CN113736663A - 一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法及其应用，通过采用特定工艺参数及提取方法，能够有效的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素，克服了现有技术中所披露的提取胞外毒素作为侵染源却未见植株发病的技术缺陷。通过本发明提供的提取方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素，采用叶圆盘法，验证对棉花的致病性，叶圆盘不仅有黄化而且枯斑显著加重现象，表通过本发明提供的提取方法获得的胞内毒素具有较高的侵染力，对于棉花抗病育种技术领域具有广泛的实用性与巨大的潜在开发价值。

Description

一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法及其应用
技术领域
本发明属于植物病害防治领域，具体涉及棉花黄萎病致病菌孢内毒素提取及其应用的技术领域。
背景技术
棉花黄萎病是严重制约棉花的重要因素，致病菌大丽轮枝菌是轮枝菌属的真菌，初侵染源以微菌核为主，该结构呈黑色致密的凝结状，可以在地下生存数十年之久，化学农药对该病的防治防效甚微，因此，抗棉花黄萎病品种的选育成为治疗该病的一个重要措施，因黄萎病变异速度快，菌株种类多而复杂，造成黄萎病致病机理尚不明确，因此，目前存在多种的方式对棉花黄萎病抗性进行鉴定，室外主要是建立病圃，利用自然环境进行鉴定，因为自然气候的地理环境以及气候条件的变化，造成棉花品种发病情况，状态不一，往往需要几年才能完成，费事费力。室内主要有分生孢子蘸根法以及毒素鉴定法两种，分生孢子蘸根法是室内抗黄萎病品种鉴定的主要方式，但其对棉花种植要求高，需要全程浇灌纯净水，并且伤根部位和程度难以控制，造成抗性呈“假阳性”的几率高，毒素鉴定法是近年来发展起来的一种鉴定的新方式，研究者普遍认为致病毒素是胞外分泌型，并且已从T9，VD8，SS-43等菌系液体培养基质中分离出相关毒素，需要培养基质多且量大，才能满足实验所需求的毒素，经费多且费事，是目前造成该研究迟缓的主要原因之一，但是对于其他菌系的致病毒素则无相关的研究，因此对其他菌系的胞内毒素研究这方面尚存在空白。大丽轮枝菌株为V991，该菌株是强致病性、落叶型的菌株，该菌株利用分生孢子浸根法可以快速让农作物发病，提取孢外毒素作为侵染源却未见植株发病，对于其侵染的具体来源并不明确。
发明内容
针对现有技术中尚无关于棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌株为V991具体侵染来源的研究，以及其相配套效果显著的孢内毒素的提取方法的技术现状，本发明创造性的提供一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，通过采用特定工艺参数及提取方法，能够有效的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素，克服了现有技术中所披露的提取孢外毒素作为侵染源却未见植株发病的技术缺陷。通过本发明提供的提取方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素，采用叶圆盘法，验证对棉花的致病性，叶圆盘不仅有黄化而且枯斑显著加重现象，表通过本发明提供的提取方法获得的孢内毒素具有较高的侵染力，对于棉花抗病育种技术领域具有广泛的实用性与巨大的潜在开发价值。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，所述的提取方法，采用如下步骤提取获得：
(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek’s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养3-6天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为6.5-8.5的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度10-100℃，高压均浆机反复研磨3-4次；
(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
优选的，所述的0.05M磷酸缓冲液的pH值为6.5。
优选的，所述的高压均浆机研磨时温度为10℃。
优选的，所述的棉花黄萎病菌饼的振荡培养时间为5天。
进一步的，本发明还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法在构建棉花黄萎病侵染模型中的应用。
进一步的，本发明还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法在培育棉花黄萎病抗性品种中的应用。
更进一步的，本发明还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素在构建棉花黄萎病侵染模型中的应用。
更进一步的，本发明还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素在培育棉花黄萎病抗性品种中的应用。
本发明具有以下有益的技术效果：
(1)本发明创造性的提供一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，通过采用特定工艺参数及提取方法，能够有效的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素，克服了现有技术中所披露的提取孢外毒素作为侵染源却未见植株发病的技术缺陷。
(2)通过本发明提供的提取方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素，采用叶圆盘法，验证对棉花的致病性，叶圆盘不仅有黄化而且枯斑显著加重现象，表通过本发明提供的提取方法获得的孢内毒素具有较高的侵染力，对于棉花抗病育种技术领域具有广泛的实用性与巨大的潜在开发价值。
附图说明
图1所示为大丽轮枝菌显微观察及测序鉴定图。其中图A所示为大丽轮枝菌菌丝显微形态；图B所示为大丽轮枝菌分生孢子梗显微形态；图C所示为ITS1/ITS4PCR扩增序列，Bar＝20μm。
图2所示为不同pH条件下大丽轮枝菌V991分生孢子破碎情况图。其中图所示为不同pH条件下大丽轮枝菌破碎程度的显微形态；图B所示为不同pH条件下大丽轮枝菌三次研磨后的破碎率情况，Bar＝20μm。
图3所示为采用Bradford法对孢内毒素进行测定结果图。
图4所示为不同pH提取毒素对棉花致病力鉴定结果图。
图5所示为不同提取温度获得的毒素对棉花致病力鉴定结果图。
图6所示为不同摇菌天数获得的毒素对棉花致病力鉴定结果图。
具体实施方式
菌株材料：
本发明中所采用的棉花黃萎病原菌：大丽轮枝菌V991(VerticilliumdaliaeKleb)，为常见菌株，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。
棉花品种：供试棉花品种(系)湘棉13号，2890，中棉12号，辽棉15号，渝棉1号，由新疆农业科学院经济作物研究所提供，分生孢子浸根法及毒素叶盘侵染法所用的棉花品种为辽棉15号。
本申请中采用的马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基(1L)配制方法：称取39g PDA干粉倒入1L去离子水中，煮沸充分溶解后，高温高压灭菌15min。
本申请中采用的查氏(Czapek)培养基(1L)配制方法：称取葡萄糖30g，NaNO32 g，K2HPO4·3H2O 1g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g依次倒入1L去离子水中，充分溶解后，高温高压灭菌15min。
本申请中采用的5mmol磷酸缓冲液母液(1L)配制方法：称取0.78g NaH2PO4·2H2O,用去离子水定容到1L,称取1.79gNa2HPO4·2H2O，用去离子水定容到1L。
本申请中采用的5mmol磷酸缓冲液pH 7.0(1L)配制方法：分别量取610mLNaH2PO4·2H2O,390mLNa2HPO4·2H2O，用去离子水定容到1L。
本发明中所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。
本试验处理采用Microsoft Excel进行数据分析处理，采用Sigmaplot 14.0软件进行数据分析作图，Photoshop 2017进行图片处理。
本发明中选用的所有材料、试剂和仪器以及数据处理方法都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例一：一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法及其应用
本发明提供一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，所述的提取方法，采用如下步骤提取获得：
(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek’s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养3-6天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为6.5-8.5的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度10-100℃，高压均浆机反复研磨3-4次；
(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
进一步的，本发明还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法在构建棉花黄萎病侵染模型中的应用。
进一步的，本发明还提供所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法在培育棉花黄萎病抗性品种中的应用。
进一步的，采用上述提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素在构建棉花黄萎病侵染模型中的应用。
更进一步的，采用上述提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素在培育棉花黄萎病抗性品种中的应用。
实施例二：一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法
一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，所述的提取方法，采用如下步骤提取获得：
(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek’s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养3天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为6.5的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度10℃，高压均浆机反复研磨3-4次；
(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
实施例三：一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法
一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，所述的提取方法，采用如下步骤提取获得：
(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek’s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养3天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为7.0的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度10℃，高压均浆机反复研磨3-4次；
(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
实施例四：一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法
一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，所述的提取方法，采用如下步骤提取获得：
(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek’s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养4天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为7.5的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度100℃，高压均浆机反复研磨3-4次；
(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
实施例五：一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法
一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，所述的提取方法，采用如下步骤提取获得：
(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek’s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养5天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为8.0的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度100℃，高压均浆机反复研磨3-4次；
(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
实施例六：一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法
一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，所述的提取方法，采用如下步骤提取获得：
(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek’s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养6天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为8.5的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度100℃，高压均浆机反复研磨3-4次；
(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
实施例七：一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法
一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，所述的提取方法，采用如下步骤提取获得：
(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek’s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养5天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为6.5的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度10℃，高压均浆机反复研磨3-4次；
(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
实施例八：棉花黄萎病病原菌株的分离培养
将贮存在-80℃冰箱里的大丽轮枝菌V991的孢子存储液，用毛细管制成接种针划线，在25℃培养，待单孢出现后，用接种针将各单孢分别培养在新的PDA固体培养基上，将上述单孢形成的菌株25℃暗培养，观察各菌株的菌丝颜色、菌落大小以及生长速度；获得14个菌系，活化培养时间为15-20d；在显微镜下观察，各菌系的菌丝、分生孢子梗的形态，并利用ITS对获得的菌株进行测序鉴定。进一步对棉花大丽轮枝菌V991进行显微形态学鉴定，鉴定结果如附图1中图A图B所示，菌丝和分生孢子为无色透明状，菌丝与分生孢子不具备典型的轮枝菌属形态，菌丝分枝及分生孢子梗存在轮枝(如附图1中图A及图B箭头所指)与非轮枝两种形态，用通用引物ITS1/ITS4PCR扩增其rDNAITS(internal transcribed spacer,ITS)区段，纯化测序，测序结果如附图1中图C所示，该序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中核酸比对软件BLAST比对分析，最终鉴别其为大丽轮枝菌，属于常见的公知的大丽轮枝菌。
实施例九：病原菌孢内毒素的提取及致病力鉴定
将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经高温高压(120℃，15min)灭菌的Czapek’s培养液中，在25℃130rpm/min的摇床中振荡培养3-6天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止，经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液，在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；并用灭菌水洗涤沉淀一次，重复上次离心步骤，收集沉淀；在沉淀中加入相应pH值的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀。
1、分生孢子水培浸根法鉴定棉花品种对黄萎病的抗性
1.1病原菌接种液制备
(1)将棉花黄萎病菌菌块(直径＝0.5cm)在超净台中移入经高温高压(120℃，15min)灭菌的Czapek’s培养液中；
(2)在25℃130rpm/min的摇床中振荡培养8d；
(3)在超净台中，用140目和400目钢筛过滤，得到孢子悬浮液；
(4)常温，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(5)沉淀用灭菌的去离子水悬浮，重复上述离心过程1次；
(6)收集的沉淀用灭菌的去离子水悬浮，并用血球计数板统计孢子数，并将获得的溶液的分生孢子数量调整至浓度为107个/mL；
(7)获得的孢子就是水培法所需的孢子。
1.2分子孢子水培浸根法具体步骤：
将灭菌过的棉籽去种皮后播于盆栽中，盆栽中营养土与蛭石的比例为2:1。置于温度为28℃，光周期为14小时白天，10小时夜晚的温室内以常规管理模式培养棉苗。棉苗长到一叶一新时，从盆栽中取出，使用纯净水小心冲洗掉棉苗根部附着的蛭石与营养土，用吸水纸吸去多余水分，并剪去棉苗根尖1cm，每个品系选取10株苗，3次重复，将棉苗根部浸入20mL孢子浓度107个/mL的大丽轮枝菌V991孢子悬浮液中40min,移入1/3MS培养液中，9d后统计病指。
1.3孢内毒素含量的测定
利用分光光度计，采用Bradford法对孢内毒素进行测定，其具体步骤操作如下：
(1)称取0.001g考马斯亮蓝G-250加入500μL95％乙醇充分溶解，加入纯净水至近100mL处，并加入1mL磷酸，充分搅拌混匀后将溶液定容至100mL，滤纸过滤后，将溶液放置在棕色瓶中4℃存贮；
(2)称取0.001g牛血清白蛋白(BSA)用0.15M NaCl溶解，配成1mg/mL溶液，按照表1下表依次加入相应试剂，在分光光度计595nm条件下测定吸光度。
表1：试剂添加表
BSA(μL) NaCl(μL) G250(mL) 蛋白浓度(μg/μL)
0 100 2 0
10 90 2 0.1
20 80 2 0.2
40 60 2 0.4
60 40 2 0.6
80 20 2 0.8
100 0 2 1
测定结果如附图2所示。
1.3数据处理
本试验处理采用Microsoft Excel进行数据分析处理，采用Sigmaplot 14.0软件进行数据分析作图，Photoshop 2017进行图片处理。
2、不同方法孢内毒素的提取及致病力鉴定
(1)不同pH值条件下大丽轮枝菌孢内毒素的提取及致病力鉴定
pH分别设定为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，悬浮分生孢子并将浓度调节至107个/mL；设置压力为120Mpa,温度10℃，高压均浆机反复研磨3-4次，直至分生孢子完全破碎为止，显微观察，分生孢子的形态及破碎情况，统计破碎率，4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为供试毒素，用于每个叶盘法致病力鉴定的用量为16-18μg。在放有叶圆盘的24孔板中分别加入不同pH条件下提取的毒素，以去离子水作为对照，放入24℃温室中，进行弱光培养15天。
基于孢内毒素提取破碎效果而言，在不同pH缓冲溶液中，各分生孢子经过高压匀浆机第一次研磨后，孢子形态变化明显，观察结果如附图2所示，pH 6.5和pH 8.5分生孢子形态变化小，而在pH 7.0,pH7.5,pH 8.0缓冲液中的分生孢子经过第一次研究后分生孢子互相连接成较大的结构，成连片状态，研磨三次后，处于不同缓冲液中的大丽轮枝菌的分生孢子破碎率差异显著，处于pH 8.0缓冲液中的分生孢子破碎率最高为96.86％，而处于pH7.0缓冲液中的分生孢子破碎率最低为74.17％，说明pH 8.0缓冲液是最佳的破碎缓冲液。
基于孢内毒素提取致病力效果而言，采用叶圆盘法，验证在不同pH条件下获得的大丽轮枝菌V991孢内毒素对棉花的致病性，结果如附图4所示，叶圆盘在侵染后，病症明显，在pH 7.0、pH 8.0、pH8.5条件下提取的毒素侵染各叶圆盘病症较轻，仅个别叶圆盘黄化，有少数枯斑出现，而在pH 6.5、pH 7.5条件下提取的毒素侵染各叶圆盘病症较重，尤其是在pH6.5提取的胞内毒素，叶圆盘不仅有黄化而且枯斑显著加重现象，说明在pH 6.5条件下提取的胞内毒素具有较高的侵染力。
(2)不同温度条件下大丽轮枝菌菌孢内毒素的提取及致病力鉴定
孢内提取温度分别设定为10℃、100℃，孢内毒素提取的pH为6.5，重复上述提取步骤，直至用0.45μm微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为10℃条件下供试毒素，将该毒素一部分在100℃条件下处理1个小时后，常温下，18000rpm/min离心25min，集上清，用0.45μm微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为100℃条件下的供试毒素，用于每个叶盘法致病力鉴定的用量为16-18μg。在放有叶圆盘的24孔板中分别加入不同温度条件下提取的毒素，以0.05M磷酸缓冲液(pH＝7.0)作为对照，放入24℃温室中，进行弱光培养15天。
在不同温度提取条件下，提取获得的孢内毒素对于棉花的侵染情况具有极显著的差异，观察结果如附图5所示，叶圆盘在侵染后，病症明显，在100℃条件下提取的毒素侵染各叶圆盘病症较轻，仅个别叶圆盘黄化，有少数枯斑出现，而在10℃条件下提取的毒素侵染各叶圆盘病症较重，叶圆盘不仅有黄化而且枯斑显著加重现象，说明在10℃条件下提取的胞内毒素具有较高的侵染力。
(3)不同摇菌时间的大丽轮枝菌孢内毒素的提取及致病力鉴定
将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经高温高压(120℃，15min)灭菌的Czapek’s培养液中，在25℃130rpm/min的摇床中振荡培养，分别设置培养天数为3、4、5、6天，并分别收集获得的分生孢子，设置孢内毒素提取温度为10℃，提取pH为6.5，按上述步骤获得供试毒素，用于每个叶盘法致病力鉴定的用量为16-18μg。在放有叶圆盘的24孔板中分别加入不同天数的毒素，以5mmol磷酸缓冲液(pH＝7.0)作为对照，放入24℃温室中，进行弱光培养15天。
在不同摇菌天数提取条件下，提取获得的孢内毒素对于棉花的侵染情况具有极显著的差异，观察结果如附图6所示，叶圆盘在侵染后，病症明显，在摇菌天数为3天、4天、6天条件下提取的毒素侵染各叶圆盘病症较轻，仅个别叶圆盘黄化，有少数枯斑出现，而在摇菌天数为5天条件下提取的毒素侵染各叶圆盘病症较重，叶圆盘不仅有黄化而且枯斑显著加重现象，说明在摇菌天数为5天条件下提取的胞内毒素具有较高的侵染力。
综上所示，本发明提供的技术方案中，0.05M磷酸缓冲液的pH值为6.5，结合高压均浆机研磨时温度为10℃，并匹配棉花黄萎病菌饼的振荡培养时间为5天为最佳提取条件，在此工艺参数组合的技术方案中提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素具有最佳的致病力。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，其特征在于，采用如下步骤提取获得：
(1)将直径为0.5cm的棉花黄萎病菌饼接种到经120℃灭菌15min的Czapek’s培养液中，在25℃转速为130rpm/min的摇床中振荡培养3-6天，至分生孢子在三角瓶壁上有成团结构出现为止；
(2)将步骤(1)中培养获得的液体经140目和400目钢筛双层过滤后即可获得孢子悬浮液；
(3)将步骤(2)中制备获得的孢子悬浮液在常温条件下，14000rpm/min离心10min，收集沉淀；
(4)将步骤(3)中收集获得的沉淀采用灭菌水洗涤沉淀，重复14000rpm/min离心10min离心步骤，收集沉淀；
(5)在步骤(4)中收集获得的沉淀中加入pH值为6.5-8.5的0.05M磷酸缓冲液中悬浮沉淀；
(6)采用灭菌水将步骤(5)中制备获得的悬浮液孢子浓度调节至107个/mL；
(7)将步骤(6)中制备获得的孢子悬浮液经120Mpa，温度10-100℃，高压均浆机反复研磨3-4次；
(8)将步骤(7)中制备获得的均质液体于4℃，18000rpm/min离心25min，弃上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤除杂菌，最终得到滤液为孢内毒素。
2.如权利要求1所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，其特征在于，所述的0.05M磷酸缓冲液的pH值为6.5。
3.如权利要求1所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，其特征在于，所述的高压均浆机研磨时温度为10℃。
4.如权利要求1所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法，其特征在于，所述的棉花黄萎病菌饼的振荡培养时间为5天。
5.如权利要求1-4任意一项所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法提取获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素在构建棉花黄萎病侵染模型中的应用。
6.如权利要求1-4任意一项所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法在构建棉花黄萎病侵染模型中的应用。
7.如权利要求1-4任意一项所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法在培育棉花黄萎病抗性品种中的应用。
8.如权利要求1-4任意一项所述的提取棉花黄萎病致病菌孢内毒素的方法获得的棉花黄萎病致病菌孢内毒素在培育棉花黄萎病抗性品种中的应用。
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