CN1470173A

CN1470173A - 一种诱导植物系统抗病性的激发子

Info

Publication number: CN1470173A
Application number: CNA031319874A
Authority: CN
Inventors: 王源超; 张正光; 胡东维
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2003-06-25
Filing date: 2003-06-25
Publication date: 2004-01-28

Abstract

本发明从疫霉菌中分离的可以诱导植物系统抗病性的蛋白激发子、制备方法，属于生物技术领域。利用硫酸铵沉淀，获得一种粗的蛋白激发子，通过离子交换色谱和疏水互作色谱等技术对其进行纯化，获得了一种在国内外均未见报道的90kDa蛋白激发子。该激发子可用于诱导烟草和小白菜的系统广谱抗病性。使用浓度为0.1～10nM。防治效果80％以上。

Description

一种诱导植物系统抗病性的激发子

(一)技术领域

本发明一种诱导植物系统抗病性的激发子，属于生物技术研究领域。专用于从棉疫病菌中制备一种蛋白类激发子，用于防治烟草和小白菜的多种病害。

(二)背景技术

激发子(elicitor)是能诱导植物产生防卫反应的一类物质，这类物质有蛋白、寡聚糖、糖蛋白等类型。激发子有生物来源和非生物来源两种类型，其中生物来源，包括植物病原真菌(如Phytophthora spp.)、植物病原细菌梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和植物胞壁等，由于生物来源的激发子具有环境安全，效果明显等特点，而且来源丰富等特点，在农业植物病害的防治上有着更为广阔的应用前景。

真菌是一种重要的激发子生物来源。目前已经报道的有来自于酵母细胞壁的寡糖、疫霉属真菌分泌的分子量为10kDa的蛋白类激发子elicitin等。这些激发子的共同特点是在植物上引起的过敏性反应，具体表现为接种区植物细胞的快速死亡，形成局部枯斑，从而阻止病原菌进一步扩展并杀死病原菌。但到目前为止，未有文献和专利报道从棉疫病菌中分离出本专利申请的一种新的蛋白激发子。

(三)发明内容

技术问题本发明的目的是提供一种能诱导植物系统抗病性的激发子，该激发子可用于诱导烟草对黑胫病、赤星病、青枯病、病毒病和小白菜对炭疽病、软腐病产生系统抗病性。此外该激发子蛋白也是研究植物对卵菌的非寄主抗病性的理想研究材料。

技术方案

1、激发子特性：本发明所提供的一种能诱导植物系统抗病性的激发子，来源于棉花疫霉菌，属蛋白类，分子量为90kDa，命名为PB90，对酸碱和热稳定。对蛋白酶ProteaseK敏感。N-端氨基酸序列为AVNN。该激发子定位于疫霉菌的细胞壁上。该激发子引起烟草过敏性反应的浓度为0.1-10mM。该激发子是通过以下制备方法获得的：

2、激发子提取与纯化：将棉疫病菌在Polich’s培养液(每升含0.5g KH₂PO4，0.25g MgSO₄·7H₂O，1g天冬酰胺酸，1mg硫胺，0.5g酵母浸膏，20g葡萄糖)中培养10d后，采用双层滤纸过滤，加入硫酸铵至70％(w/v)，在4℃过夜，12000g的离心力下离心10分钟，收集粗蛋白沉淀，用1％体积的Tris.HCl(7.4)悬浮，即为粗蛋白激发子；

用快速蛋白液相色谱FPLC纯化：阴离子交换色谱，色谱柱为SepharoseQFF，流动相：A，20mmol/L Tris.HCl pH6.0；B，A+1mol/L NaCl；流速：2.5ml/min，30min梯度洗脱，收集活性峰，活性峰测定方法是将收集的溶液稀释100倍后注射烟草叶片，能引起过敏性反应的部分就是活性组分；疏水相互作用色谱，色谱柱：Sepharose PHE HP：流动相：A，0.8mol/L硫酸铵20mmol/LTris.HCl pH6.0；B.MiliQ水；流速：1.5ml/min，梯度洗脱，收集活性峰，即为纯化的活性蛋白，分子量为90kDa。

3、施用方法和应用范围：

将该激发子稀释至200pM，以每株植物20μL注射植物叶片上，或以每亩3L喷雾接种在植物叶片上，可以诱导烟草对烟草花叶病毒、烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、烟草赤星病菌，以及小白菜对炭疽病菌、软腐病等多种病害的系统广谱抗病性，诱抗效果可以持续15天以上。系统抗病性效果高达80％以上。

有益效果本发明所提供的一种能诱导植物系统抗病性的激发子，与其他激发子比较，具有如下优点和积极效果：

本发明所提供的疫霉菌90kDa蛋白激发子诱导植物系统获得抗病性的作用浓度低，只需0.1mmol.L^-1就可以诱导烟草和白菜对不同病原菌的抗病性高达85％以上。而现有技术中来源于植物病原细菌的Harpin类蛋白诱导植物抗病性所需浓度为20mmol.L^-1以上，比本研究所提供的激发子活性低1000倍以上。因此本申请所提供的激发子具有更强的生物活性。

(四)说明书附图图1，激发子纯化色谱图，HP1为活性峰图2，纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图3，激发子诱导抗病性，A：激发子诱导烟草对TMV抗性；B：激发子诱导烟草对赤

星病的抗性图4，激发子的免疫金标记定位于疫霉菌的细胞壁。

具体实施方式

实施例1：棉疫病菌90kDa蛋白激发子PB90的制备方法：

将棉疫病菌在合成培养液中培养10天后，采用双层滤纸过滤，加入硫酸铵至80％，在4℃过夜，12000g离心10分钟，收集蛋白沉淀，用1％体积的Tris.HCl(7.4)悬浮。

采用快速蛋白液相色谱FPLC纯化。过程：阴离子交换色谱，色谱柱SepharoseQFF，流动相：A，20mmol/L Tris.HCl pH6.0；B，A+1mol/L NaCl；流速：2.5ml/min，30min梯度洗脱，收集活性峰，活性峰的测定方法是：将不同收集管中的蛋白溶液分别脱盐后，稀释100倍，注射烟草，能引起烟草细胞过敏性坏死反应的组分，就收集起来做进一步纯化；疏水相互作用色谱，色谱柱：Sepharose PHE HP；流动相：A，0.8mol/L硫酸铵20mmol/LTris.HCl pH6.0；B，MiliQ水；流速：1.5ml/min，经过50分钟梯度洗脱，收集活性峰(色谱图见图1)。纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图见图2，所纯化蛋白的分子量为90KD，命名为PB90，对酸碱和热稳定。对蛋白酶ProteaseK敏感。N-端氨基酸序列为AVNN。该激发子定位于疫霉菌的细胞壁上。该激发子引起烟草过敏性反应的浓度为0.1-10mM。实施例2：该激发子诱导植物系统广谱抗病性：

将该激发子稀释至100pM，采用去掉针头的注射器，沿植物叶片背面注射到植物叶片内，24小时后，注射部位叶片变为褐色，在激发子处理后直到15天内，植物挑战接种烟草花叶病毒、烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、烟草赤星病菌，以及小白菜炭疽病菌等，植物均可以表现出高达80％以上的系统广谱抗病性(诱导抗性＝对照叶片病斑数-处理叶片病斑数/对照叶片病斑数×100％)，结果表明本研究所获得的激发子诱抗抗性效果可以持续15天以上。图3

实施例3：

采用免疫金标记技术，证明该激发子定位于疫霉菌的细胞壁上。图4

Claims

1、一种诱导植物过敏性反应的激发子，其特征在于：激发子来源于棉花疫霉菌(Phytophthora boehmeriae)，属蛋白类，分子量为10～100kDa，对酸、碱、热稳定；对蛋白酶ProteaseK敏感，N-端氨基酸序列为AVNN，该激发子引起烟草过敏性反应的浓度为0.1-10mM；

该激发子的制备方法包括：将棉疫病菌在Plich′s培养液(每升含0.5gKH₂PO4，0.25g MgSO₄·7H₂O，1g天冬酰胺酸，1mg硫胺，0.5g酵母浸膏，20g葡萄糖)中培养10天后，采用双层纱布过滤，再采用双层滤纸过滤，加入硫酸铵至70g/100mL，在4℃过夜，12000g离心10分钟，收集粗蛋白沉淀，用1％体积的Tris.HCl，PH为7.4，悬浮，即为粗蛋白激发子；

采用快速蛋白液相色谱FPLC纯化：阴离子交换色谱，色谱柱SepharoseQFF，流动相：A，20mmol/L Tris.HCl pH6.0；B，A+1mol/L NaCl；流速：2.5ml/min，30min梯度洗脱，收集活性峰：将不同收集管中的蛋白溶液分别脱盐后，稀释100倍，注射烟草，能引起烟草细胞过敏性坏死反应的组分，就收集起来做进一步纯化；疏水相互作用色谱，色谱柱：Sepharose PHE HP；流动相：A，0.8mol/L硫酸铵20mmol/LTris.HCl pH6.0；B，MiliQ水；流速：1.5ml/min，梯度洗脱，收集活性峰(方法同上)，透析后冻干浓缩制成纯品。

2、权利要求1所述诱导植物过敏性反应的激发子的应用，包括：将浓度为0.1-10mM的激发子溶液，注射或喷雾接种在植物叶片上，诱导烟草对烟草花叶病毒、烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、烟草赤星病菌，以及小白菜对炭疽病菌等多种病害的系统广谱抗病性。