于，所述组织培养方法 还包括移栽，所述移栽:清水洗净根部培养基，将其移栽入经过〇. 5 %高锰酸钾消毒的轻基 质容器内，所述轻基质包括草炭、珍珠岩与蛭石，所述轻基质中草炭、珍珠岩与蛭石的比例 是6:1:1〇